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CN109069603A - 全细胞癌症疫苗及其选择方法 - Google Patents

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CN109069603A
CN109069603A CN201780023982.8A CN201780023982A CN109069603A CN 109069603 A CN109069603 A CN 109069603A CN 201780023982 A CN201780023982 A CN 201780023982A CN 109069603 A CN109069603 A CN 109069603A
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CN201780023982.8A
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马库斯·丹尼尔·拉彻
约瑟夫·保罗·瓦格纳
查尔斯·路易斯·怀斯曼
威廉·瓦伦蒂恩·威廉姆斯
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Briacell Therapeutics Corp USA
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Briacell Therapeutics Corp USA
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Abstract

本发明提供了经修饰的人癌细胞，其包含编码人白细胞抗原基因的等位基因的重组多核苷酸。本发明还提供了用于为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，和使用本发明的全细胞癌症疫苗治疗癌症的方法。此外，本发明提供了确定细胞的HER2状态的方法。本文还提供了组合物和试剂盒。

Description

全细胞癌症疫苗及其选择方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月25日提交的美国临时申请No.62/299,674和2016年11月21日提交的美国临时申请No.62/425,027的优先权，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
背景技术
用同种异体全细胞疫苗进行的癌症免疫疗法是一种相对简单且在许多情况下有效减轻肿瘤负荷的方法。一般认为，为了有效，疫苗需要表达在患者肿瘤细胞中共表达的免疫原性抗原；并且抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞(DC)需要在摄取疫苗细胞片段后交叉呈递此类抗原。本领域不仅需要改良的全细胞疫苗，而且还需要阐明和表征潜在的诊断性特征以前瞻性地鉴定可能受益于全细胞癌症苗的患者。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优势。
发明概述
在第一方面，本发明提供了经修饰的人癌细胞，其包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码HLAII类基因的等位基因的重组多核苷酸。
在第二方面，本发明提供了经修饰的人癌细胞，其包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码HLA I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，重组多核苷酸存在于细胞中的载体上。在其它实施方案中，将重组多核苷酸整合至细胞基因组中。
在一些实施方案中，HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。在其它情况下，HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。在一些情况下，HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
在一些实施方案中，HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。在一些实施方案中，HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。在特定的情况下，HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02并且HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组多核苷酸。在其它实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码干扰素α(IFNa)的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)或它们的组合。
在一些实施方案中，人癌细胞是人癌细胞系。在一些情况下，人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
在第三方面，本发明提供了用于为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，该方法包括：
(a)检测从受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在以生成受试者的HLA等位基因谱；
(b)基于全细胞癌症疫苗中的一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，将受试者的HLA等位基因谱与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱进行比较；和
(c)当受试者的HLA等位基因谱与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。
在一些实施方案中，一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。在其它实施方案中，HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。在其它情况下，HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。在一些情况下，HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
在一些实施方案中，HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。在一些实施方案中，HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。在其它情况下，HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02并且HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
在一些实施方案中，当受试者的HLA等位基因谱中的一种或多种等位基因与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。在一些情况下，当受试者的HLA等位基因谱中的一种或多种等位基因与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。
在第四方面，本发明提供了为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，该方法包括：
(a)(i)检测从所述受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的存在或水平；和/或
(a)(ii)测量从所述受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量；
(b)将在步骤(a)(i)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或在步骤(a)(ii)中测量的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量与对照样品中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量进行比较；和
(c)基于步骤(b)中的比较，为受试者选择全细胞癌症疫苗，其中所述全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。在其它实施方案中，一种或多种生物标志物选自：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)、α-1,3-葡糖基转移酶(ALG8)、肌动蛋白相关的蛋白2/3复合体、亚基5样(ARPC5L)、染色盒同系物2(CBX2)、胶原VIII型α1链(COL8A1)、DDB1和CUL4相关因子10(DCAF10)、真核翻译起始因子3亚基H(EIF3H)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、组蛋白簇1H4家族成员h(HIST1H4H)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)、整合因子复合体亚基7(INTS7)、角蛋白19(KRT19)、角蛋白81(KRT81)、甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶、同工酶A(MGAT4A)、迁移和侵袭增强子1(MIEN1)、后-GPI附着蛋白3(PGAP3)、重构和间隔因子1(RSF1)、含SH2结构域的衔接子蛋白B(SHB)、可溶性载体家族35成员A2(SLC35A2)、含血影蛋白重复的核被膜家族成员4(SYNE4)、转运蛋白1(TNPO1)以及它们的组合。在其它实施方案中，一种或多种生物标志物选自：PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。在一些情况下，一种或多种生物标志物是PRAME。在其它情况下，一种或多种生物标志物选自：ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
在一些实施方案中，与对照样品相比，当从受试者获得的样品中一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达时，为受试者选择疫苗，其中对照样品包括从受试者、从不同受试者或从受试者群体获得的正常细胞或组织。在一些情况下，与对照样品相比，当一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达至少约1.5倍时，为受试者选择疫苗。
在其它实施方案中，相较于对照样品，当从受试者获得的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量更高时，为受试者选择疫苗，其中对照样品包括从不患有癌症的不同的受试者或受试者群体获得的一种或多种免疫细胞。在一些情况下，相较于对照样品，从受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量至少高约1.5倍。
在一些实施方案中，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。在一些情况下，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
在一些实施方案中，使用选自以下的方法检测所述一种或多种生物标志物的存在或水平：ELISA、多重测定、测量编码抗原的基因的RNA转录物水平、免疫组织化学、蛋白质印迹、基于珠粒的方法以及它们的组合。在其它实施方案中，使用选自以下的方法检测所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC、流式细胞术测定以及它们的组合。在具体的实施方案中，在用抗原刺激后，测量一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包括一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因。在其它实施方案中，一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。在一些其它实施方案中，HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。在其它情况下，HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。在一些情况下，HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
在一些实施方案中，HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。在一些实施方案中，HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。在其它情况下，HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
在一些实施方案中，当从受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因与疫苗中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因匹配时，为受试者选择疫苗。
在其它实施方案中，从受试者获得的样品是全血样品、血浆样品、血清样品、口腔拭子样品、肿瘤组织样品、生物流体样品、胸腔积液样品、尿液样品、毛发样品、皮肤样品或它们的组合。在其它实施方案中，样品从活检、从手术切除物、作为细针抽吸物(FNA)或它们的组合获得。在一些其它实施方案中，样品包括肿瘤组织、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)或它们的组合。
在第五方面，本发明提供了包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
在第六方面，本发明提供了包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码HLA I类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它实施方案中，重组多核苷酸存在于细胞中的载体上。在一些实施方案中，将重组多核苷酸整合至细胞基因组中。
在一些实施方案中，HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。在一些情况下，的等位基因HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。在其它情况下，HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。在一些情况下，HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
在一些实施方案中，HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。在一些实施方案中，HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。在其它实施方案中，HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。在一些情况下，HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。在特定的情况下，HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)或它们的组合。
在其它实施方案中，组合物还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，GM-CSF由重组多核苷酸编码并且由经修饰的细胞表达。在一些情况下，GM-CSF由同一经修饰的细胞表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它情况下，GM-CSF不由同一经修饰的细胞表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它实施方案中，GM-CSF以可溶形式存在。
在一些实施方案中，组合物还包含干扰素α(IFNa)。在具体的实施方案中，IFNa由同一经修饰的细胞表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它实施方案中，IFNa以可溶形式存在。
在一些实施方案中，人癌细胞是人癌细胞系。在一些情况下，人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的组合物和药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包含用选自以下的疗法处理受试者：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、分化剂、小分子药物以及它们的组合。在一些情况下，免疫疗法包含选自以下的试剂：免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、小分子药物以及它们的组合。在其它情况下，化学疗法包括选自以下的试剂：烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇以及它们的组合。在一些实施方案中，该方法还包含根据本发明的方法为受试者选择全细胞癌症疫苗。
在一些实施方案中，受试者患有I期、II期、III期或IV期癌症。在其它实施方案中，癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、眼癌、软组织癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、间皮瘤、急性白血病、慢性白血病、成神经管细胞瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤以及它们的组合。
在一些实施方案中，药物组合物通过注射施用。在一些情况下，注射是真皮内和/或淋巴管内注射。在其它实施方案中，治疗受试者使得肿瘤体积减少。在其它实施方案中，治疗受试者缓解或消除癌症的一种或多种的体征或症状。
在其它实施方案中，治疗受试者导致一种或多种免疫细胞的活性和/或数量的增加。在一些实施方案中，其中活性水平和/或数量增加的一种或多种免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。在一些情况下，其中活性水平和/或数量增加的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量使用选自以下的方法测量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC多聚体测定、流式细胞术测定以及它们的组合。在具体的实施方案中，在用抗原刺激后测量一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
在一些实施方案中，免疫细胞活性和/或数量的增加表明应向受试者施用一个或多个此外剂量的药物组合物。在其它实施方案中，治疗受试者导致增加的存活时间。
在另一方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的受试者的试剂盒，其包括本发明的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包括使用说明书。在其它实施方案中，试剂盒还包括一种或多种试剂。在一些情况下，一种或多种试剂用于从患有癌症的受试者分离样品、检测一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在、检测一种或多种生物标志物的存在或水平、和/或测量一种或多种免疫细胞的活性和/或数量。
在另一方面，本发明提供了用于确定细胞的HER2状态的方法，该方法包括：
(a)检测样品细胞中的一种或多种生物标志物的存在或水平，其中一种或多种生物标志物包括：
(i)MIEN1，
(ii)PGAP3，
(iii)ERBB2和MIEN1，
(iv)ERBB2和PGAP3，
(v)MIEN1和PGAP3，或
(vi)ERBB2、MIEN1和PGAP3；
(b)将在步骤(a)中检测的一种或多种生物标志物的存在或水平与在参考细胞中的一种或多种生物标志物的存在或水平进行比较；和
(c)基于步骤(b)中进行的比较，确定样品细胞的HER2状态。
在一些实施方案中，样品细胞是癌细胞或从患有癌症的受试者获得的细胞。在其它实施方案中，与参考细胞相比，当样品细胞以更高水平表达一种或多种生物标志物时，确定样品细胞为HER2阳性。在一些情况下，参考细胞是从与样品细胞相同的受试者获得的非癌细胞，或是从不同的受试者或受试者群体获得的非癌细胞。
在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平在HER2 3+细胞中比在HER2 2+细胞中更高。在其它实施方案中，一种或多种生物标志物的水平在HER2 2+细胞中比在HER21+细胞中或HER2 0细胞中更高。在一些其它实施方案中，检测一种或多种生物标志物的存在或水平包括测量mRNA表达、蛋白丰度或它们的组合。
在一些实施方案中，以至少约60％的灵敏度进行确定。在一些情况下，以至少约87％的灵敏度进行确定。在其它情况下，以至少约100％的灵敏度进行确定。在其它实施方案中，步骤(a)、步骤(b)和/或步骤(c)是自动化的。
从以下详细描述和附图中，本发明的其它目的、特征和优势对于本领域技术人员是显而易见的。
附图说明
图1A-图1D显示了SV-BR-1-GM的开发。图1A显示了描绘SV-BR-1-GM(BriaVax)细胞系的开发的示意图。SV-BR-1-GM细胞系来源于用CSF2(其编码人GM-CSF)稳定转染后的SV-BR-1乳腺癌细胞。SV-BR-1细胞系本身是由转移性乳腺癌患者的胸腔病变建立的(16,17)。之前产生SV-BR-1-GM主细胞库(MCB)，并且由此制备了数个“临床产物”(CP)批次用于实际或潜在的临床用途。此外，产生非MCB-依赖性研究(RES)库。所描绘的SV-BR-1-GM的发育阶段代表了在实施例1中产生基因表达谱的样品。用于基因表达分析的RNA是从直接从低温小瓶(“cryo”)取得的细胞中提取的或在培养步骤(“培养”)之后提取的。图1B显示血清饥饿后SV-BR-1-GM细胞的形态，如培养的SV-BR-1-GM Lot 11细胞的40倍和100倍放大所示。值得注意的是，SV-BR-1-GM细胞以单层生长，但在低密度接种后也可松散附着或形成聚集体。图1C和图1D描绘了质量控制(QC)措施。图1C显示了基于它们的微阵列表面谱的SV-BR-1-GM样品的分级聚类。在聚类之前对属于相同样品类型的样品的归一化基因表达水平进行平均(即，计算算术平均值)。图1D显示了只有RINe值为至少7.5的样品用于该研究。值得注意的是，CP Lot V cryo样品分别聚类。此外，CP Lot V cryo样品未通过最小可变性QC度量(参见，实施例1的标题为“方法”的章节)，并因此从其它分析中排除。
图2A-图2C显示了分级聚类。MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-468是人乳腺癌细胞系。MCF10A是“正常”人上皮细胞系。HMEC表示人乳腺上皮细胞。除了SV-BR-1-GM之外的数据集获自GEO(NCBI)并且如下：来自GSE35399的非培养乳腺细胞(Shehata等人,Breast CancerRes.2012；14(5):R134)、来自GSE56718的HMEC(Lowe等人,Genome Biol.2015年9月17日；16:194)，及来自GSE48398的MCF7、MCF10A、MDA-MB-231和MDA-MB-468。图2A显示了其中所有样品中的最小表达值大于本底截止值的1.5倍的样品和基因(即探针)两者的分级聚类。SV-BR-1-GM样品与MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF7和MCF10A样品分开聚类。图2B显示了不同样品组中最大表达值大于本底截止值的1.5倍的样品和基因(即探针)两者的分级聚类(即SV-BR-1-GM、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF7、MCF10A、ALDH NEG、ALDH POS、ERBB3 NEG、NCL、BASAL、STROMAL、HMEC_早期增殖、HMEC_深度衰老)。细胞系和非培养的乳腺细胞构建了单独的簇；SV-BR-1-GM样品在细胞系组内构建了自己的子簇。图2C显示了ERBB2簇。ALDH3B2、EIF4E3、SYBU和TMC6跨所示的样品与ERBB2紧密聚类。所示的热图表示图2B中显示的热图的放大部分。“全局”相对于“相对”是指，基于所表示的所有表达值(“全局”)的强度或仅基于相应基因的那些表达值(“相对”)的强度。从“全局”显示中可以看出，在SV-BR-1-GM和正常乳腺细胞中，ERBB2以高于其它基因的水平表达。“染色体位置(Chr.Location)”表示如相应的NCBI基因位点上指示的染色体位置。
