[go: up one dir, main page]

CN109072305A - 利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物 - Google Patents

利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN109072305A
CN109072305A CN201780025886.7A CN201780025886A CN109072305A CN 109072305 A CN109072305 A CN 109072305A CN 201780025886 A CN201780025886 A CN 201780025886A CN 109072305 A CN109072305 A CN 109072305A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
label
chain reaction
polymerase chain
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780025886.7A
Other languages
English (en)
Inventor
金寿玉
金锡俊
洪璿杓
郑贤在
赵佑宰
金在日
梁承民
赵爱悧
洪诚秀
金政优
郑先泳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genematrix Inc
Original Assignee
Genematrix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genematrix Inc filed Critical Genematrix Inc
Publication of CN109072305A publication Critical patent/CN109072305A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/622—Ion mobility spectrometry
    • G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/131—Modifications characterised by incorporating a restriction site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物，具体地，涉及通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物与标记互补序列相连接，来在聚合酶链式反应中通过限制酶产生标记，并且通过利用长度及核酸的组合等的要素来对与各个引物相连接的标记互补序列进行多样化处理，而且利用这些来区分靶序列的方法。根据本发明，在严格条件下，切割的互补标签片段(Cleaved ComplementaryTag Fragment，CCTF)为与引物相连接的5'末端的任意序列和互补序列，若不产生聚合酶链式反应和限制酶反应，则仅当与靶序列杂交并形成与靶序列互补的引物延伸产物时，才形成切割的单链，从而可确保更高的精确度。而且，切割的互补标签片段可用于根据用户的意图选择各种分析技术和分析设备来鉴定多个靶核酸序列。例如，可以快速且准确地确认基因测试、样品中的活生物鉴定、微生物感染或病毒感染的诊断等。

Description

利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物
技术领域
本发明涉及利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物，具体地，涉及将与靶序列进行特异性反应的引物连接到能够产生标记物质的标记的模板，来在聚合酶链式反应中通过限制酶活性合成并释放标记，来使之流入到反应液中来鉴定扩增产物的方法。而且，本发明涉及标记产生方法和标记鉴定方法以及用于该方法的组合物，其特征在于，对于一个靶序列仅使用一种类型的标记模板序列，并利用各种分析装置分析反应中产生的标记来识别标记。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是检测和分析低浓度的核酸的最有用的技术之一。核酸的检测基于双链寡核苷酸序列的互补性以及各个脱氧核糖核酸(Desoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶的延伸反应，并且可以利用这些来检测靶核酸序列(Barry et al.,Current Opinion in Biotechnology,12:21,2001)。
多重聚合酶链反应为可以同时扩增几种靶序列的核酸的方法，与其他方法相比，相对快速且简单，由此在基因检测、样品中的生物体鉴定、微生物感染或病毒感染与否等的诊断领域中起到非常重要的作用。
确认这种多重聚合酶链反应的结果的最常用方法为通过改变聚合酶链反应所需的靶序列的扩增产物的大小来设计引物，并通过电泳分析聚合酶链反应产物的扩增产物的大小，从而确认所属靶序列的扩增与否。在这种情况下，能够一次性扩增的基因的数量在实验上限制为3～4个，其原因在于，扩增效率取决于聚合酶链式反应中能够产生的扩增产物的大小，从而不能保障均匀的扩增效率，因此存在将扩增产物的大小限制在狭窄范围的局限性。此时，也会产生所需的基因扩增产物的大小重叠的情况，像这样，在基于大小来分析多重聚合酶链反应的情况下，存在对于检测方法的解释的局限性。
在确认聚合酶链反应结果时，实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)可确保快速确认结果，在聚合酶链反应中标记荧光物质，来能够确认扩增与否，无论扩增产物的大小如何。实施并检测实时荧光定量聚合酶链反应的方法可分为嵌入方法和探针方法，嵌入方法是指，在双链的碱基序列之间插入荧光物质来确认荧光强度的方法。这种方法具有如下局限性，即，不能区分形成双链的扩增产物，并均可以用相同的波长的荧光观察到，因此很难通过识别每个靶序列的扩增产物来同时检测和确认一个以上的扩增物。探针(Probe)方法是指通过读取被指定为每个靶序列的探针的荧光值来检测扩增产物的方法，在使用该方法时，仅可以在所使用的仪器的可分析荧光通道的数量范围内检测出扩增物，因此不适合于荧光通道数以上的多重分析。
因此，不断进行有关在聚合酶链反应中插入标记的研究，以能够进行最大数量的多重分析。
在美国路明克斯公司(美国Luminex公司)的xTAG技术的情况下，设定由组成核酸的胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)的随机排列构成的规定的碱基序列，并将其命名为xTAG。在需要观察的靶序列的扩增的情况下，为了使xTAG序列位于末端而在引物插入xTAG的序列，来在聚合酶链反应过程中xTAG插入于扩增产物，并通过再次与使附着有与xTAG互补的序列的珠子相结合，来形成两个碱基序列的互补结合，并利用这些来感知靶，用珠子的荧光分析靶序列的方法。上述方法具有如下问题，即，即使xTAG不参与扩增，若扩增后的引物没被完全去除，则也与珠子的互补xTAG相结合来会识别标记，xTAG的互补序列由聚合酶链反应产生非特异反应，并且会产生检测非特异靶的错误(美国专利号(U.S.patent no.)7645868及8624014)。
为了解决这种问题而持续进行有关在聚合酶链式反应中构筑标记且标记不影响聚合酶链式反应，而且尽可能检测多数多重检测的技术的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于解决上述问题且满足上述需求，具体地，本发明的目的在于提供，用于解决在基于使用如聚合酶链反应等的聚合酶链反应的靶序列扩增及进行分析的生成产物的长度来判断结果时可能产生的结果的不确定性，而且在进行多重检测时能够解决对于能够确认扩增的最大数量的限制的方法。
本发明的另一目的在于，提供通过解决由于非特异性扩增引起的错误来提高准确度的方法，上述非特异性扩增是在形成标记来确认靶序列扩增时，将任意序列作为标记本身来使用而引起的。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供包含与靶序列非互补的随机核酸序列，并依次包含限制酶识别序列及与靶序列互补的核酸序列的结构的引物。
在本发明的一实例中，优选地，上述限制酶识别序列为对于选自由Pho I、PspGI、BstNI、TfiI、ApeKI、TspMI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BssKI、BstYI、TaqI、MwoI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspRI、Tth111I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI限制酶及Nick限制酶组成的组中的限制酶的识别序列，但不局限于此。
在本发明的再一实例中，优选地，在上述引物中，在上述引物的限制酶识别序列中的切割部位插入有修饰的脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP)，以能够除切割的互补标签片段之外的切割副产物不参与反应，而且优选地，插入于上述切割部位的修饰的脱氧核糖核苷三磷酸包含硫代磷酸化(Phosphorothioated)的脱氧核糖核苷三磷酸、包含7-脱氮嘌呤(Deazapurine)的脱氧核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核酸模板中的2'-O-甲基核苷酸(methyl nucleotide；2'-OMeN)，但不局限于此。
在本发明的另一实例中，优选地，在上述引物中，所产生的切割的互补标签片段的长度为5mer以上且50mer以下，但不局限于此。
在本发明一实例中，优选地，上述引物选自由SEQ ID NO.1、3、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、74、76、78、80、82、84、86、115、117、119、121、123、125、127、129、131、151、153、155、156、159、161、163、164、166、168、170、204、205、207、218、220及222组成的组中的一种以上引物，但不局限于此。
而且，本发明提供形成并鉴定用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的方法，包括步骤(a)，使包含用于产生作为切割的互补标签片段的标记的模板的上述本发明的引物与靶序列进行杂交；步骤(b)，当因上述步骤(a)的杂交而进行扩增过程时，由限制酶的活性产生从上述引物中切割的互补标签片段并流入于反应液中；以及步骤(c)，通过分析设备来鉴定上述反应所产生的切割的互补标签片段，并确认靶核酸序列的存在。
在本发明的一实例中，在上述方法中，优选地，通过分析切割的互补标签片段的质量来鉴定切割的互补标签片段，用于上述质量分析的仪器为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS，matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometer)、液相色谱-质谱联用仪(Liquid ChromatographyMassSpectrometry)或高效液相色谱仪(High Performance Liquid ChromatographyMassSpectrometry)，但不局限于此。
在本发明的再一实例中，用于质量分析的切割的标签片段的每单位电荷的质量(m/z)在大于0Da且小于10000Da之间，但不局限于此。
在本发明的另一实例中，优选地，为了保留用于上述扩增过程中的质量分析的切割的互补标签片段的质量，使用作为聚合酶的特性的3’末端腺嘌呤的额外延伸效果(A拖尾)功能被抑制的脱氧核糖核酸聚合酶，但不局限于此。
在本发明的还有一实例中，优选地，以上述切割的互补标签片段的鉴定方法、并且利用标记有荧光及猝灭剂且具有切割的互补标签片段的互补序列的寡核苷酸来分析荧光信号，但不局限于此。
在本发明又一实例中，优选地，在上述方法中，对将寡核苷酸和切割的互补标签片段的双链解离成单链的固有的解离温度进行多种改变，来分析解离温度和熔融峰，并对切割的互补标签片段进行鉴定来确认靶序列的存在，但不局限于此。
在本发明的又一实例中，优选地，上述寡核苷酸的长度为5个以上的寡核苷酸，但不局限于此。
在本发明的又一实例中，优选地，在上述方法中，为了防止寡核苷酸中的碱基序列的延伸，而阻断寡核苷酸的3’末端核苷酸，但不局限于此。
在本发明的又一实例中，优选地，在上述方法中，通过分析寡核苷酸的荧光信号的循环阈(Cycle threshold，Ct)值，来鉴定切割的互补标签片段，但不局限于此。
在本发明的优选实施例中，优选地，上述方法用于鉴定性传播疾病的致病菌，上述性传播疾病的致病菌选自由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhea)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、生殖器支原体(Mycoplasmagenitalium)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)、尿素分解支原体(Ureaplasmaurealyticum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、白念珠菌(Candida albicans)、阴道加德菌(Gardnerella vaginalis)、1-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1)、2-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2)及苍白密螺旋体(Treponema pallidum)组成的组，但不局限于此。
而且，本发明提供包含上述本发明的引物作为有效成分的用于诊断性传播疾病的组合物。
在本发明的又一实施例中，优选地，上述方法用于鉴定胃肠道疾病致病因子，上述胃肠道疾病致病因子选自由甲型轮状病毒(Rotavirus A)、星状病毒(Astrovirus)、腺病毒F40(Adenovirus F40)、腺病毒F41(Adenovirus F41)、诺如病毒GⅠ(Norovirus GⅠ)及诺如病毒GⅠ(Norovirus GⅡ)组成的组，但不局限于此。
而且，本发明提供包含上述本发明的引物作为有效成分的用于诊断胃肠道疾病致病因子的组合物。
在本发明的再一优选实施例中，优选地，上述方法用于鉴定人乳头瘤病毒，上述人乳头瘤病毒的亚型16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型及82型组成的组，但不局限于此。
而且，本发明提供包含上述本发明的引物作为有效成分的用于诊断人乳头瘤病毒的组合物。
在本发明另一优选实施例中，优选地，上述方法用于鉴定呼吸道疾病的致病因子，上述呼吸道疾病的致病因子选自由甲型H1N1流行性感冒(Influenza A/H1N1)、甲型H3N2流行性感冒(Influenza A/H3N2)、流行性感冒A(H1N1)pdm09(Influenza A/H1N1/2009pdm)、乙型流行性感冒(Influenza B)、副流感病毒1(Parainfluenza 1)、副流感病毒3(Parainfluenza 3)、呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A)、呼吸道合胞病毒B(Respiratory syncytial virus B)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus)及腺病毒(Adenovirus)组成的组，但不局限于此。
而且，本发明提供包含上述本发明的引物作为有效成分的用于诊断呼吸道疾病的组合物。
在本发明的还有一优选实施例中，在上述方法中，优选为单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)，优选地，上述单碱基变异选自由脑源性神经营养因子基因(Brain-derived neurotrophic factor gene，BDNF)的r6265组成的组，但不局限于此。
而且，本发明提供包含上述本发明的引物作为有效成分的用于分析脑源性神经营养因子基因的rs6265基因的组合物。
以下，对本发明进行说明。
本发明人在进行扩增反应且解释结果时，能够更简单快速且有效的方法来准确区分各个扩增产物，由此为了开发以大量靶为对象一次性进行多重扩增反应且解释结果的方法而尽力研究。
其结果，确认出当为了在扩增反应中能够产生可作为标记来使用的核酸序列，而在引物中插入作为标记的模板的序列并利用限制酶来仅切割标记时，产生的标记可以用作检测靶序列的标记来使用，而且确认出通过将其应用于分析法，证实了在多重扩增反应分析中，与以往的其他方法相比可有效且快速识别扩增与否，并且完成了本发明。
本发明涉及形成在聚合酶链式反应中用于区分和分析扩增的靶序列的类型的标记的方法。
尤其，在本发明中，其特征在于，包括：步骤(1)，包含用于产生标记的、标记的模板的引物与靶序列进行杂交；步骤(2)，在聚合酶链式反应中利用限制酶来从标记的模板中产生标记；以及步骤(3)，用各种分析设备对产生的标记进行分析来识别标记。
步骤(1)，包含用于产生标记(标记模板的引物(CCTF-Cleaved ComplementaryTagFragment)，以下称为CCTF)的、标记模板的引物(CTPO-CleavableTag PrimerOligonucleotide，以下称为CTPO)与靶序列进行杂交，具体地，CTPO包含靶序列和非互补的核酸序列(CCTF的模板)，依次包含限制酶识别序列及与靶序列互补的核酸序列，通过位于3'末端的与靶序列互补的核酸序列部位与靶序列杂交，来在聚合酶链式反应中用作引物来使用；步骤(2)，在扩增过程中，由限制酶的活性而从CTPO中产生CCTF并释放，具体地，在从上述叙述的CTPO中延伸的扩增产物中插入有限制酶识别序列，由识别这些的热稳定性限制酶的活性而产生CCTF并流入于反应液中；以及步骤(3)，通过各种分析设备来分析和鉴定上述产生的CCTF，来确认靶核酸序列的存在，具体地，通过测定产生的CCTF的质量来了解CCTF的类型，并且区分扩增的物质来确认靶核酸序列的存在，或者由产生的CCTF和互补序列构成并标记有荧光及猝灭剂的寡核苷酸(信号捕获寡核苷酸(SCO-Signal CaptureOligonucleotide)，以下称为SCO)与CCTF杂交，来形成双链，并在再次解离成单链的过程中形成荧光的发光，并通过分析这些固有解离温度来确认CCTF的类型，进而确认靶核酸序列的扩增与否。
以下，对本发明进行详细的说明。
在步骤(1)中，在杂交CTPO和靶序列之前，CTPO的结构如以下结构式1所示，可分为作为CCTF的模板的部分和限制酶识别序列部分以及与靶互补的序列部分。
结构式1
5'-A-B-C-3'
结构式1的A部位为作为CCTF的模板的部分，是随机序列，与靶序列进行退火处理后扩增并延伸CCTF的模板的互补序列，即CCTF部分之后，在扩增中由限制酶来释放CCTF部分。释放的CCTF的特征在于，上述释放的CCTF为具有5个寡核苷酸以上的长度的随机序列，以能够作为标记特异性地分析靶序列。在随机序列中，当在聚合酶链式反应中不产生副产物时，可以使用任何序列。用于CCTF的模板的核苷酸序列均满足在扩增反应中不产生杂交反应的任何序列。
B作为限制酶识别序列，意味着具有在扩增过程中能够使用的热稳定性的限制酶及Nick限制酶的特异性识别序列。例如，Pho I、PspGI、BstNI、TfiI、ApeKI、TspMI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BssKI、BstYI、TaqI、MwoI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspRI、Tth111I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI。
其中，最优选地，可以使用PspGI，并且在本发明的实施例中所使用的限制酶为PspGI。
为了除CCTF以外的切割副产物不存在且不参与反应中，而在CTPO的限制酶识别序列中由限制酶切割的部位插入修饰的脱氧核糖核苷三磷酸。作为该类型具有硫代磷酸化(Phosphorothioated)的脱氧核糖核苷三磷酸、包含7-脱氮嘌呤(Deazapurine)的脱氧核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核酸模板中的2'-O-甲基核苷酸(methyl nucleotide；2'-OMeN)等。作为现有技术，论文PNAS 89(1992)392-396以及核酸研究(Nucleic Acids Research)20(1)1991 55-61等可应用于本发明。最优选地，在识别序列中的切割部位上插入磷酸化的键(phosphothiolated bond)来防止由限制酶引起的CCTF的模板的切割，从而确保能够产生CCTF的模板，而且可以防止因CCTF的模板流入于反应液中而可产生的副产物，来可提高反应效率。在产生CCTF并防止该模板流入于反应液的方面上，与作为现有技术的链替代扩增反应(Strand Displacement Amplification，SDA)方法(美国专利92-819358)相比，展示不同的发明效果。
如结构式1所示的C部位是指限制酶识别序列后直到3’末端的序列，并且由靶特异性序列组成，在扩增时以靶特异性来相结合，从而可保持作为引物的作用。
在步骤(2)中，形成由CTPO引起的扩增产物，在从以双链的形式存在的扩增产物被限制酶切割成CCTF并释放到反应液中时所使用的限制酶的适当温度可根据使用目的而得到多种变化。而且，根据所使用的聚合酶的类型，其结果也有所不同，而且这些也可根据使用目而不同。例如，优选地，在为了进行质量分析而形成CCTF的情况下，CCTF的重量应保持规定质量，而不管扩增过程如何，而且不应反映核酸聚合酶的固有性质。因此，应该选定没有作为核酸聚合酶的固有性质的3’末端的腺嘌呤的额外延伸效果(A拖尾)的核酸聚合酶并使用。在核酸聚合酶中不具备A拖尾的酶是Phusion聚合酶(Phusion polymerase)、Vent聚合酶(Vent polymerase)、Deep Vent聚合酶(Deep Vent polymerase)、Bst聚合酶(Bstpolymerase)等。
然而，当应用使用除质量分析之外的其他技术的、CCTF的分析法时，由A拖尾引起的结果没有变化，因此可以使用任何聚合酶。
为了通过提高限制酶的效率来促进CCTF的产生及反应液中的流入，来最大化效果，而在聚合酶链反应过程中可以额外进行限制酶反应时间。反应时间及反应温度等可根据具体的限制酶类型、反应意图而所适用的范围不同。
在步骤(3)中，作为用各种分析设备分析产生的CCTF来鉴定靶核酸序列的步骤，当直接分析产生的CCTF的质量时，通过长度及序列的再组合来多样化CCTF的类型，并当利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)、液相色谱-质谱联用仪(LCMS)、高效液相色谱-质谱联用仪(HPLCMS)等的质量分析仪来分析这些质量时，可以观察产生的CCTF的固有质量，而且利用这些可以区分和确认扩增的靶序列。优选地，在用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪来进行观察时，易于观察的CCTF的质量范围在1200Da以上。可通过在上述范围的质量下形成各种CCTF来观察扩增产物。
可通过观察CCTF的荧光信号来识别扩增的靶序列的识别，而且标记有荧光及猝灭剂，使得在产生有CCTF的固有解离温度下能够提供荧光信号，并通过具有固有解离温度的CCTF与作为互补序列的SCO进行杂交来分析固有解离温度中的荧光信号，并确认CCTF的产生与否，通过这些鉴定靶核酸序列的存在。
如上所述，为了释放CCTF而决定根据使用目的的限制酶的使用浓度，并且与质量分析不同，聚合酶的类型与A拖尾无关。从扩增产物释放并流入到反应液中的CCTF与存在于反应液的SCO进行反应，SCO结构如下。
为了在5’末端方向至3’末端方向上能够与CCTF进行杂交而存在CCTF的互补序列，SCO的序列依赖于CCTF，是由CCTF的长度、序列再组合来决定。在上述步骤(1)中，为了多样化标记的类型而使用如CCTF的长度及序列再组合等的方法，像这样为了赋予CCTF及SCO的固有解离温度而能够以不同的方式设计长度及序列的组合。此时，SCO由CCTF的互补序列构成，在序列中包含荧光物质，而且荧光物质的位置可以存在于与猝灭剂隔开规定长度以上的距离。因在SCO的3’末端具有阻断剂(Blocker)而SCO在反应中起到引物作用，从而防止碱基序列的延伸。作为阻断剂可以使用间隔C3(Spacer C3)、磷脂(Phosphat)、碳酸二月桂酯(ddC)、反转末端(Inverted END)及猝灭剂等，但不仅局限于此。尤其，当在SCO的3’末端上具有猝灭剂时，SCO在反应中起到引物作用，因此防止碱基序列的延伸的同时，在与CCTF进行杂交来形成双链之前由FRET现象而具有控制荧光物质的发光的功能。通过将猝灭剂作为防止碱基序列的延伸的物质来混合使用，来减少制备SCO时的不必要的改性(modification)反应，从而能够提高制备反应的收率，进一步能够节约制备成本。利用反应中包含的SCO与反应中产生的CCTF之间的杂交来在特定温度上用荧光确认并分析是否能够观察到杂交的双链的解离，从而确认由靶序列引起的CCTF的产生与否，并利用这些能够坚定靶序列。可以指定为上述SCO的固有解离温度的温度范围在～95℃，若不存在各个双链的解离温度的干扰，则在指定每个荧光物质的固有解离温度时不受数量限制。
SCO的荧光物质和猝灭剂的组合可以为Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 540Q、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTOThio12、ATTO 580Q、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO Rho13、ATTO 594、ATTO 610、ATTO 612Q、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、ATTOMB2、AMCA、AMCA-S、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPYTMR、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPYTR、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、Biosearch Blue、CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Pulsar 650、Quasar570、Quasar 670、Quasar 705.FAM、荧光素(Fluorescein)、荧光素C3(Fluorescein-C3)、钙黄绿素(Calcein)、羧基罗丹明6G(Carboxyrhodamine 6G)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-X-rhodamine，ROX)、Cascade Blue、Cascade Yellow、Cy2、Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5、Cy7、丹酰(Dansyl)、Dapoxyl、Dialkylaminocoumarin、4',5'-Dichloro-2',7'-dimethoxy-fluorescein、DM-NERF、Eosin、Erythrosin、HEX、Hydroxycoumarin、IRD40、IRD 700、IRD800、JOE、Lissamine rhodamine B、LC Red 610、LC Red 640、Marina Blue、Methoxycoumarin、Naphthofluorescein、NED、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、海水蓝(Pacific Blue)、PyMPO、嵌二萘(Pyrene)、藻红蛋白(Phycoerythrin)、罗丹明6G(Rhodamine 6G)、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红(Rhodamine Red)、Rhodol Green、2',4',5',7'-Tetra-bromosulfonefluorescein、四甲基罗达明(Tetramethyl-rhodamine，TMR)、羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、德克萨斯红(Texas Red)、Texas Red-X.TET、VIC、Yakima Yellow、BMN-Q460、DDQ-I、Dabcyl、BMN-Q530、BMN-Q535、Eclipse、Iowa BlackFQ、BHQ-1、TQ2、IQ4、QSY-7、BHQ-2、TQ3、DDQ-II、BBQ-650、Iowa Black RQ、QSY-21、BHQ-3等，不局限于上述列表，可以包含任何荧光物质和猝灭剂。
并且，SCO与CCTF之间的反应与扩增反应及CCTF形成反应同时进行，并通过利用SCO的双链形成比率显示与靶序列的扩增量相似的效率的事实，来能够制作具有固有解离温度的SCO的Ct图表，并利用这些用固有解离温度分析方法和其他方法来鉴定靶序列的鉴定。