图3描绘了SV-BR-1-GM细胞中免疫刺激物的表达。已发表的报告(29-70)(表2)中鉴定了具有已知免疫刺激作用的111种基因，并确定了它们基于微阵列的mRNA表达水平。该图中显示的22种基因呈现出在每个SV-BR-1-GM样品中转录物水平大于本底截止值的1.5倍。术语“相表达值”是指分位数归一化的mRNA水平。
图4A-图4C描绘了SV-BR-1-GM细胞中的HLA II类组分。SV-BR-1-GM细胞表达可预测功能性HLA-DR复合体形成的组分。术语“相对表达值”是指经由微阵列杂交获得的分位数归一化的mRNA水平。图4A描绘了编码HLA-DRα链的HLA-DRA的表达。图4B描绘了编码HLA-DM的HLA-DMA和HLA-DMB的表达，所述HLA-DM是非典型的MHC II，其伴随针对CLIP肽与来自内吞或内源抗原的肽的交换的失活和催化的无肽MHC II(71)。图4C描绘了编码不变链和CLIP的CD74的表达。
图5A-图5C描述了通过定量RT-PCR验证HLA II类基因的表达。为了验证数种关键HLA II类组分的表达，对用于微阵列分析的SV-BR-1-GM样品子集(表4)并用来自MCF7细胞(即，携带HLA-DRB3*0202等位基因的乳腺癌细胞系(72))的RNA作为校准品样品进行了验证性实验。分析的MHC II相关转录物不仅在SV-BR-1-GM细胞中表达，而且以显著更高的水平表达，除了MCF7细胞。图5A描绘了HLA-DRA和HLA-DRB的表达。图5B描绘了HLA-DMA和HLA-DMB的表达。图5C描绘了CD74的表达。
图6A-图6G显示了SV-BR-1-GM表达“典型”HLA-Ia和“非典型”HLA-Ib组分。“相对表达水平”是指经由微阵列杂交获得的分位数归一化的mRNA水平。图6A显示了编码b2-微球蛋白的B2M的表达。图6B显示了HLA-A的表达。图6C显示了HLA-B的表达。图6D显示了HLA-E的表达。图6E显示了HLA-F的表达。图6F显示了HLA-G的表达。图6G显示了HLA-H的表达。
图7A和图7B描绘了SV-BR-1-GM细胞的GM-CSF分泌。对于每种样品类型，评估来自三个冷冻小瓶(小瓶1-3)中的细胞的GM-CSF产生。从每个冷冻小瓶中，将细胞接种到三个T-75烧瓶中(约4百万个/烧瓶)。两天后(t＝0小时)，用14mL补充有10％FBS和GlutaMAXTM(获得自Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的RPMI-1640替换每种冷冻小瓶的两个烧瓶的培养基，并测定来自第三烧瓶的细胞的数量。培养基替换后24小时和48小时，收获培养上清液的等分试样并冷冻保存。通过ELISA(人GM-CSF Quantikine ELISA Kit；获自R&DSystems/bio-techne,Minneapolis,MN)从上清液评估GM-CSF分泌。数据表示为每100万个细胞和24小时(相对于t＝0小时的细胞数量)的ng的GM-CSF。图7A显示了CP Lot IV 4p的数据。图7B显示了CP Lot VIII的数据。
图8显示了强临床响应者的肿瘤标本中的HLA-DRB3表达。为了评估实施例1中被称为受试者A002的强临床响应者(16)是否呈现HLA-DRB3的肿瘤表达，将石蜡包埋的A002肿瘤材料用针对人HLA-DRB3的N末端区域产生的兔多克隆抗体进行染色。如所证明，HLA-DRB3免疫活性是显著的。
图9A-图9E描绘了SV-BR-1-GM细胞中的癌症/睾丸抗原(CTA)表达。图9A描绘了SV-BR-1-GM细胞、其它数种建立的乳腺癌细胞系和数种正常人乳腺细胞类型中的证实的或推定的CTA(表7)的RNA表达水平。图9B描绘了PRAME的转录水平。图9C描绘了KIF2C的转录水平。图9D描绘了CEP55的转录水平。图9E描绘了PBK的转录水平。
图10A-图10C描绘了免疫原候选物的计算机筛选结果。将SV-BR-1-GM RNA样品杂交至人类HT-12 v4表达BeadChip阵列上。将SV-BR-1-GM表达数据与基因表达综合(GEO,NCBI)数据库中作为数据集GSE35399(81)、GSE56718(80)和GSE48398(仅MCF10A)提供的正常人乳腺细胞的那些表达数据进行比较。将两个串联的滤波器(图13和图14)应用于分位数归一化的表达值，以富集可能区分SV-BR-1-GM细胞与正常乳腺细胞的基因。此类基因代表了用于介导SV-BR-1-GM抗癌作用的候选免疫原。在应用第一(即，低严格性)滤波器之后，保留455种不同的基因，其中在应用第二(即，中严格性)滤波器后剩余352种。对GEO数据集GSE29431(即乳腺癌组织)和GSE7307(即代表各种器官的非恶性组织；参见表11)进行后面基因的计算机验证。通过这种高严格性过滤/验证步骤，用表达水平鉴定了20种基因，其在乳腺癌中比在各种非恶性组织中更高。引人注目的是，在这20种基因中有3种定位至染色体17q12(表12)，即ERBB2、MIEN1和PGAP3。图10A描绘了ERBB2的表达(HER2/neu,探针216836_s_at)。图10B描绘了MIEN1的表达(探针224447_s_at)。图10C描绘了PGAP3的表达(探针55616_at)。
图11A-图11C描绘了SV-BR-1-GM的作用机制。图11A描绘了BriaVax(SV-BR-1-GM)中表达的免疫调节剂。显示的是具有在SV-BR-1-GM中表达的免疫调节作用的因子的子集。表5中列出了其它的因子。图11B描绘了用SV-BR-1-GM肽-MHC对DC进行交叉修饰(胞啃(trogocytosis))。在该机制中，通过胞啃将载有SV-BR-1-GM抗原的同种异体SV-BR-1-GM细胞表面MHC直接转移到患者DC的细胞表面上。图11C描绘了交叉呈递。在该机制中，SV-BR-1-GM细胞被降解(即通过凋亡和其它机制)，然后经降解的细胞的片段被来自患者的树突细胞(DC)摄取。在DC内部，SV-BR-1-GM抗原被蛋白水解降解并且在细胞表面MHC上呈递给患者T细胞。
图12描绘了BriaVax(SV-BR-1-GM)癌症疫苗的作用机制。显示了在SV-BR-1-GM细胞中表达的因子(图11A)和它们作为免疫调节剂的一些已知作用。HLA I类和II类基因的表达与其中SV-BR-1-GM疫苗直接刺激细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)和T辅助细胞(CD4+)并从而诱导细胞毒性和体液响应的模型相一致。由于SV-BR-1-GM细胞不表达CD80或CD86mRNA，它们不太可能直接作为活化天然T细胞的抗原呈递细胞。然而，DC在从SV-BR-1-GM细胞获得的MHC上展示SV-BR-1-GM TAA肽(即，经由交叉修饰(图11B)和/或经由交叉呈现在它们自己的一些MHC上(图11C))，可以活化此类天然T细胞。SV-BR-1-GM TAA-特异性T细胞识别并杀死共表达并呈递相应的TAA的肿瘤细胞。此外，肿瘤破坏可以经由抗体发生。CTL表示细胞毒性T淋巴细胞；TH表示T辅助细胞。
图13描绘了用于鉴定候选TAA的过滤策略的概述。将SV-BR-1-GM细胞的基因表达谱与正常乳腺细胞(即由GSE35399、GSE56718、GSE48398表示的样品的子集)的那些基因表达谱进行比较。应用低严格性滤波器后，保留455种基因(NCBI基因符号)；在应用中严格性滤波器后，它们中的352种还被保留。然后对这352种基因进行计算机验证步骤，旨在鉴定在SV-BR-1-GM细胞和乳腺癌组织中过表达但在各种器官的非恶性组织中缺乏表达的基因。
图14描绘了低严格性过滤和中严格性过滤。
发明详述
I.引言
先前已有报道，在临床研究中，接种全细胞疫苗SV-BR-1-GM(被称为BriaVax)后，患有IV期乳腺癌的受试者(“特殊临床响应者”)经历了乳腺、肺脏和脑部病变的显著消退。本发明部分基于以下发现：SV-BR-1-GM细胞不仅表达肿瘤相关抗原(TAA)，而且还发现一组生物标志物，其包括HLA I类和II类等位基因，已知其在抗原呈递细胞(APC)中有免疫刺激作用。本发明还部分基于以下发现：人白细胞抗原(HLA)等位基因在SV-BR-1-GM之间匹配，并且特殊临床响应者使患者T淋巴细胞能够直接识别如由疫苗的MHC体系所呈递的TAA。此外，本发明部分基于生物标志物的发现，而不是能够优异地鉴定和区分HER2阳性细胞。
II.定义
除非另外特别指出，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。此外，与本文描述的方法或材料类似或等同的任何方法或材料可用于实施本发明。出于本发明的目的，定义了以下术语。
如本文所用的术语“一个”、“一种”或“所述”不仅包括具有一个成员的方面，还包括具有多于一个成员的方面。例如，单数形式“一个”、“一种”或“所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“所述试剂”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等。
术语“约”和“近似”应通常意指鉴于测量的性质或精度而测量的量的可接受的误差度。典型的，示例性误差度在20％(％)之内，优选在10％之内，并且更优选在给定值或值范围的5％之内。可替代地并且特别地是在生物系统中，术语“约”和“近似”可以意指在一定数量级内的值，优选在给定值的5倍之内且更优选在给定值的2倍之内。除非另有说明，否则本文给出的数值是近似值，意味着在未明确说明时可以推断出术语“约”或“近似”。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指代脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠、大鼠、猿猴、人类、农场型动物、运动型动物和宠物。还涵盖在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“施用”包括经口施用，局部接触，作为栓剂施用，静脉内、腹膜内、肌内、病变内、肿瘤内、真皮内、淋巴内、鞘内、鼻内或皮下施用于受试者。施用是通过任何途径，包括肠胃外和透粘膜(如，经颊、舌下、经腭、经牙龈、经鼻、经阴道、经直肠或透皮)进行的。肠胃外施用包括，如静脉内、肌内、动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其它的递送模式包括但不限于脂质体制剂的使用、静脉内输注、透皮贴剂等。
术语“治疗”是指用于获得有益或所需结果的方法，包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处意指对治疗中的一种或多种疾病、疾患或症状的任何治疗性相关改善或影响。治疗性益处还可以意指实现治疗中的一种或多种疾病、疾患或症状的治愈。
术语“有效量”或“足够量”是指经修饰的癌细胞或其它组合物的足以产生有益或所需结果的量。治疗有效量可以根据以下一种或多种而变化：正在治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，其可以容易地由本领域的技术人员确定。具体的量可以根据以下一种或多种而变化：所选择的特定药剂、靶细胞类型、受试者体内的靶细胞位置、要遵循的给药方案、是否与其它化合物联合施用、施用时间以及携带其的物理递送系统。
出于本文的目的，有效量由如本领域可能已知的此类考虑因素确定。该量必须有效地在患有癌症的受试者中实现所需的治疗作用。所需的治疗作用可以包括，例如，改善与癌症相关的不期望的症状、预防此类症状在其发生之前的表现、减缓与癌症相关的症状的进展、减慢或限制由癌症引起的任何不可逆的损害、减轻癌症的严重程度或治愈癌症、或提高存活率或提供更快速从癌症中的恢复。
有效量尤其取决于待治疗疾病的类型和严重程度以及治疗方案。有效量通常在适当设计的临床试验(剂量范围研究)中确定，并且本领域技术人员将知道如何正确地进行此类试验以确定有效量。众所周知，有效量取决于多种因素，包括治疗剂(如，全细胞癌症疫苗)或组合物在体内的分布情况、各种药理学参数(如，体内半寿期)和非所需副作用之间的关系、以及其它因素诸如年龄和性别等。
术语“药学上可接受的载体”是指一种有助于施用活性剂至细胞、生物体或受试者的物质。“药学上可接受的载体”是指载体或赋形剂，其可以包含在本发明的组合物中并且不会对受试者产生显著的不良毒理学作用。药物上可接受的载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液(lactated Ringer’s)、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、涂料、甜味剂、调味剂和着色剂、脂质体、分散介质、微胶囊、阳离子脂质载体、等渗和吸收延迟剂等。载体也可以是用于为制剂提供稳定性、无菌性和等渗性的物质(如抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂)、用于防止微生物体作用的物质(如抗微生物剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸等)或用于为制剂提供具有可食用风味的物质等。在一些情况下，载体是一种促进经修饰的癌细胞至靶细胞或组织的递送的试剂。本领域的技术人员将认识到其它药物载体可用于本发明。
如本文所用的术语“核酸”或“核苷酸”是指含有呈单链或双链形式的至少两个脱氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，并且包括DNA、RNA及其杂合物。DNA可以呈以下形式：如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合的DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些基团的衍生物和组合。RNA可以呈以下形式：小干扰RNA(siRNA)、Dicer-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称的干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)以及它们的组合。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键联的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的并且具有与参考核酸相似的结合性质。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非特别限定，否则术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合性质。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守性修饰(如，简并密码子取代)的变体、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸根基团。核苷酸通过磷酸根基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及合成的嘌呤和嘧啶衍生物，其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸根和烷基卤化物)的修饰。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA区段。DNA区段可以包括在基因产物的转录/翻译以及转录/翻译的调控中涉及的编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)，以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“载体”和“表达载体”是指重组或合成产生的核酸构建体，具有允许在宿主细胞中特定的多核苷酸序列进行转录的一系列指定的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括可操作地连接于启动子的待转录的多核苷酸。术语“启动子”在本文中用于指代指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用，启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，诸如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点数千碱基对的位置。表达载体中可能存在的其它元件包括增强转录(如增强子)和终止转录(如终止子)的那些元件。
“重组”是指经遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物体。例如，重组多核苷酸(或重组多核苷酸的拷贝或补充物)是使用众所周知的方法操作的。包含与第二多核苷酸(如编码序列)可操作地连接的启动子的重组表达盒可包括由于人操作(如，通过Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,New York,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology Volumes1-3,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所述的方法)而对第二多核苷酸呈异源性的启动子。重组表达盒(或表达载体)通常包含组合的在自然界中未发现的多核苷酸。例如，人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以将启动子与其它序列侧接或分离。重组蛋白是由重组多核苷酸表达的重组蛋白，并且重组细胞、组织和生物体是包含重组序列(多核苷酸和/或多肽)的那些。重组细胞是用重组核苷酸、表达载体或盒等修饰(如，转染或转化)的重组细胞。
术语“癌症”旨在包括以异常细胞不受控制的生长为特征的一类疾病的任何成员。术语包括所有已知的癌症和肿瘤疾患，无论特征是恶性、良性、复发、软组织还是实体，以及所有分期和等级的癌症，包括晚期、转移前和转移后的癌症。不同类型的癌症的实例包括但不限于，妇科癌症(如，卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌)；肺癌(如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、类癌瘤、肺腺癌)；乳腺癌(如，三阴性乳腺癌、原位管癌、浸润性管癌、乳腺小管癌、髓样癌、粘液癌、乳头状癌、筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、原位小叶癌、佩吉特氏病(Paget’sdisease)、叶状瘤)；消化和胃肠癌，诸如胃部癌(如胃癌)、结直肠癌、胃肠道基质瘤(GIST)、胃肠道类癌肿瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和食道癌；甲状腺癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；前列腺癌(如，前列腺腺癌)；肾癌(如，肾细胞癌)；中枢神经系统癌(如，成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤)；皮肤癌(如，黑素瘤)；骨和软组织肉瘤(如，尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma))；淋巴瘤；绒毛膜癌；泌尿系癌(如，尿路上皮膀胱癌)；头颈癌；以及骨髓癌和血癌(如，急性白血病、慢性白血病(如，慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)。如本文所用，“肿瘤”包括一种或多种癌性细胞。
在癌症的上下文中，术语“期”是指对癌症程度的分类。对癌症进行分期时考虑的因素包括但不限于肿瘤尺寸、附近组织的肿瘤侵袭以及肿瘤是否已转移到其它位点。用于区分一个期与另一个期的具体标准和参数可以根据癌症的类型而变化。例如，使用癌症分期来帮助确定预后和/或鉴定最适当的治疗选择。
癌症分期系统的一个非限制性实例被称为“TNM”系统。在TNM系统中，“T”是指主要肿瘤的尺寸和程度，“N”是指癌症已经扩散到的附近淋巴结的数量，并且“M”是指癌症是否已经转移。“TX”表示不能测量的主要肿瘤，“T0”表示不能找到主要肿瘤，并且“T1”、“T2”、“T3”和“T4”表示主要肿瘤的尺寸和/或程度，其中较大的数量对应于较大的肿瘤和/或已经发展到附近组织中的肿瘤。“NX”表示无法测量附近淋巴结中的癌症，“N0”表示附近淋巴结中没有癌症，并且“N1”、“N2”、“N3”和“N4”表示癌症已扩散到的淋巴结的数量和位置，其中较大的数量对应于含有癌症的淋巴结的较大数量。“MX”表示不能测量转移，“M0”表示没有发生转移，并且“M1”表示癌症已经转移到身体的其它部位。
在癌症分期系统的另一个非限制性实例中，癌症被分类或分级为具有五个期之一：“0期”、“I期”、“II期”、“III期”和“IV期”。“0期”表示存在异常细胞，但尚未扩散到附近的组织。这通常也称为原位癌(CIS)。CIS不是癌症，但可能随后发展成癌症。I期、II期和III期表示存在癌症。较高的数量对应于较大的肿瘤尺寸和/或已扩散至附近组织的肿瘤。IV期表示癌症已经转移。本领域的技术人员将熟悉不同的癌症分期系统，并且能够容易地应用和/或解释它们。
术语“活检”是指去除组织样品用于诊断性或预后评价的过程，以及是指组织样本本身。本领域已知的任何活检技术均可应用于本发明的方法和组合物。所应用的活检技术通常取决于待评价的组织类型和肿瘤的尺寸和类型(即，固体或混悬的(即，血液、胸腔穿刺术抽吸物或腹水))等因素。代表性活检技术包括切除活检、切开活检、针活检(如，核针活检、细针抽吸活检等)、手术活检和骨髓活检。活检技术例如在Harrison's Principles ofInternal Medicine,Kasper,等人编，第16版，2005，第70章以及第V部分全文中进行了讨论。本领域技术人员将理解，可以进行活检技术以鉴定给定组织样品中的癌性和/或癌性前细胞。
术语“等位基因”是指通常通过突变事件产生的基因的特定形式或变体。等位基因可以由例如核苷酸取代、添加或缺失而产生，或者可以代表可变数量的短核苷酸重复。在人白细胞抗原(HLA)基因的背景下，HLA等位基因由世界卫生组织HLA系统因子命名委员会(World Health Organization Naming Committee for Factors of the HLA system)命名。在该系统下，HLA基因名称后跟一系列数字字段。至少包括两个数字字段。作为非限制性实例，HLA-A*02:101表示HLA-A基因的特定等位基因。第一个字段与基因名称用星号分隔，表示等位基因组。第二个字段通过冒号与第一个字段分开，表示产生的特定HLA蛋白。在一些情况下，使用更长的名称(如，HLA-A*02:101:01:02N)。在该实例中，第三数字字段表示在编码区域内是否存在同义DNA取代，并且第四数字字段表示存在于非编码区域中的等位基因之间的差异。在一些其它情况下，HLA等位基因名称最后包含一个字母。在HLA等位基因命名系统下，“N”表示等位基因是无效等位基因(即，等位基因产生非功能性蛋白)，“L”表示等位基因导致在特定HLA蛋白的低于正常细胞表面表面，“S”表示等位基因产生在细胞表面未发现的可溶蛋白，“Q”表示可疑的等位基因(即，不会影响正常表达的等位基因)，“C”表示等位基因产生存在于细胞质中但不存在于细胞表面的蛋白，并且“A”表示导致异常表达的等位基因(即，不确定是否表达特定的HLA蛋白)。本领域的技术人员将熟悉各种基因等位基因及其命名惯例。
术语“等位基因谱”是指特定样品中一种或多种基因的等位基因的集合。样品可以从受试者、特定细胞或细胞类型(如，乳腺细胞或乳腺癌细胞)获得，或者从经工程化的细胞(如，已经工程化以表达一种或多种蛋白质的癌细胞)获得。在一些情况下，等位基因谱描述了样品中(如，在从受试者或癌症疫苗细胞获得的细胞中)存在的单个基因的等位基因，或者可描述在样品中存在的两种或多种基因的等位基因。作为非限制性实例，等位基因谱可以列出在特定样品中存在的HLA-A基因的等位基因。对于二倍体细胞，可能仅存在一种等位基因(如，如果两个染色体含有相同的等位基因，则诸如HLA-A*02:01)。可替代地，可能存在两种不同的等位基因(如，等位基因谱含有HLA-A*02:01和HLA-A*24:02，或HLA-A*02:01和HLA-A*03:01)。在其它情况下，等位基因谱列举了两种或多种基因所存在的等位基因。作为非限制性实例，等位基因谱可以描述存在于患者样品中的HLA-A和HLA-DRB3基因的等位基因。
仅出于说明的目的，受试者的等位基因谱可表明HLA-A基因的HLA-A*02:01和HLA-A*24:02等位基因存在，并且存在HLA-A基因的HLA-DRB3*03:01等位基因。此外，可以比较等位基因谱。作为一个非限制性实例，受试者可具有含有HLA-A*02:01和HLA-A*24:02等位基因的等位基因谱，而癌症疫苗细胞可具有含有HLA-A*02:01和HLA-A*03:01等位基因的谱。在该实例中，如果将两个等位基因谱进行比较，则在谱之间存在部分匹配(即，两个谱中存在HLA-A*02:01等位基因)。作为另一个非限制性实例，如果疫苗细胞具有含有HLA-A*02:01和HLA-A*24:02的等位基因谱，则受试者和疫苗细胞谱相对于该特定基因是完全匹配的。