通过本发明的实施例，将更详细地描述由本发明的解决方案创建的上述内容作为最优选的实施例。
有益效果
在本发明中，在扩增反应中由限制酶来产生和切割任意标记(CCTF)，因此为了形成标记而添加的随机序列(CTPO)在进行扩增反应之前不形成限制酶识别序列的双链，由此不可能随机切割，由于标记仅由聚合酶链反应期间在靶序列中特异性产生的反应产物来产生，因此在形成CCTF时准确度高，并与依赖于聚合酶链反应的扩增产物的长度或特定序列的特异性的以往聚合酶链反应结果的分析方法相比，可获得精确的分析结果，而且即使以相同长度来生产各种类型的扩增产物，也能够特异性地区分并分析扩增产物。并且，利用这种方法来产生的CCTF的解释也可大部分应用于使用碱基序列的分析法，因此可以广泛地选择并适用用于解释的装置。尤其，这些可适用于需要利用扩增反应的迅速多重分析的诊断等的领域中。
附图说明
图1为形成CCTF的示意图，用于说明在聚合酶链式反应中所使用的CTPO及CCTF的产生过程，以及用于分析CCTF的示例的代表图。
图2为示出双靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析结果的图。设计CTPO，使得每个靶序列能够形成各个不同的CCTF，通过扩增反应来用基质辅助激光解吸电离进行分析的结果，扩增淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)并扩增切割的CCTF 1和人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)，来观察到该当切割的CCTF 2的质量的峰值。
图3为示出对性传播疾病的致病因子进行实时荧光定量聚合酶链反应熔融峰(Melting Peak)分析的结果的图。并且作为示出沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhea，NG)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium，MG)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis，TV)、尿素分解支原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)、白念珠菌(Candida albicans，CA)、阴道加德菌(Gardnerella vaginalis，GV)、1-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1，HSV 1)、2-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2，HSV2)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum，TP)及内部控制物质(Internal Control，IC)的每个靶的多重固有解离温度的测定的结果，在各个SCO具有固有解离温度(CT：FAM 80℃、NG：HEX 76.5℃、MH：HEX 68℃、MG：CalRed610 67.5℃、TV：Quasar670 71.5℃、UU：CalRed61077℃、UP：FAM 77℃、CA：FAM 65℃、GV：Quasar670 78.5℃、HSV 1：Quasar705 73.5℃、HSV2：Quasar705 79℃、TP：Quasar705 66℃、IC：Quasar670 63.5℃)中观察到峰值，当在图3的(a)部分、图3的(b)部分、图3的(c)部分、图3的(d)部分、图3的(e)部分、图3的(f)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图3的(g)部分)。
图4为示出对胃肠道疾病致病因子进行实时荧光定量聚合酶链反应熔融峰(Melting Peak)分析的结果的图。并且作为示出甲型轮状病毒(Rotavirus A，RVA)、星状病毒(Astrovirus，AstV)、腺病毒F40(Adenovirus F40，AdV 40)、腺病毒F41(AdenovirusF41，AdV 41)、诺如病毒GⅠ(Norovirus GⅠ，NoV GⅠ)、诺如病毒GⅡ(Norovirus GⅡ，NoV GⅡ)及外部控制物质(External control)的每个靶的多重固有解离温度的结果，并在各个SCO具有的固有解离温度(RVA：HEX 78℃，AstV：CalRed610 78℃，AdV 40：CalRed610 67℃，AdV 41：CalRed610 67℃，NoV GⅠ：FAM 68℃，NoV GⅡ：FAM 84℃，EC：HEX 69℃)中，观察到峰值，当在图4的(a)部分、图4的(b)部分、图4的(c)部分、图4的(d)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图4的(e)部分)。
图5为示出用于检测人乳头瘤病毒的实时荧光定量聚合酶链反应熔融峰(MeltingPeak)分析结果的图。并且作为示出16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型、82型及IC的每个靶的多重固有解离温度的测定的结果，并在各个SCO具有的固有解离温度(16型：HEX 76.5℃、18型：FAM 78℃、33型：Quasar670 71℃、35型：Quasar670 71℃、51型：Quasar670 71℃、53型：Quasar670 71℃、59型：Quasar670 71℃、68型a：Quasar670 71℃、82型：Quasar67071℃、IC：Quasar670 67.5℃)中观察到峰值，当在图5的(a)部分、图5的(b)部分、图5的(c)部分、图5的(d)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图5的(e)部分)。
图6为示出用于检测诱发呼吸道疾病的病毒的实时荧光定量聚合酶链反应熔融峰(Melting Peak)分析的结果图。并且作为示出甲型H1N1流行性感冒(Influenza A/H1N1，H1)、甲型H3N2流行性感冒(Influenza A/H3N2，H3)、流行性感冒A(H1N1)pdm09(InfluenzaA/H1N1/2009pdm，2009pdm)、乙型流行性感冒(Influenza B，Flu B)、副流感病毒1(Parainfluenza 1，PIV 1)、副流感病毒3(Parainfluenza 3，PIV 3)、呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV A)、呼吸道合胞病毒B(Respiratory syncytialvirus B，RSV B)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus，MPV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)、外部控制物质(External control，EC)的每个靶的多重固有解离温度的测定的结果，在各个SCO具有的固有解离温度(H1：FAM 67.5℃、H3：FAM 76.5℃、2009pdm：FAM 86.5℃、Flu B：CalRed610 83.5℃、PIV 1：Quasar670 66℃、PIV 3：Quasar67074℃、RSV A：HEX 63.5℃、RSV B：CalRed610 72℃、MPV：HEX 86℃、ADV：Quasar670 85℃、EC：CalRed610 68.5)中，观察到峰值，当在图6的(a)部分、图6的(b)部分、图6的(c)部分、图6的(d)部分、图6的(e)的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图6的(f)部分)。
图7为示出用于分析脑源性神经营养因子基因的单核苷酸多态性的rs6265的基因型的实时荧光定量聚合酶链反应熔融峰(Melting Peak)分析结果的图。并且作为示出突变型的A/A、野生型的G/G及异型合子的A/G的每个靶的多重固有解离温度的测定的结果，在各个SCO具有的固有解离温度(A/A：76.5℃、A/G：76.5℃以及75℃、G/G75℃、IC：66℃)中，观察到峰值，当在图7的(a)部分、图7的(b)部分、图7的(c)部分、图7的(d)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图7的(e)部分)。
图8为示出实时荧光定量聚合酶链反应的Ct图表的结果的图。并且作为示出在将每个致病菌的基因组DNA(genomic DNA)从100pg/ul的浓度稀释成10倍的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea，NG)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)、微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)的多重实时聚合酶链反应实验条件下显示的SCO的荧光扩增曲线(fluorescent amplification curves)及标准曲线(standard curves)的结果，图8的(a)部分的图表是指当3个靶序列以不同浓度来同时存在时显示的荧光扩增曲线，图8的(b)部分的图表为当均不包含3个靶序列时显示的阴性结果。在图8的(a)部分的图表中对应于淋病奈瑟菌的图表可以用单个荧光扩增曲线来表示，标准曲线可以用图8的(c)部分及图8的(d)部分来表示，属于MG的图表可以用图8的(e)部分及图8的(f)部分来表示，属于UP的曲线可以用图8的(g)部分及图8的(h)部分来表示。
具体实施方式
以下，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于说明本发明，因此不应解释为本发明的范围受这些实施例的限制。
实施例1.双靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析
实施本实验的目的在于，证明能够利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)来分析在用于检测多重靶序列的聚合酶链式反应中形成的CCTF，来能够特异性地检测靶。在本实施例1中，将作为性传播疾病的致病因子的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)及人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)的脱氧核糖核酸作为对象进行了实验。
1.靶模板的脱氧核糖核酸以及特异性地制备序列的的引物
在本实施例中，靶向的淋病奈瑟菌及人型支原体的正向引物为CTPO，是基于发明的详细描述的方法来制备的。正向引物的5’末端能够为由与淋病奈瑟菌及人型支原体的脱氧核糖核酸非互补的序列组成的任意碱基序列，以能够作为CCTF的模板来所使用，而且紧接着位于限制酶识别序列。从限制酶识别序列到3’末端由与淋病奈瑟菌以及人型支原体的脱氧核糖核酸的靶部位互补的序列组成，因此起到引物的作用。并且，正向引物5’末端由各个不同的数量的核苷酸形成，因此每个产生的CCTF具有不同的质量值，其原因在于，当形成CCTF时，可以用质量来区分扩增物。反向引物由与淋病奈瑟菌及人型支原体的脱氧核糖核酸的靶部位互补的序列组成。
引物信息及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物1：5'-TGAACTAT*CCTGGTCCGACGTTTCGGTTGTGTTGAAACACCGCCCGG-3’(SEQ IDNO.1)
引物2：5'-GCTCCTTATTCGGTTTGACCGG-3’(SEQ ID NO.2)
引物3：5'-ATCTATGATA*CCTGGTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTGG-3’(SEQ ID NO.3)
引物4：5'-TGTGTGGAGCATCTTGTAATCTTTGGTC-3’(SEQ ID NO.4)
扩增物1：GenBank:CP012028.1/Position(start-end)：251416-251506
5’TGAACTAT*CCTGGTCCGACGTTTCGGTTGTGTTGAAACACCGCCCGGAACCCGATATAATCCGCCCTTCAACATCAGTGAAAATCTTTTTTTTAACCGGTCAAACCGAATAAGGAGC-3’(SEQ ID NO.5)
扩增物2：GenBank:AJ243692.1/Position(start-end)：835-944
5’ATCTATGATA*CCTGGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTGGAAAAAAACTTTGGTATTGAAAAAGGATTTATGACAACAGTCCACTCATATACAGCAGACCAAAGATTACAAGATGCTCCACACA-3’(SEQ ID NO.6)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线为由此产生的CCTF的互补序列。在本发明的实施例中，用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modified dCTP)的标记。
从扩增物中产生的CCTF的序列及质量如下。
CCTF 1：5'-CCAGGATAGTTCA-3’/4038.6Da(SEQ ID NO.7)
CCTF 2：5'-CCAGGTATCATAGAT-3’/4351.8Da(SEQ ID NO.8)
2.聚合酶链反应扩增
通过加入作为正向引物的引物1、引物3，作为反向引物的引物2、引物4来同时进行聚合酶链式反应，并观察CCTF的形成与否。在如下条件下，利用C1000聚合酶链反应(美国博乐公司(Bio-Rad，USA))来对包含各个3μM的引物、PspGI(NEB，USA)2U、聚合酶链反应缓冲液(PCR buffer，1x)、3mM的MgSO4、400μM的dNTP、Vent聚合酶(Vent Polymerase)(NEB，USA)1U及100pg/ul的NG、MH模板脱氧核糖核酸的、20μl的总反应液进行聚合酶链式反应。
在94℃温度下，进行10分钟；在94℃温度下，进行30秒钟；在62℃温度下，进行30秒钟；在72℃温度下进行30秒钟(循环(cycles)35次)；在85℃温度下，进行2.5小时。
3.聚合酶链式反应中切割的片段的纯化及脱盐
为了聚合酶链式反应中处理成限制酶来将切割的脱氧核糖核酸片段从上述溶液中分离，而利用Oasis(Waters)C18反相柱色谱法(C18reverse phase columnchromatography)。在用上述限制酶来处理的溶液中加入70μl的0.15M的三乙基乙酸铵(TEAA，pH值为7.6)之后放置1分钟。将100％的乙腈(ACN；Sigma，USA)和1ml的0.1M的TEAA注入于柱中来活化树脂(Resin)之后，依次完全通入用上述限制酶来处理的溶液和100μl的0.15M的TEAA的混合液、2ml的0.1M的TEAA及1ml的三级蒸馏水。在收集板(CollectionPlate)的上部放置上述柱，并加入100μl的70％的乙腈之后通入。当洗脱液收集在收集板时，在120℃温度下，对上述收集板进行干燥处理60分钟。
4.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)分析
将4μl的基质辅助激光解吸电离基质(MALDI matrix)(22.8mg的柠檬酸铵、148.5mg的羟基吡啶甲酸(hydroxypicolinic acid)、1.12ml的乙腈、7.8ml的H2O)预先分布(dotting)在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Biflex IV，Bruker)的锚芯片板(Anchor chip plate)上之后，在37℃温度下进行30分钟的干燥处理。在经过纯化过程和脱盐过程的收集板的样品中加入10μl的三级蒸馏水并经过熔解后，在干燥的基质辅助激光解吸电离基质的上部分布2μl，并将基质辅助激光解吸电离基质再次在37℃温度下干燥30分钟之后，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行分析。分析方法遵循基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的手册。
用质量分析仪分析由上述反应产生的CCTF的结果如图2所示。图2的结果，可以确认出，当用引物1和引物2的组合来进行聚合酶链反应时刻形成的CCTF 1的质量的4083Da的峰值以及当用引物3和引物4的组合来进行聚合酶链反应时形成的CCTF 2的质量的4351Da的峰值(图2的(a)部分)。通过这些确认出可以用由CTPO形成的CCTF来分析聚合酶链反应扩增产物，并且证明当在混入有各种引物的反应物中准确扩增并区分靶序列时，也可以适用CCTF。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应，并进行聚合酶链反应之后通过利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)的质量分析法来鉴别各种长度的标记片段，从而证明出与以往的聚合酶链反应方法相比更精确地进行靶核酸序列的检测。
实施例2.多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值分析
通过聚合酶链式反应中产生的CCTF与能够在固有解离温度中产生荧光信号的SCO相结合，来形成固有解离温度峰值，这些可以用实时荧光定量聚合酶链反应仪来进行聚合酶链反应过程之后直接可以观察。在聚合酶链式反应中形成CCTF的同时，与在反应容器中放在一起的SCO的CCTF互补序列部位进行杂交，从而形成双链。通过测定在将此双链解离成单链时显示的SCO的固有解离温度，来可通过实时荧光定量聚合酶链反应仪来与聚合酶链反应同时进行区分和分析CCTF的类型。本实施例中所使用的SCO使用各个不同的荧光报道分子并调节固有解离温度，来可区分CCTF。
在本实施例中，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来对12种性传播疾病的致病因子、5种胃肠道疾病致病因子、9种人乳头瘤病毒亚型、10种呼吸道疾病的致病因子、BDNF基因的单碱基变异rs6265核酸进行CCTF分析。
1.性传播疾病致病因子的多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值分析
利用作为性传播疾病的致病因子的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea，NG)人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium，MG)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis，TV)、尿素分解支原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)、白念珠菌(Candida albicans，CA)、阴道加德菌(Gardnerella vaginalis，GV)、1-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1，HSV 1)、2-型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2，HSV2)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum，TP)及内部控制物质(Internal Control，IC)的脱氧核糖核酸的实时荧光定量聚合酶链反应仪来进行CCTF分析。
1)用靶序列模板脱氧核糖核酸的序列特异性来制备的引物
本实施例中所使用的正向引物为CTPO，用与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的脱氧核糖核酸非互补的序列组成，以能够形成CCT。之后，存在限制酶识别序列，之后到3’末端位置由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物与各个需要扩增的靶部位互补的序列组成。
而且，通过形成与CCTF互补的结合来成为双链的模板的SCO放置3’末端的荧光抵消分子(BHQ-1或BHQ-2)，并且以具有规定距离的方式放置荧光报道分子。
引物信息以及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物5：
5'-CCACTCCAGCCGGCTGACA*CCAGGACTTGGTGTGACGCTATCAGCAT-3’(SEQ ID NO.9)
引物6：
5'-GTTTTCAAAACACGGTCGAAAACAAAGTC-3’(SEQ ID NO.10)
引物7：
5'-CATCGCCACGAGCCGGTTAA*CCAGGTTGAAACACCGCCCGGAACCC-3’(SEQ ID NO.11)
引物8：
5'-GCTCCTTATTCGGTTTGACCGGT-3’(SEQ ID NO.12)
引物9：
5'-ACTCACGCTAATGGAGCGCA*CCAGGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTGG-3’(SEQ IDNO.13)
引物10：
5'-TGTGTGGAGCATCTTGTAATCTTTGGTC-3’(SEQ ID NO.14)
引物11：
5'-GCTACCCAGCCGGCTACAAG*CCAGGCTTTATGGTGCTTATATTGGTGGCATG-3’(SEQ IDNO.15)
引物12：
5'-CTGTATAACGTTGTGCAGCAGGTC-3’(SEQ ID NO.16)
引物13：
5'-TGCCGCGTGATTCGATCCCA*CCAGGTATGTCCGGCACAACATGCGCT-3’(SEQ ID NO.17)
引物14：
5'-GAGCTTACGAAGGTCGGAGTTGA-3’(SEQ ID NO.18)
引物15：
5'-TCTCATAGCTGGGCCGCTG*CCAGGAAGTAGCATATGATGAAGCACACAACA-3’(SEQ IDNO.19)
引物16：
5'-TAATGCAACGTGCATTTGCTTCAAC-3’(SEQ ID NO.20)
引物17：
5'-CAGATCGTTGGCACTCTGCGA*CCAGGTTAAAGTAGCATATGATCAAGCTCATTCA-3’(SEQ IDNO.21)
引物18：
5'-TTGTAATGATACAACGAGCATCATCATTAAT-3’(SEQ ID NO.22)
引物19：
5'-GCTCGTATGCCGCTCCATATA*CCAGGCCAAATCTGGATCTTCCTCTGCATC-3’(SEQ IDNO.23)
引物20：
5'-GAGCTTGAGCTGGACCCAGAG-3’(SEQ ID NO.24)
引物21：
5'-ACGTGCCGTGCATCGTTGCA*CCAGGCAACCGGCTCCATTTTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO.25)
引物22：
5'-CGTCACGTCCTTCATCGGTCC-3’(SEQ ID NO.26)
引物23：
5'-TCGCAGTCCCGTCGAGGAA*CCAGGAGGCCTGGCTATCCGGAGAAAC-3’(SEQ ID NO.27)
引物24：
5'-CGTTGTGTTGGCCGCAGGTC-3’(SEQ ID NO.28)
引物25：
5'-CTCATAGCTAGGCGCCTG*CCAGGGCTGCACGTGGGTCTGTTGTG-3’(SEQ ID NO.29)
引物26：
5'-GGAAACGCAGGCCACGAAACC-3’(SEQ ID NO.30)
引物27：
5'-GCTTCGCGTCTCAGGCCTGT*CCAGGGGGCATTACAGTTTTGCGTCATGAC-3’(SEQ IDNO.31)
引物28：
5'-CAAGTCTGAGCACTTGCACCG-3’(SEQ ID NO.32)
引物29：
5'-CTGTTAGCTCTGCGAGCT*CCAGGGGAGCGACACTTGTTGGTGTTGAC-3’(SEQ ID NO.33)
引物30：
5'-TGATGAAATGAAGCCACCCGTGC-3’(SEQ ID NO.34)
SCO 1：
TCGGAGCCAGCGCGGCGTAAAC[T(FAM)]CCACTCCAGCCGGCTGACA[BHQ1](SEQ ID NO.35)
SCO 2：
TACAACAGCAGTACGGAGACGAC[T(HEX)]CATCGCCACGAGCCGGTTAA[BHQ1](SEQ IDNO.36)
SCO 3：
ATTTATTCTTACTCGATGTTAAA[T(HEX)]ACTCACGCTAATGGAGCGCA[BHQ1](SEQ IDNO.37)
SCO 4：
TATATATATATATTATTATAAA[T(CalRed610)]GCTACCCAGCCGGCTACAAG[BHQ2](SEQ IDNO.38)
SCO 5：
AAGAATAACTACTACAATCTACT[T(Quasar670)]TGCCGCGTGATTCGATCCCA[BHQ2](SEQID NO.39)
SCO 6：
TTATTATTATTATTATTATATA[T(CalRed610)]TCTCATAGCTGGGCCGCTG[BHQ2](SEQ IDNO.40)
SCO 7：
AATCTTCAATGCTTACCGTA[T(FAM)]CAGATCGTTGGCACTCTGCGA[BHQ1](SEQ ID NO.41)
SCO 8：
AAAATAAATAATATAATATA[T(FAM)]GCTCGTATGCCGCTCCATATA[BHQ1](SEQ ID NO.42)
SCO 9：
TCGGAGCCAGCGCGGCGTAACG[T(Quasar670)]ACGTGCCGTGCATCGTTGCA[BHQ2](SEQ IDNO.43)
SCO 10：
AAGAATAACTACTACAATCTAC[T(Quasar705)]TTCGCAGTCCCGTCGAGGAA[BHQ2](SEQ IDNO.44)
SCO 11：
TCGGAGCCAGCGCGGCGTAA[T(Quasar705)]CTCTCATAGCTAGGCGCCTG[BHQ2](SEQ IDNO.45)
SCO 12：
AAAATAAATAATATAATATAG[T(Quasar705)]CTTCGCGTCTCAGGCCTGT[BHQ2](SEQ IDNO.46)
SCO 13：
AAAATAAATAATATAATATA[T(Quasar670)]TCTGTTAGCTCTGCGAGCT[BHQ2](SEQ IDNO.47)
扩增物3：GenBank：X52557.1/Position(start-end)：157-227
CCACTCCAGCCGGCTGACA*CCAGGACTTGGTGTGACGCTATCAGCATGCGTATGGGTTACTATGGTGACTTTGTTTTCGACCGTGTTTTGAAAAC(SEQ ID NO.48)
扩增物4：GenBank：X52364.1/Position(start-end)：375-459
CGCCCACCGCATCCCGCGCCCCTCCCTCAGCA*CCAGGTTGAAACACCGCCCGGAACCCGATATAATCCGCCCTTCAACATCAGTGAAAATCTTTTTTTAACCGGTCAAACCGAATAAGGAGC(SEQ ID NO.49)
扩增物5：GenBank：AJ243692.1/Position(start-end)：835-944
ACTCACGCTAATGGAGCGCA*CCAGGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTGGAAAAAAACTTTGGTATTGAAAAAGGATTTATGACAACAGTCCACTCATATACAGCAGACCAAAGATTACAAGATGCTCCACACA(SEQ ID NO.50)
扩增物6：GenBank：U09251.1/Position(start-end)：3462-3687
GCTACCCAGCCGGCTACAAG*CCAGGCTTTATGGTGCTTATATTGGTGGCATGCACCATGATCGTCCTTTTAAAAAGTCTGCGAGGATTGTTGGTGATGTAATGAGTAAATTCCACCCTCATGGTGATATGGCAATATATGACACCATGTCAAGAATGGCTCAAGACTTTTCATTAAGATACCTTTTAATTGATGGTCATGGTAATTTTGGTTCTATAGATGGTGATAGACCTGCTGCACAACGTTATACAG(SEQ ID NO.51)
扩增物7：GenBank：XM_001582993.1/Position(start-end)：705-768
TGCCGCGTGATTCGATCCCA*CCAGGTATGTCCGGCACAACATGCGCTTATGTCCGGCACAACATGCGCTCTCCGCTTCCCAGGTCAGCTCAACTCCGACCTTCGTAAGCTC(SEQ ID NO.52)
扩增物8：GenBank：AF085700.2/Position(start-end)：4673-4873