术语“人白细胞抗原(HLA)”是指编码人主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的基因复合体，其是一组细胞表面蛋白，对于适应性免疫系统识别外来分子所必需的。HLA复合体位于染色体6p21的3Mbp段内。从细胞内部呈递肽的I类MHC蛋白由HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因编码。HLA-A、HLA-B和HLA-C基因多态性较大，而HLA-E、HLA-F和HLA-G基因的多态性较小。还已知HLA-K和HLA-L作为假基因存在。此外，β-2-微球蛋白是由(B2M)基因编码的MHCI类蛋白。HLA-A核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_001242758和NM_002116下列出。HLA-B核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_005514下列出。HLA-C核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_001243042和NM_002117下列出。HLA-E核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_005516下列出。HLA-F核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_018950下列出。HLA-G核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_002127下列出。B2M核苷酸序列的非限制性实例在GenBank参考号NM_004048下列出。
从细胞外侧呈递抗原至T淋巴细胞的II类MHC蛋白由HLA-DP、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DR基因编码。HLA-DM基因包括HLA-DMA和HLA-DMB。HLA-DO基因包括HLA-DOA和HLA-DOB。HLA-DP基因包括HLA-DPA1和HLA-DPB1。HLA-DQ基因包括HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1和HLA-DQB2。HLA-DR基因包括HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5。HLA-DMA和HLA-DMB核苷酸序列的非限制性实例分别以的GenBank参考号NM_006120和NM_002118示出。HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5核苷酸序列的非限制性实例以参考号NM_01911、NM_002124、NM_022555、NM_021983、NM_002125示出。
术语“疫苗”是指当施用给受试者时，具有产生针对受试者中特定病原体或疾病的获得性免疫的能力的生物组合物。通常，将与目标病原体或疾病相关的一种或多种抗原或抗原片段施用给受试者。疫苗可包括例如灭活或减毒的生物体(如，细菌或病毒)、细胞、从细胞表达或在细胞上表达的蛋白(如，细胞表面蛋白)、由生物体产生的蛋白(如，毒素)或生物体部分(如，病毒包膜蛋白。在一些情况下，细胞经工程化以表达蛋白，使得当作为疫苗施用时，它们增强受试者获得针对此特定细胞类型的免疫力的能力(如，增强受试者获得针对癌细胞的免疫的能力)。如本文所用，术语“疫苗”或“全细胞癌症疫苗”包括但不限于本发明的一种或多种经修饰的癌细胞。
术语“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)”是指单体糖蛋白，也被称为“集落刺激因子(CSF2)”，其由细胞诸如巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌。GM-CSF用作影响细胞类型(特别是巨噬细胞和嗜酸性粒细胞)的数量的细胞因子。作为免疫/炎性级联的一部分，GM-CSF刺激干细胞以产生粒细胞(即，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞随后在组织浸润后成熟为巨噬细胞和树突细胞。在GenBank参考号NM_000758下示出了人类中CSF2核苷酸序列(编码GM-CSF的基因)的非限制性实例。
术语“干扰素α(IFNa)”或“IFN-α”是指一组蛋白，它们是被称为干扰素的较大类蛋白的一部分，是由宿主细胞响应于病原体(如，病毒、细菌、寄生虫、肿瘤细胞)合成和释放的信号传导蛋白。干扰素α蛋白由白细胞产生，并且主要参与先天免疫应答。I型干扰素蛋白包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω和IFN-ν。编码IFN-α蛋白的基因包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。人核苷酸序列的非限制性实例分别以基因库参考号NM_024013、NM_000605、NM_021068、NM_002169、NM_021002、NM_021057、NM_002170、NM_002171、NM_006900、NM_002172、NM_002173、NM_021268和NM_002175示出。
术语“存活”是指疾病的诊断和/或开始或完成针对疾病(如，癌症)的特定治疗过程后的一段时间。术语“总体存活”包括描述在被诊断患有或治疗疾病(诸如癌症)后限定时间内存活的患者的临床终点。术语“无疾病存活”包括治疗特定疾病(如癌症)后的时间长度，在此期间患者存活且没有疾病迹象(如，没有已知的复发)。在某些实施方案中，无疾病存活是用于评价特定疗法的功效的临床参数，其通常以1年或5年为单位测量。术语“无进展存活”包括治疗特定疾病(如癌症)期间和之后的时间长度，其中患者带病生活而没有此外的疾病症状。在一些实施方案中，存活表示为中值或平均值。
术语“HER2”、“HER2/neu”和“ERBB2”(也被称为CD340、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2、原癌基因Neu和人表皮生长因子受体2)是指人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。这种生物标志物的扩增或过表达在某些侵袭性类型的癌症(包括乳腺癌)的发展和进展中起着重要作用。因此，HER2已成为至少约30％乳腺癌患者的重要生物标志物和治疗靶标。HER2核苷酸序列的非限制性实例以GenBank参考号NP_001005862、NP_001289936、NP_001289937、NP_001289938和NP_004448示出。HER2肽序列的非限制性实例以GenBank参考号NP_001005862、NP_001276865、NP_001276866、NP_001276867和NP_004439示出。
HER2测试方法包括免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、ELISA和RNA定量(如HER2表达的)方法诸如RT-PCR和微阵列分析。HER2测试是针对正在考虑接受曲妥珠单抗疗法的患者进行的，因为HER2阳性患者更可能对曲妥珠单抗疗法有响应。
当HER2在细胞中被扩增或过表达时，该细胞被称为“HER2阳性”。HER2阳性细胞中HER2扩增或过表达的水平通常表示为0至3范围内的评分(即，HER2 0、HER2 1+、HER2 2+或HER2 3+)，其中更高的分数相对于更大程度的表达。
III.实施方案的详述
A.经修饰的人癌细胞
在一方面，本发明提供了经修饰的人癌细胞，其包含编码人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码HLA I类基因的一种或多种等位基因。在其它实施方案中，重组多核苷酸编码HLA II类基因的一种或多种等位基因。在具体的实施方案中，重组多核苷酸编码HLA I类基因的一种或多种等位基因和HLA II类基因的一种或多种等位基因。
在一些实施方案中，重组多核苷酸被整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，重组多核苷酸存在于细胞中的载体上。在存在多于一种重组多核苷酸的实施方案中，所有重组多核苷酸可以存在于同一载体上，或者每种重组多核苷酸可以存在于单独的载体上。任何数量的组合都是允许的。作为非限制性实例，编码HLA I类基因等位基因的所有重组多核苷酸可以存在于一个载体上，并且编码HLA II类基因等位基因的所有重组多核苷酸可存在于另一个载体上。作为另一个非限制性实例，编码HLA-A基因等位基因的所有重组多核苷酸可以存在于一个载体上，并且编码HLA-B基因等位基因的所有重组多核苷酸可以存在于另一个载体上。
在一些实施方案中，HLA I类基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因或B2M基因。在其它实施方案中，HLA I类基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因和/或B2M基因的组合。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码一种或多种(如，1、2、3、4、5、6或7种)HLA I类基因的等位基因的一种或多种重组多核苷酸。
适合的HLA-A等位基因的实例包括但不限于HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01和HLA-A*02:06。本发明的经修饰的人癌细胞可包含编码HLA-A等位基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
适合的HLA-B等位基因的实例包括但不限于HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01和HLA-B*52:01。本发明的经修饰的人癌细胞可包含编码HLA-B等位基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16种或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
适合的HLA-C等位基因的实例包括但不限于HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03和HLA-C*14:02。本发明的经修饰的人癌细胞可包含编码HLA-C等位基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
在一些实施方案中，HLA II类基因是HLA II类α亚基基因。在其它实施方案中，HLAII类基因是HLA II类β亚基基因。在具体的实施方案中，HLA II类基因是HLA II类α亚基和HLA II类β亚基基因的组合。
在其它实施方案中，HLA II类基因是HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DO基因、HLA-DQ基因和/或HLA-DR基因。在一些情况下，HLA-DO基因是HLA-DOA基因。在其它情况下，HLA-DO基因是HLA-DOB基因。在特定的情况下，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DOA和HLA-DOB基因等位基因两者的重组核苷酸。在一些情况下，HLA-DM基因是HLA-DMA基因。在其它情况下，HLA-DM基因是HLA-DMB基因。在特定的情况下，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DMA和HLA-DMB基因等位基因两者的重组核苷酸。
在一些实施方案中，HLA-DR基因是HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因和/或HLA-DRB5基因。在具体的实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码一种或多种(如，1、2、3、4、5种或更多种)HLA-DR基因的等位基因的重组多核苷酸。
适合的HLA-DRB3等位基因的实例包括但不限于HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01和HLA-DRB3*03:01。本发明的经修饰的人癌细胞可包含编码HLA-DRB3等位基因的一种或多种(如，1、2、3种或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*01:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*02:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*03:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*26:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*29:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*32:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*01:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*01:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*01:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*02:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*02:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*02:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*03:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*03:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*03:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*26:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*26:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*26:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*29:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*29:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*29:02等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*32:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*32:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*32:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*01:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*02:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*03:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*26:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*29:02等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*32:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*01:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*01:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*01:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*02:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*02:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*02:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*03:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*03:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*03:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*26:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*26:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*26:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*29:02等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*29:02等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*29:02等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*32:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*32:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*32:01等位基因及GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*01:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*02:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*03:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*26:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*29:02等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*32:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*01:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*01:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*01:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*02:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*02:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*02:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*03:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*03:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*03:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*26:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*26:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*26:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*29:02等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*29:02等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*29:02等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*32:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*32:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*32:01等位基因及IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*02:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*03:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*26:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*29:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A*32:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*02:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*02:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*02:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*03:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*03:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*03:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*26:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*26:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*26:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*29:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*29:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*29:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*01:01和HLA-A*32:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*02:02和HLA-A*32:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-DRB3*03:01和HLA-A*32:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因和HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因和HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因和HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因和HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因和GM-CSF的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*11:01等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码HLA-A的HLA-A*24:02等位基因、HLA-DRB3的HLA-DRB3*01:01等位基因、GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组多核苷酸。在一些情况下，将编码GM-CSF的重组多核苷酸整合至细胞基因组中。在其它情况下，编码GM-CSF的重组多核苷酸存在于载体上。编码GM-CSF的重组多核苷酸可存在于与编码一种或多种HLA等位基因的重组多核苷酸相同的载体上，或可存在于不同的载体上。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码干扰素α(IFNa)的重组多核苷酸。在一些情况下，将编码IFNa的重组多核苷酸整合至细胞的基因组中。在其它情况下，编码IFNa的重组多核苷酸存在于载体上。编码IFNa的重组多核苷酸可存在于与编码一种或多种HLA等位基因的重组多核苷酸相同的载体上，或可存在于不同的载体上。