TCTCATAGCTGGGCCGCTG*CCAGGAAGTAGCATATGATGAAGCACACAACAAAATGGCGCATACTGTGTATTTCACTAATTTCTATCGTTCATCAAAACCACTATTTTTAGATGAAGAAGACCCAATTAATCCCTGTTTTCAAACTATTAGTATGGGTGGGGGTTATGTATCTGGTGAAGTGTATCGTTCTGATTTTGAAGTTGAAGCAAATGCACGTTGCATTA(SEQ ID NO.53)
扩增物9：GenBank：AF085733.2/Position(start-end)：4677-4886
CAGATCGTTGGCACTCTGCGA*CCAGGTTAAAGTAGCATATGATCAAGCTCATTCAAAAATGGCACATACTGTCTATTTTACGAATTTTTATCGTTCATCTAAACCTTTATTTTTAGATGAAGAAGATCCAATCAACCCCTGTTTTCAAACAATTAGTATGGGTGGTGGATATGTTTCAGGTGAAATTTATCGTTCTGATTTTGAAATTAATGATGATGCTCGTTGTATCATTACAA(SEQ ID NO.54)
扩增物10：GenBank：M90812.1/Position(start-end)：1736-1811
GCTCGTATGCCGCTCCATATA*CCAGGCCAAATCTGGATCTTCCTCTGCATCTGCTTCTGGATCATCAAGCAGCAGCACCAGCTCTGGGTCCAGCTCAAGCTC(SEQ ID NO.55)
扩增物11：GenBank：L08167.1/Position(start-end)：273-434
ACGTGCCGTGCATCGTTGCA*CCAGGCAACCGGCTCCATTTTGGTGGAGTCGCTTGATCGTTTTGTGATCGTTTAGTGTGATGATTTATTATGTCTAGAGAGTTAAGCGATAGGCTTTTACTGGTGTATCACTGTAAGGGCGTATTGGTTGGATGCCTTGGTAGACAGGACCGATGAAGGACGTGACG(SEQ ID NO.56)
扩增物12：DQ889502.1/Position(start-end)：123860-124007
TCGCAGTCCCGTCGAGGAA*CCAGGAGGCCTGGCTATCCGGAGAAACAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGTGTCGCGATGTCTCTGCGCGCAGTCTGGCATCTGGGGCTTTTGGGAAGCCTCGTGGGGGCTGTTCTTGCCGCCACCCATCGGGGACCTGCGGCCAACACAACG(SEQ ID NO.57)
扩增物13：GenBank：EU018100.1/Position(start-end)：561-746
CTCATAGCTAGGCGCCTG*CCAGGGCTGCACGTGGGTCTGTTGTGGGTAGAGGTGGGCGGGGAGGGCCCCGGCCCCACCGCCCCCCCCACAGGCGGCGCGTGCGGAGGGCGGCCCGTGCGTCCCCCCGGTCCCCGCGGGCCGCCCGTGGCGCTCGGTGCCCCCGGTATGGTATTCCGCCCCCAACCCCGGGTTTCGTGGCCTGCGTTTCC(SEQ ID NO.58)
扩增物14：GenBank：U57757.1/Position(start-end)：910-1067
GCTTCGCGTCTCAGGCCTGT*CCAGGGGGCATTACAGTTTTGCGTCATGACGGCTTTGAAGCTGACGACCTCATTGCAACCCTAGCAAAACGAGTTGCGGCTGAGCACTGTCATGTTGTGATTATCTCCTCAGATAAAGATGTACTTCAGCTTGTGTGTGATACGGTGCAAGTGCTCAGACTTG(SEQ ID NO.59)
扩增物15：GenBank：NM_001035551.2/Position(start-end)：214-369
CTGTTAGCTCTGCGAGCT*CCAGGGGAGCGACACTTGTTGGTGTTGACAAGTTCGGTAACAAATACTACCAGAAGCTAGGCGATACTCAATACGGTATGCACAGATGGGTAGAGTATGCTTCAAAGGATCGTTACAACGCATCTCAAGTACCAGCTGAATGGCACGGGTGGCTTCATTTCATCA(SEQ ID NO.60)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线为由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modifieddCTP)的标记。在SCO中，括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 3：5'-CCTGGTGTCAGCCGGCTGGAGTGG-3’(SEQ ID NO.61)
CCTF 4：5'-CCTGGTTAACCGGCTCGTGGCGATG-3’(SEQ ID NO.62)
CCTF 5：5'-CCTGGTGCGCTCCATTAGCGTGAGT-3’(SEQ ID NO.63)
CCTF 6：5'-CCTGGCTTGTAGCCGGCTGGGTAGC-3’(SEQ ID NO.64)
CCTF 7：5'-CCTGGTGGGATCGAATCACGCGGCA-3’(SEQ ID NO.65)
CCTF 8：5'-CCTGGCAGCGGCCCAGCTATGAGA-3’(SEQ ID NO.66)
CCTF 9：5'-CCTGGTCGCAGAGTGCCAACGATCTG-3’(SEQ ID NO.67)
CCTF 10：5'-CCTGGTATATGGAGCGGCATACGAGC-3’(SEQ ID NO.68)
CCTF 11：5'-CCTGGTGCAACGATGCACGGCACGT-3’(SEQ ID NO.69)
CCTF 12：5'-CCTGGTTCCTCGACGGGACTGCGA-3’(SEQ ID NO.70)
CCTF 13：5'-CCTGGCAGGCGCCTAGCTATGAG-3’(SEQ ID NO.71)
CCTF 14：5'-CCTGGACAGGCCTGAGACGCGAAGC-3’(SEQ ID NO.72)
CCTF 15：5'-CCTGGAGCTCGCAGAGCTAACAG-3’(SEQ ID NO.73)
2)聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度的测定
利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-Rad，USA)来对添加有各个引物5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和SCO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13各0.15μM、PspGI(NEB，USA)5U、聚合酶链反应缓冲液(PCRbuffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、h-Taq脱氧核糖核酸聚合酶(DNApolymerase)(Solgent，Korea)1.6U及CT、NG、MH、MG、TV、UU、UP、CA、GV、HSV1、HSV2、TP及IC的100pg/rxn的基因组DNA的模板DNA(template DNA)的20μl的总反应液进行下一个聚合酶链式反应。
在95℃温度下进行15分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在63℃温度下进行1分钟(循环50次)，在95℃的变性温度下进行15分钟并进行1次，在95℃的变性温度下进行30秒钟，在63℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。在反应之后，在相同的仪器中将反应混合物冷却至50℃，在50℃温度下保持30秒钟后，在50℃温度下逐渐加热至95℃，从而获得固有解离温度分析曲线。利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。
图3的(a)部分为示出CT、NG、MH、MG、TV、UU、UP、CA、GV、HSV1、HSV2、TP、IC的每个致病菌的多重固有解离温度的测定结果的图，在具有各个SCO的固有解离温度(CT：FAM 80℃，NG：HEX 76.5℃，MH：HEX 68℃，MG：CalRed610 67.5℃，TV：Quasar670 71.5℃，UU：CalRed610 77℃，UP：FAM 77℃，CA：FAM 65℃，GV：Quasar670 78.5℃，HSV 1：Quasar70573.5℃，HSV 2：Quasar705 79℃，TP：Quasar705 66℃，IC：Quasar670 63.5℃)中观察到峰值，当在图3的(a)部分、图3的(b)部分、图3的(c)部分、图3的(d)部分、图3的(e)部分、图3的(f)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图3的(g)部分)。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应的同时，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来分析SCO的荧光，来证明了与以往的聚合酶链反应方式相比能够更迅速简单地检测出靶核酸序列的检测。
2.胃肠道疾病致病因子的多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值的分析
利用作为胃肠道疾病的致病因子的甲型轮状病毒(Rotavirus A，RVA)、星状病毒(Astrovirus，AstV)、腺病毒F40(Adenovirus F40，AdV 40)、腺病毒F41(Adenovirus F41，AdV 41)、诺如病毒GⅠ(Norovirus GⅠ，NoV GⅠ)、诺如病毒GⅡ(Norovirus GⅡ，NoV GⅡ)及外部控制物质(External control，EC)的DNA的实时荧光定量聚合酶链反应仪来进行CCTF的分析。
1)靶序列模板DNA的序列的特异性来制备的引物
在本实施例中所使用的正向引物为CTPO，与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的DNA非互补的序列组成，以能够形成CCTF。之后，设置限制酶识别序列，之后到3’末端由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物由与各个所需的靶部位互补的序列组成。
而且，通过形成与CCTF互补的结合来将成为双链的模板的SCO放置3’末端的荧光抵消分子(BHQ-1或BHQ-2)，并且以隔开规定距离的方式放置荧光报道分子。
引物信息及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物31：
5'-GCAGGAGCCTCTCATCTCG*CCAGGCTCATTTATAGACARCTTCTCACTAATTC-3’(SEQ IDNO.74)
引物32：
5'-AGTTTTTTCTGATCCAATYTGYTCTATTTC-3’(SEQ ID NO.75)
引物33：
5'-TCAGACGGTTCGAGGCTCC*CCAGGARGATYAAGCGTGGAGTATAYATGG-3’(SEQ IDNO.76)
引物34：
5'-TTTGCGTGCYTCTTCACACGC-3’(SEQ ID NO.77)
引物35：
5'-AACGCGAATCGACCGGAT*CCAGGCGCGATGTGTTTGCCGATAAAAC-3’(SEQ ID NO.78)
引物37：
5'-CATTGCGTCTGCCCCACTTG-3’(SEQ ID NO.79)
引物38：
5'-AACGCGAATCGACCGGAT*CCAGGAAACAAGAACACCTATGCCTACATGAAC-3’(SEQ IDNO.80)
引物39：
5'-ATGTTAACGTCCTTCCTGAAGTTCCAC-3(SEQ ID NO.81)
引物40：5'-TAGATCGGACTGCGAATCG*CCAGGGAGATCGCRATCTYCTGCCCGA-3(SEQ IDNO.82)
引物41：
5'-RGCGTCCTTAGACGCCATCATC-3(SEQ ID NO.83)
引物42：
5'-ATCTACAGCGTCGCATCACG*CCAGGCGCAATCTGGCTCCCARTTTTGTG-3(SEQ ID NO.84)
引物43：
5'-GCGTCAYTCGACGCCATCYTCA-3(SEQ ID NO.85)
引物44：
5'-CATAGGTCGAGGTCCTCAC*CCAGGGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACG-3(SEQ IDNO.86)
引物45：
5'-AAGCGGTGATCCGCACAGTG-3(SEQ ID NO.87)
SCO 14：
TCGGCCGATCGTCCATAGAGTCAAGC[T(HEX)]CGCAGGAGCCTCTCATCTCG[BHQ1](SEQ IDNO.88)
SCO 15：
TCACGATGAGCGAGTTGAGCTACG[T(Calred610]ATCAGACGGTTCGAGGCTCC[BHQ2](SEQID NO.89)
SCO 16：
TGTTCAATATATAATGATAATATG[T(Calred610)]AACGCGAATCGACCGGAT[BHQ2](SEQ IDNO.90)
SCO 17：TGTTCAATATATAATGATAATATG[T(Calred610)]AACGCGAATCGACCGGAT[BHQ2](SEQ ID NO.91)
SCO 18：
ACATTTATAATACAGTATTTTA[T(FAM)]TAGATCGGACTGCGAATCG[BHQ1](SEQ ID NO.92)
SCO 19：
AGCTCCTGCCAGTACTGCCATCCA[T(FAM)]ATCTACAGCGTCGCATCACG[BHQ1](SEQ IDNO.93)
SCO 20：
TAGTTATAATGAATAACTATTAT[T(HEX)]CATAGGTCGAGGTCCTCAC[BHQ1](SEQ IDNO.94)
扩增物16：
GenBank：KT694942.1/Position(start-end)：19-99
GCAGGAGCCTCTCATCTCG*CCAGGCTCATTTATAGACARCTTCTCACTAATTCATATTCAGTAGATTTACATGATGAAATAGARCARATTGGATCAGAAAAAACT(SEQ ID NO.95)
扩增物17：GenBank：AB000287.1/Position(start-end)：2232-2321
TCAGACGGTTCGAGGCTCC*CCAGGARGATYAAGCGTGGAGTATAYATGGACCTGCTTGTCTCGGGGGCAAGCCCAGGCAATGCATGGTCCCATGCGTGTGAAGARGCACGCAAA(SEQ ID NO.96)
扩增物18：GenBank：KM274923.1/Position(start-end)：121-179
AACGCGAATCGACCGGAT*CCAGGCGCGATGTGTTTGCCGATAAAACGTACCAACCGGAGCCCCAAGTGGGGCAGACGCAATG(SEQ IDNO.97)
扩增物19：GenBank：AB330122.1/Position(start-end)：1407-1691
AACGCGAATCGACCGGAT*CCAGGAAACAAGAACACCTATGCCTACATGAACGGTCGGGTGGCGGTTCCTAGCGCCCTCGATACCTACGTAAACATCGGGGCACGGTGGTCTCCAGATCCCATGGACAATGTTAACCCCTTCAATCACCACCGTAACGCCGGTCTGCGCTATCGATCCATGCTCTTGGGCAACGGGCGTTACGTACCCTTCCACATTCAAGTCCCCCAGAAGTTTTTTGCCATTAAAAATCTCCTCCTCTTACCGGGTTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGACGTTAACAT(SEQ ID NO.98)
扩增物20：GenBank：LN854564.1/Position(start-end)：5325-5378
TAGATCGGACTGCGAATCG*CCAGGGAGATCGCRATCTYCTGCCCGAATTCGTAAATGATGATGGCGTCTAAGGACGCY(SEQ ID NO.99)
扩增物21：GenBank：KT202798.1/Position(start-end)：5060-5107
ATCTACAGCGTCGCATCACG*CCAGGCGCAATCTGGCTCCCARTTTTGTGAATGARGATGGCGTCGARTGACGC(SEQ ID NO.100)
扩增物22：GenBank：EF204940.1/Position(start-end)：1707-1878
CATAGGTCGAGGTCCTCAC*CCAGGGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGACAACAAAGAAGTTCAACTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTCGAAATTTACCAATCAATTGCTTCTGTCGCTACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTG(SEQ ID NO.101)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线为由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modified dCTP)的标记。在SCO中括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 16：5'-CCTGGTGTCAGCCGGCTGGAGTGG-3’(SEQ ID NO.102)
CCTF 17：5'-CCTGGTTAACCGGCTCGTGGCGATG-3’(SEQ ID NO.103)
CCTF 18：5'-CCTGGTGCGCTCCATTAGCGTGAGT-3’(SEQ ID NO.104)
CCTF 19：5'-CCTGGCTTGTAGCCGGCTGGGTAGC-3’(SEQ ID NO.105)
CCTF 20：5'-CCTGGTGGGATCGAATCACGCGGCA-3’(SEQ ID NO.106)
CCTF 21：5'-CCTGGCAGCGGCCCAGCTATGAGA-3’(SEQ ID NO.107)
CCTF 22：5'-CCTGGTCGCAGAGTGCCAACGATCTG-3’(SEQ ID NO.108)
CCTF 23：5'-CCTGGTATATGGAGCGGCATACGAGC-3’(SEQ ID NO.109)
CCTF 24：5'-CCTGGTGCAACGATGCACGGCACGT-3’(SEQ ID NO.110)
CCTF 25：5'-CCTGGTTCCTCGACGGGACTGCGA-3’(SEQ ID NO.111)
CCTF 26：5'-CCTGGCAGGCGCCTAGCTATGAG-3’(SEQ ID NO.112)
CCTF 27：5'-CCTGGACAGGCCTGAGACGCGAAGC-3’(SEQ ID NO.113)
CCTF 28：5'-CCTGGAGCTCGCAGAGCTAACAG-3’(SEQ ID NO.114)
2)聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度的测定
利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-Rad，USA)来对添加有各个引物31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45和SCO14、15、16、17、18、19、20各0.15μM、PspGI(NEB，USA)1U、聚合酶链反应缓冲液(PCR buffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、0.1mM的DTT、RNase Inhibitor 1U、SuperiorScript III(Enzynomics，Korea)1U及RVA、stV、AdV 40、AdV41、NoV GⅠ、NoV GⅡ及EC(MS2phage)的基因组RNA 1×10^4pg/rxn的核酸的、20μl的总反应液进行下一个聚合酶链式反应。
在55℃温度下进行20分钟，在95℃温度下进行10分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在63℃温度下进行1分钟(循环50次)，在逆转录的55℃反应温度下，进行20分钟实施一次及在95℃的变性温度下进行10分钟实施一次，在95℃的变性温度下进行30秒钟，在63℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。在反应之后，在相同的仪器中将反应混合物冷却至50℃，在50℃温度下保持30秒钟后，在50℃温度下逐渐加热至95℃，从而获得固有解离温度分析曲线。利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。
图4为示出RVA、AstV、AdV 40、AdV 41、NoV GⅠ、NoV GⅡ的每个致病菌的多重固有解离温度的测定结果的图，在具有各个SCO的固有解离温度(RVA：HEX 78℃、AstV：CalRed610 78℃、AdV 40：CalRed610 67℃、AdV 41：CalRed610 67℃、NoV GⅠ：FAM 68℃、NoV GⅡ：FAM 84℃、EC：HEX 69℃)中观察到峰值，当在图4的(a)部分、图4的(b)部分、图4的(c)部分、图4的(d)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图4的(e)部分)。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应的同时，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来分析SCO的荧光，来证明了与以往的聚合酶链反应方式相比能够更迅速简单地检测出靶核酸序列的检测。
3.用于检测人乳头瘤病毒的多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值的分析
利用作为人乳头瘤病毒(HPV，Human Papillomavirus)的亚型的16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型、82型及内部控制物质(Internal Control，IC)的DNA来对利用实时荧光定量聚合酶链反应仪的CCTF进行分析。
1)靶序列模板DNA的序列的特异性来制备的引物
本实施例中所使用的正向引物为CTPO，用与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的脱氧核糖核酸非互补的序列组成，以能够形成CCT。之后，存在限制酶识别序列，之后到3’末端位置由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物与各个需要扩增的靶部位互补的序列组成。
而且，通过形成与CCTF互补的结合来成为双链的模板的SCO放置3’末端的荧光抵消分子(BHQ-1或BHQ-2)，并且以具有规定距离的方式放置荧光报道分子。
引物信息以及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物46：
5'-CTCTGATAGCGACTGCTCGCA*CCAGGATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGG-3’(SEQ IDNO.115)
引物47：
5'-CTCCATGCATGATTACAGCTGGGTT-3’(SEQ ID NO.116)
引物48：
5'-ATCGGTCTCCTGAAAGCTGCG*CCAGGCAGAAGGTACAGACGGGGAGGGC-3’(SEQ IDNO.117)
引物49：
5'-CACCTCCAGCCGCTCCCCTAAT-3’(SEQ ID NO.118)
引物50：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGCAACGATAACCGACCACCACAAGCA-3’(SEQ IDNO.119)
引物51：
5'-CGGGGTCTGCACAGAACAGCTTT-3’(SEQ ID NO.120)
引物52：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGAGGACCCAGCTGAACGACCTTACAA-3’(SEQ IDNO.121)
引物53：
5'-CTGTCCACCGTCCACCGATGTTATG-3’(SEQ ID NO.122)
引物54：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGGCTGGCAACGTACACGACAACG-3’(SEQ IDNO.123)
引物55：
5'-GCTGTACAACGCGAAGGGTGTC-3’(SEQ ID NO.124)
引物56：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGTCCACCTATGCACCGAAACCTCCAA-3’(SEQ IDNO.125)
引物57：
5'-TGCAGTGACGAGTCCCCGTGTAGTA-3’(SEQ ID NO.126)
引物58：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGGACTGTACACCGTATGCAGCGTG-3’(SEQ IDNO.127)
引物59：
5'-GCGTATCAGCAGCTCATGTAA-3’(SEQ ID NO.128)
引物60：
5'-CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGACAAACTCGACGTCGTCTCGGAA-3’(SEQ IDNO.129)
引物61：
5'-CAGGTCACCACAACAAAGGCTCCGT-3’(SEQ ID NO.130)
引物62：
5'-ATCAGGACGCAGCCGGTTCT*CCAGGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATC-3’(SEQ IDNO.131)
引物63：
5'-GGTGCCCTTGAGGTTGTCCAGGTG-3’(SEQ ID NO.132)
SCO21：
GAGACGTTTAAGTCCGCGACCGCTC[T(HEX)]CTGATAGCGACTGCTCGCA[BHQ 1](SEQ IDNO.133)
SCO22：
CAGGCGACGTCCATATGGTGCGCTA[T(FAM)]CGGTCTCCTGAAAGCTGCG[BHQ 1](SEQ IDNO.134)
SCO23：
CCCTTAGGTAACGTCTGGC[T(Qusar670)]GGCGTAGAGCACTTACGCT[BHQ 2](SEQ IDNO.135)
SCO24：
AAACTTTAATTATTGTATA[T(FAM)]CAGGACGCAGCCGGTTCT[BHQ 1](SEQ ID NO.136)
扩增物23：GenBank：LC193821.1/Position(start-end)：480-571
CTCTGATAGCGACTGCTCGCA*CCAGGATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAATCATGCATGGAG(SEQ ID NO.137)
扩增物24：GenBank：KC470209.1/Position(start-end)：538-747
ATCGGTCTCCTGAAAGCTGCG*CCAGGCACGACAGGAACGACTCCAACGACGCAGAGAAACACAAGTATAATATTAAGTATGCATGGACCTAAGGCAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCTTCTATGTCACGAGCAATTAAGCGACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAGTTAATCATCAACATTTACCAGCCCGACG(SEQ ID NO.138)
扩增物25：GenBank：KU298894.1/Position(start-end)：535-860
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGACGCCATGAGAGGACACAAGCCAACGTTAAAGGAATATGTTTTAGATTTATATCCTGAACCAACTGACCTATACTGCTATGAGCAATTAAGTGACAGCTCAGATGAGGATGAAGGCTTGGACCGGCCAGATGGACAAGCACAACCAGCCACAGCTGATTACTACATTGTAACCTGTTGTCACACTTGTAACACCACAGTTCGTTTATGTGTCAACAGTACAGCAAGTGACCTACGAACCATACAGCAACTACTTATGGGCACAGTGAATATTGTGTGCCCTACCTGTGCACAACAATAAACATCATCTACAATGGCCGATCCTGAA(SEQ ID NO.139)
扩增物26：GenBank：M74117.1/Position(start-end)：117-509
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGAGGACCCAGCTGAACGACCTTACAAACTGCATGATTTGTGCAACGAGGTAGAAGAAAGCATCCATGAAATTTGTTTGAATTGTGTATACTGCAAACAAGAATTACAGCGGAGTGAGGTATATGACTTTGCATGCTATGATTTGTGTATAGTATATAGAGAAGGCCAGCCATATGGAGTATGCATGAAATGTTTAAAATTTTATTCAAAAATAAGTGAATATAGATGGTATAGATATAGTGTGTATGGAGAAACGTTAGAAAAACAATGCAACAAACAGTTATGTCATTTATTAATTAGGTGTATTACATGTCAAAAACCGCTGTGTCCAGTTGAAAAGCAAAGACATTTAGAAGAAAAAAAACGATTCCATAACATCGGTGGACGGTGGACAG(SEQ ID NO.140)
扩增物27：GenBank：KU298905.1/Position(start-end)：512-812
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGGCTGGCAACGTACACGACAACGTAACGAAACCCAAGTGTAATAAAGCCATGCGTGGTAATGTACCACAATTAAAAGATGTAGTATTGCATTTAACACCACAGACTGAAATTGACTTGCAATGCTACGAGCAATTTGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAGTAGATAATATGCGTGACCAGCTACCAGAAAGACGGGCTGGACAGGCTACGTGTTACAGAATTGAAGCTCCGTGTTGCAGGTGTTCAAGTGTAGTACAACTGGCAGTGGAAAGCAGTGGAGACACCCTTCGCGTTGTACAGC(SEQ ID NO.141)
扩增物28：GenBank：KU298906.1/Position(start-end)：3374-3558
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGTCCACCTATGCACCGAAACCTCCAAGACCTCCGCATTGTCCGTGGGTGCCAAAGACACACACCTACAACCACCACAGAAACGACGACGACCAGACGTCACAGACTCCAGAAACACCAAGTACCCCAACAACCTTTTGCGGGGACAACAATCCGTGGACAGTACTACACGGGGACTCGTCACTGCA(SEQ ID NO.142)
扩增物29：GenBank：KU298922.1/Position(start-end)：226-366
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGGTTAAGACCGAAAACGGTGCATATAAAGGTAGTTAGAAAGAAAAGGGCAACGGCATGGCACGCTTTGAGGATCCTACACAACGACCATACAAACTGCCTGACTTGAGCACAACATTGAATATTCCTCTGCATGATATTCGC(SEQ IDNO.143)
扩增物30：GenBank：KC470271.1/Position(start-end)：3389-3541
CTGGCGTAGAGCACTTACGCT*CCAGGATGGCGCTATTTCACAACCCTGAGGAACGGCCATACAAATTGCCAGACCTGTGCAGGACATTGGACACTACATTGCATGACGTTACAATAGAGTGTGTCTATTGCAGAAGGCAACTACAACGGACAGAGGTATATGAATTTGCCTTTAGTGAC(SEQ ID NO.144)
扩增物31：GenBank：EF450778.1/Position(start-end)：431-681
GCTCATATGCGGCGCCATTTA*CCAGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGG(SEQ ID NO.145)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线为由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modifieddCTP)的标记。在SCO中括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 29：5'-TGCGAGCAGTCGCTATCAGAG-3’(SEQ ID NO.146)
CCTF 30：5'-CGCAGCTTTCAGGAGACCGAT-3’(SEQ ID NO.147)
CCTF 31：5'-AGCGTAAGTGCTCTACGCCAG-3’(SEQ ID NO.148)
CCTF 32：5'-AGAACCGGCTGCGTCCTGAT-3’(SEQ ID NO.149)
2)聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度的测定
利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-Rad，USA)来对添加有各个引物46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63和SCO21、22、23、24各0.15μM、PspGI(NEB，USA)5U、聚合酶链反应缓冲液(PCR buffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、h-Taq DNA polymerase(Solgent，Korea)1.6U及HPV16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型、82型及IC的100pg/rxn的基因组DNA的模板DNA(template DNA)的、20μl的总反应液进行下一个聚合酶链式反应。
在95℃温度下进行15分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在63℃温度下进行1分钟(循环50次)，在95℃的变性温度下进行15分钟并进行1次，在95℃的变性温度下进行30秒钟，在63℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。在反应之后，在相同的仪器中将反应混合物冷却至50℃，在50℃温度下保持30秒钟后，在50℃温度下逐渐加热至95℃，从而获得固有解离温度分析曲线。利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。
图5为示出16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型、82型、IC的每个靶的多重固有解离温度测定的结果的图，在具有各个SCO的固有解离温度(16型：HEX 76.5℃、18型：FAM 78℃、33型：Quasar670 71℃、35型：Quasar670 71℃、51型：Quasar670 71℃、53型：Quasar670 71℃、59型：Quasar670 71℃、68型a：Quasar670 71℃、82型：Quasar670 71℃、IC：Quasar670 67.5℃)中观察到峰值，当在图5的(a)部分、图5的(b)部分、图5的(c)部分、图5的(d)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图5的(e)部分)。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应的同时，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来对SCO的荧光进行分析，来证明了与以往的聚合酶链反应方法相比更精确地进行靶核酸序列的检测。
4.用于检测呼吸道疾病的致病因子的多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值的分析
利用作为呼吸道疾病的致病因子的甲型H1N1流行性感冒(Influenza A/H1N1，FluA/H1N1)、甲型H3N2流行性感冒(Influenza A/H3N2，Flu A/H3N2)、流行性感冒A(H1N1)pdm09(Influenza A/H1N1/2009pdm，Flu A/H1N1/2009pdm)、乙型流行性感冒(InfluenzaB，Flu B)、副流感病毒1(Parainfluenza 1，PIV1)、副流感病毒3(Parainfluenza 3，PIV3)、呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV A)、呼吸道合胞病毒B(Respiratory syncytial virus B，RSV B)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus，MPV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)及外部控制物质(Extraction Control，EC)的核酸的实时荧光定量聚合酶链反应仪来进行CCTF分析。
1)靶序列模板DNA的序列特异性来制备的引物
本实施例中所使用的正向引物为CTPO，用与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的脱氧核糖核酸非互补的序列组成，以能够形成CCT。之后，存在限制酶识别序列，之后到3’末端位置由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物与各个需要扩增的靶部位互补的序列组成。
而且，通过形成与CCTF互补的结合来成为双链的模板的SCO放置3’末端的荧光抵消分子(BHQ-1或BHQ-2)，并且以具有规定距离的方式放置荧光报道分子。
引物信息以及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物64：
5'-TTGCTATGGCTGACGGGGAAGAATGG-3’(SEQ ID NO.150)
引物65：
5'-GCCCCGTTGAGAGCACGAAT*CCAGGGGGGTGAATCTTCTGCTTAATGTGAAGACA C-3’(SEQID NO.151)
引物66：
5'-GGGCACCATGCAGTACCAAACGGAAC-3’(SEQ ID NO.152)
引物67：
5'-CCGTGGCGCGAACTTATCGA*CCAGGATCACACTGAGGGTCTCCCAATAGAGC-3’(SEQ IDNO.153)
引物68：
5'-TCAAAGACTAAGTGGTGCCATGGATGAAC-3’(SEQ ID NO.154)
引物69：
5'-AAGTGACCTGCCATTGCGCG*CCAGGTATGTCTACAGCAGAGGGACCCAGC-3’(SEQ IDNO.155)
引物70：
5'-GGCTTAGAGCACCGCGTCATT*CCAGGTGTCGCTACTGGAAGCGGTGATC-3’(SEQ IDNO.156)
引物71：
5'-GCGATAGCTAAGGTACGACGGGTC-3’(SEQ ID NO.157)
引物72：
5'-GTAGATTCGATCCATGCTCCTCTACTACC-3’(SEQ ID NO.158)
引物73：
5'-CGTCTTACATGCGCAAGCGG*CCAGGTGATATTGAGTTCGGTAATGCAAGATCTGC-3’(SEQ IDNO.159)
引物74：
5'-CCATAGAGATGGCAATAGATGAAGAGC-3’(SEQ ID NO.160)
引物75：
5'-AGGCGTTCCGCTTCAACGAG*CCAGGTTGTCAGATTCTGTAGCTTGCTCAGTC-3’(SEQ IDNO.161)
引物76：
5'-GGTGGTGATCCCAACTTGTTATATCGAAG-3’(SEQ ID NO.162)
引物77：
5'-TCCGTCTGCGAAGATCTGAGC*CCAGGTTCAATCTATCRTCTGACAGATCTTGAAGT-3’(SEQID NO.163)
引物78：
5'-GTGTCACGACGCGCGAATCT*CCAGGAGATCGTGACCAGTATAATAGCTCAACAC-3’(SEQ IDNO.164)
引物79：
5'-TTTCAGACAATGCAGGGATAACACCAGC-3’(SEQ ID NO.165)
引物80：
5'-CCCAGAACGATTTGCGGCGT*CCAGGCTTGGTCCTCTCTTAGGAGGCAAGC-3’(SEQ IDNO.166)
引物81：
5'-AGGATGCTTCGGAGTACCTGAG-3’(SEQ ID NO.167)
引物82：
5'-TGCATTGCCGTCGCAGAGAC*CCAGGCAACGGGCACGAAGCGCATC-3’(SEQ ID NO.168)
引物83：
GCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGG(SEQ ID NO.169)
引物84：
5'-ATGCGCTTGGATTGCCGATG*CCAGGAGCCCTGTTAGTTCTGGATGCTGAACA-3’(SEQ IDNO.170)
SCO33：
CTTATAGATTATA[T(FAM)]TGCCCCGTTGAGAGCACGAAT[BHQ1](SEQ ID NO.171)
SCO34：
CTAAGTAAGCCTATATCGAAT[T(FAM)]CCGTGGCGCGAACTTATCGA[BHQ1](SEQ IDNO.172)
SCO35：
CGTACTGCACTCGCCTACGAC[T(Cal Fluor Red 610)]AAGTGACCTGCCATTGCGCG[BHQ2](SEQ ID NO.173)
SCO36：
CTTATAAGTTACA[T(Cal Fluor Red 610)]GGCTTAGAGCACCGCGTCATT[BHQ2](SEQ IDNO.174)
SCO 37：
CTAATTGTAATAC[T(Quasar 670)]CGTCTTACATGCGCAAGCGG[BHQ2](SEQ ID NO.175)
SCO 38：
CTAATCGTATGAGATCTATGA[T(Quasar 670)]AGGCGTTCCGCTTCAACGAG[BHQ2](SEQ IDNO.176)
SCO 39：
TCATAGACATTTA[T(Cal Fluor Gold 540)]TCCGTCTGCGAAGATCTGAGC[BHQ1](SEQID NO.177)
SCO 40：
TACGAATCTGACCTAGTAAGA[T(Cal Fluor Gold 540)]GTGTCACGACGCGCGAATCT[BHQ1](SEQ ID NO.178)
SCO 41：
TGCCACTAACAGGCCGCTAGA[T(Cal Fluor Gold 540)]CCCAGAACGATTTGCGGCGT[BHQ1](SEQ ID NO.179)
SCO 42：
TCGAGCGTGCGCCAGATCCA[T(Quasar 670)]TGCATTGCCGTCGCAGAGAC[BHQ2](SEQ IDNO.180)
SCO 43：
TCGACTGTGCCTGCGTCCGTA[T(FAM)]ATGCGCTTGGATTGCCGATG[BHQ1](SEQ IDNO.181)
扩增物32：GenBank：KU558787.1/Position(start-end)：428-621
TTGCTATGGCTGACGGGGAAGAATGGTTTGTACCCAAACCTGAGCATGTCCTATGTAAACAACAAAGAGAAAGAAGTCCTTGTGCTATGGGGTGTTCATCACCCACCTAACATAGGGAACCAAAGGGCCCTCTACCATACAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCACATTATAGCAGAAGATTCACCCC*CCTGGATTCGTGCTCTCAACGGGGC(SEQ IDNO.182)
扩增物33：GenBank：CY221934.1/Position(start-end)：111-296
GGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCAAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGAT*CCTGGTCGATAAGTTCGCGCCACGG(SEQ ID NO.183)
扩增物34：GenBank：CY221750.1/Position(start-end)：1291-1501
TCAAAGACTAAGTGGTGCCATGGATGAACTCCACAACGAAATACTCGAGCTGGATGAAAAAGTGGATGACCTCAGAGCTGACACTATAAGCTCACAAATAGAACTTGCAGTCTTGCTTTCCAACGAAGGAATAATAAACAGTGAAGATGAGCATCTATTGGCACTTGAGAGAAAACTAAAGAAAATGCTGGGTCCCTCTGCTGTAGACATA*CCTGGCGCGCAATGGCAGGTCACTT(SEQ ID NO.184)
扩增物35：GenBank：JF719743.1/Position(start-end)：1816-1950
GGCTTAGAGCACCGCGTCATT*CCAGGTGTCGCTACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACTTAAGGGACGAATTGCTCGCAAAGCATCCGACCTTAGGTTCTGGTAATGACGAGGCGACCCGTCGTACCTTAGCTATCGC(SEQ IDNO.185)
扩增物36：GenBank：KX639498.1z/Position(start-end)：4035-4253
GTAGATTCGATCCATGCTCCTCTACTACCATGGTCCAGCCGACTGAGACAAGGGATGATATATAATGCCAATAAAGTAGCTCTGGCACCCCAATGTCTCCCAGTCGACAAAGATATCAGATTCAGAGTTGTATTTGTCAACGGAACATCACTGGGTACAATCACAATTGCCAAGGTCCCAAAAACTCTTGCAGATCTTGCATTACCGAACTCAATATCA*CCTGGCCGCTTGCGCATGTAAGACG(SEQ ID NO.186)
扩增物37：GenBank：KY369876.1/Position(start-end)：1310-1463
CCATAGAGATGGCAATAGATGAAGAGCCAGAACAATTCGAACATAGAGCAGACCAAGAACAAGATGGGGAACCTCAATCATCTATAATCCAATATGCTTGGGCAGAAGGAAACAGAAGCGATGACCGGACTGAGCAAGCTACAGAATCTGACAA*CCTGGCTCGTTGAAGCGGAACGCCT(SEQ ID NO.187)
扩增物38：GenBank：KX894800.1/Position(start-end)：11378-11529
GGTGGTGATCCCAACTTGTTATATCGAAGTTTCTATAGAAGAACTCCTGATTTCCTCACAGAGGCTATAGTTCACTCTGTGTTCATACTTAGTTATTATACAAACCATGATTTAAAGGATAAACTTCAAGATCTGTCAGAYGATAGATTGAA*CCTGGGCTCAGATCTTCGCAGACGGA(SEQ ID NO.188)
扩增物39：GenBank：KY249683.1/Position(start-end)：11465-11577
GGTGGTGATCCTAATTTGTTATATCGAAGCTTTTATAGGAGAACTCCAGACTTCCTTACAGAAGCTATAGTACATTCAGTGTTCGTGTTGAGCTATTATACTGGTCACGATCT*CCTGGAGATTCGCGCGTCGTGACAC(SEQ ID NO.189)
扩增物40：GenBank：KJ627391.1/Position(start-end)：3631-3933
TTTCAGACAATGCAGGGATAACACCAGCAATATCATTGGACCTAATGACTGATGCTGAACTGGCCAGAGCTGTATCATACATGCCAACATCTGCAGGGCAGATAAAGCTGATGTTGGAGAACCGCGCAATGGTAAGGAGAAAAGGATTTGGAATCCTAATAGGGGTCTACGGAAGCTCTGTGATTTACATGGTTCAATTGCCGATCTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATAATCAAGGCAGCTCCCTCTTGCTCAGAAAAAAACGGGAATTATGCTTGCCTCCTAAGAGAGGACCAAG*CCTGGACGCCGCAAATCGTTCTGGG(SEQ ID NO.190)
扩增物41：GenBank：KT963081.1/Position(start-end)：18437-18598
AGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGACTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTG*CCTGGGTCTCTGCGACGGCAATGCA(SEQ ID NO.191)
扩增物42：GenBank：CY221624.1/Position(start-end)：988-1252
GCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGGTCCAGTATCGTCTAATGGAGCAAATGGAGTAAAAGGATTTTCATTCAAATACGGCAATGGTGTTTGGATAGGGAGAACTAAAAGCATTAGTTCAAGAAAAGGTTTTGAGATGATTTGGGATCCGAATGGATGGACTGGGACTGACAATAAATTCTCAATAAAGCAAGATATCGTAGGAATAAATGAGTGGTCAGGGTATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTAACAGGGCT*CCTGGCATCGGCAATCCAAGCGCAT(SEQ ID NO.192)。
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modified dCTP)的标记。在SCO中括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 33：5'-ATTCGTGCTCTCAACGGGGC-3’(SEQ ID NO.193)
CCTF 34：5'-TCGATAAGTTCGCGCCACGG-3’(SEQ ID NO.194)
CCTF 35：5'-CGCGCAATGGCAGGTCACTT-3’(SEQ ID NO.195)
CCTF 36：5'-AATGACGCGGTGCTCTAAGCC-3’(SEQ ID NO.196)
CCTF 37：5'-CCGCTTGCGCATGTAAGACG-3’(SEQ ID NO.197)
CCTF 38：5'-CTCGTTGAAGCGGAACGCCT-3’(SEQ ID NO.198)
CCTF 39：5'-GCTCAGATCTTCGCAGACGGA-3’(SEQ ID NO.199)
CCTF 40：5'-AGATTCGCGCGTCGTGACAC-3’(SEQ ID NO.200)
CCTF 41：5'-ACGCCGCAAATCGTTCTGGG-3’(SEQ ID NO.201)
CCTF 42：5'-GTCTCTGCGACGGCAATGCA-3’(SEQ ID NO.202)
CCTF 43：5'-CATCGGCAATCCAAGCGCAT-3’(SEQ ID NO.203)
2)聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度的测定
利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-Rad，USA)来对添加有各个引物64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和SCO 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43各0.15μM、PspGI(NEB，USA)1U、聚合酶链反应缓冲液(PCR buffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、0.1mM的DTT、RNase Inhibitor 1U、SuperiorScript III(Enzynomics，Korea)1U Flu A/H1N1、Flu A/H3N2、Flu A/H1N1/2009pdm、Flu B、PIV1、PIV3、RSV A、RSV B、hMPV、ADV及MS2phage的1×10^4copies/rxn的基因组RNA的模板核酸的、20μl的总反应液进行下一个聚合酶链式反应。
在55℃温度下进行20分钟，在95℃温度下进行10分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在63℃温度下进行1分钟(循环50次)，在55℃的逆转录反应温度下进行20分钟并进行1次，以及在95℃的变性温度下进行10分钟并进行1次，并在95℃的变性温度下进行30秒钟，在63℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。在反应之后，在相同的仪器中将反应混合物冷却至50℃，在50℃温度下保持30秒钟后，在50℃温度下逐渐加热至95℃，从而获得固有解离温度分析曲线。利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。
图6为示出Flu A/H1N1、Flu A/H3N2、Flu A/H1N1/2009pdm、Flu B、PIV1、PIV3、RSVA、RSV B、hMPV、ADV、EC(Ms2phage)的每个致病菌的多重固有解离温度的测定结果图，在具有各个SCO的固有解离温度(Flu A/H1N1：67.5℃、Flu A/H3N2：76.5℃、Flu A/H1N1/2009pdm：86.5℃、Flu B：83.5℃、PIV1：66℃、PIV3：74℃、RSV A：63.5℃、RSV B：72℃、hMPV：86℃、ADV：85℃)中观察到峰值，当在图6的(a)部分、图6的(b)部分、图6的(c)部分、图6的(d)部分、图6的(e)部分的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图6的(f)部分)。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应的同时，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来分析SCO的荧光，来证明了与以往的聚合酶链反应方式相比能够更迅速简单地检测出靶核酸序列。
5.用于分析脑源性神经营养因子基因的单碱基变异基因型的多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的固有解离温度峰值的分析
为了分析作为BDNF基因单碱基变异的rs6265的基因型而利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来进行CCTF的分析。
1)靶序列模板DNA的序列特异性来制备的引物
在本实施例中所使用的正向引物为CTPO，与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的DNA非互补的序列组成，以能够形成CCTF。之后，设置限制酶识别序列，之后到3’末端由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物由与各个所需的靶部位互补的序列组成
而且，通过形成与CCTF互补的结合来将成为双链的模板的SCO放置3’末端的荧光抵消分子(BHQ-1或BHQ-2)，并且以隔开规定距离的方式放置荧光报道分子。
引物信息及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物85：
5'-ACGAGGCCTGTCCGCTTACTAG*CCAGGCTGGTCCTCATCCAACAGCTCTTCTATCGC-3’(SEQID NO.204)
引物86：
5'-CCGGGTACGCTAAGTCCGCTAT*CCAGGTTCTGGTCCTCATCCAACAGCTCTTCTATCGT-3’(SEQ ID NO.205)
引物87：
5'-GACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAA-3’(SEQ ID NO.206)