在一些实施方案中，经修饰的人癌细胞还包含编码GM-CSF和IFNa的重组多核苷酸。在一些情况下，将编码GM-CSF和/或IFNa的重组多核苷酸整合至细胞的基因组中。在其它情况下，编码GM-CSF和/或IFNa的重组多核苷酸存在于载体上。编码GM-CSF和/或IFNa的重组多核苷酸可存在于与编码一种或多种HLA等位基因的重组多核苷酸相同的载体上，或可存在于不同的载体上。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码一种或多种免疫-刺激基因的重组多肽。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码选自以下的免疫-刺激基因的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)以及它们的组合。在具体的实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码免疫刺激基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码一种或多种癌症/睾丸抗原(CTA)基因的重组多肽。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码选自以下的CTA基因的重组多核苷酸：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)以及它们的组合。在具体的实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码CTA基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8种或更多种)重组多核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码免疫刺激基因和/或CTA基因的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码选自以下的基因的一种或多种多核苷酸：ADA、ADGRE5、CAV1、CD58、CD74、CD83、CXCL8、CXCL16、ICAM3、IL6、IL10、IL15、IL18、KITLG、TNFSF14、PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、PLAC1、OIP5、CABYR、SPAG1以及它们的组合。可将编码免疫刺激和/或CTA基因的重组多核苷酸整合至经修饰的癌细胞的基因组中，或可存在于一种或多种载体上。
在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码表1、表2、表5、表7、表8、表9、表10、表12、表13和表14中列出的一种或多种基因的一种或多种重组多核苷酸。在一些情况下，经修饰的癌细胞还包含一种或多种重组多核苷酸。在具体的实施方案中，经修饰的癌细胞包含编码表1、表2、表5、表7、表8、表9、表10、表12、表13和表14中示出的基因的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300种或更多种重组多核苷酸。在一些情况下，经修饰的癌细胞还包含编码PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、ERBB2、MIEN1、PGAP3或它们的组合的多核苷酸。可将重组多核苷酸整合至经修饰的癌细胞的基因组中，或位于一种或多种载体上。
在优选的实施方案中，本文所述的一种或多种HLA等位基因、一种或多种CTA基因、一种或多种免疫刺激基因、GM-CSF-编码基因、IFNa编码基因和/或一种或多种其它生物标志物由重组多核苷酸编码，由细胞表达。表达可以是瞬时的，或在优选的实施方案中，表达是长期的。在一些实施方案中，HLA等位基因、CTA基因、免疫刺激基因、GM-CSF、IFNa和/或其它生物标志物的表达是可诱导的。
在一些实施方案中，人癌细胞是人癌细胞系。任何数量的人癌细胞或癌细胞系适用于本发明。适合的人癌细胞系的非限制性实例包括SV-BR-1、SVCT、MDA-MB-231、MDA-MB-157、ZR-75-30、ZR-75-1、Hs 578T、MCF7、T47D、MTSV1-7CE1、1-7HB2、VP303、VP267和VP229乳腺癌细胞系，UM-UC-3、T24/83、ECV304、RT4和HT 1197膀胱癌细胞系，MDST8、C170、GP5d、GP2d和LS 123结肠癌细胞系，SHP-77、COR-L23/R、COR-L23/5010、MOR/0.2R、NCI-H69/LX20、ChaGo-K-1和Meta 7肺癌细胞系，MFE-280和MFE-296子宫内膜癌细胞系，CAKI 2、A.704、G-402、ACHN、G-401、UM-RC-7和RCC4plusVHL肾癌细胞系，SK-HEP-1、Hep 3B、PLC/PRF/5、HepG2和Huh-7D12肝癌细胞系，HL60、Eos-HL-60、JVM-13、Sci-1和Ri-1白血病细胞系，BHL-89、COR-L24、U937(CD59+)、My-La CD8+和HGC-27淋巴瘤细胞系，A375-C6、GR-M、VA-ES-BJ、MEWO和COLO 818皮肤癌细胞系，AsPC-1、HuP-T4、HuP-T3、BxPC-3和CFPAC-1胰腺癌细胞系，8505C、8305C、FTC-238、TT、RO82-W-1和K1甲状腺癌细胞系，HeLa DH、HR5-CL11、HtTA-1、HR5、X1/5、HeLa、C-4I、C-4II、HeLa S3、Ca Ski、HeLa229、Hep2(HeLa衍生物)、HeLa B、Bu25TK-HeLa Ohio和HeLa(无AC)子宫颈癌细胞系，NB69、BE(2)-C、BE(2)-M17、SK-N-BE(2)和SK-N-DZ脑癌细胞系，OV7、OV17R、OV58、OV56、A2780ADR、A2780、COLO 720E、SW 626、SK-OV-3、PA-1、59M、OAW28、TO14、PEO23和COV362卵巢癌细胞系，IMR 32腹癌细胞系，SW 13肾上腺皮质癌细胞系，TR146颊粘膜癌细胞系，SK-GT-4食道癌细胞系，TE 671胚胎癌细胞系，FLYRD18纤维肉瘤细胞系，1411H生殖细胞瘤细胞系，MFM-223乳腺癌细胞系，H-EMC-SS肌癌细胞系，Detroit 562咽癌细胞系，BeWo胎盘癌细胞系，Mero-95胸腔癌细胞系，PC-3、LNCap克隆FGC、Shmac 5、P4E6和VCaP前列腺癌细胞系，SW 837、SW 1463、CMT 93、HRT-18,和HRA-19直肠癌细胞系，Y79、WERI和RB247C视网膜癌细胞系，CHP-100脊柱癌细胞系，KARPAS 1718脾淋巴瘤细胞系，AGS和KATO-III胃癌细胞系，NTERA-2克隆D1睾丸癌细胞系，SCC-9、H357、H103、BICR56和PE/CA-PJ49舌癌细胞系，MES-SA/Dx-5、MES-SA、COLO 685和COLO 684子宫癌细胞系，和HMVII阴道癌细胞系。在具体的实施方案中，人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。在一些情况下，人癌细胞系是经修饰的SV-BR-1-GM癌细胞系。本文描述的细胞系和其它细胞系是可例如从Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)获得的。在一些其它实施方案中，经修饰的癌细胞在癌细胞修饰前从待治疗癌症的受试者获得。
在一些实施方案中，一种或多种HLA等位基因、一种或多种生物标志物、GM-CSF和/或IFNa的表达在两种或多种不同的启动子的控制下。在一些情况下，每个等位基因、生物标志物、GM-CSF和/或IFNa的表达在单独的启动子的控制下。在一些实施方案中，一种或多种HLA等位基因、一种或多种生物标志物、GM-CSF和/或IFNa的表达在单个启动子的控制下。在一些情况下，一种或多种HLA等位基因、一种或多种生物标志物、GM-CSF和/或IFNa表达为多顺反子mRNA。在特定的情况下，一种或多种顺反子由内部核糖体进入位点来分隔。
B.用于选择全细胞癌症疫苗的方法
在另一方面，本发明提供了用于为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
(a)检测从受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，以生成受试者的HLA等位基因谱；
(b)基于全细胞癌症疫苗中的一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，将受试者的HLA等位基因谱与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱进行比较；和
(c)当受试者的HLA等位基因谱与全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。
在一些实施方案中，一种或多种HLA I类基因的一种或多种等位基因被检测到并用于生成等位基因谱。在其它实施方案中，一种或多种HLA II类基因的一种或多种等位基因被检测到并用于生成等位基因谱。在其它实施方案中，一种或多种HLAI类基因的一种或多种等位基因和一种或多种HLA II类基因的一种或多种等位基因被检测到并用于生成等位基因谱。
在一些实施方案中，HLA I类基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因或B2M基因。在其它实施方案中，HLA I类基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因和/或B2M基因的组合。在一些实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6或7种)HLA I类基因。
适合的HLA-A等位基因的实例包括但不限于HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01和HLA-A*02:06。在一些实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种)HLA-A等位基因。在一些实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-A等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
适合的HLA-B等位基因的实例包括但不限于HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01和HLA-B*52:01。在一些实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16种或更多种)HLA-B等位基因。在一些实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-B等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
适合的HLA-C等位基因的实例包括但不限于HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03和HLA-C*14:02。在一些实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)HLA-C等位基因。在一些实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-C等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
在一些实施方案中，HLA II类基因是HLA II类α亚基基因。在其它实施方案中，HLAII类基因是HLA II类β亚基基因。在具体的实施方案中，HLA II类基因是HLA II类α亚基和HLA II类β亚基基因的组合。
在其它实施方案中，HLA II类基因是HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DO基因、HLA-DQ基因和/或HLA-DR基因。在一些情况下，HLA-DO基因是HLA-DOA基因。在其它情况下，HLA-DO基因是HLA-DOB基因。在特定的情况下，缺失HLA-DOA和HLA-DOB基因两者的等位基因。在一些情况下，HLA-DM基因是HLA-DMA基因。在其它情况下，HLA-DM基因是HLA-DMB基因。在特定的情况下，缺失HLA-DMA和HLA-DMB基因两者的等位基因。
在一些实施方案中，HLA-DR基因是HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因和/或HLA-DRB5基因。在具体的实施方案中，缺失一种或多种(如，1、2、3、4、5种或更多种)HLA-DR基因的等位基因。
适合的HLA-DRB3等位基因的实例包括但不限于HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01和HLA-DRB3*03:01。在一些实施方案中，缺失编码HLA-DRB3等位基因的一种或多种(如，1、2、3或更多种)重组多核苷酸。在一些实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约5％的最大频率存在。在其它实施方案中，所选择用于检测的一种或多种HLA-DRB3等位基因各自以群体中至少约2％的中位频率并且以群体中至少约5％的最大频率存在。
在一些实施方案中，等位基因谱包含HLA-A的HLA-A*11:01或HLA-A*24:02等位基因以及HLA-DRB3的HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
在一些实施方案中，当在受试者的HLA等位基因谱与疫苗的HLA等位基因谱之间存在完全匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。在一些情况下，受试者谱中存在的所有HLA等位基因存在于疫苗谱中。在其它情况下，疫苗谱中存在的所有HLA等位基因存在于受试者谱中。在其它实施方案中，当在受试者的HLA等位基因谱与疫苗的HLA等位基因谱之间存在部分匹配时，为受试者选择全细胞癌症疫苗。在一些情况下，当受试者谱中存在的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46种或更多种)等位基因存在于疫苗谱中时，存在部分匹配。在一些情况下，当疫苗谱中存在的一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46种或更多种)等位基因存在于受试者谱中时，部分匹配存在。在一些情况下，当在受试者的等位基因谱与疫苗的等位基因谱之间存在至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％匹配时，部分匹配存在。
在其它实施方案中，该方法包括：
检测从所述受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的存在或水平；
将从受试者获得的样品中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平与对照样品中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平进行比较；和
基于比较，为受试者选择全细胞癌症疫苗，其中全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。在一些情况下，乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
在一些其它实施方案中，该方法包括：
测量从所述受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量；
将从受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性和/或数量与对照样品中的一种或多种免疫细胞的活性和/或数量进行比较；和
基于比较，为受试者选择全细胞癌症疫苗，其中全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。在一些情况下，乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
在其它实施方案中，该方法包括：
检测从所述受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的存在或水平；和/或
测量从所述受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量；
将从受试者获得的样品中检测的一种或多种生物标志物的存在或水平和/或从受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量与对照样品中的一种或多种生物标志物的存在或水平和/或一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量进行比较；和
基于比较，为受试者选择全细胞癌症疫苗，其中全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。在一些情况下，乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
适用于本发明的方法的生物标志物包括但不限于表1、表2、表5、表7、表8、表9、表10、表12、表13和表14中列出的那些。在一些实施方案中，检测到表1、表2、表5、表7、表8、表9、表10、表12、表13和表14中列出的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300种或生物标志物。
在一些实施方案中，检测到一种或多种免疫刺激基因的存在或水平。在具体的实施方案中，一种或多种免疫刺激基因选自：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)以及它们的组合。在具体的实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)免疫刺激基因。
在一些实施方案中，检测到一种或多种癌症/睾丸抗原(CTA)基因。在一些实施方案中，一种或多种CTA基因选自：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)以及它们的组合。在具体的实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8种或更多种)CTA基因。
在一些实施方案中，检测到一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或更多种)免疫刺激和/或CTA基因。在一些实施方案中，检测到选自以下的一种或多种基因：ADA、ADGRE5、CAV1、CD58、CD74、CD83、CXCL8、CXCL16、ICAM3、IL6、IL10、IL15、IL18、KITLG、TNFSF14、PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、PLAC1、OIP5、CABYR、SPAG1。
在一些实施方案中，检测到的一种或多种生物标志物选自：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)、α-1,3-葡糖基转移酶(ALG8)、肌动蛋白相关的蛋白2/3复合体、亚基5样(ARPC5L)、染色盒同系物2(CBX2)、胶原VIII型α1链(COL8A1)、DDB1和CUL4相关因子10、(DCAF10)、真核翻译起始因子3亚基H(EIF3H)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、组蛋白簇1H4家族成员h(HIST1H4H)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)、整合因子复合体亚基7(INTS7)、角蛋白19(KRT19)、角蛋白81(KRT81)、甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶、同工酶A(MGAT4A)、迁移和侵袭增强子1(MIEN1)、后-GPI附着蛋白3(PGAP3)、重构和间隔因子1(RSF1)、含SH2结构域的衔接子蛋白B(SHB)、可溶载体家族35，成员A2(SLC35A2)、含血影蛋白重复的核被膜家族成员4(SYNE4)、转运蛋白1(TNPO1)以及它们的组合。在一些情况下，选择的一种或多种生物标志物选自：PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。在特定的情况下，一种或多种生物标志物是PRAME。在其它情况下，一种或多种生物标志物选自：ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
与本发明相关的一些血清/血浆生物标志物(“分析物”)在表1中提供。流体中的分析物诸如血清或血浆的水平可以经由Luminex多重测定来测量。推荐的聚苯乙烯和磁珠测定的稀释液可从www.rndsystems.com/luminex/analytes获得。应当注意，虽然表1中与本发明相关的分析物被分类为“血清/血浆生物标志物”，但这些生物标志物的水平也可以在其它生物流体诸如尿液中进行评估。
表1：血清/血浆生物标志物
在一些实施方案中，与对照样品相比，当在从受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的至少一种的水平过表达时，为受试者选择疫苗。在一些情况下，对照样品包含从受试者获得的正常细胞或组织。在其它情况下，对照样品包括从不同的受试者或受试者群体获得的正常细胞或组织。受试者群体可用于建立用于比较的参考范围。
在一些实施方案中，当一种或多种(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300种或更多种)生物标志物相较于对照样品过表达时，为受试者选择疫苗。在其它实施方案中，当一种或多种生物标志物的一个或多个水平相较于对照样品高至少约1.5倍(如，约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或更多倍)时，为受试者选择疫苗。在一些情况下，当一种或多种生物标志物的至少一种相较于对照样品过表达至少约1.5倍时，为受试者选择疫苗。
在一些实施方案中，当从受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量相较于对照样品更高时，为受试者选择疫苗。在一些情况下，对照样品包括从没有患有癌症的不同的受试者或没有患有癌症的受试者群体获得的一种或多种免疫细胞。受试者群体可用于建立用于比较的参考范围。在其它实施方案中，当从受试者获得的免疫细胞的活性水平和/或数量相较于对照样品高至少约1.5倍(如，约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或更多倍)时，为受试者选择疫苗。在一些情况下，当从受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性和/或数量的一个或多个水平相较于对照样品高至少约1.5倍时，为受试者选择疫苗。
任何数量的免疫细胞类型可用于根据本发明的方法为受试者选择全细胞癌症疫苗。适合的细胞的非限制性实例包括外周血液单核细胞(PBMC)、淋巴细胞(如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞)、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞和骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，其中测量活性水平和/或数量的一种或多个免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞(如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞)和/或树突细胞。
检测本发明的生物标志物的存在或水平的方法对于本领域技术人员来说是已知的。检测生物标志物的存在或水平可包括，例如测量DNA水平(如，基因组DNA拷贝数、mRNA或cDNA定量)或蛋白水平(如，定量样品中存在的蛋白的量，测量蛋白活化或修饰的量，或检测抗体)。在一些实施方案中，使用选自以下的方法检测生物标志物的存在或水平：定量PCR、微阵列分析、ELISA、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫荧光、FACS分析、电化学发光、多重珠粒测定(如，使用Luminex或荧光微珠)、免疫组织化学、蛋白质印迹、斑点印迹以及它们的组合。
检测免疫细胞活性水平和/或数量的方法将是本领域技术人员已知的。适合的方法的非限制性实例包括抗体检测(如，使用ELISA或蛋白质印迹)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定(如，铬释放测定、IFN-γELISpot测定或基于多因子流式细胞术的测定)、细胞毒性测定、增殖测定(如，胸苷掺入测定、比色测定(如，MTT测定、WST1测定或刃天青测定)或ATP定量测定(如，基于生物发光的ATP检测测定))、细胞因子产生测定(如，ELISpot测定或ELISA(如，对培养物上清液或血清))、流式细胞术测定和MHC多聚体测定。在MHC多聚体测定中，荧光标记的肽-MHC复合体的多聚体用于对细胞诸如肽特异性T细胞进行染色。该肽可以是例如肿瘤相关抗原(TAA)诸如PRAME或其它生物标志物。通常，多聚体是四聚体或五聚体，尽管其它构型也是可能的。在一些情况下，荧光团或珠粒(如磁珠)的缀合允许T淋巴细胞的分离和/或分选(如，使用流式细胞术)。
在一些实施方案中，用于检测一种或多种生物标志物、测量免疫细胞活性或数量或进行HLA分型的抗体或其复数形式可以固定在固体支持物上。固体支持物可以是例如多孔板、微阵列、芯片、珠粒、多孔条带或硝基纤维素过滤器。在一些情况下，珠粒包含几丁质。固定可以经由共价或非共价结合进行。
经标记的二级抗体可用于检测抗体与生物标志物、免疫细胞和/或HLA抗原之间的结合。二级抗体结合至免疫球蛋白IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的不同类别或同种型的恒定或“C”区域。通常，在本方法中使用针对IgG恒定区的二级抗体。针对IgG亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的二级抗体也可用于本方法中。二级抗体可以用任何直接或间接可检测的部分标记，包括荧光团(如荧光素、藻红蛋白、量子点、Luminex珠、荧光珠)、酶(如，过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(如，3H、32P、125I)或化学发光部分。可以使用生物素的复合体和生物素结合部分(如，亲和素、链霉亲和素、中性亲和素)放大标记信号。荧光标记的抗人IgG抗体可从如Molecular Probes(Eugene,OR)商购获得。酶标记的抗人IgG抗体可从如Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)和Chemicon(Temecula,CA)商购获得。
通用免疫测定技术是本领域熟知的。用于优化参数的指导可参见，例如，Wu,Quantitative Immunoassay:A Practical Guide for Assay Establishment,Troubleshooting,and Clinical Application,2000,AACC Press；Principles andPractice of Immunoassay,Price和Newman编,1997,Groves Dictionaries,Inc.；TheImmunoassay Handbook,Wild编,2005,Elsevier Science Ltd.；Ghindilis,Pavlov和Atanassov,Immunoassay Methods and Protocols,2003,Humana Press；Harlow和Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,1998,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；以及Immunoassay Automation:An Updated Guide to Systems,Chan编,1996,Academic Press。
在某些实施方案中，一种或多种生物标志物、免疫细胞和/或HLA抗原的存在或者存在减少或存在增加由免疫测定中的可检测的信号(如，印迹、荧光、化学发光、颜色、放射活性)表示。可以将该可检测信号与来自对照样品的信号或阈值进行比较。
在一些实施方案中，生物标志物存在或水平测定、免疫细胞测量和/或HLA分型的结果记录在有形介质中。例如，结果可以记录在如纸上或电子媒体上(如，录音带、计算机磁盘、CD、闪存驱动器等)。
在一些实施方案中，在测量活性和/或数量之前刺激免疫细胞(如，在体外刺激经分离的免疫细胞)。在一些情况下，用抗原蛋白诸如TAA(如，PRAME)或本文所述的其它生物标志蛋白刺激免疫细胞。在特定的情况下，通过暴露于全细胞(如，癌细胞或经修饰的癌细胞)来刺激免疫细胞。
在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含如本文所述的一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因。在具体的实施方案中，当从受试者获得的样品中的一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因与疫苗中的一种或多种基因的一种或多种等位基因匹配时，为受试者选择疫苗。所述匹配可以是完全匹配或部分匹配，如本文所述。
本领域技术人员已知的HLA分型方法通常分为表型分型和基因分型的方法。通常，表型分析方法涉及使用单克隆抗体来检测HLA抗原，尽管血清学方法(如，补体依赖性细胞毒性测定)也是已知的。基因分型方法通常涉及HLA等位基因的PCR扩增。在扩增之后，可以使用基于高分辨率序列的分型方法或低分辨率方法，诸如序列特异性引物分型或序列特异性寡核苷酸探针方法。
在一些实施方案中，从受试者获得的样品包括全血、血浆、血清、脑脊液、组织、唾液、口腔细胞、肿瘤组织、生物流体(如，尿液、胸腔积液样品)、毛发、皮肤或它们的组合。对于HLA分型，任何细胞、组织或生物流体类型都是适合的，只要它含有足够量的DNA或RNA以允许分型。在一些情况下，该样品包含循环肿瘤细胞(CTC)。样品也可以由正常细胞和癌细胞的组合组成。
样品可以通过活检、从手术切除物、作为细针抽吸物或通过产生足够数量的细胞或量的组织的任何其它方法获得，使得可进行生物标志物的检测、免疫细胞活性和/或数量的测量、或HLA分型。
C.组合物
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的本发明的经修饰的人癌细胞的组合物。经修饰的癌细胞可如本文所述包含一种或多种HLA I类基因的一种或多种等位基因、一种或多种HLA II类基因的一种或多种等位基因或它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的癌细胞还包含编码本文所述的一种或多种生物标志物的一种或多种重组多核苷酸。在一些情况下，一种或多种生物标志物包含一种或多种CTA基因和/或一种或多种免疫-刺激基因。在一些实施方案中，一种或多种HLA等位基因和/或生物标志物由经修饰的人癌细胞表达。表达可为瞬时或长期的。在一些情况下，表达是可诱导的。
在一些实施方案中，组合物还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在具体的实施方案中，GM-CSF由重组多核苷酸编码并由经修饰的细胞表达。在特定的情况下，GM-CSF由同一经修饰的细胞(即，经修饰的癌细胞)表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它情况下，GM-CSF不由同一经修饰的细胞(如，经修饰的癌细胞)表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在一些实施方案中，GM-CSF以可溶形式存在于组合物中。
在一些实施方案中，组合物还包含干扰素α(IFNa)。在具体的实施方案中，IFNa由同一经修饰的细胞(如，经修饰的癌细胞)表达，所述细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。在其它实施方案中，IFNa由已修饰以表达IFNa的不同的细胞表达。在一些实施方案中，IFNa以可溶形式存在。
在一些实施方案中，人癌细胞是人癌细胞系。如本文所述，任何数量的人癌细胞系适用于本发明。在具体的实施方案中，人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。在一些情况下，人癌细胞系是经修饰的SV-BR-1-GM癌细胞系
在另一方面，本发明提供了药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的组合物和药学上可接受的载体。药物组合物的制剂是本领域众所周知的(参见，如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。通过添加一种或多种不同的抗细菌剂和抗真菌剂可以实现微生物体污染预防。
适用于施用的药物形式包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。典型的载体包括溶剂或分散介质，其含有例如水缓冲的水溶液(即，生物相容性缓冲液，其非限制性实例包括乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer’ssolution)和CryoStor冷冻保存介质(如，分别含有2％、5％和10％的DMSO的CS2、CS5和CS10；可从BioLife Solutions,Bothell,WA获得))、乙醇、多元醇诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其合适的混合物、表面活性剂或植物油。
灭菌可通过本领域公认的技术完成，包括但不限于添加抗细菌剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸或硫柳汞。此外，等渗剂诸如糖或氯化钠可以掺入本组合物中。
含有一种或多种经修饰的癌细胞和/或本发明的其它组合物的无菌可注射溶液的产生可以根据需要通过将所需的一个或多个量的一种或多种化合物掺入具有以上列举的各种成分的适当溶剂中、然后灭菌来实现。为了获得无菌粉末，可以根据需要将上述无菌溶液真空干燥或冷冻干燥。
在一些实施方案中，一种或多种经修饰的癌细胞和/或本文提供的一种或多种其它组合物经配制用于以便于施用和剂量均匀的单位剂型施用，如真皮内注射、淋巴管内注射、经口、经鼻、局部或肠胃外施用。如本文所用，单位剂量形式通常是指适合作为受试者(如人或其它待治疗的哺乳动物)的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算与所需的药物载体组合产生所需的治疗作用的预定量的活性物质。在一些情况下，可以制备更浓的剂型，然后可以从中产生更稀的单位剂型。因此，更浓剂型含有基本上大于一种或多种经修饰的癌细胞和/或一种或多种其它组合物的量，如是一种或多种经修饰的癌细胞和/或一种或多种其它组合物的量的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。
剂量可包括例如，约50,000至50,000,000(如，约50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000、900,000、950,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、5,500,000、6,000,000、6,500,000、7,000,000、7,500,000、8,000,000、8,500,000、9,000,000、9,500,000、10,000,000、11,000,000、12,000,000、13,000,000、14,000,000、15,000,000、16,000,000、17,000,000、18,000,000、19,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。在一些实施方案中，剂量可含有约5,000,000个经修饰的癌细胞。
剂量还可包括例如，至少约5,000,000至100,000,000(如，约5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000、55,000,000、60,000,000、65,000,000、70,000,000、75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000、100,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。
剂量可以可替代地包括例如至少约100,000,000至1,000,000,000(如，约100,000,000、150,000,000、200,000,000、250,000,000、300,000,000、350,000,000、400,000,000、450,000,000、500,000,000、550,000,000、600,000,000、650,000,000、700,000,000、750,000,000、800,000,000、850,000,000、900,000,000、950,000,000、1,000,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。
在一些实施方案中，辐照经修饰的癌细胞。辐照剂量可以例如为约2至2,000Gy(如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900或2,000Gy)。在具体的实施方案中，用约200Gy的剂量辐照经修饰的癌细胞。
用于制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知的(参见，如REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)。剂型通常包含常规的药物载体或赋形剂，并且可以还包含其它药剂、载体、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。适当的赋形剂可以通过本领域熟知的方法(参见，如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)调整以适应特定剂型和施用途径。
适合的赋形剂包括但不限于，乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸诸如Carbopol，如Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981等。剂型可以此外包含润滑剂诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；助悬剂；防腐剂诸如甲基-羟基-苯甲酸酯、乙基-羟基-苯甲酸酯和丙基-羟基-苯甲酸酯(即对羟基苯甲酸酯)；pH调节剂诸如无机和有机酸和碱；甜味剂；和调味剂。剂型还可包含可生物降解的聚合物珠粒、右旋糖酐和环糊精包合物复合体。
在一些实施方案中，用于施用的组合物可以是经口递送媒介物，诸如胶囊、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的组合物以向患者提供正确的递增剂量。经口递送媒介物可以用于例如避免组合物与口腔和上胃肠道之间的接触。对于经口施用，治疗有效剂量可以呈片剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、溶液、糖浆剂、喷雾剂、锭剂、粉剂和持续释放制剂的形式。适用于经口施用的赋形剂包括药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在一些实施方案中，治疗有效剂量采取药剂、片剂或胶囊剂的形式，并因此剂型可以连同一种或多种经修饰的癌细胞和/或一种或多种本文所述的其它组合物，所述其它组合物为以下中的任一种：稀释剂诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂诸如淀粉或其衍生物；润滑剂诸如镁硬脂酸等；以及粘合剂，诸如淀粉、阿拉伯树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。
在一些实施方案中，适合的载体掩蔽组合物(如，一种或多种经修饰的癌细胞和/或来自口腔和上胃肠(GI)道的一种或多种其它组合物)并且减少或阻止在施用期间在这些区域中发生局部瘙痒/肿胀反应。例如，载体可含有一种或多种脂质、多糖或蛋白成分。在某些情况下，载体是食品。
对于局部施用，治疗有效剂量可以呈乳剂、洗剂、凝胶剂、泡沫、乳剂、胶凝剂、溶液、混悬剂、软膏剂和透皮贴剂的形式。对于通过吸入进行的施用，本文所述的一种或多种经修饰的癌细胞和/或一种或多种其它组合物可以经由喷雾器以干粉或液体形式递送。可以将气雾剂制剂置于加压可接受的推进剂(诸如二氯二氟甲烷)中。对于肠胃外施用，治疗有效剂量可以呈无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。优选地，可注射溶液在约4.5至约7.5的pH下进行配制。
治疗有效剂量也可以冻干形式提供。此类剂型可以包含缓冲剂例如碳酸氢盐以用于在施用之前复溶，或者缓冲剂可以包含在冻干剂型中以用于用水复溶。冻干剂型还可以包含适合的血管收缩剂，如肾上腺素。冻干剂型可以在注射器中提供，任选地与用于复溶的缓冲剂组合包装，使得复溶的剂型可以立即施用于个体。
在一些实施方案中，治疗有效剂量还可包含其它组分，例如抗过敏药，诸如抗组胺、类固醇、支气管扩张剂、白三烯稳定剂和肥大细胞稳定剂。适合的抗过敏药是本领域熟知的。
D.用于治疗癌症的方法
在另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的本发明的药物组合物(如，包含本发明的经修饰的癌细胞的药物组合物)。
在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用一种或多种其它疗法。适合的其它类型的实例包括但不限于化学疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、分化剂和小分子药物。本领域的技术人员将能够容易选择适当的其它疗法。
可用于本发明的化疗剂包括但不限于烷基化剂(如，氮芥(如，二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑)、亚硝基脲(如，链脲佐菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀)、磺酸烷基酯(如，白消安)、三嗪(如，达卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺)、乙烯亚胺(如，噻替派、六甲蜜胺(六甲基三聚氰胺)))、铂药物(如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞)、蒽环霉素抗肿瘤抗生素(如，道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星)、非蒽环抗肿瘤抗生素(如，放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌)、有丝分裂抑制剂(如，紫杉烷(如，紫杉醇、多西他赛)、埃坡霉素(如，伊沙匹隆)、长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、长春瑞滨)、长春瑞滨)、皮质类固醇(如，泼尼松、甲基泼尼松龙、地塞米松)、L-天冬酰胺酶、硼替佐米和拓扑异构酶抑制剂。可以使用化疗剂的组合。
拓扑异构酶抑制剂是抑制拓扑异构酶活性的化合物，它是通过催化DNA链主链中磷酸二酯键断裂和重新连接而促进DNA结构变化的酶。DNA结构的这种变化对于正常细胞周期期间的DNA复制是必需的。拓扑异构酶抑制剂在细胞周期期间抑制DNA连接，导致单链和双链断裂的数量增加并从而导致基因组稳定性退化。此类基因组稳定性的退化导致凋亡和细胞死亡。
拓扑异构酶通常分为I型和II型拓扑异构酶。I型拓扑异构酶对于DNA复制和转录过程中DNA超螺旋的放松至关重要。I型拓扑异构酶生成DNA单链断裂并还重新连接所述断裂以重建完整的双链体DNA分子。拓扑异构酶I型的抑制剂的实例包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱和片螺素D，它们全部靶向IB型拓扑异构酶。
II型拓扑异构酶抑制剂大致分为拓扑异构酶毒物和拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶毒物靶向拓扑异构酶-DNA复合体，而拓扑异构酶抑制剂扰乱酶催化转换。II型拓扑异构酶抑制剂的实例包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星和氟喹诺酮。
在一些实施方案中，化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。在一些情况下，拓扑异构酶抑制剂是拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂或它们的组合。在具体的实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自：多柔比星、依托泊苷、替尼泊苷、道诺霉素、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱、金精三羧酸、HU-331、伊立替康、拓扑替康、喜树碱、片螺素D、白藜芦醇、染料木素、槲皮黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)以及它们的组合。EGCG是用作适合的拓扑异构酶抑制剂的植物源性天然苯酚的一个实例。在一些情况下，拓扑异构酶抑制剂是多柔比星。
免疫疗法是指任何使用受试者的免疫系统来对抗疾病(如，癌症)的治疗。免疫疗法可以涉及增强或抑制免疫功能。在癌症疗法的背景下，免疫疗法方法通常涉及增强或激活免疫功能。在一些情况下，免疫治疗剂包含靶向特定类型或部分的癌细胞的单克隆抗体。在一些情况下，抗体与诸如药物分子或放射性物质的部分缀合。抗体可以来源于嵌合性或人源化小鼠作为非限制性实例。治疗性单克隆性抗体的非限制性实例包括阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、伊匹单抗(MDX-101)、纳武单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗。
免疫治疗剂还可以包含免疫检查点抑制剂，其调控免疫系统区分正常和“外来”细胞的能力。程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和蛋白死亡配体1(PD-L1)是免疫检查点抑制剂的共同靶标，因为破坏PD1和PD-L1之间的相互作用增强了免疫细胞抗外来细胞诸如癌细胞的活性。PD-1抑制剂的实例包括派姆单抗和纳武单抗。PD-L1抑制剂的实例是阿特朱单抗。
用于治疗癌症的另一种免疫检查点靶标是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，其是下调免疫细胞响应的受体。因此，抑制CTLA-4的药物可以增加免疫功能。此类药物的一个实例是伊匹单抗，其是结合至并抑制CTLA-4的单克隆抗体。
术语“放射疗法”是指递送高能量辐照给用于治疗疾病(如，癌症)的受试者。放射疗法可以包括X射线、γ射线和/或带电粒子的递送。放射疗法可以局部(如至肿瘤的位点或区域)或全身(如放射性物质诸如放射性碘全身施用，并前往肿瘤位点)递送。
术语“激素疗法”是指激素合成、激素受体拮抗剂或激素补充剂的抑制剂。激素合成的抑制剂包括但不限于芳香酶抑制剂和促性腺激素释放激素(GnRH)类似物。激素受体拮抗剂包括但不限于选择性受体拮抗剂和抗雄激素药物。激素补充剂包括但不限于孕激素、雄激素、雌激素和生长抑素类似物。芳香酶抑制剂例如用于治疗乳腺癌。非限制性实例包括来曲唑、阿那曲唑和氨基格鲁米特。例如，可以使用GnRH类似物来诱导化学阉割。通常用于治疗乳腺癌的选择性雌激素受体拮抗剂包括他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬和氟维司群。结合至并抑制雄激素受体的抗雄激素药物通常用于抑制睾酮对前列腺癌的生长和存活作用。非限制性实例包括氟他米特、阿帕鲁胺和比卡鲁胺。
术语“分化剂”是指促进细胞分化的任何物质，其在癌症的背景下可促进恶性细胞呈现较少的干细胞样状态。抗癌症分化剂的非限制性实例是视黄酸。
小分子药通常是具有低分子量(即小于约900道尔顿)的药理学试剂。用于治疗癌症的小分子药物的非限制性实例包括硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)、伊马替尼(酪氨酸激酶抑制剂)和塞利西利(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)及epacadostat(吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂)。