引物88：
5'-GCTCATATGCGGCGCCATTTA*CCAGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTACAAGACAG-3’(SEQ IDNO.207)
引物89：
5'-CCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCC-3’(SEQ ID NO.208)
SCO 44：
GTAGCACGCTTCGAATGGC[T(HEX)]ATACGAGGCCTGTCCGCTTACTAG[BHQ1](SEQ IDNO.209)
SCO 45：
GATACGGAGGTCCGAAGGCAG[T(FAM)]GTTGGTTACCCTAACGCGCCGGA[BHQ1](SEQ IDNO.210)
SCO 46：
ATTAGTTTAACTATTATATT[T(FAM)]TATGCTCATATGCGGCGCCATTTA[BHQ1](SEQ IDNO.211)
扩增物43：GenBank：NT_009237.19/Position(start-end)：27598340-27598451
ACGAGGCCTGTCCGCTTACTAG*CCAGGCTGGTCCTCATCCAACAGCTCTTCTATCACGTGTTCGAAAGTGTCAGCCAATGATGTCAAGCCTCTTGAACCTGCCTTGGGCCCATTCACGCTCTCCAGAGTCCCATGGGTC(SEQ ID NO.212)
扩增物44：GenBank：NT_009237.19/Position(start-end)：27598338-27598451
CCGGGTACGCTAAGTCCGCTAT*CCAGGTTCTGGTCCTCATCCAACAGCTCTTCTATCACGTGTTCGAAAGTGTCAGCCAATGATGTCAAGCCTCTTGAACCTGCCTTGGGCCCATTCACGCTCTCCAGAGTCCCATGGGTC(SEQ ID NO.213)
扩增物45：GenBank：EF450778.1/Position(start-end)：431-681
GCTCATATGCGGCGCCATTTA*CCAGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGG(SEQ ID NO.214)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modified dCTP)的标记。在SCO中括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 44：5'-CTAGTAAGCGGACAGGCCTCGT-3’(SEQ ID NO.215)
CCTF 45：5'-ATAGCGGACTTAGCGTACCCGG-3’(SEQ ID NO.216)
CCTF 46：5'-TAAATGGCGCCGCATATGAG-3’(SEQ ID NO.217)
2)聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度的测定
利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-Rad，USA)来对添加有各个引物85、86、87、88、89和SCO44、45、46各0.15μM、PspGI(NEB，USA)5U、聚合酶链反应缓冲液(PCRbuffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、h-Taq DNA polymerase(Solgent，Korea)1.6U及Flu A/H1N1、Flu A/H3N2、Flu A/H1N1/2009pdm、Flu B、PIV1、PIV3、RSV A、RSV B、hMPV、ADV及MS2 phage的1×10^4copies/rxn的基因组RNA的模板核酸的、20μl的总反应液进行下一个聚合酶链式反应。
在95℃温度下进行15分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在65℃温度下进行1分钟(循环50次)，在95℃的变性温度下进行15分钟并进行1次，在95℃的变性温度下进行30秒钟，在65℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。在反应之后，在相同的仪器中将反应混合物冷却至50℃，在50℃温度下保持30秒钟后，在50℃温度下逐渐加热至95℃，从而获得固有解离温度分析曲线。利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。
图7的(a)部分为示出rs6265的突变型A/A、野生型G/G及异型合子A/G的基因型和内部控制物质(IC)的多重固有解离温度测定的结果的图，在具有各个SCO的固有解离温度(A/A：76.5℃、A/G：76.5℃以及75℃、G/G75℃、IC：66℃)中观察到峰值，当在图7的(a)部分、图7的(b)部分、图7的(c)部分、图7的(d)部分、的相同组合物中未加入靶序列时，未观察到显示CCTF的SCO的峰值(图7的(e)部分)。
因此，利用CCTF的标记技术来进行聚合酶链反应的同时，利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来分析SCO的荧光，来证明了与以往的聚合酶链反应方式相比能够更迅速简单地检测出靶核酸序列的检测。
实施例3.多重靶聚合酶链反应中的CCTF的形成及CCTF的循环阈值(Ct)图表的分析
在实施例2中，已证明用实时荧光定量聚合酶链反应仪能够适用SCO来确认CCTF的产生与否。在上述方法中所使用的SCO在聚合酶链反应的扩增过程中的产生靶序列的反应中同时形成，从而能够进行实时荧光分析，进而可以鉴定产生的CCTF。基于此在本实施例中，其目的在于证明出，在具有多重靶序列的聚合酶链反应的情况下，当用SCO来分析CCTF的形成时，能够形成标准曲线。
为了进行本实施例而选择作为性传播感染症(sexually transmittedinfections，STI)的致病菌的、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea，NG)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)及微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)。
1.靶模板DNA的特异性引物的制备
在本实施例中所使用的正向引物为CTPO，与上述实施例1相同的原理来制备。CTPO的5’末端由19～20mer的核苷酸序列组成，由与靶序列的DNA非互补的序列组成，以能够形成CCTF。之后，设置限制酶识别序列，之后到3’末端由与各个靶部位互补的序列组成，从而起到引物的作用。反向引物由与各个所需的靶部位互补的序列组成。
并且，与CCTF形成二聚体的SCO被设计成具有双标记，而且针对每种致病菌设计。SCO以3’末端的猝灭剂(BHQ1或BHQ2)分子与荧光报道分子(分别为FAM、HEX、CAL Fluor Red610)之间具有规定距离的方式设计成，序列与需要分析的CCTF的序列互补。
引物信息及通过扩增来产生的靶序列信息如下。
引物90：5'-CTCATCGCCACGAGCCGGTTAA*CCAGGTTGAAACACCGCCCGGAACCC-3'(SEQ IDNO.218)
引物91：5'-GCTCCTTATTCGGTTTGACCGGT-3’(SEQ ID NO.219)
引物92：5'-GCTCGCAGGTACGGCACCATTCA*CCAGGCAGAAGGTATGATAACAACGGTAGAGC-3'(SEQ ID NO.220)
引物93：5'-CCCCTTTGCACCGTTGAGGGG-3’(SEQ ID NO.221)
引物94：5'-AGTCGATTATGTCTGAGGCCGCG*CCAGGTTAAAGTAGCATATGATCAAGCTCATTCA-3'(SEQ ID NO.222)
引物95：5'-GATCCTGACATATAATCATTATCTCCTTTTATAAA-3’(SEQ ID NO.223)
SCO 47：TC[T(HEX)[CATCGCCACGAGCCGGTTAA[BHQ](SEQ ID NO.224)
SCO 48：TG[T(CAL Fluor Red 610)]CGCAGGTACGGCACCATTCA[BHQ2](SEQ IDNO.225)
SCO 49：TAG[T(FAM)]CGATTATGTCTGAGGCCGCG[BHQ](SEQ ID NO.226)
扩增物46：GenBank：X52364.1/Position(start-end)：375-459
CTCATCGCCACGAGCCGGTTAA*CCAGGTTGAAACACCGCCCGGAACCCGATATAATCCGCCCTTCAACATCAGTGAAAATCTTTTTTTAACCGGTCAAACCGAATAAGGAGC(SEQ ID NO.227)
扩增物47：GenBank：M31431.1/Position(start-end)：1455-1535
GCTCGCAGGTACGGCACCATTCA*CCAGGCAGAAGGTATGATAACAACGGTAGAGCTTTATATGATATTAACTTAGCAAAAATGGAAAACCCCTCAACGGTGCAAAGGGG(SEQ ID NO.228)
扩增物48：GenBank：AF085733.2/Position(start-end)：416-502
AGTCGATTATGTCTGAGGCCGCG*CCAGGGTTTCTGTACACGATCCAATT[T/c]ACAAATAACATTTACAATTCGTAAAATTTTTTTATAAAAGGAGATAATGATTATATGTCAGGATC(SEQ IDNO.229)
在上述引物序列中粗而倾斜的字体意味着限制酶识别序列，下划线为由此产生的CCTF的互补序列。用*表示的部分是指为了阻断(blocking)PspGI限制酶切割的部位而在识别序列中的C中插入有改性的磷酸脱氧胞苷(modified dCTP)的标记。在SCO中括号是指位于荧光抵消分子和荧光报道分子的碱基序列的位置。在引物及SCO中属于NG的引物与在实施例2中所使用的引物相同。从扩增物中产生的CCTF的序列如下。
CCTF 47：5'-CCTGGTTAACCGGCTCGTGGCGATGAG-3’(SEQ ID NO.230)
CCTF 48：5'-CCTGGTGAATGGTGCCGTACCTGCGAGC-3’(SEQ ID NO.231)
CCTF 49：5'-CCTGGCGCGGCCTCAGACATAATCGACT-3’(SEQ ID NO.232)
2.聚合酶链反应扩增及SCO固有解离温度测定
分别加入0.15uM的上述引物涉及中所提及的各个靶序列的3种特异性的正向引物及3种反向引物、3种SCO，并在如下条件下，利用CFX96实时荧光定量聚合酶链反应(Bio-RadInc.,USA)仪对包含PspGI(NEB，USA)2U、聚合酶链反应缓冲液(PCR buffer，1x)、2.5mM的MgCl2、200μM的dNTP、h-Taq DNA polymerase(Solgent，Korea)1.6U及将由每个致病菌的以往的定量方法来证明的100pg/μl的基因组DNA稀释10倍的模板DNA的、20μl的总反应液进行反应。
在95℃温度下进行15分钟，在95℃温度下进行30秒钟，在63℃温度下进行1分钟(循环50次)，在95℃的变性温度下进行15分钟并进行1次，在95℃的变性温度下进行30秒钟，在63℃的退火温度下进行1分钟，将此循环反复进行50次。而且在退火步骤种收集到荧光信号，并利用Bio-Rad CFXManager 1.6进行数据分析。通过已知数据的DNA浓度的对数放大器来获得循环阈值(Cycle threshold，Ct)并由此来制作对于菌株的标准曲线。
如图8的(a)部分所示，根据模板的浓度，在不同的图中能够观察到SCO的预期荧光扩增曲线。并且，在未加入模板DNA的情况下，未观察到任何峰值(图8的(b)部分)。作为示出在将每个致病菌的基因组DNA从100pg浓度稀释成10倍浓度的NG(实线)、MG(虚线)、UP(圆形)的多重实时聚合酶链反应实验条件下显示的SCO的荧光扩增曲线(fluorescentamplification curves)及标准曲线(standard curve)的结果，图8的(a)部分的图表是在指在每3种靶序列以不同浓度来同时存在时表示的荧光扩增曲线，图8的(b)部分的图表为在均不包含3种靶序列时表示的阴性结果。在图8的(a)部分的图表中，将属于NG的图表显示为单荧光扩增曲线，在标准曲线的情况下可以为图8的(c)部分及图8的(d)部分，属于MG的图表可显示为图8的(e)部分及图8的(f)部分，属于UP的曲线可显示为图8的(g)部分及图8的(h)部分。
在标准曲线的线性回归分析中，回归系数(Regression coefficient)(r2)分别显示为NG0.9982、MG0.999、UP 0.9992。回归图(Regression plot)的斜率为NG-3.85、MG-3.89、UP-3.66。各个扩增效率(E＝10[-1/slope]-1)分别为NG81.8％、MG80.7％、UP87.6％，从而可以确认出被列在80～120％之间的适当范围内。
通过本实施例确认出，在利用实时荧光定量聚合酶链反应仪来读取每个致病菌的不同的CCTF时，了解通过测定SCO的实时荧光程度来产生的CCTF的相对数量，并利用标记形成方法确认循环阈值(Ct)值来可鉴定靶序列。
<110> 基因矩阵公司
GeneMatrix Inc.
<120> 利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物
A METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE USING CLEAVED
COMPLEMENTARY TAG FRAGMENT AND A COMPOSITION THEREFOR
<130> P16-0238HSP
<150> KR 10-2016-0050313
<151> 2016-04-25
<160> 232
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
tgaactatcc tggtccgacg tttcggttgt gttgaaacac cgcccgg 47
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gctccttatt cggtttgacc gg 22
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atctatgata cctggtttag ctcctattgc caacgtattg g 41
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tgtgtggagc atcttgtaat ctttggtc 28
<210> 5
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 5
tgaactatcc tggtccgacg tttcggttgt gttgaaacac cgcccggaac ccgatataat 60
ccgcccttca acatcagtga aaatcttttt tttaaccggt caaaccgaat aaggagc 117
<210> 6
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 6
atctatgata cctggtttag ctcctattgc caacgtattg gaaaaaaact ttggtattga 60
aaaaggattt atgacaacag tccactcata tacagcagac caaagattac aagatgctcc 120
acaca 125
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 7
ccaggatagt tca 13
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 8
ccaggtatca tagat 15
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ccactccagc cggctgacac caggacttgg tgtgacgcta tcagcat 47
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gttttcaaaa cacggtcgaa aacaaagtc 29
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
catcgccacg agccggttaa ccaggttgaa acaccgcccg gaaccc 46
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gctccttatt cggtttgacc ggt 23
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
actcacgcta atggagcgca ccaggtttag ctcctattgc caacgtattg g 51
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
tgtgtggagc atcttgtaat ctttggtc 28
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gctacccagc cggctacaag ccaggcttta tggtgcttat attggtggca tg 52
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctgtataacg ttgtgcagca ggtc 24
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tgccgcgtga ttcgatccca ccaggtatgt ccggcacaac atgcgct 47
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gagcttacga aggtcggagt tga 23
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tctcatagct gggccgctgc caggaagtag catatgatga agcacacaac a 51
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
taatgcaacg tgcatttgct tcaac 25
<210> 21
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cagatcgttg gcactctgcg accaggttaa agtagcatat gatcaagctc attca 55
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
ttgtaatgat acaacgagca tcatcattaa t 31
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gctcgtatgc cgctccatat accaggccaa atctggatct tcctctgcat c 51
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gagcttgagc tggacccaga g 21
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
acgtgccgtg catcgttgca ccaggcaacc ggctccattt tggtggag 48
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cgtcacgtcc ttcatcggtc c 21
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
tcgcagtccc gtcgaggaac caggaggcct ggctatccgg agaaac 46
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
cgttgtgttg gccgcaggtc 20
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ctcatagcta ggcgcctgcc agggctgcac gtgggtctgt tgtg 44
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggaaacgcag gccacgaaac c 21
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gcttcgcgtc tcaggcctgt ccagggggca ttacagtttt gcgtcatgac 50
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
caagtctgag cacttgcacc g 21
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ctgttagctc tgcgagctcc aggggagcga cacttgttgg tgttgac 47
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgatgaaatg aagccacccg tgc 23
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 35
tcggagccag cgcggcgtaa acccactcca gccggctgac a 41
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 36
tacaacagca gtacggagac gactcatcgc cacgagccgg ttaa 44
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 37
atttattctt actcgatgtt aaatactcac gctaatggag cgca 44
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 38
tatatatata tattattata aatgctaccc agccggctac aag 43
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 39
aagaataact actacaatct actttgccgc gtgattcgat ccca 44
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 40
ttattattat tattattata tattctcata gctgggccgc tg 42
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 41
aatcttcaat gcttaccgta tcagatcgtt ggcactctgc ga 42
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 42
aaaataaata atataatata tgctcgtatg ccgctccata ta 42
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 43
tcggagccag cgcggcgtaa cgtacgtgcc gtgcatcgtt gca 43
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 44
aagaataact actacaatct actttcgcag tcccgtcgag gaa 43
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 45
tcggagccag cgcggcgtaa tctctcatag ctaggcgcct g 41
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 46
aaaataaata atataatata gtcttcgcgt ctcaggcctg t 41
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 47
aaaataaata atataatata ttctgttagc tctgcgagct 40
<210> 48
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 48
ccactccagc cggctgacac caggacttgg tgtgacgcta tcagcatgcg tatgggttac 60
tatggtgact ttgttttcga ccgtgttttg aaaac 95
<210> 49
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 49
cgcccaccgc atcccgcgcc cctccctcag caccaggttg aaacaccgcc cggaacccga 60
tataatccgc ccttcaacat cagtgaaaat ctttttttaa ccggtcaaac cgaataagga 120
gc 122
<210> 50
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 50
actcacgcta atggagcgca ccaggtttag ctcctattgc caacgtattg gaaaaaaact 60
ttggtattga aaaaggattt atgacaacag tccactcata tacagcagac caaagattac 120
aagatgctcc acaca 135
<210> 51
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 51
gctacccagc cggctacaag ccaggcttta tggtgcttat attggtggca tgcaccatga 60
tcgtcctttt aaaaagtctg cgaggattgt tggtgatgta atgagtaaat tccaccctca 120
tggtgatatg gcaatatatg acaccatgtc aagaatggct caagactttt cattaagata 180
ccttttaatt gatggtcatg gtaattttgg ttctatagat ggtgatagac ctgctgcaca 240
acgttataca g 251
<210> 52
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 52
tgccgcgtga ttcgatccca ccaggtatgt ccggcacaac atgcgcttat gtccggcaca 60
acatgcgctc tccgcttccc aggtcagctc aactccgacc ttcgtaagct c 111
<210> 53
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 53
tctcatagct gggccgctgc caggaagtag catatgatga agcacacaac aaaatggcgc 60
atactgtgta tttcactaat ttctatcgtt catcaaaacc actattttta gatgaagaag 120
acccaattaa tccctgtttt caaactatta gtatgggtgg gggttatgta tctggtgaag 180
tgtatcgttc tgattttgaa gttgaagcaa atgcacgttg catta 225
<210> 54
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 54
cagatcgttg gcactctgcg accaggttaa agtagcatat gatcaagctc attcaaaaat 60
ggcacatact gtctatttta cgaattttta tcgttcatct aaacctttat ttttagatga 120
agaagatcca atcaacccct gttttcaaac aattagtatg ggtggtggat atgtttcagg 180
tgaaatttat cgttctgatt ttgaaattaa tgatgatgct cgttgtatca ttacaa 236
<210> 55
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 55
gctcgtatgc cgctccatat accaggccaa atctggatct tcctctgcat ctgcttctgg 60