在一些实施方案中，治疗本发明的癌症的方法还包括根据本文所述的本发明的方法为受试者选择全细胞癌症疫苗。在具体的实施方案中，受试者具有I期、II期、III期和/或IV期癌症。在其它阶段之间，癌症正在各期之间转变。在一些实施方案中，受试者具有癌症前病变。在一些实施方案中，受试者没有患有癌症。
在一些实施方案中，治疗受试者包括抑制癌细胞生长，抑制癌细胞增殖，抑制癌细胞迁移，抑制癌细胞侵袭，改善或消除癌症的症状，减小癌症肿瘤的尺寸(如，体积)，降低癌症肿瘤的数量，降低癌细胞的数量，诱导癌细胞坏死、细胞焦亡、胀亡、凋亡、自噬或其它细胞死亡，或增强组合物或药物组合物的治疗作用。在一些实施方案中，治疗受试者导致存活时间增加。在一些情况下，总体存活增加。在其它情况下，无病存活增加。在一些情况下，无进展存活增加。在具体的实施方案中，治疗受试者导致肿瘤体积减少和/或存活时间增加。
在具体的实施方案中，治疗受试者增强了抗癌疗法诸如化疗剂、免疫治疗剂、放射疗法、激素疗法、分化剂和/或小分子药物的治疗作用。
本发明的疗法诸如一种或多种经修饰的癌细胞、一种或多种组合物和一种或多种药物组合物可以使用本领域技术人员容易知道的途径、剂量和方案来施用。施用可以每天进行一次、每两天进行一次、每三天进行一次、每四天进行一次、每五天进行一次、每六天进行一次或每周进行一次。疗法可以每周施用、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次。在一些情况下，本发明的一种或多种经修饰的癌细胞、一种或多种组合物和/或一种或多种药物组合物以单剂量施用、共施用(如，以单独剂量或通过不同的途径但在时间上紧密相连施用)或单独施用(如，以不同的剂量，包括相同或不同的途径但由约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时或更多个小时隔开地施用)。在同一天施用多剂量或者单剂量包含一种或多种组分(如，一种或多种经修饰的癌细胞和IFNa分开施用)的情况下，施用可以例如在一天中发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次或更多次。
在一些情况下，治疗性施用可以每周发生约一次、每两周发生约一次、每三周发生一次或每月约一次。在一些情况下，治疗性施用可以每月发生约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30次或更多次。治疗可以持续约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更多个月；或更久。在治疗期间的任何时间，治疗性计划可以根据需要进行调整。例如，根据对本发明的一种或多种经修饰的癌细胞、组合物或一种或多种药物组合物的响应，可以选择不同的疫苗、一种或多种此外的治疗剂或治疗药物可以选择，或治疗计划的任何方面可以停止。本领域的技术人员很容易做出这样的决定，其可以通过例如等位基因谱比较的结果、免疫细胞的活性和/或数量的变化和/或一种或多种生物标志物的存在或水平的变化而获得启示。
本发明的一种或多种经修饰的癌细胞、一种或多种组合物和一种或多种药物组合物可通过任何适合的途径(包括本文所述的那些途径)施用。在一些实施方案中，施用是通过真皮内或淋巴管内注射进行的。在一些实施方案中，全细胞癌症疫苗(如本发明的经修饰的癌细胞)与干扰素α(IFNa)分开给予。在一些情况下，局部注射IFNa。IFNa可以在施用疫苗之前和/或之后给予。单独注射的时间可以是任何适合的间隔，包括本文所述的那些间隔。
本领域的技术人员将容易能够施用一定数量的适当的经修饰的癌细胞以包含在特定剂量中。剂量可包括例如约50,000至50,000,000个(如，约50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000、900,000、950,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、5,500,000、6,000,000、6,500,000、7,000,000、7,500,000、8,000,000、8,500,000、9,000,000、9,500,000、10,000,000、11,000,000、12,000,000、13,000,000、14,000,000、15,000,000、16,000,000、17,000,000、18,000,000、19,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。在一些实施方案中，剂量可含有约5,000,000个经修饰的癌细胞。
剂量还可包括例如至少约5,000,000至100,000,000个(如，约5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000、55,000,000、60,000,000、65,000,000、70,000,000、75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000、100,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。
剂量可以可替代地包括例如至少约100,000,000至1,000,000,000个(如，约100,000,000、150,000,000、200,000,000、250,000,000、300,000,000、350,000,000、400,000,000、450,000,000、500,000,000、550,000,000、600,000,000、650,000,000、700,000,000、750,000,000、800,000,000、850,000,000、900,000,000、950,000,000、1,000,000,000个或更多个)经修饰的癌细胞。
在一些实施方案中，辐照经修饰的癌细胞。辐照剂量可以为例如约2至2,000Gy(如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900Gy或2,000Gy)。在具体的实施方案中，用约200Gy的剂量辐照经修饰的癌细胞。
在一些实施方案中，治疗受试者导致在从受试者获得的样品中测量或检测的一种或多种生物标志物的存在或水平降低。在一些实施方案中，治疗受试者导致在从受试者获得的样品中测量或检测的一种或多种生物标志物的存在或水平增加。在具体的实施方案中，治疗受试者导致一种或多种生物标志物的存在或水平不改变。
在一些实施方案中，治疗受试者导致一种或多种免疫细胞的活性和/或数量增加。在一些情况下，增加是在一种细胞类型中产生的。在其它情况下，增加是在多种细胞类型中产生的。在一些实施方案中，其中活性水平和/或数量增加的细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞(如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。在具体的实施方案中，一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量使用本文所述的本发明的方法测量。
在一些实施方案中，免疫细胞活性和/或数量的增加表明应向该受试者施用一种或多种此外剂量的药物组合物(如，包含本发明的经修饰的癌细胞)。在一些情况下，施用不同的疫苗。本领域的技术人员将认识到，在已施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多个剂量的疫苗之后，在一些情况下会发生免疫细胞活性和/或数量的增加。
在一些实施方案中，样品是从受试者获得的。在其它实施方案中，样品是从不同的受试者或受试者群体获得的。样品可用于选择本发明的适当的癌症疫苗、监测对疫苗疗法的响应和/或预测受试者将如何对疫苗疗法作出响应。例如，可以使用从不同受试者和/或受试者群体获得的样品来建立参考范围以促进作为本发明方法的一部分的比较。样品可以在任何时间，包括在一种或多种经修饰的癌细胞、一种或多种药物组合物和/或一种或多种本发明的其它组合物之前和/或之后获得。在一些实施方案中，样品包括全血、血浆、血清、脑脊液、组织、唾液、口腔细胞、肿瘤组织、尿液、从胸腔积液获得的液体、毛发、皮肤或它们的组合。通常，该样品可包括任何生物流体。对于HLA分型，任何细胞、组织或生物流体类型都是适合的，只要它含有足够量的DNA或RNA以允许分型。在一些情况下，该样品包括循环肿瘤细胞(CTC)。样品也可以由正常细胞和癌细胞的组合组成。在具体的实施方案中，该样品包括循环肿瘤细胞(CTC)。例如，可以从活检、从手术切除物和/或作为细针抽吸物(FNA)获得样品。样品可用于确定、测量或检测一种或多种HLA等位基因、免疫细胞活性和/或数量和/或一种或多种生物标志物，如本文所述。
在一个实施方案中，HLA分型(如，等位基因谱中存在的等位基因，等位基因谱的比较结果)、免疫细胞活性和/或数量测量和/或生物标志物存在或水平测定的结果记录在有形介质中。例如，测定(如，等位基因谱中存在的等位基因、等位基因谱比较的结果、免疫细胞的活性水平和/或数量、一种或多种生物标志物的存在或水平(如，表达))和/或预后或诊断(如，是否存在癌症，预测受试者是否将对疫苗响应，或受试者是否正在对疫苗响应)的结果可以记录在纸上或电子媒体上(如，录音带、计算机磁盘、CD、闪存驱动器等)。
在其它实施方案中，该方法还包括提供对患者(即受试者)的测定、预后和/或诊断的结果和/或治疗结果的步骤。
E.试剂盒
在另一方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的受试者的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括本文所述的本发明的经修饰的癌细胞、组合物和/或药物组合物。该试剂盒可用于治疗任何癌症，所述癌症的一些非限制性实例包括乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、眼癌、软组织癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、间皮瘤、急性白血病、慢性白血病、成神经管细胞瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤和本文所述的任何其它癌症，包括其组合。
可以在试剂盒中提供实施本发明的各种方法的材料和试剂，以便于实施所述方法。如本文所用，术语“试剂盒”包括促进过程、测定、分析或操作的制品组合。特别地，本发明的试剂盒可用于广泛的应用，包括例如诊断剂、预后、疗法等。
试剂盒可含有化学试剂以及其它组分。此外，本发明的试剂盒可包括但不限于试剂盒使用者的说明书、用于样品收集和/或纯化的装置和试剂、用于产品收集和/或纯化的装置和试剂、用于施用一种或多种经修饰的癌细胞或本发明的其它组合物的装置和试剂、用于确定一种或多种生物标志物和/或免疫细胞的活性水平和/或数量的装置和试剂、用于检测HLA等位基因的装置和试剂、样品管、支架、托盘、架子、盘子、板、溶液、缓冲液或其它化学试剂，适用于标准化、归一化和/或对照样品的样品。本发明的试剂盒也可以例如在具有盖子的盒子中包装以用于方便储存和安全运输。
在一些实施方案中，该试剂盒还含有阴性和阳性对照样品，以用于检测HLA等位基因、免疫细胞活性和/或数量和/或生物标志物的存在或水平。在一些实施方案中，阴性对照样品是从待治疗或正在接受治疗的受试者获得的非癌细胞、组织或生物流体。在其它实施方案中，阴性对照样品是从没有患有癌症的个体或个体组获得的。在其它实施方案中，阳性对照样品是从患有癌症的受试者或其它个体或个体组获得的。在一些实施方案中，该试剂盒含有用于制备样品中一种或多种生物标志物的滴定曲线的样品，以帮助评价生物样品中的一种或多种免疫细胞和/或生物标志物的活性和/或数量的定量水平。
F.用于确定HER2状态的方法
在另一方面，本发明提供了用于确定样品细胞的HER2状态的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
(a)检测样品细胞中的一种或多种生物标志物的存在或水平，其中一种或多种生物标志物包括：
(i)MIEN1，
(ii)PGAP3，
(iii)ERBB2和MIEN1，
(iv)ERBB2和PGAP3，
(v)MIEN1和PGAP3，或
(vi)ERBB2、MIEN1和PGAP3；
(b)将步骤(a)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平与参考细胞中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平进行比较；和
(c)基于步骤(b)中进行的比较，确定样品细胞的HER2状态。
在一些实施方案中，样品细胞是癌细胞。在一些情况下，样品细胞从患有癌症的受试者获得。样品细胞可作为活检样本、通过手术切除物、或作为细针抽吸物(FNA)获得。在一些实施方案中，样品细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。
在一些实施方案中，当一种或多种生物标志物在样品细胞中以相较于参考细胞更高的水平表达时，样品细胞被确定为HER2阳性。在其它实施方案中，当一种或多种生物标志物的表达相较于参考细胞过表达至少约1.5倍(如，约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或更多倍)时，该细胞被确定为HER2阳性。在具体的实施方案中，当一种或多种生物标志物的表达相较于参考细胞过表达至少约1.5倍时，该细胞被确定为HER2阳性。
在一些实施方案中，该细胞被确定为过表达或不过表达HER2。在具体的实施方案中，该细胞被确定为HER2 3+、HER2 2+、HER2 1+或HER2 0(即，不过表达HER)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平在HER2 3+细胞中比HER2 2+细胞中更高。在其它实施方案中，一种或多种生物标志物的水平在HER2 2+细胞中比在HER2 1+细胞或HER2 0细胞中更高。
在一些实施方案中，参考细胞是从与样品细胞同一受试者获得的非癌细胞。在其它实施方案中，参考细胞是从不同的受试者或受试者群体获得的非癌细胞。在一些实施方案中，测量表达包括例如测量mRNA表达、蛋白丰度或它们的组合。本文描述了适用于测量表达的方法的一些实例。
在一些实施方案中，以至少约60％(如，约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的灵敏度进行HER2状态的确定。在其它实施方案中，以至少约80％(如，约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的灵敏度进行HER2状态的确定。在其它实施方案中，以至少约90％(如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的灵敏度进行HER2状态的测定。在一些情况下，灵敏度是至少约60％。在其它情况下，灵敏度是至少约87％。在一些情况下，灵敏度是约100％。
在一些实施方案中，检测步骤的一个或多个方面是自动化的。在其它实施方案中，比较步骤的一个或多个方面是自动化的。在其它实施方案中，确定步骤的一个或多个方面是自动化的。可自动化的方面或步骤的非限制性实例包括样品采集、样品分离、样品处理、一种或多种mRNA检测方法、一种或多种蛋白检测方法、一种或多种生物标志物的水平与参考值的定量和/或比较，和处理表达水平值以确定细胞的HER2状态。
实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相同的结果的各种非关键参数。
实施例1：SV-BR-1-GM(BriaVax)，一种GM-CSF-分泌的全细胞疫苗，表达免疫签名并且在HLA I和II等位基因处与在SV-BR-1-GM接种之后具有全身性肿瘤消退的IV期乳腺癌患者匹配。
摘要
背景
使用同种异体全细胞疫苗的癌症免疫疗法是减轻肿瘤负荷的有效方法。一般认为，为了有效，疫苗需要表达在患者肿瘤细胞中共表达的免疫原性抗原，并且在摄取疫苗细胞片段之后，抗原-呈递细胞(APC)诸如树突细胞(DC)需要交叉呈递此类抗原。先前已报道，在I期/初步研究中，在接种全细胞疫苗SV-BR-1-GM(称为BriaVax)后，患有IV期乳腺癌的受试者的乳腺、肺脏和脑部病变大幅度消退。为了鉴定潜在的诊断性特征，从而允许对可能受益于SV-BR-1-GM的患者进行前瞻性鉴定，对疫苗和患者来源的血液以及肿瘤样本进行了分子分析。
结果
SV-BR-1-GM细胞表达预测主要组织相容性复合体(MHC)I类(即，B2M、HLA-A、HLA-B)和II类(即，HLA-DRA、HLA-DRB3、HLA-DMA、HLA-DMB)分子存在的一组基因。此外，疫苗表达了具有免疫调节功能的其它几个因子，包括ADGRE5(CD97)、CD58(LFA3)、CD74(不变链和CLIP)、CD83、CXCL16、HLA-F、IL6、IL10、IL15、IL18、CXCL16和TNFSF14(LIGHT)。令人惊讶的是，SV-BR-1-GM和具有最显着临床响应的研究受试者都携带HLA-A*11:01和HLA-DRB3*02:02等位基因。此外，与正常人乳腺细胞相比，SV-BR-1-GM细胞过表达已知编码肿瘤相关抗原(TAA)的数种基因，诸如PRAME，癌症/睾丸抗原。此外，鉴定了编码潜在新型TAA的基因。
讨论
尽管它们是乳腺来源的，但SV-BR-1-GM细胞不仅表达TAA，而且还表达了一组生物标志物，包括HLA I类和II类等位基因，已知它们在APC中具有免疫刺激作用。这表明SV-BR-1-GM与特殊临床响应者之间的部分HLA等位基因匹配能够使患者T淋巴细胞能够直接识别如疫苗MHC系统所呈递的TAA。
结论
这些发现表明SV-BR-1-GM细胞可以直接作为APC，和/或APC诸如DC可以通过用来自SV-BR-1-GM细胞的载有肽的MHC进行胞啃的方式进行交叉修饰。
背景
与杀死快速分裂细胞的传统化学疗法或放射疗法相比，无论它们是癌性的还是正常的，癌症免疫疗法的目标是基于恶性细胞的抗原补充来消除肿瘤。后一种方法的肿瘤选择性是可变的，并取决于靶向的抗原。例如，虽然癌症/睾丸抗原(CTA)诸如MAGE-A和NY-ESO-1可能在某些肿瘤中特异性表达但在相应的正常组织中则不表达，用于嵌合性抗原受体(CAR)-T细胞方法的原型靶标CD19在恶性和正常B细胞中表达。为了补偿正常B细胞的损失，用免疫球蛋白替代物处理基于CAR-T细胞的CD19靶向后的B细胞发育不良(1)。
癌症免疫疗法的发展已经表明，不仅有数种可行的方法来诱导针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答，而且此类TAA可以在胞内和/或胞外定位。例如，鉴于CARs(1、2)和使细胞毒性T细胞与癌细胞交联的双特异性抗体(3)依赖于细胞表面抗原、异位T细胞受体(TCR)(4)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL；5、6)的存在，并且基于疫苗的方法(7-18)需要通过主要组织相容性复合体(MHC)展示抗原肽，无论肽是代表胞内还是胞外TAA。类似地，免疫检查点抑制剂诸如抗-PD-1抗体纳武单抗和派姆单抗以及抗-CTLA-4抗体伊匹单抗被设计用于防止效应T细胞的抑制，而不区分识别来自胞内相对于来自胞外抗原的MHC结合肽的T细胞(19)。
包含活的但受辐照的癌细胞的全细胞疫苗表达非常大数量的抗原，其中一些可以在肿瘤中共表达。然而被免疫抑制性微环境屏蔽的肿瘤可能不会引发免疫应答，全细胞疫苗(20)如果注入免疫豁免位点，则可能引发免疫应答。然而，即使由疫苗诱导的免疫应答可能具有肿瘤定向的组分，也可能并不知道介导该效应的抗原的确切性质。
已经研究了两种主要类别的全细胞疫苗(即，自体和同种异体疫苗)。预期来源于待治疗患者的肿瘤的自体疫苗表达包含患者特异性新表位的相关抗原，但可能无法有效克服免疫抑制以引起有效的免疫应答。另一方面，虽然经工程化以表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的同种异体疫苗可能通过促进树突细胞(DC)上的抗原展示来诱导强烈的免疫应答，但它们可能缺乏关键抗原(15)。随着不同的成功，经工程化以表达GM-CSF(“GVAX”疫苗)的同种异体全细胞疫苗已经针对代表血液学癌和实体癌的多种恶性肿瘤(诸如白血病、黑素瘤及胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌)进行了临床测试(7，8，10，11，14，16，18，21-24)。值得注意的是，已经使用小鼠模型证明GVAX方法可能适合于预防肿瘤建立(即，预防性治疗可能不能有效减少已存在的疾病的肿瘤负荷(25)。
先前已经建立了来自转移性乳腺癌患者(17)的胸壁病变的细胞系。称为SV-BR-1的细胞系是雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)阴性和非常强烈的HER2/neu(ERBB2)阳性(17)。为了增强细胞的免疫反应性，SV-BR-1细胞经遗传工程化以稳定地过表达GM-CSF，从而产生SV-BR-1-GM(BriaVax)系。一些晚期HER2+癌症患者在两个早期临床试验环境中接受了经辐照的亲本SV-BR-1(BB-IND 2749)或SV-BR-1-GM(BB-IND 10312)细胞治疗(16、17)。两项研究均采用低剂量环磷酰胺预处理步骤，该方法已用于许多疫苗研究中，以减弱调控性T细胞的活性。此外，对于SV-BR-1-GM研究，在施加疫苗后2天和4天，将干扰素-α局部注射到每个接种位点中以提供另外的“危险信号”。一名受试者对该方案做出了响应，仅3次接种后多重乳腺病变几乎完全消退且肺转移完全缓解，但随后在最后一个循环后3个月经历疾病消退，在肺脏、软组织、乳腺和大脑中发展出病变。在获得FDA许可后，疫苗接种恢复。随后，观察到全身响应，从而包括脑中那些肿瘤在内的位点肿瘤随着迅速肿瘤消退作出响应(16)。
本文描述了用代表发育中间体或最终产物的样品(诸如分别为主细胞库或临床产品批次)建立的SV-BR-1-GM分子指纹。进一步提供了两条证据，证明SV-BR-1-GM细胞直接和/或间接充当抗原-呈递细胞(APC)，并从而增加有效的肿瘤定向的免疫应答。第一，尽管它们是假定的乳腺上皮起源的，但SV-BR-1-GM细胞表达一组基因，包括与免疫细胞、而不是上皮细胞相关的HLA I类和II类组分。第二，在HLA等位基因与I类和II类基因座的SV-BR-1-GM的那些HLA等位基因相匹配的临床测试受试者中发生了稳健的临床响应。这表明在该患者中，在SV-BR-1-GM细胞的细胞表面上表达的完全组装的TAA-MHC复合体与患者T细胞直接相互作用，或者它们通过胞啃(“交叉修饰”)并然后遇到相应的T细胞的方式被首次转移到树突细胞(DC)上。
结果
指示临床响应的生物标志物
鉴于之前报道的BriaVax疫苗(SV-BR-1-GM细胞系)的强烈临床效果(16)，假设疫苗的作用机制(MoA)可能至少部分地由一套基因的表达介导，所述基因的蛋白产物充当免疫原，从而介导免疫耐受的破坏。除了SV-BR-1-GM细胞中过表达的基因之外，还研究了特殊临床响应者和SV-BR-1-GM在其HLA类型中是否表现出部分重叠(16)。免疫原候选物和HLA等位基因都可用于预测哪些患者将对BriaVax响应最好，并因此具有预后和诊断重要性。
用于该研究的SV-BR-1-GM样品
从女性转移性乳腺癌患者的胸壁病变建立多克隆SV-BR-1细胞系。如图1A所描绘，SV-BR-1-GM细胞系来源于用编码人GM-CSF的CSF2基因稳定转染并博莱霉素选择后的SV-BR-1细胞(参见，如美国专利No.7,674,456，美国专利申请No.10/868,094，两者均出于所有目的通过引用整体并入本文并且(16、17))。由于它未经克隆选择，其在扩增期间可能经历了大量的克隆漂移。然而，尽管预期其它参数也有助于疫苗的效力，但预期GM-CSF将是主要因素(15)。因此，对于细胞系作为疫苗的临床应用，使用培养物上清液作为测定输入，通过ELISA评估GM-CSF产生。
GM-CSF信号传导涉及GM-CSF与其受体的α亚基的结合和受体α亚基的募集(26)。尽管GM-CSF的第一α螺旋中的限制区域被认为与受体的α亚基相互作用，数个区域还下游接触α亚基(27)。与GM-CSF的NCBI参考序列(参见，NCBI参考No.NP_000749.2)相比，SV-BR-1-GM的异位GM-CSF序列在位置53(即，Thr而不是Met)和117(即，Thr而不是Ile)处变化。尽管位置53定位在第一β-折叠片(即氨基酸39-43)和第二α螺旋(即氨基酸55-64)之间并且不涉及GM-CSF与受体α亚基的结合，位置117定位至与受体结合相关的区域(27)，因此产生问题，即在位置117处是苏氨酸的情况下是否仍然可能发生受体结合从而信号传导。与信号传导活性和因此的GM-CSF生物活性一致，来自受辐照的SV-BR-1-GM细胞的细胞培养物上清液支持MUTZ-3细胞(一组据报道依赖于细胞因子诸如GM-CSF的细胞系)的增殖(28)，而来自亲本SV-BR-1细胞(即，不经工程化以表达GM-CSF)的上清液具有至多极小的效果。
自从1999年切除原始肿瘤样本以来，已经制造了数批SV-BR-1和SV-BR-1-GM。图1A描绘了生成其基因表达谱及其系谱学的SV-BR-1-GM样品。来源于主细胞库(MCB)的批次被指定为“临床产品”(CP)批次。此外，生成非MCB依赖性研究(RES)库。血清饥饿后SV-BR-1-GM细胞的形态示于图1B中。基因表达谱在HumanHT-12v.4Bead Chips上从直接获自冷冻保存的细胞悬浮液(在样品名称中表示为“冷冻”标签)的RNA或从获自最近的培养物(在样品名称中表示为“培养物”标签)的RNA生成。尽管在不同的SV-BR-1-GM样品类型中存在一定程度的基因表达可变性(图1C)，但总体而言，SV-BR-1-GM细胞展现出与其它已建立的乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞类型基本上不同的基因表达谱(图2)。RNA完整性数量当量(RINe)值小于7.5的样品被排除在分析之外。类似地，未通过另一个质量控制测试的一些样品(如，CP Lot V cryo)(参见，下面标题为“方法”的章节)未用于进一步的比较分析，即使它们的RINe值大于或等于7.5(图1D)。
SV-BR-1-GM表达与免疫刺激功能相关的24-基因标签
SV-BR-1-GM细胞表达数种具有已知与免疫系统相关的作用的基因(如，参与由APC诸如树突细胞(DC)进行的MHC II类-基抗原呈递的基因)。在这些基因中，有HLA-DMA、HLA-DRA和CD74，它们产生不变的链(Ii)和II类相关的不变链肽(CLIP)。
生成含有111个具有已知的免疫刺激作用的基因的数据库(29-70)(表2)。具体地，包括编码以下的基因：(a)T细胞共刺激受体或已知正刺激T细胞的其它细胞表面相关因子(即支持T细胞活化而非抑制的那些)的细胞表面配体；(b)具有正T细胞刺激功能(诸如支持活化、促进存活和/或诱导趋化性)的细胞因子和其它可溶性(即游离)因子，(c)促进DC的成熟、存活、趋化和/或体外产生的因子，以及(d)促进抗原呈递的因子。在111种基因中，22种在所有SV-BR-1-GM样品中具有分位数归一化的表达水平，其是本底截止值的大于1.5倍(参见，下面用于定义的标题为“方法”的章节)。这22种生物标志物中的11种以超过本底截止值的5倍的水平表达，如至少一种探针所示(图3和4)。然而，如通过定量RT-PCR(qRT-PCR)所评估，HLA-DRB3在SV-BR-1-GM细胞中表达(图5)。
令人惊讶的是，在22种基因中有数个编码HLA I类(B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-F)或II类(HLA-DMA、HLA-DRA)组分。如图6所示，基因HLA-E和HLA-H也在SV-BR-1-GM细胞中强烈表达。然而，因为它们与免疫刺激角色没有明显关联，所以它们不被认为是有助于SV-BR-1-GM作为癌症疫苗的功效的基因。
为了进一步研究SV-BR-1-GM表现出直接免疫刺激作用的观点，通过qRT-PCR证实了具有已知免疫活化功能的数种基因的表达。这个基因集还包括HLA-DRB3和HLA-DMB，后者仅以本底截止值的大于1.5倍表达，但功能上与HLA-DMA相关(71)，HLA-DMA是另一种在SV-BR-1-GM细胞中表达的免疫刺激生物标志物(图3)。验证实验是对用于微阵列分析的SV-BR-1-GM样品亚组并使用来自MCF7细胞(即携带HLA-DRB3*0202等位基因的乳腺癌细胞系(72))的RNA作为校准样品进行的。使用可商购获得的引物/探针组(表3和表4)。如图5所示，所分析的所有MHC II类相关转录物(如，HLA-DRA、HLA-DRB3、HLA-DMA、HLA-DMB、CD74)以比MCF7细胞中显著更高的水平表达。该数据证明在与免疫刺激功能相关的基因标签中包含HLA-DRB3和HLA-DMB两者(表5)。此外，即使SV-BR-1-GM细胞经工程化以表达CSF2(即，编码GM-CSF)，但是通过微阵列基因表达谱分析未检测到CSF2转录物。然而，这一发现并不令人惊讶，因为未预测到CSF2的Illumina探针序列(ILMN_1661861)在异位CSF2mRNA中表现。重要的是，通过ELISA，在经辐照和未辐照的SV-BR-1-GM细胞调节的培养基中证实了外源GM-CSF蛋白表达(图7)。
总之，除了具有图3中转录物表示的22种基因，HLA-DRB3和CSF2(GM-CSF)也被认为是有助于SV-BR-1-GM(BriaVax)癌症疫苗功效的相关免疫刺激因子。完整的24-基因“免疫标签”示于表5中。
表5：在SV-BR-1-GM细胞(BriaVax)中表达的具有免疫刺激作用的基因
在上面的表5中，基因符号是指NCBI指定和HUGO基因命名委员会(HGNC)建议。基因符号、官方全名和描述以及别名如各NCBI基因位点所示。
HLA等位基因在SV-BR-1-GM与稳健临床响应者之间匹配
通过血清分型，先前已确定稳健的临床响应者(在本文中称为受试者A002)和SV-BR-1-GM细胞在其HLA表型中具有相似性(16)。为了确定在等位基因水平是否进一步反映了此类相似性，使来自患者的外周血细胞和SV-BR-1-GM细胞进行HLA-A、-B和-DRB3的高分辨率HLA分型。实际上，虽然没有经历SV-BR-1-GM诱导的肿瘤消退的三名临床试验受试者仅与SV-BR-1-GM具有HLA-A等位基因匹配，但受试者A002在HLA-A(*11:01)和HLA-DRB3(*02:02)处匹配。参见表6。这一发现与其中SV-BR-1-GM MHC上展示的肿瘤抗原有助于疫苗的治疗功效的作用机制一致。
由于使用外周血细胞进行HLA分型，并且因为基于疫苗的癌症免疫疗法需要癌细胞MHC表达，因此在来自临床试验受试者A002的石蜡包埋的肿瘤样本中鉴定了HLA-DRB3蛋白的水平。如图8所示，HLA-DRB3免疫活性确实很明显，因此进一步证明了HLA II类在SV-BR-1-GM(BriaVax)的MoA中的作用。
表6：HLA等位基因
上面的表6列出了经鉴定的SV-BR-1-GM(BriaVax)和来自4名研究受试者(Clinical Trials.gov Identifier:NCT00095862)的外周血细胞的HLA等位基因。具有HLA-A和HLA-DRB3匹配的受试者A002对SV-BR-1-GM接种有响应，具有显著的肿瘤消退。“Dx至Vac”列显示了从最初的癌症诊断到第一次SV-BR-1-GM接种的时间间隔。“+”表示等位基因水平并且“(+)”表示与SV-BR-1-GM相同的等位基因组水平。
SV-BR-1-GM中表达的癌症/睾丸抗原
癌症/睾丸抗原(CTA)代表一类抗原，其生理表达主要限于睾丸或胎盘组织，并且对于亚组，限于脑组织。然而，在某些情况下，CTA在来自各种器官的细胞恶性转化后会上调。对于许多此类CTA，已经建立了免疫刺激作用(6、73-79)。
鉴于此类特征，在SV-BR-1-GM细胞中评估了279种确认或推定的CTA(表7)的mRNA表达水平，并将其与其它数种乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞中的表达进行比较。使用培养的(即GSE56718(80)和GSE48398(MCF10A))和未培养的(即GSE35399(81))正常乳腺细胞的GEO数据集。从(79)和(78)所述的那些、CT数据库(77)中列出的那些以及由HumanPanCancer Immune Profiling Panel(从NanoString Seattle,WA获得)代表的那些中，选择用于分析的CTA基因。
在对基因和样品进行分级聚类后，一组CTA基因(即KIF2C、OIP5、CEP55、PBK、KIF20B、TTK、CABYR、SPAG1、CCNA1、PLAC1和PRAME)出现特别好区分SV-BR-1-GM和正常乳腺细胞的能力(图9A)。基因PRAME、KIF2C、CEP55和PBK在SV-BR-1-GM细胞中稳健表达(图9B-图9E)，其中PRAME于正常乳腺样品中在SV-BR-1-GM表达水平与最大表达水平之间表现出最高的倍数变化比(表8)。与PRAME(图9B)相比，KIF2C、CEP55和PBK也在培养的人乳腺上皮细胞(HMEC)中表达。有趣的是，如图9C-图9E所示，后三种基因的表达值在“早期增殖”中高于衰老的HMEC(80)。这表明增殖的乳腺上皮细胞也在体内表达这些基因。表8中显示了具有在SV-BR-1-GM细胞中比在正常乳腺细胞类型中更大的转录物表达值的CTA列表。
表8：SV-BR-1-GM细胞中的CTA表达
表8中列出的是满足以下所有标准的CTA：1)SV-BR-1-GM细胞中代表性转录物水平大于本底截止值的1.5倍，2)在非培养(NC)正常乳腺细胞类型(SV-BR-1-GM/Max)中，SV-BR-1-GM细胞中的代表性转录物水平大于最大转录物水平的1.5倍，3)在NC正常乳腺细胞类型中的最大转录物水平小于本底截止值的1.5倍，从而在每种样品类型的代表值中建立最大NC转录物水平(参见，下面“方法”章节中标题为“样品表示”的章节)。对于PBK、CEP55和CABYR，单独使用NC细胞类型的情况下SV-BR-1-GM/Max大于1，但当包括培养的(C)乳腺细胞(C+NC)时小于1。这可能表明培养上调了这些基因的表达。“C”表示培养的正常细胞类型(即来自GEO数据集GSE48398的MCF10A，和来自GSE56718(80)的“早期_增殖”和“深度_衰老”人乳腺上皮细胞(HMEC))。“NC”表示非培养的正常细胞类型(即来自GSE35399(81)的ALDHNEG、ALDH POS、ERBB3NEG、NCL、BASAL、STROMAL)。本底截止值为141.16。
SV-BR-1-GM疫苗细胞中表达的其它候选免疫原
即使SV-BR-1-GM疫苗表达“免疫标签”(表5)，单独的后者不太可能足以诱导强烈的肿瘤定向免疫应答，因为它不提供癌症特异性。假设合理的是，对于对全细胞癌症疫苗有响应的肿瘤消退的患者，疫苗通过在肿瘤中共表达的TAA的过表达来提供这种缺失的定向性。SV-BR-1-GM疫苗的候选TAA包括上述和图9中示出的CTA。
为了系统地搜索具有通过过表达破坏免疫耐受性的潜力的SV-BR-1-GM抗原，采用了基于双层微阵列的方法。第一，鉴定了相对于正常乳腺细胞在SV-BR-1-GM细胞中上调的基因。为此，将SV-BR-1-GM细胞中的基因表达水平与由Shehata等人,2012(GEO数据集GSE35399，(81))、Lowe等人,2015(GEO数据集GSE56718,(80))和来自GEO数据集GSE48398的MCF10A描述的多种正常人乳腺细胞类型的那些进行比较。将两个串联滤波器施用至分位数归一化的基因表达值，以富集将分化的SV-BR-1-GM细胞与正常乳腺细胞区分开来的基因。在低严格性过滤后，保留了455种不同的基因(包括非编码RNA)，其中在中等严格性过滤后，剩余352种(表9和表10)。
其次，在中等严格性过滤后保留的352种基因中，不仅相对于正常乳腺细胞而且相对于除乳腺以外的组织上调的那些被认为是经验证的免疫原候选物。这第二个标准旨在富集具有破坏免疫耐受性潜力的基因，因为生理上高水平的基因表达不仅在乳腺中而且在其它器官的组织中都可以防止耐受性的破坏。在该步骤中施用的高严格性过滤器将GEO数据集GSE29431(即乳腺癌组织)与由GEO数据集GSE7307(即非恶性组织)所代表的样品子集(表11)进行比较，并对中等严格性过滤之后保留的327种基因进行。值得注意的是，选择过滤器截止标准(参见，下面标题为“方法”的章节)以保留ERBB2(HER2/neu)，其免疫原性性质在数个临床试验中被利用(13、82)。使用该策略将20种基因验证为TAA候选物(表12)。有趣的是，它们中的三个定位至染色体17q12(即ERBB2(HER2/neu)、MIEN1和PGAP3(图10))。
表12：计算机验证的候选TAA
表13和表14提供了20种计算机验证TAA重要性的进一步证据。全部定位至染色体17q12的ERBB2、MIEN1和PGAP3(粗体条目)表现出它们在Her2 3+肿瘤中表达最高的趋势、在Her2 2+肿瘤中表达较少并且在Her2 0-1+肿瘤中表达最低。表14提供了Her2 2+肿瘤内的比较(即总体而言，FISH阳性和阴性样品)，并显示出Her2 FISH+的ERBB2、MIEN1和PGAP3的95％置信区间(CI)高于Her2 FISH-癌症组。
讨论
同种异体全细胞癌症疫苗表达各种抗原，其中一些可能是患者肿瘤中共表达的TAA。然而，是否针对此类TAA产生有效的免疫应答取决于许多因素。该实施例表明，疫苗与患者之间的HLA等位基因同一性是一个重要因素。
在四名临床试验受试者(即三名患有乳腺癌且一名患有卵巢癌)中，仅在一名患者(在本文中称为受试者A002)中观察到SV-BR-1-GM(BriaVax)接种后的客观肿瘤消退(16)。与其它三名受试者相比，受试者A002携带疫苗中存在的HLA I类(即HLA-A*11:01)和II类(即HLA-DRB3*02:02)等位基因两者(表6；图11A)。此外，与一组具有已知免疫刺激作用的其它基因一起，SV-BR-1-GM细胞表达“免疫标签”(表5)。从机理角度来看，这些研究结果表明TAA展示在疫苗细胞表面MHC上，其中它们可以直接和/或间接(在“交叉修饰”后，即在基于胞基的转移至APC诸如树突细胞上后)活化T细胞(图11B)(83-85)。此外，其它机制可能有助于疫苗的免疫刺激作用。特别地，交叉呈递。由此来自疫苗的细胞片段(其被APC内吞、加工、然后对应加载到MHC分子上的肽抗原)也可能起到重要作用(图11C)(85、86)。然而，由于只有疫苗直接活化T细胞并且用来自疫苗的TAA-MHC进行DC的交叉修饰需要患者和疫苗之间的HLA等位基因同一性，并且因为只有具有HLA I类和II类等位基因两者与疫苗匹配的患者表现出稳健的肿瘤消退(表6和(16))，推测直接活化和/或交叉修饰确实在疫苗的作用机制中发挥重要作用是合理的。
由于提出的SV-BR-1-GM疫苗的作用机制(图12)与其它GVAX疫苗相关，人们可能想知道在这样的程序中，具有HLA I类和II类等位基因匹配的患者(如果有的话)对疫苗的临床响应是否优于不具有的那些患者。此外，如果HLA等位基因确实对GVAX疫苗的功效有贡献，那么高分辨率HLA分型具有作为伴随诊断的优点。表15概述了不同种族分组中SV-BR-1-GM中存在的HLA等位基因组合的估计频率。如所示，等位基因组合频率范围为5.4-31.0％(即，随机选择的个体携带SV-BR-1-GM的HLA I类中的至少一个和其HLA II类等位基因的一个为5.4-31.0％(根据种族分组)的概率)。当放宽限制仅考虑等位基因组时，组合频率范围为12.8-37.7％。
表15：HLA等位基因组合的频率
表15中公开的等位基因频率报告在(87)中。计算估计的“表型频率”，表明个体携带至少1个SV-BR-1-GM的以下各项的概率：(a)HLA I类等位基因(A*11:01，HLA-A*24:02，HLA-B*35:08和HLA-B*55:01)或等位基因组(HLA-A*11，HLA-A*24，HLA-B*35和HLA-B*55)，(b)HLA II类等位基因(HLA-DRB3*01:01和HLA-DRB3*02:02)或等位基因组(HLA-DRB3*01和HLA-DRB3*02)，或(c)HLA I类和II等位基因或等位基因组。显示的是作为百分比值的“表型频率”。有关计算的详细信息，请参阅下面标题为“方法”的章节。AAFA代表非裔美国人；AFB代表非洲人；AINDI表示南亚印第安人；AMIND代表北美印第安人；CARB表示加勒比黑人；CARHIS表示加勒比西班牙人；EURCAU表示欧洲高加索人；FILII表示菲律宾人；JAPI表示日本人；KORI表示韩国人；MENAFC表示中东人或非洲北海岸人；MSWHIS表示墨西哥人或奇卡诺人；NCHI表示中国人；SCAHIS表示西班牙裔-南美洲人或中美洲人；SCSEAI表示东南亚人；VIET表示越南人。
为了减轻由疫苗本身引起的肿瘤发展的风险，在临床应用之前用200Gy(20,000rad)辐照SV-BR-1-GM细胞(16)。有趣的是，已经证明离体γ-辐照可以在代表不同癌症类型的癌细胞系中和来自肉瘤患者的活检样品中上调MHC I类和癌症/睾丸抗原。重要的是，此类基因表达的变化伴随着CD8+细胞识别的增加(88)。这一概念在临床上也很重要，因为有证据表明肿瘤辐照可以增强免疫疗法的益处(89-91)。因此，由于在本研究的背景下生成的基因表达谱来源于非辐照细胞，如果200Gy辐照进一步提高HLA基因表达水平，则并不会令人惊讶。
不受任何特定理论的束缚，似乎合理的是，除了匹配HLA等位基因之外，在疫苗和患者肿瘤中共表达的TAA在受试者A002中观察到的有利作用过程中起作用。在这里提出的分子研究中，寻找候选TAA的同一性，所述候选TAA在SV-BR-1-GM细胞中的过表达诱导免疫耐受性的破坏。
免疫耐受性是一把双刃剑。其潜在的机制阻止自体抗原引起免疫应答(自身免疫性)和免疫系统识别肿瘤。已经描述了数种破坏耐受性的方法，包括使用免疫检查点抑制剂或单克隆抗体递送共刺激信号至T细胞(92)。在GVAX的背景下，疫苗分泌的GM-CSF在克服免疫耐受性方面起到了重要作用(9)。然而，鉴于GVAX全细胞疫苗表达了在健康细胞上共表达的大量抗原，人们可以想象这种治疗可能伴随着自身免疫。实际上，已经在GVAX施加后观察到自身炎性响应，如抗甲状腺球蛋白抗体的血清水平增加所证明。然而，尽管它们与自身免疫相关，但抗甲状腺球蛋白抗体水平似乎与治疗功效呈正相关(21)。
采用基于双层微阵列的计算机模拟方法来检查负责疫苗抗肿瘤作用的TAA是否由于过表达介导的耐受性破坏而诱导免疫应答。首先，鉴定了在SV-BR-1-GM细胞中相对于正常乳腺细胞上调的基因。这是通过将数种不同批次的SV-BR-1-GM与各种正常人乳腺细胞类型进行比较来实现的。其次，与正常乳腺细胞相比，使SV-BR-1-GM中表达水平显著较高的基因经过验证步骤，所述验证步骤将乳腺癌中的基因表达水平与各种器官的正常组织的那些进行比较。由于过表达对免疫耐受性的破坏原则上可能只发生在每个允许免疫监视的位点处没有表达或低生理表达的基因，因此理论上理想的候选免疫原应该在SV-BR-1-GM细胞和乳腺癌组织中高度表达，但在非-免疫豁免的正常组织中不表达或仅最少表达。应用于验证免疫原候选物的生物信息学策略反映了这一理论。认为20种编码候选TAA的基因在SV-BR-1-GM细胞和乳腺癌组织中比在正常组织中更高表达(表12)。有趣的是，在这20种基因中有5种位于染色体17上，其中3种定位至17q12(即ERBB2(HER2/neu)、MIEN1(C17ORF37)和PGAP3(PERLD1))(图10)。这表明ERBB2不仅在乳腺癌亚组中过表达，而且位于ERBB2附近的其它候选TAA也是如此(93、94)。
此外，该实施例中呈现的数据(图10，表13、表14和表20)显示ERBB2、MIEN1和PGAP3可用于鉴定和/或分化HER2阳性(HER2+)患者。本文提出的微阵列分析证明ERBB2(也被称为HER2)显示出与基于免疫组织化学(IHC)的方法的结果较差的相关性。特别地，被诊断为HER2 3+的15名患者中有9名(60％)的ERBB2 mRNA水平约为HER2 0-1+组的那些ERBB2mRNA水平。然而，如表20所示，如果MIEN1和/或PGAP3用于分析(单独、彼此组合或与ERBB2组合)，则灵敏度得到提高。单独的MIEN1和PGAP3(即代替ERBB2)产生87％的灵敏度。类似地，ERBB2和MIEN1或ERBB2和PGAP3的组合产生87％的灵敏度。MIEN1和PGAP3的组合或所有三种生物标志物的组合产生100％的灵敏度。显然，当测量mRNA水平时，这些生物标志物得到超过当前IHC或FISH测定以及单独的ERBB2的优异灵敏度。
癌症/睾丸抗原(CTA)是一类在癌症和种系组织中特异性表达的肿瘤相关抗原(6，73-79)。产生20种计算机验证的TAA候选者的严格过滤方法没有选择CTA。然而，当分析一组279个CTA(表7)的基因表达谱时，发现数个CTA，最值得注意的是PRAME，与正常乳腺细胞相比，其在SV-BR-1-GM中选择性表达(图9和表8)。尽管没有发现除睾丸组织和子宫内膜组织以外的非癌性组织中表达，但由于分析了54个乳腺癌标本，PRAME没有出现在严格的计算机筛选中，PRAME表达仅限于11个(20％)样品，其中只有2个(4％)表现出明显的表达水平。此外，至少一些CTA在SV-BR-1-GM细胞中具有低表达水平(图9)。然而，正如Groeper等人所证明的，CTA特异性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)甚至可以从具有不可检测的CTA水平的肿瘤中扩增(6)。这表明微小(即低于检测水平)的CTA表达水平可能足以使肿瘤中的CTA特异性T细胞保留，或者使此类T细胞仅在切除时偶然碰巧留在肿瘤组织中。与后一种可能性一致，来自具有不可检测的CTA表达的肿瘤的TIL的CTA定向的细胞毒性较弱(6)。
总之，这里提供的研究提供的证据表明，接种SV-BR-1-GM疫苗后观察到的和之前报道的(16)肿瘤定向效应是由疫苗的“免疫标签”以及TAA诸如PRAME介导的，所述免疫标签包括范围为HLA I类和II类组分至T细胞共刺激受体的配体的因子以及已知促进免疫细胞吸引的趋化因子。
结论
与其它已建立的乳腺癌细胞系不同，SV-BR-1-GM细胞不仅表达已知和推定的TAA，而且还表达了在促进免疫应答中具有已知作用的因子的集合。最值得注意的是，除了HLA I类因子之外，II类基因诸如HLA-DMA和-DMB也被表达。由于HLA II类组分与真实的(bonefide)抗原呈递细胞诸如DC相关，它们在SV-BR-1-GM细胞中的表达是令人惊讶的并且指向一种独特的作用机制。观察到响应于SV-BR-1-GM疫苗并伴有肿瘤消退(16)的患者也携带在疫苗中发现的HLA I类和II类等位基因，这与共表达SV-BR-1-GM TAA并且具有匹配的HLA等位基因的患者特别有可能发展强烈的肿瘤定向免疫应答的假设一致。
方法
SV-BR-1-GM(BriaVax)细胞的培养
将SV-BR-1-GM批次在补充有10％FBS和L-谷氨酰胺或GlutaMAXTM(获得自Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的RPMI-1640中制备。通常，此类培养基的级分(如，约50％)在培养基更换时被SV-BR-1-GM细胞预处理。对于早期批次，将SV-BR-1-GM细胞从冷冻保存的细胞混悬液中扩增，从T-25烧瓶开始，在较大的烧瓶中连续繁殖并从约30个T-150烧瓶中收获。从小型组织培养容器开始扩增批次，并在T-225烧瓶中按比例进一步扩增。最终的扩增步骤在10-STACK培养室(获自Corning Inc.,Corning,NY)中进行。
微阵列基因表达谱分析
将从液氮中回收后直接从低温小瓶中获得的或从培养物中收集的SV-BR-1-GM细胞在补充或不补充β-巯基乙醇(获自Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的情况下在缓冲液RLT(得自Qiagen,Valencia,CA)中裂解。经由RNeasy微型试剂盒(从Qiagen获得)从裂解物中分离总RNA，然后进行微阵列杂交。简言之，RNA被扩增、生物素标记、Cy3标记，然后杂交到HumanHT-12v4表达BeadChip阵列(得自San Diego,CA)上。荧光信号强度在iScan阵列扫描仪上获得。使用GenomeStudio软件计算平均信号强度和检测p值。此后，使用公共服务器门户www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern(99)，使用基因模式软件的各种模块分析通过如下定义的质量控制(QC)标准的非归一化数据集。如果适用，使用MergeColumns的版本1模块合并要比较的数据集。所有要交叉比较的样品的表达水平均使用IlluminaNormalizer软件版本2(beta)模块进行分位数归一化，然后在Microsoft Excel中进一步处理和/或经由HierarchicalClustering软件版本6模块进行log转化和分级聚类(即距离相关性：Pearson相关性；聚类方法：成对平均键联)。使用Hierarchical Clustering Viewer软件版本11模块生成聚类数据的热图和树形图。为了比较SV-BR-1-GM与其它人分析的样品之间的基因表达水平，基因表达库(GEO；美国国家生物技术信息中心，NCBI)数据集，还在HumanHT-12 v4Expression BeadChip平台上生成，首先与SV-BR-1-GM数据集合并并且如上所述进行处理。对于在Affymetrix人基因组U133Plus 2.0阵列上生成的GEO数据集的计算机分析，使用Expression File Creator软件模块对CEL文件进行RMA/分位数归一化并减去本底，然后如下所述在Microsoft Excel中过滤。
如果至少一个相应的探针在所有人RNA靶向、非对照、探针中产生高于中间“表达”水平的分位数归一化表达值，则将基因定义为经表达的(对于HumanHT-12 v4 ExpressionBeadChip arrays,最大值为47,323)。该本底截止定义与粗略估计一致，即组织中约50％的基因被表达(100)。然而，由于组织含有未知数量的不同细胞类型并且每种细胞类型对细胞总体数量的未知的相对贡献，因此该定义可能高估了实际本底的程度。然而，因此，它降低了识别经表达的非表达基因的可能性。
未归一化的数据集的质量控制
经由Agilent’s 4200 TapeStation系统(得自Agilent,Santa Clara,CA)测定预扩增的SV-BR-1-GM RNA的完整性。具有小于7.5的RNA完整性数值当量(RINe)值的样品被排除在进一步分析之外。此外，对于SV-BR-1-GM样品以及经由(NCBI)获得并在Human HT-12v.4 Bead Chips上处理的样品，评估非归一化数据集的基因表达变异性。除图1C所示的分析外，低变异性样品被排除在进一步处理之外。低变异性定义为第95分位数的表达值与第5分位数的值之间的比率小于10。
样品表示