atcatcaagc agcagcacca gctctgggtc cagctcaagc tc 102
<210> 56
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 56
acgtgccgtg catcgttgca ccaggcaacc ggctccattt tggtggagtc gcttgatcgt 60
tttgtgatcg tttagtgtga tgatttatta tgtctagaga gttaagcgat aggcttttac 120
tggtgtatca ctgtaagggc gtattggttg gatgccttgg tagacaggac cgatgaagga 180
cgtgacg 187
<210> 57
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 57
tcgcagtccc gtcgaggaac caggaggcct ggctatccgg agaaacagca cacgacttgg 60
cgttctgtgt gtcgcgatgt ctctgcgcgc agtctggcat ctggggcttt tgggaagcct 120
cgtgggggct gttcttgccg ccacccatcg gggacctgcg gccaacacaa cg 172
<210> 58
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 58
ctcatagcta ggcgcctgcc agggctgcac gtgggtctgt tgtgggtaga ggtgggcggg 60
gagggccccg gccccaccgc cccccccaca ggcggcgcgt gcggagggcg gcccgtgcgt 120
ccccccggtc cccgcgggcc gcccgtggcg ctcggtgccc ccggtatggt attccgcccc 180
caaccccggg tttcgtggcc tgcgtttcc 209
<210> 59
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 59
gcttcgcgtc tcaggcctgt ccagggggca ttacagtttt gcgtcatgac ggctttgaag 60
ctgacgacct cattgcaacc ctagcaaaac gagttgcggc tgagcactgt catgttgtga 120
ttatctcctc agataaagat gtacttcagc ttgtgtgtga tacggtgcaa gtgctcagac 180
ttg 183
<210> 60
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 60
ctgttagctc tgcgagctcc aggggagcga cacttgttgg tgttgacaag ttcggtaaca 60
aatactacca gaagctaggc gatactcaat acggtatgca cagatgggta gagtatgctt 120
caaaggatcg ttacaacgca tctcaagtac cagctgaatg gcacgggtgg cttcatttca 180
tca 183
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 61
cctggtgtca gccggctgga gtgg 24
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 62
cctggttaac cggctcgtgg cgatg 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 63
cctggtgcgc tccattagcg tgagt 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 64
cctggcttgt agccggctgg gtagc 25
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 65
cctggtggga tcgaatcacg cggca 25
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 66
cctggcagcg gcccagctat gaga 24
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 67
cctggtcgca gagtgccaac gatctg 26
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 68
cctggtatat ggagcggcat acgagc 26
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 69
cctggtgcaa cgatgcacgg cacgt 25
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 70
cctggttcct cgacgggact gcga 24
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 71
cctggcaggc gcctagctat gag 23
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 72
cctggacagg cctgagacgc gaagc 25
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 73
cctggagctc gcagagctaa cag 23
<210> 74
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gcaggagcct ctcatctcgc caggctcatt tatagacarc ttctcactaa ttc 53
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
agttttttct gatccaatyt gytctatttc 30
<210> 76
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
tcagacggtt cgaggctccc caggargaty aagcgtggag tatayatgg 49
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
tttgcgtgcy tcttcacacg c 21
<210> 78
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
aacgcgaatc gaccggatcc aggcgcgatg tgtttgccga taaaac 46
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
cattgcgtct gccccacttg 20
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
aacgcgaatc gaccggatcc aggaaacaag aacacctatg cctacatgaa c 51
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
atgttaacgt ccttcctgaa gttccac 27
<210> 82
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
tagatcggac tgcgaatcgc cagggagatc gcratctyct gcccga 46
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
rgcgtcctta gacgccatca tc 22
<210> 84
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
atctacagcg tcgcatcacg ccaggcgcaa tctggctccc arttttgtg 49
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
gcgtcaytcg acgccatcyt ca 22
<210> 86
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
cataggtcga ggtcctcacc cagggcaaac tccggcatct actaatagac g 51
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
aagcggtgat ccgcacagtg 20
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 88
tcggccgatc gtccatagag tcaagctcgc aggagcctct catctcg 47
<210> 89
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 89
tcacgatgag cgagttgagc tacgtatcag acggttcgag gctcc 45
<210> 90
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 90
tgttcaatat ataatgataa tatgtaacgc gaatcgaccg gat 43
<210> 91
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 91
tgttcaatat ataatgataa tatgtaacgc gaatcgaccg gat 43
<210> 92
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 92
acatttataa tacagtattt tattagatcg gactgcgaat cg 42
<210> 93
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 93
agctcctgcc agtactgcca tccatatcta cagcgtcgca tcacg 45
<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 94
tagttataat gaataactat tattcatagg tcgaggtcct cac 43
<210> 95
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 95
gcaggagcct ctcatctcgc caggctcatt tatagacarc ttctcactaa ttcatattca 60
gtagatttac atgatgaaat agarcaratt ggatcagaaa aaact 105
<210> 96
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 96
tcagacggtt cgaggctccc caggargaty aagcgtggag tatayatgga cctgcttgtc 60
tcgggggcaa gcccaggcaa tgcatggtcc catgcgtgtg aagargcacg caaa 114
<210> 97
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 97
aacgcgaatc gaccggatcc aggcgcgatg tgtttgccga taaaacgtac caaccggagc 60
cccaagtggg gcagacgcaa tg 82
<210> 98
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 98
aacgcgaatc gaccggatcc aggaaacaag aacacctatg cctacatgaa cggtcgggtg 60
gcggttccta gcgccctcga tacctacgta aacatcgggg cacggtggtc tccagatccc 120
atggacaatg ttaacccctt caatcaccac cgtaacgccg gtctgcgcta tcgatccatg 180
ctcttgggca acgggcgtta cgtacccttc cacattcaag tcccccagaa gttttttgcc 240
attaaaaatc tcctcctctt accgggttcc tacacctacg agtggaactt caggaaggac 300
gttaacat 308
<210> 99
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 99
tagatcggac tgcgaatcgc cagggagatc gcratctyct gcccgaattc gtaaatgatg 60
atggcgtcta aggacgcy 78
<210> 100
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 100
atctacagcg tcgcatcacg ccaggcgcaa tctggctccc arttttgtga atgargatgg 60
cgtcgartga cgc 73
<210> 101
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 101
cataggtcga ggtcctcacc cagggcaaac tccggcatct actaatagac gccggccatt 60
caaacatgag gattacccat gtcgaagaca acaaagaagt tcaactcttt atgtattgat 120
cttcctcgcg atctttctct cgaaatttac caatcaattg cttctgtcgc tactggaagc 180
ggtgatccgc acagtg 196
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 102
cctggtgtca gccggctgga gtgg 24
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 103
cctggttaac cggctcgtgg cgatg 25
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 104
cctggtgcgc tccattagcg tgagt 25
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 105
cctggcttgt agccggctgg gtagc 25
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 106
cctggtggga tcgaatcacg cggca 25
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 107
cctggcagcg gcccagctat gaga 24
<210> 108
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 108
cctggtcgca gagtgccaac gatctg 26
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 109
cctggtatat ggagcggcat acgagc 26
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 110
cctggtgcaa cgatgcacgg cacgt 25
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 111
cctggttcct cgacgggact gcga 24
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 112
cctggcaggc gcctagctat gag 23
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 113
cctggacagg cctgagacgc gaagc 25
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 114
cctggagctc gcagagctaa cag 23
<210> 115
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 115
ctctgatagc gactgctcgc accaggataa tataaggggt cggtggaccg g 51
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 116
ctccatgcat gattacagct gggtt 25
<210> 117
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 117
atcggtctcc tgaaagctgc gccaggcaga aggtacagac ggggagggc 49
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 118
cacctccagc cgctccccta at 22
<210> 119
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 119
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggcaac gataaccgac caccacaagc a 51
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 120
cggggtctgc acagaacagc ttt 23
<210> 121
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 121
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggagga cccagctgaa cgaccttaca a 51
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 122
ctgtccaccg tccaccgatg ttatg 25
<210> 123
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 123
ctggcgtaga gcacttacgc tccagggctg gcaacgtaca cgacaacg 48
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 124
gctgtacaac gcgaagggtg tc 22
<210> 125
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 125
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggtcca cctatgcacc gaaacctcca a 51
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
tgcagtgacg agtccccgtg tagta 25
<210> 127
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
ctggcgtaga gcacttacgc tccagggact gtacaccgta tgcagcgtg 49
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
gcgtatcagc agctcatgta a 21
<210> 129
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 129
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggacaa actcgacgtc gtctcggaa 49
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 130
caggtcacca caacaaaggc tccgt 25
<210> 131
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 131
atcaggacgc agccggttct ccaggccaag gacaggtacg gctgtcatc 49
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 132
ggtgcccttg aggttgtcca ggtg 24
<210> 133
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 133
gagacgttta agtccgcgac cgctctctga tagcgactgc tcgca 45
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 134
caggcgacgt ccatatggtg cgctatcggt ctcctgaaag ctgcg 45
<210> 135
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 135
cccttaggta acgtctggct ggcgtagagc acttacgct 39
<210> 136
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 136
aaactttaat tattgtatat caggacgcag ccggttct 38
<210> 137
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 137
ctctgatagc gactgctcgc accaggataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat 60
gtcttgttgc agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaatcat gcatggag 118
<210> 138
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 138
atcggtctcc tgaaagctgc gccaggcacg acaggaacga ctccaacgac gcagagaaac 60
acaagtataa tattaagtat gcatggacct aaggcaacat tgcaagacat tgtattgcat 120
ttagagcccc aaaatgaaat tccggttgac cttctatgtc acgagcaatt aagcgactca 180
gaggaagaaa acgatgaaat agatggagtt aatcatcaac atttaccagc ccgacg 236
<210> 139
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 139
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggacgc catgagagga cacaagccaa cgttaaagga 60
atatgtttta gatttatatc ctgaaccaac tgacctatac tgctatgagc aattaagtga 120
cagctcagat gaggatgaag gcttggaccg gccagatgga caagcacaac cagccacagc 180
tgattactac attgtaacct gttgtcacac ttgtaacacc acagttcgtt tatgtgtcaa 240
cagtacagca agtgacctac gaaccataca gcaactactt atgggcacag tgaatattgt 300
gtgccctacc tgtgcacaac aataaacatc atctacaatg gccgatcctg aa 352
<210> 140
<211> 419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 140
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggagga cccagctgaa cgaccttaca aactgcatga 60
tttgtgcaac gaggtagaag aaagcatcca tgaaatttgt ttgaattgtg tatactgcaa 120
acaagaatta cagcggagtg aggtatatga ctttgcatgc tatgatttgt gtatagtata 180
tagagaaggc cagccatatg gagtatgcat gaaatgttta aaattttatt caaaaataag 240
tgaatataga tggtatagat atagtgtgta tggagaaacg ttagaaaaac aatgcaacaa 300
acagttatgt catttattaa ttaggtgtat tacatgtcaa aaaccgctgt gtccagttga 360
aaagcaaaga catttagaag aaaaaaaacg attccataac atcggtggac ggtggacag 419
<210> 141
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 141
ctggcgtaga gcacttacgc tccagggctg gcaacgtaca cgacaacgta acgaaaccca 60
agtgtaataa agccatgcgt ggtaatgtac cacaattaaa agatgtagta ttgcatttaa 120
caccacagac tgaaattgac ttgcaatgct acgagcaatt tgacagctca gaggaggagg 180
atgaagtaga taatatgcgt gaccagctac cagaaagacg ggctggacag gctacgtgtt 240
acagaattga agctccgtgt tgcaggtgtt caagtgtagt acaactggca gtggaaagca 300
gtggagacac ccttcgcgtt gtacagc 327
<210> 142
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 142
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggtcca cctatgcacc gaaacctcca agacctccgc 60
attgtccgtg ggtgccaaag acacacacct acaaccacca cagaaacgac gacgaccaga 120
cgtcacagac tccagaaaca ccaagtaccc caacaacctt ttgcggggac aacaatccgt 180
ggacagtact acacggggac tcgtcactgc a 211
<210> 143
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 143
ctggcgtaga gcacttacgc tccagggtta agaccgaaaa cggtgcatat aaaggtagtt 60
agaaagaaaa gggcaacggc atggcacgct ttgaggatcc tacacaacga ccatacaaac 120
tgcctgactt gagcacaaca ttgaatattc ctctgcatga tattcgc 167
<210> 144
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 144
ctggcgtaga gcacttacgc tccaggatgg cgctatttca caaccctgag gaacggccat 60
acaaattgcc agacctgtgc aggacattgg acactacatt gcatgacgtt acaatagagt 120
gtgtctattg cagaaggcaa ctacaacgga cagaggtata tgaatttgcc tttagtgac 179
<210> 145
<211> 277
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 145
gctcatatgc ggcgccattt accagggcag gttgctatca aggttacaag acaggtttaa 60
ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt ctgataggca 120
ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag gctgctggtg gtctaccctt 180
ggacccagag gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct gttatgggca 240
accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcgg 277
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 146
tgcgagcagt cgctatcaga g 21
<210> 147
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 147
cgcagctttc aggagaccga t 21
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 148
agcgtaagtg ctctacgcca g 21
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 149
agaaccggct gcgtcctgat 20
<210> 150
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 150
ttgctatggc tgacggggaa gaatgg 26
<210> 151
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 151
gccccgttga gagcacgaat ccaggggggt gaatcttctg cttaatgtga agacac 56
<210> 152
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 152
gggcaccatg cagtaccaaa cggaac 26
<210> 153
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 153
ccgtggcgcg aacttatcga ccaggatcac actgagggtc tcccaataga gc 52
<210> 154
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 154
tcaaagacta agtggtgcca tggatgaac 29
<210> 155
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 155
aagtgacctg ccattgcgcg ccaggtatgt ctacagcaga gggacccagc 50
<210> 156
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 156
ggcttagagc accgcgtcat tccaggtgtc gctactggaa gcggtgatc 49
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 157
gcgatagcta aggtacgacg ggtc 24
<210> 158
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 158
gtagattcga tccatgctcc tctactacc 29
<210> 159
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 159
cgtcttacat gcgcaagcgg ccaggtgata ttgagttcgg taatgcaaga tctgc 55
<210> 160
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 160
ccatagagat ggcaatagat gaagagc 27
<210> 161
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 161
aggcgttccg cttcaacgag ccaggttgtc agattctgta gcttgctcag tc 52
<210> 162
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 162
ggtggtgatc ccaacttgtt atatcgaag 29
<210> 163
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 163
tccgtctgcg aagatctgag cccaggttca atctatcrtc tgacagatct tgaagt 56
<210> 164
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 164
gtgtcacgac gcgcgaatct ccaggagatc gtgaccagta taatagctca acac 54
<210> 165
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 165
tttcagacaa tgcagggata acaccagc 28
<210> 166
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 166
cccagaacga tttgcggcgt ccaggcttgg tcctctctta ggaggcaagc 50
<210> 167
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 167
aggatgcttc ggagtacctg ag 22
<210> 168
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 168
tgcattgccg tcgcagagac ccaggcaacg ggcacgaagc gcatc 45
<210> 169
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 169
gccctaatga taagacaggc agttgtgg 28
<210> 170
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 170
atgcgcttgg attgccgatg ccaggagccc tgttagttct ggatgctgaa ca 52
<210> 171
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 171
cttatagatt atattgcccc gttgagagca cgaat 35
<210> 172
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 172
ctaagtaagc ctatatcgaa ttccgtggcg cgaacttatc ga 42
<210> 173
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 173
cgtactgcac tcgcctacga ctaagtgacc tgccattgcg cg 42
<210> 174
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 174
cttataagtt acatggctta gagcaccgcg tcatt 35
<210> 175
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 175
ctaattgtaa tactcgtctt acatgcgcaa gcgg 34
<210> 176
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 176
ctaatcgtat gagatctatg ataggcgttc cgcttcaacg ag 42
<210> 177
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 177
tcatagacat ttattccgtc tgcgaagatc tgagc 35
<210> 178
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 178
tacgaatctg acctagtaag atgtgtcacg acgcgcgaat ct 42
<210> 179
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 179
tgccactaac aggccgctag atcccagaac gatttgcggc gt 42
<210> 180
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 180
tcgagcgtgc gccagatcca ttgcattgcc gtcgcagaga c 41
<210> 181
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 181
tcgactgtgc ctgcgtccgt atatgcgctt ggattgccga tg 42
<210> 182
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 182
ttgctatggc tgacggggaa gaatggtttg tacccaaacc tgagcatgtc ctatgtaaac 60
aacaaagaga aagaagtcct tgtgctatgg ggtgttcatc acccacctaa catagggaac 120
caaagggccc tctaccatac agaaaatgct tatgtctctg tagtgtcttc acattatagc 180
agaagattca cccccctgga ttcgtgctct caacggggc 219
<210> 183
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 183
gggcaccatg cagtaccaaa cggaacgata gtgaaaacaa tcacaaatga ccaaattgaa 60
gttactaatg ctactgagtt ggttcagaat tcctcaatag gtgaaatatg cgacagtcct 120
catcagatcc ttgatggaga gaactgcaca ctaatagatg ctctattggg agaccctcag 180
tgtgatcctg gtcgataagt tcgcgccacg g 211
<210> 184
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 184
tcaaagacta agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactcgagc tggatgaaaa 60
agtggatgac ctcagagctg acactataag ctcacaaata gaacttgcag tcttgctttc 120
caacgaagga ataataaaca gtgaagatga gcatctattg gcacttgaga gaaaactaaa 180
gaaaatgctg ggtccctctg ctgtagacat acctggcgcg caatggcagg tcactt 236
<210> 185
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 185
ggcttagagc accgcgtcat tccaggtgtc gctactggaa gcggtgatcc gcacagtgac 60
gactttacag caattgctta cttaagggac gaattgctcg caaagcatcc gaccttaggt 120
tctggtaatg acgaggcgac ccgtcgtacc ttagctatcg c 161
<210> 186
<211> 244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 186
gtagattcga tccatgctcc tctactacca tggtccagcc gactgagaca agggatgata 60
tataatgcca ataaagtagc tctggcaccc caatgtctcc cagtcgacaa agatatcaga 120
ttcagagttg tatttgtcaa cggaacatca ctgggtacaa tcacaattgc caaggtccca 180
aaaactcttg cagatcttgc attaccgaac tcaatatcac ctggccgctt gcgcatgtaa 240
gacg 244
<210> 187
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 187
ccatagagat ggcaatagat gaagagccag aacaattcga acatagagca gaccaagaac 60
aagatgggga acctcaatca tctataatcc aatatgcttg ggcagaagga aacagaagcg 120
atgaccggac tgagcaagct acagaatctg acaacctggc tcgttgaagc ggaacgcct 179
<210> 188
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 188
ggtggtgatc ccaacttgtt atatcgaagt ttctatagaa gaactcctga tttcctcaca 60
gaggctatag ttcactctgt gttcatactt agttattata caaaccatga tttaaaggat 120
aaacttcaag atctgtcaga ygatagattg aacctgggct cagatcttcg cagacgga 178
<210> 189
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 189
ggtggtgatc ctaatttgtt atatcgaagc ttttatagga gaactccaga cttccttaca 60
gaagctatag tacattcagt gttcgtgttg agctattata ctggtcacga tctcctggag 120
attcgcgcgt cgtgacac 138
<210> 190
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 190
tttcagacaa tgcagggata acaccagcaa tatcattgga cctaatgact gatgctgaac 60
tggccagagc tgtatcatac atgccaacat ctgcagggca gataaagctg atgttggaga 120
accgcgcaat ggtaaggaga aaaggatttg gaatcctaat aggggtctac ggaagctctg 180
tgatttacat ggttcaattg ccgatctttg gtgtcataga tacaccttgt tggataatca 240
aggcagctcc ctcttgctca gaaaaaaacg ggaattatgc ttgcctccta agagaggacc 300
aagcctggac gccgcaaatc gttctggg 328
<210> 191
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 191
aggatgcttc ggagtacctg agtccgggtc tggtgcagtt cgcccgtgca acagacacct 60
acttcagtat ggggaacaag tttagaaacc ccacagtggc gcccacccac gatgtgacca 120
ccgaccgtag ccagcgactg atgctgcgct tcgtgcccgt tgcctgggtc tctgcgacgg 180
caatgca 187
<210> 192
<211> 290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 192
gccctaatga taagacaggc agttgtggtc cagtatcgtc taatggagca aatggagtaa 60
aaggattttc attcaaatac ggcaatggtg tttggatagg gagaactaaa agcattagtt 120
caagaaaagg ttttgagatg atttgggatc cgaatggatg gactgggact gacaataaat 180
tctcaataaa gcaagatatc gtaggaataa atgagtggtc agggtatagc gggagttttg 240
ttcagcatcc agaactaaca gggctcctgg catcggcaat ccaagcgcat 290
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 193
attcgtgctc tcaacggggc 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 194
tcgataagtt cgcgccacgg 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 195
cgcgcaatgg caggtcactt 20
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 196
aatgacgcgg tgctctaagc c 21
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 197
ccgcttgcgc atgtaagacg 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 198
ctcgttgaag cggaacgcct 20
<210> 199
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 199
gctcagatct tcgcagacgg a 21
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 200
agattcgcgc gtcgtgacac 20
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 201
acgccgcaaa tcgttctggg 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 202
gtctctgcga cggcaatgca 20
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 203
catcggcaat ccaagcgcat 20
<210> 204
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 204
acgaggcctg tccgcttact agccaggctg gtcctcatcc aacagctctt ctatcgc 57
<210> 205
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 205
ccgggtacgc taagtccgct atccaggttc tggtcctcat ccaacagctc ttctatcgt 59
<210> 206
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 206
gacccatggg actctggaga gcgtgaa 27
<210> 207
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 207
gctcatatgc ggcgccattt accagggcag gttgctatca aggttacaag acag 54
<210> 208
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 208
ccgagcactt tcttgccatg agcc 24
<210> 209
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 209
gtagcacgct tcgaatggct atacgaggcc tgtccgctta ctag 44
<210> 210
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 210
gatacggagg tccgaaggca gtgttggtta ccctaacgcg ccgga 45
<210> 211
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 211
attagtttaa ctattatatt ttatgctcat atgcggcgcc attta 45
<210> 212
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 212
acgaggcctg tccgcttact agccaggctg gtcctcatcc aacagctctt ctatcacgtg 60
ttcgaaagtg tcagccaatg atgtcaagcc tcttgaacct gccttgggcc cattcacgct 120
ctccagagtc ccatgggtc 139
<210> 213
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 213
ccgggtacgc taagtccgct atccaggttc tggtcctcat ccaacagctc ttctatcacg 60
tgttcgaaag tgtcagccaa tgatgtcaag cctcttgaac ctgccttggg cccattcacg 120
ctctccagag tcccatgggt c 141
<210> 214
<211> 277
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 214
gctcatatgc ggcgccattt accagggcag gttgctatca aggttacaag acaggtttaa 60
ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt ctgataggca 120
ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag gctgctggtg gtctaccctt 180
ggacccagag gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct gttatgggca 240
accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcgg 277
<210> 215
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 215
ctagtaagcg gacaggcctc gt 22
<210> 216
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 216
atagcggact tagcgtaccc gg 22
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTF
<400> 217
taaatggcgc cgcatatgag 20
<210> 218
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 218
ctcatcgcca cgagccggtt aaccaggttg aaacaccgcc cggaaccc 48
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 219
gctccttatt cggtttgacc ggt 23
<210> 220
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 220
gctcgcaggt acggcaccat tcaccaggca gaaggtatga taacaacggt agagc 55
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 221
cccctttgca ccgttgaggg g 21
<210> 222
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 222
agtcgattat gtctgaggcc gcgccaggtt aaagtagcat atgatcaagc tcattca 57
<210> 223
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 223
gatcctgaca tataatcatt atctcctttt ataaa 35
<210> 224
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 224
tctcatcgcc acgagccggt taa 23
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 225
tgtcgcaggt acggcaccat tca 23
<210> 226
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 226
tagtcgatta tgtctgaggc cgcg 24
<210> 227
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 227
ctcatcgcca cgagccggtt aaccaggttg aaacaccgcc cggaacccga tataatccgc 60
ccttcaacat cagtgaaaat ctttttttaa ccggtcaaac cgaataagga gc 112
<210> 228
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 228
gctcgcaggt acggcaccat tcaccaggca gaaggtatga taacaacggt agagctttat 60
atgatattaa cttagcaaaa atggaaaacc cctcaacggt gcaaagggg 109
<210> 229
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 产物
<400> 229
agtcgattat gtctgaggcc gcgccagggt ttctgtacac gatccaatty acaaataaca 60
tttacaattc gtaaaatttt tttataaaag gagataatga ttatatgtca ggatc 115
<210> 230
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 230
cctggttaac cggctcgtgg cgatgag 27
<210> 231
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 231
cctggtgaat ggtgccgtac ctgcgagc 28
<210> 232
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCO
<400> 232
cctggcgcgg cctcagacat aatcgact 28

Claims (39)

1.一种引物，其特征在于，包含与靶序列非互补的随机核酸序列，并且依次包含限制酶识别序列以及与靶序列互补的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，上述限制酶识别序列为对于选自由Pho I、PspGI、BstNI、TfiI、ApeKI、TspMI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BssKI、BstYI、TaqI、MwoI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspRI、Tth111I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI限制酶及Nick限制酶组成的组中的限制酶的识别序列。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在上述引物中，为了不让除了切割的互补标签片段之外的切割副产物参加反应，在上述引物中由限制酶切割的部位插入有修饰的脱氧核糖核苷三磷酸。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，插入于上述切割部位的修饰的脱氧核糖核苷三磷酸包含硫代磷酸化的脱氧核糖核苷三磷酸、包含7-脱氮嘌呤的脱氧核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核酸模板中的2'-O-甲基核苷酸。
5.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在上述引物中，所产生的切割的互补标签片段的长度为5mer以上且50mer以下。
6.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，上述引物选自由SEQ ID NO.1、3、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、74、76、78、80、82、84、86、115、117、119、121、123、125、127、129、131、151、153、155、156、159、161、163、164、166、168、170、204、205、207、218、220及222组成的组中的一种以上引物。
7.一种用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，包括：
步骤a)，使包含用于产生作为切割的互补标签片段的标记的、标记的模板的权利要求1至6中任一项所述的引物与靶序列进行杂交；
步骤b)，当因上述步骤a)的杂交而进行扩增过程时，由限制酶的活性产生从上述引物中切割的互补标签片段，并释放及流入于反应液中；以及
步骤c)，通过分析设备来鉴定所产生的上述切割的互补标签片段，并确认靶核酸序列的存在。
8.根据权利要求7所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，通过分析切割的互补标签片段的质量，来鉴定切割的互补标签片段。
9.根据权利要求7所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，用于上述质量分析的仪器为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪、液相色谱-质谱联用仪或高效液相色谱仪。
10.根据权利要求7所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，用于质量分析的切割的互补标签片段的每单位电荷的质量m/z在大于0Da且小于10000Da之间。
11.根据权利要求7所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，为了保留用于上述扩增过程中的质量分析的切割的互补标签片段的质量，使用作为聚合酶的特性的3’末端腺嘌呤的额外延伸功能被抑制的脱氧核糖核酸聚合酶。
12.根据权利要求8所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，以上述切割的互补标签片段的鉴定方法，并且利用标记有荧光及猝灭剂且具有切割的互补标签片段的互补序列的寡核苷酸来分析荧光信号。
13.根据权利要求7所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，对将寡核苷酸和切割的互补标签片段的双链解离成单链的固有的解离温度进行多种改变，来分析解离温度和熔融峰，并对切割的互补标签片段进行鉴定来确认靶序列的存在。
14.根据权利要求13所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，当检测2种以上的靶时，使得具有不同的解离温度，并且通过分析熔融峰来同时分析2种以上的靶。
15.根据权利要求12所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述寡核苷酸的长度为5个以上至50个以下之间的寡核苷酸。
16.根据权利要求12所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，为了防止寡核苷酸中的碱基序列的延伸，而阻断寡核苷酸的3’末端核苷酸。
17.根据权利要求16所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，为了防止寡核苷酸中的碱基序列延伸，而在寡核苷酸的3’末端核苷酸中附着间隔C3、磷脂、碳酸二月桂酯、反转末端。
18.根据权利要求16所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，为了防止寡核苷酸中的碱基序列延伸，而在寡核苷酸的3’末端核苷酸中附着猝灭剂。
19.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述方法用于鉴定性传播疾病的致病菌。
20.根据权利要求19所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述性传播疾病的致病菌选自由沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、生殖器支原体、阴道滴虫、尿素分解支原体、微小脲原体、白念珠菌、阴道加德菌、1-型单纯疱疹病毒、2-型单纯疱疹病毒及苍白密螺旋体组成的组。
21.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述方法用于鉴定胃肠道疾病的致病因子。
22.根据权利要求21所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述胃肠道疾病的致病因子选自由甲型轮状病毒、星状病毒、腺病毒F40、腺病毒F41、诺如病毒G Ⅰ及诺如病毒G Ⅱ组成的组。
23.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述方法用于鉴定人乳头瘤病毒。
24.根据权利要求23所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述人乳头瘤病毒选自由16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型及82型组成的组。
25.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述方法用于鉴定呼吸道疾病的致病因子。
26.根据权利要求25所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述呼吸道疾病的致病因子选自由甲型H1N1流行性感冒、甲型H3N2流行性感冒、流行性感冒A/H1N1/pdm09、乙型流行性感冒、副流感病毒1、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B、人偏肺病毒及腺病毒组成的组。
27.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述方法用于分析单核苷酸多态性的基因型。
28.根据权利要求27所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，上述单核苷酸多态性能够分析作为脑源性神经营养因子基因的单核苷酸多态性的rs6265的突变型A/A的基因型、野生型G/G的基因型或异型合子A/G的基因型。
29.根据权利要求7至18中任一项所述的用于区分和分析聚合酶链反应中扩增的靶序列类型的标记的形成及鉴定的方法，其特征在于，在上述方法中，通过分析寡核苷酸的荧光信号的循环阈值，来鉴定切割的互补标签片段。
30.一种用于诊断性传播疾病的组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的引物作为有效成分。
31.根据权利要求30所述的用于诊断性传播疾病的组合物，其特征在于，上述性传播疾病由选自由沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、生殖器支原体、阴道滴虫、尿素分解支原体、微小脲原体、白念珠菌、阴道加德菌、1-型单纯疱疹病毒、2-型单纯疱疹病毒及苍白密螺旋体组成的组中的细菌引起。
32.一种用于诊断胃肠道疾病的组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的引物作为有效成分。
33.根据权利要求32所述的用于诊断胃肠道疾病的组合物，其特征在于，上述胃肠道疾病由选自由甲型轮状病毒、星状病毒、腺病毒F40、腺病毒F41、诺如病毒G Ⅰ及诺如病毒G Ⅱ组成的组中的细菌引起。
34.一种用于诊断人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的引物作为有效成分。
35.根据权利要求34所述的用于诊断人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，上述人乳头瘤病毒亚型用于诊断16型、18型、33型、35型、51型、53型、59型、68a型或82型。
36.一种用于诊断呼吸道疾病的致病因子的组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的引物作为有效成分。
37.根据权利要求36所述的用于诊断呼吸道疾病的致病因子的组合物，其特征在于，上述呼吸道疾病由选自由甲型H1N1流行性感冒、甲型H3N2流行性感冒、流行性感冒A/H1N1/pdm09、乙型流行性感冒、副流感病毒1、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B、人偏肺病毒及腺病毒组成的组中的细菌引起。
38.一种用于分析单碱基变异的组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的引物作为有效成分。
39.根据权利要求38所述的用于分析单碱基变异的组合物，其特征在于，上述单碱基变异能够分析作为脑源性神经营养因子基因的单核苷酸多态性的rs6265的突变型A/A的基因型、野生型G/G的基因型或异型合子A/G的基因型。
CN201780025886.7A 2016-04-25 2017-04-21 利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物 Pending CN109072305A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0050313 2016-04-25
KR20160050313 2016-04-25
PCT/KR2017/004297 WO2017188669A2 (ko) 2016-04-25 2017-04-21 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109072305A true CN109072305A (zh) 2018-12-21

Family

ID=60159893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780025886.7A Pending CN109072305A (zh) 2016-04-25 2017-04-21 利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11193161B2 (zh)
EP (1) EP3453768B1 (zh)
JP (1) JP6796660B2 (zh)
KR (1) KR101961642B1 (zh)
CN (1) CN109072305A (zh)
WO (1) WO2017188669A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110702813A (zh) * 2019-10-23 2020-01-17 贵州中医药大学 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法
CN111041127A (zh) * 2020-01-10 2020-04-21 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种hsv1病毒的检测引物及其试剂盒
CN115873946A (zh) * 2022-08-04 2023-03-31 山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司 基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019045532A2 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Seegene, Inc. EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS
US11401546B2 (en) 2017-09-29 2022-08-02 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by PTO cleavage and extension-dependent extension assay
KR102369388B1 (ko) 2018-01-05 2022-03-02 주식회사 씨젠 시료에서 M. tuberculosis, M. bovis 및 M. bovis BCG의 존재 또는 부존재를 결정하는 방법
EP3781708B1 (en) 2018-04-20 2025-01-15 Seegene, Inc. Method for detecting a plurality of target nucleic acid sequences in sample
KR20230098259A (ko) * 2020-10-29 2023-07-03 비오까르띠 엔브이 멀티플렉스 핵산 검출을 위한 제네릭 카트리지 및 방법
JP7585843B2 (ja) * 2021-02-10 2024-11-19 株式会社島津製作所 オリゴヌクレオチドプローブ、検査液および検出方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741678A (en) * 1994-11-15 1998-04-21 American Health Foundation Quantitative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
EP0909823A2 (en) * 1997-09-23 1999-04-21 Becton, Dickinson and Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
CN1491285A (zh) * 2000-12-26 2004-04-21 �����﹤����ʽ���� 致病微生物的检测方法
WO2004053159A2 (en) * 2002-12-07 2004-06-24 Guoliang Fu Oligonucleotide guided analysis of gene expression
CN101605909A (zh) * 2006-12-05 2009-12-16 塞昆纳姆股份有限公司 使用质谱法的生物分子检测和定量
WO2009155271A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Sigma-Aldrich Co. Real time polymerase chain reaction process using a universal detection system
CN102471771A (zh) * 2010-01-21 2012-05-23 爱科来株式会社 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂
US8383348B2 (en) * 2000-10-24 2013-02-26 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Precircle probe nucleic acid amplification methods
WO2013115442A1 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide hybridization assay
CN103534358A (zh) * 2011-03-29 2014-01-22 Seegene株式会社 基于pto切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测
WO2014163225A1 (ko) * 2013-04-01 2014-10-09 (주)지노믹트리 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법
CN105229170A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 豪夫迈·罗氏有限公司 通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830655A (en) * 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
WO2003050304A1 (en) * 2001-12-08 2003-06-19 Seegene, Inc Annealing control primer system for regulating primer annealing specificity and its applications
CA2477611A1 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
AU2003272104A1 (en) * 2002-10-18 2004-05-04 Genematrix Inc. Method for detecting mutations
KR101025450B1 (ko) * 2008-08-06 2011-04-04 (주)진매트릭스 다중 염기변이 분석방법
KR20110048734A (ko) 2009-11-03 2011-05-12 주식회사 씨젠 5―미스매치 프로브 타겟 검출
KR101503726B1 (ko) 2013-04-30 2015-03-19 (주)진매트릭스 Ｄｎａ 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이러한 프라이머의 설계방법
KR101738596B1 (ko) * 2014-05-28 2017-05-22 (주)진매트릭스 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 분석용 조성물
EP3158082B1 (en) * 2014-06-19 2020-12-30 Multiplicom NV Restriction mediated quantitative polymerase chain reactions
KR101616796B1 (ko) 2015-01-05 2016-05-12 엘에스산전 주식회사 냉각장치를 갖는 태양광 모듈

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741678A (en) * 1994-11-15 1998-04-21 American Health Foundation Quantitative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
EP0909823A2 (en) * 1997-09-23 1999-04-21 Becton, Dickinson and Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
US8383348B2 (en) * 2000-10-24 2013-02-26 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Precircle probe nucleic acid amplification methods
CN1491285A (zh) * 2000-12-26 2004-04-21 �����﹤����ʽ���� 致病微生物的检测方法
WO2004053159A2 (en) * 2002-12-07 2004-06-24 Guoliang Fu Oligonucleotide guided analysis of gene expression
CN101605909A (zh) * 2006-12-05 2009-12-16 塞昆纳姆股份有限公司 使用质谱法的生物分子检测和定量
WO2009155271A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Sigma-Aldrich Co. Real time polymerase chain reaction process using a universal detection system
CN102471771A (zh) * 2010-01-21 2012-05-23 爱科来株式会社 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂
CN103534358A (zh) * 2011-03-29 2014-01-22 Seegene株式会社 基于pto切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测
WO2013115442A1 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide hybridization assay
CN105229170A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 豪夫迈·罗氏有限公司 通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定
WO2014163225A1 (ko) * 2013-04-01 2014-10-09 (주)지노믹트리 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G T WALKER等: "Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique", 《NUCLEIC ACIDS RES》 *
GWENDOLYN M STOVALL等: "In vitro selection using modified or unnatural nucleotides", 《CURR PROTOC NUCLEIC ACID CHEM》 *
LI-YEH CHUANG等: "Specific primer design for the polymerase chain reaction", 《BIOTECHNOL LETT》 *
陈明洁等: "多重PCR—一种高效快速的分子生物学技术", 《武汉理工大学学报》 *
黄德蕙等: "国内外鼠疫引物设计研究进展", 《国外医学(医学地理分册)》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110702813A (zh) * 2019-10-23 2020-01-17 贵州中医药大学 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法
CN110702813B (zh) * 2019-10-23 2022-03-11 贵州中医药大学 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法
CN111041127A (zh) * 2020-01-10 2020-04-21 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种hsv1病毒的检测引物及其试剂盒
CN115873946A (zh) * 2022-08-04 2023-03-31 山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司 基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210189456A1 (en) 2021-06-24
WO2017188669A2 (ko) 2017-11-02
KR101961642B1 (ko) 2019-03-25
EP3453768C0 (en) 2025-03-26
EP3453768B1 (en) 2025-03-26
JP6796660B2 (ja) 2020-12-09
JP2019514384A (ja) 2019-06-06
EP3453768A4 (en) 2020-01-01
US11193161B2 (en) 2021-12-07
US20190177768A1 (en) 2019-06-13
KR20170121700A (ko) 2017-11-02
EP3453768A2 (en) 2019-03-13
WO2017188669A3 (ko) 2018-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109072305A (zh) 利用切割的互补标签片段的靶核酸序列检测方法及其组合物
US11041189B2 (en) Genetic markers for discrimination and detection of a virus causing red sea bream iridovirus disease which is an infectious aquatic organism disease, and method of discriminating and detecting the virus using the same
US9074249B2 (en) Detection of amplification products
US9074243B2 (en) Detection of amplification products
CN111511925B (zh) 用于扩增靶核酸的方法及用于扩张靶核酸的组合物
CN110964814B (zh) 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
CN112592964A (zh) 用于进行核酸多重检测的方法
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
KR101986193B1 (ko) 유전성 난청 검출용 ｐｎａ 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법
US20130078631A1 (en) Probe, and polymorphism detection method using the same
US10745732B2 (en) Genetic marker for discriminating and detecting causative bacteria of fish Edwardsiellosis and Streptococcosis, and method for discriminating and detecting causative bacteria using same
TWI795626B (zh) 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法
US11209368B2 (en) Method for detecting specific nucleic acid sequences
CN114008217B (zh) 检测核酸的组合、方法及试剂盒
CN104032031A (zh) 一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法
CN116355997A (zh) 多重pcr反应体系
TW201814053A (zh) 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
WO2025091343A1 (zh) 核酸扩增产物检测方法、引物组合物及试剂盒
CN119193791A (zh) 用于核酸检测的引物探针及其应用
CN102732512B (zh) 一种寡核苷酸标签及其应用
CN120006042A (zh) 多核苷酸检测方法、试剂盒和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181221