为了比较性基因表达分析，各个基因在各种SV-BR-1-GM样品类型(即MCB cryo、CPLot IV培养物、CP Lot IV 4p cryo、CP Lot IV 4p培养物、CP Lot V cryo、CP Lot VIIIcryo、CP Lot VIII培养物1d、CP Lot VIII培养物3d和RES Lot II cryo)由其算术基因表达平均值表示。对于需要一个代表性SV-BR-1-GM基因表达值的计算，使用算术平均值中的中值。从GEO获得的除SV-BR-1-GM以外的样品的代表性基因表达水平如下定义：来自数据集GSE48398的乳腺癌细胞系样品和来自数据集GSE56718(80)的人乳腺上皮细胞样品(HMEC，“早期增殖”相对于“深度衰老”)用它们的算术平均值表示。除了图9B-图9E，来自数据集GSE35399(81)的正常乳腺样品类型(即，ALDH NEG、ALDH POS、ERBB3NEG、NCL、BASAL和STROMAL)由它们的中值表达值表示，其中显示了算术平均值和平均值标准误差(SEM)。对于数据集GSE48398，仅使用来自在37℃培养的细胞的表达谱。对于乳腺癌(数据集GSE2943)和正常组织(数据集GSE7307)之间的比较，所有乳腺癌组织(GSE2943的HER2_3+、HER2_2+、HER2_0-1+)中的第95分位数的值和正常组织(表11，GSE73073)的每个组的最大表达值中的第95分位数的值均用作比较物。选择第95分位数的值而不是最大表达值以适应潜在的异常值。
推定的SV-BR-1-GM TAA的计算机鉴定
将分位数归一化的SV-BR-1-GM基因表达值与由GEO数据集GSE35399(81)和GSE56718(80)表示的正常人乳腺细胞的那些表达值进行比较。此外，使代表性SV-BR-1-GM表达值均大于本底截止值(如上定义)的1.5倍并且比所有正常乳腺细胞组中的最大代表值高大于1.5倍的基因，经过第二、中度严格性过滤步骤(即，表达水平大于本底截止值的5倍)(图13和图14；表9和表10)。经由GSE2943中的代表性乳腺癌样品的商和GEO数据集GSE7307中分位数归一化和分组的正常组织的那些商(即高严格性过滤器)进行中度严格性过滤后保留的基因的验证。表11中列出了正常组织组，并且表12中的高严格性过滤后保留的20种基因。ERBB2 Affymetrix探针216836_s_at的商(乳腺癌/正常组织)值(商＝3.738)用作其商≥3.738的探针的高严格性过滤器保留基因的截止值，被定义为“经验证的”。
对于图3，仅进一步分析了在所有样品中的最大代表性表达值大于本底截止值的1.5倍的癌症/睾丸抗原(CTA)(表7)。
定量RT-PCR
通过定量RT-PCR对样品亚组的基因表达进行的验证是在ABI 7900HT实时PCR仪器上使用可商购获得的测定(表3)以及表4中列出的样品进行的。
HLA分型和免疫组织化学
对SV-BR-1-GM和外周血细胞样品进行HLA-A、HLA-B和HLA-DRB3的高分辨率HLA分型。使用针对人HLA-DRB3的N末端区域产生的兔多克隆抗体，通过免疫组织化学在石蜡包埋的组织上评估肿瘤样品上的HLA-DRB3表达(产品代码：ab196601；获自Abcam,Cambridge,MA)。
HLA等位基因组合的频率
根据(87)报道的等位基因频率，计算出估计的“表型频率”，表明个体携带以下的概率：(a)SV-BR-1-GM的HLA I类等位基因(HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-B*35:08或HLA-B*55:01)或等位基因的组(HLA-A*11、HLA-A*24、HLA-B*35或HLA-B*55)中的至少一种，(b)SV-BR-1-GM的HLA II类等位基因(HLA-DRB3*01:01或HLA-DRB3*02:02)或等位基因的组(HLA-DRB3*01或HLA-DRB3*02)中的至少一种，和(c)SV-BR-1-GM的I类和II类等位基因或等位基因的组中的每一种中的至少一种。对于以下定义，等位基因和等位基因的组都被称为“等位基因”，并且各个SV-BR-1-GM HLA-A、-B和-DRB3等位基因频率的总和分别被称为ΣfaA、ΣfaB和ΣfaDRB3。“表型频率”(fp)计算如下：对于(a)，fp＝1-(1-ΣfaA)2x(1-ΣfaB)2，从而(1-ΣfaA)2和(1-ΣfaB)2是个体既不携带SV-BR-1-GM HLA-A(1-ΣfaA)2也不携带-B(1-ΣfaB)2等位基因的概率(由于二倍体，指数＝2，即2组染色体，并且因此2个HLA-A和两个HLA-B基因座)。相反，1-(…)2x(…)2是个体携带至少一个SV-BR-1-GM HLA-A或-B等位基因的概率；对于(b)，fp＝1-(1-ΣfaDRB3)2，从而(1-ΣfaDRB3)2是每个个体不存在SV-BR-1-GM HLA-DRB3等位基因的概率，并且相反，1-(…)2是个体携带至少一个SV-BR-1-GM HLA-DRB3等位基因的频率；对于(c)，fp＝[1-(1-ΣfaA)2x(1-ΣfaB)2]x[1-(1-ΣfaDRB3)2]，从而1-(1-ΣfaA)2x(1-ΣfaB)2表示个体携带至少一个SV-BR-1-GM HLA-A或-B等位基因的概率，并且1-(1-ΣfaDRB3)2是个体携带至少一个SV-BR-1-GM HLA-DRB3等位基因的概率。用于计算的等位基因频率是从(87)中的数据5中获得的，并且包括具有不同名称但在抗原识别位点中氨基酸相同的等位基因的频率(参见，(87)中的补充数据集1)。
缩写
APC：抗原呈递细胞
DC：树突细胞
HGNC：人基因组组织(HUGO)基因命名委员会
HLA：人白细胞抗原
HMEC：人乳腺上皮细胞
MHC：主要组织相容性复合体
MoA：作用机制
RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应
TAA：肿瘤相关抗原
表2：具有已知免疫刺激作用的基因
表3：定量RT-PCR 试剂
使用表3中列出的可商购获得的测定(获自Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)在ABI 7900HT实时PCR仪器上进行样品子集的基因表达的验证。
表4：用于定量RT-PCR的样品
样品 RIN [RNA](ng/μL) OD 260/280 OD<sub>260</sub>/OD<sub>230</sub>
MCB cryo 7.5 587.1 1.96 1.97
CP Lot IV cryo 6.9 935.1 2.06 1.9
CP Lot VIII cryo 10 108.1 1.84 2.23
CP Lot VIII cryo 9.9 107.7 1.89 1.91
CP Lot IV培养物 9.9 514.4 2 1.91
CP Lot VIII培养物 10 71.24 1.8 2.41
使用表4中列出的样品通过定量RT-PCR进行样品子集的基因表达的验证。“RIN”表示RNA完整性数值；“OD”表示光密度。
表7：推定的CTA
ACRBP ACTL8 ADAM2 ADAM20 ADAM21 ADAM22 ADAM23 ADAM28
ADAM29 AKAP3 AKAP4 ANKRD30BP2 ANKRD45 ARMC3 ARX ATAD2
ATAD2B BAGE BAGE2 BAGE3 BAGE4 BAGE5 BRDT CABYR
CAGE1 CALR3 CCDC110 CCDC33 CCDC36 CCDC62 CCDC83 CCNA1
CEP290 CEP55 CNOT9 COX6B2 CPXCR1 CRISP2 CSAG1 CSAG2
CT45A1 CT45A2 CT45A3 CT45A5 CT45A6 CT47A1 CT47A10 CT47A11
CT47A12 CT47A2 CT47A3 CT47A4 CT47A5 CT47A5 CT47A7 CT47A8
CT47A9 CT47B1 CT55 CT62 CT83 CTAG1A CTAG1B CTAG2
CTAGE1 CTCFL CTNNA2 DCAF12 DDX43 DDX5 DDX53 DKKL1
DMRT1 DNAJB8 DPPA2 DSCR8 ELOVL4 EPPIN FAM133A FAM46D
FATE1 FBXO39 FMR1NB FSIP1 FTHL17 GAGE1 GAGE10 GAGE12B
GAGE12C GAGE12D GAGE12E GAGE12F GAGE12G GAGE12H GAGE12I GAGE12J
GAGE13 GAGE2A GAGE3 GAGE4 GAGE5 GAGE6 GAGE7 GAGE8
GOLGA6L2 GPAT2 GPATCH2 HEMGN HORMAD1 HORMAD2 HSPB9 IGSF11
IL13RA2 IMP3 KDM5B KIAA0100 KIF20B KIF2C KNL1 LDHC
LEMD1 LINC01192 LINC01193 LINC01194 LIPI LOC440934 LUZP4 LY6K
LYPD6B MAEL MAGEA1 MAGEA10 MAGEA11 MAGEA12 MAGEA2 MAGEA2B
MAGEA3 MAGEA4 MAGEA5 MAGEA6 MAGEA8 MAGEA9 MAGEA9B MAGEB1
MAGEB10 MAGEB16 MAGEB17 MAGEB18 MAGEB2 MAGEB3 MAGEB4 MAGEB5
MAGEB6 MAGEC1 MAGEC2 MAGEC3 MIA2 MORC1 MPHOSPH10 NLRP4
NOL4 NR6A1 NUF2 NXF2 NXF2B ODF1 ODF2 ODF2L
ODF3 ODF3L1 ODF3L2 ODF4 OIP5 OTOA PAGE1 PAGE2
PAGE2B PAGE3 PAGE4 PAGE5 PASD1 PBK PIWIL1 PIWIL2
PLAC1 POTEA POTEB POTEC POTED POTEE POTEG POTEH
PRAME PRAMEF1 PRAMEF11 PRM1 PRM2 PRSS50 PRSS54 PRSS55
PTPN20 RBM46 REC114 RGS22 RHOXF2 RNF17 ROPN1 ROPN1B
ROPN1L SAGE1 SEMG1 SLCO6A1 SPA17 SPACA3 SPAG1 SPAG17
SPAG4 SPAG6 SPAG8 SPAG9 SPANXA1 SPANXA2 SPANXB1 SPANXC
SPANXD SPANXN1 SPANXN2 SPANXN3 SPANXN4 SPANXN5 SPATA19 SPEF2
SPO11 SSX1 SSX2 SSX2B SSX4 SSX4B SSX5 SSX6
SSX7 SSX9 SUN5 SYCE1 SYCE1L SYCP1 TAF7L TDRD1
TDRD6 TEKT5 TEX101 TEX14 TEX15 TEX38 TFDP3 THEG
TMEFF1 TMEFF2 TMEM108 TMPRSS12 TPPP2 TPTE TPTE2 TSGA10
TSPY1 TSPY2 TSPY3 TSSK6 TTK TULP2 VENTXP1 XAGE1B
XAGE1E XAGE2 XAGE3 XAGE-4 XAGE5 ZNF165 ZNF645
表9：低严格性过滤之后保留的基因
表10：中度严格性过滤(&gt;5.0x本底并且&gt;1.5x最大值(正常))后保留的基因
表11：正常组织
表13：正常组织和乳腺癌组织(Her23+、2+和0-1+)中计算机验证的TAA候选物的 95％置信区间
将N＝44的正常组织组内的95％置信区间(CI)与数个乳腺癌组的95％CI进行比较(即，其Her2状态不同)，每个组由TAA表达水平高于正常组织的95％CI的上限的样品组成。GEO DataSet GSE2943用于建立乳腺癌表达值。选择来自GSE7307的151个样品用于正常组织。这151个样品代表44种不同类别的组织(即，脂肪、肾上腺、动脉、骨髓、脑、乳腺、子宫颈、子宫内膜、食管、输卵管、肠、心脏、免疫细胞、关节、肾脏、肝脏、肺脏、淋巴结、粘膜、神经、卵巢、胰腺、阴茎、腹膜、脑下垂体、胎盘、前列腺、子宫颈后浸润物、唾液腺、骨骼肌、皮肤、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、尿道、子宫、阴道、静脉、外阴)。为了确定正常组织组中的95％CI，每个类别由其最高表达值表示。ERBB2、MIEN1和PGAP3的95％CI对于Her2 3+最高，而对于Her2 0-1+癌症组最低。
表14：正常组织和乳腺癌组织(FISH阳性和阴性Her2 2+)中计算机验证的TAA候选 物的95％置信区间
将N＝44的正常组织组内的95％置信区间(CI)与数个Her22+乳腺癌组(即，全部，FISH阳性以及FISH阴性)的95％CI进行比较，每个组由TAA表达水平高于正常组织的95％CI上限的样品组成。GEO DataSet GSE2943用于建立乳腺癌表达值。选择来自GSE7307的151个样品用于正常组织。这151个样品代表44种不同类别的组织(即，脂肪、肾上腺、动脉、骨髓、脑、乳腺、子宫颈、子宫内膜、食管、输卵管、肠、心脏、免疫细胞、关节、肾脏、肝脏、肺脏、淋巴结、粘膜、神经、卵巢、胰腺、阴茎、腹膜、脑下垂体、胎盘、前列腺、子宫颈后浸润物、唾液腺、骨骼肌、皮肤、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、尿道、子宫、阴道、静脉、外阴)。ERBB2、MIEN1和PGAP3的95％CI对于Her2 FISH+比对Her2 FISH-癌症组更高。
表20：用于HER2分化的选定生物标志物的灵敏度分析
(灵敏度＝使用RNA数据，检测为HER2阳性的Her2 3+患者的百分比；特异性＝100％，即，Her2 0-1+患者没有一个被检测为HER2阳性)
实施例2：经由稳定转染进行的HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02的过表达。
背景
如表16(87)所示，HLA-A*02:01是生活在美国的16个种族的组中特别常见的HLA-A等位基因(3.5-27.5％，中位数：13.6％)，其中北美印第安人组(27.8％)患病率最高，其后是欧洲高加索人组(27.6％)。同样，HLA-DRB3*02:02是同一16组中最常见的HLA-DRB3等位基因(10.4-34.5％，中位数：20.0％)，其中在中东组或非洲北海岸组中的患病率最高(34.5％)，其后是南亚印第安人组(27.2％)。据报道，北美印第安人组和欧洲高加索人组的HLA-DRB3*02:02患病率分别为14.5％和18.2％(表16)。
表16：HLA-A和HLA-DRB3等位基因频率
表16列出了如由(87)报告的频率。AAFA表示非裔美国人，AFB表示非洲人，AINDI表示南亚印度人，AMIND表示北美印第安人，CARB表示加勒比黑人，CARHIS表示加勒比西班牙人，EURCAU表示欧洲高加索人，FILII，菲律宾人，JAPI表示日本人，KORI表示韩国人，MENAFC表示中东人或非洲北岸人，MSWHIS表示墨西哥人或奇卡诺人，NCHI表示中国人，SCAHIS表示西班牙裔-南美洲人或中美洲人，SCSEAI表示东南亚人以及VIET表示越南人。一些等位基因名称中的“g”是指包含具有不同名称但具有在抗原识别位点中与列出的等位基因相同的氨基酸的等位基因。
表17中显示了HLA-A/HLA-DRB3等位基因组合的表型频率，其由存在每个个体(2n)的一种或多种相应等位基因的至少一个拷贝定义。在中东人或非洲北岸人组的表型频率为20.3并且欧洲高加索人的表型频率为15.7％的情况下，HLA-A*02:01/HLA-DRB3*02:02在上述16个种族的组中的患病率最高。因此，假设胞啃(即“交叉修饰”)或直接抗原呈递给T细胞是全细胞疫苗免疫刺激的有效机制，表达HLA-A*02:01/HLA-DRB3*02:02组合的疫苗具有特别广泛的适用性。
表17：HLA-A/HLA-DRB3等位基因组合的表型频率
根据(87)报道的等位基因频率，计算估计的“表型频率”，表明个体携带指定的HLA-A的至少一种和指定的HLA-DRB3等位基因的至少一种的概率。表17中显示的是作为百分比值的“表型频率”。AAFA表示非裔美国人，AFB表示非洲人，AINDI表示南亚印度人，AMIND表示北美印第安人，CARB表示加勒比黑人，CARHIS表示加勒比西班牙人，EURCAU表示欧洲高加索人，FILII，菲律宾人，JAPI表示日本人，KORI表示韩国人，MENAFC表示中东人或非洲北海岸人，MSWHIS表示墨西哥人或奇卡诺人，NCHI表示中国人，SCAHIS表示西班牙裔-南美洲人或中美洲人，SCSEAI表示东南亚人以及VIET表示越南人。一些等位基因名称中的“g”是指包含具有不同名称但具有在抗原识别位点中与列出的等位基因相同的氨基酸的等位基因。
质粒构建
用于生成质粒和进行基于质粒的转染的方法对于本领域技术人员来说是已知的。该实施例证明了产生过表达HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02的SV-BR-1-GM细胞。
为了使基因表达最大化，将HLA-A*02:01编码序列在计算机上进行了优化。作为起点，使用如由GenBank(NCBI)登录号AY365426.1表示的HLA-A*02:01 cDNA核酸序列(SEQ IDNO:1)。使用软件诸如Gene Optimizer软件(可从Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA获得)进行优化。用户指定的参数包括1)通过添加“GCCACC”序列在翻译起始密码子的紧邻上游确保存在Kozak序列，2)5’BamH I限制性位点序列(GGATCC)和3’Cla I(ATCGAT)限制性位点序列，用于将插入物直接转移至另一个载体，和3)优化以用于智人(Homo sapiens)。基因合成、转移至适合的载体诸如pcDNATM 载体(可从Thermo Fisher Scientific获得)中、将质粒扩增(如，使用细菌细胞诸如大肠埃希氏菌(E.coli))并且纯化方法是本领域技术人员已知的。经优化的HLA-A*02:01ORF的DNA序列示于SEQ ID NO:2中并且整个pcDNA3.4-A0201构建体序列示于SEQ ID NO:3中。
实现HLA-A基因的表达(如，在哺乳动物细胞中)的方法是本领域技术人员已知的。与本发明特别相关的是SV-BR-1-GM细胞(参见，如美国专利No.,7674456和美国专利申请No.US 10/868,094，两者均出于所有目的完全并入本文)，尽管进行了数月的培养，但还没有丢失编码GM-CSF的CMV启动子驱动的CSF2基因表达。然而，可以使用替代启动子，诸如EF-1α启动子，其比CMV启动子更不易被沉默(101)。
本发明的一个优选方面包括经工程化以表达两种异位HLA基因的癌细胞。为了使用具有两个单独转录单元的单个质粒实现此类双重表达，使用pVITRO2-neo-mcs(可从Invivogen,San Diego,CA获得)。pVITRO2-neo-mcs质粒包含两个多克隆位点(即MCS1和MCS2)。MCS1经由含有人铁蛋白重链和小鼠EF-1α调控元件的启动子允许异位表达，MCS2插入物通过包含人铁蛋白轻链和黑猩猩EF-1α调控元件的复合启动子表达。此外，MCS1转录单元的表达产生双顺反子信使RNA，其包含编码MCS1插入物的mRNA、内部核糖体进入位点(IRES)和编码新霉素/G418抗性标记的mRNA。本领域的技术人员将认识到后一特征对于选择具有来源于pVITRO2-neo-mcs的稳定整合的DNA的哺乳动物细胞特别重要，因为新霉素/G418抗性细胞也表达克隆到MCS1中的转基因。
为了将来自pcDNA3.4-A0201的HLA-A*02:01ORF转移到pVITRO2-neo-mcs载体的MCS1中，将两种质粒用BamHI和ScaI双重消化。此后，将来自pcDNA3.4-A0201的BamHI-[HLA-A*02:01]-ScaI片段连接到pVITRO2-neo-mcs载体的BamHI和ScaI位点中。此后，所得的质粒，被称为pVITRO2-A0201，在卡那霉素选择压力下在大肠埃希氏菌中扩增，然后纯化。本领域的技术人员使用已知的标准技术用于上述步骤。经纯化的pVITRO2-A0201质粒可以用于瞬时或稳定(经由G418选择)转染哺乳动物细胞，和/或可以进一步经工程化用于插入MCS2中的第二异位基因的表达。pVITRO2-A0201在ori区域含有单个ApaL I限制(GTGCAC)位点(用于在大肠埃希氏菌中进行质粒复制)，即在哺乳动物调控区域之外或者在新霉素抗性标记或在HLA-A*02:01的ORF中。因此，在转染到哺乳动物细胞中之前，可以用ApaLI消化pVITRO2-A0201以促进染色体整合，而没有任何这些关键元件的功能性失活。
为了促进异位HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02的共表达，将HLA-DRB3*02:02ORF插入pVITRO2-A0201的MCB2中。为实现此目的，HLA-DRB3*02:02ORF序列中的ApaL I位点(GTGCAC)，如可经由欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)作为IMGT/HLA Acc No.HLA00895(SEQ ID NO:4)获得，其首先通过用“A”改变最后的“C”而被去除。通过这种改变，CGG密码子被AGG密码子替代，两者都编码精氨酸。两个密码子的频率相似(即CGG为11.4/1000，并且AGG为12.0/1000)。在包含同义突变后，HLA-DRB3*02:02ORF(SEQ ID NO:4)显示为SEQ ID NO:5。之后使用Gene Optimizer软件(Thermo FisherScientific)优化后一序列。用户指定的参数包括上述的那些参数。在优化之后，从序列中去除该临时ApaL I位点。合成、转移到载体中、扩增和纯化的后续步骤如上所述。经优化的HLA-DRB3*02:02ORF的DNA序列在SEQ ID NO:6中所示，并且整个pcDNA3.4-DRB30202构建体的序列在SEQ ID NO:7中所示。
为了将来自pcDNA3.4-DRB30202的HLA-DRB3*02:02ORF转移到pVITRO2-A0201载体的MCS2中，将两个质粒用XhoI和NheI双重消化。此后，将来自pcDNA3.4-DRB30202的XhoI-[HLA-DRB3*02:02]-NheI片段连接到pVITRO2-A0201载体的XhoI和NheI位点。此后，所得的质粒，被称为pVITRO2-A0201-DRB30202，在卡那霉素选择压力下在大肠埃希氏菌中扩增，然后纯化。本领域的技术人员使用已知的标准技术用于上述步骤。经纯化的pVITRO2-A0201-DRB30202质粒可用于瞬时或稳定转染哺乳动物细胞。pVITRO2-A0202-DRB30202的序列在SEQ ID NO:8中示出。
引入质粒至哺乳动物细胞中
将pcDNA3.4-A0201、pcDNA3.4-DRB30202和/或pVITRO2-A0201-DRB30202质粒稳定转染到适当的细胞(如哺乳动物细胞)中的方法是本领域技术人员已知的。对于pcDNA3.4-A0201和pcDNA-DRB30202，PvuI是在氨基青霉素抗性标记的ORF中切割的适合的限制性内切核酸酶。对于pVITRO2-A0201-DRB30202，在复制起点(ori)区切割的ApaLI是最优选的限制酶。
在线性化之后，使用本领域技术人员已知的方法将质粒纯化。随后的步骤，包括SV-BR-1-GM细胞的培养、转染试剂(TR)-DNA复合体的制备、细胞的酶促脱附和培养基中的再悬浮、细胞接种和用TR-DNA复合体孵育、用新鲜培养基替换培养基、稳定转染细胞的短期培养抗生素选择和稳定转染细胞的克隆，也是本领域技术人员已知的。本领域的技术人员也知道，与用于转染混悬细胞的那些方法类似的方法可以应用于贴壁细胞的转染。
虽然这里概述的方法使用SV-BR-1-GM细胞作为一个实例来示例，本领域的技术人员将认识到，因为HLA等位基因的异位表达促进了各种哺乳动物细胞上的抗原呈递，包括其它全细胞癌症疫苗，所以本文所述的方法可用于除了SV-BR-1-GM细胞之外的任何细胞数。此外，尽管SV-BR-1-GM确实表达内源性HLA-DRB3*02:02，但经由强启动子的异位表达进一步改善了基于HLA-DRB3的抗原呈递。
实施例3：评估经工程化以过表达HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02的SV-BR-1-GM细胞的免疫原性。
HLA-A*02:01-特异性免疫作用的体外评估
为了评估经工程化以过表达单独的HLA-A*02:01或与HLA-DRB3*02:02组合的HLA-A*02:01的SV-BR-1-GM细胞的免疫原性，将对包含HLA-A*02:01蛋白的MHC有特异性的T细胞与HLA-A*02:01+SV-BR-1-GM细胞共孵育，然后测定活化。
第一，来自携带HLA-A*02:01等位基因的SV-BR-1-GM接种或未接种疫苗的供体的T细胞，经由抗体介导的CD28和CD3以及任选的CD2的刺激进行体外扩增。作为一个非限制性实例，使用T细胞活化/扩增试剂盒(可从Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany获得)与未分选的PBMC或选择的CD8+T细胞的组合。第二，从供体来源的细胞的总群体中分离出对包含HLA-A*02:01蛋白的MHC有特异性的T细胞。该富集步骤通过FACS使用包含HLA-A*02:01和体现肿瘤相关抗原的抗原肽(其在SV-BR-1-GM细胞中表达，诸如PRAME或ERBB2(HER2))的荧光标记的MHC四聚体或五聚体进行。第三，为了评估靶细胞刺激后效应T细胞是否被激活以及何种程度激活，将肽特异性效应T细胞和靶细胞共孵育。此后，回收效应T细胞并分析其活化。作为一个非限制性实例，可以进行活化标记CD137(4-1BB)的染色，然后进行基于流式细胞术的定量和细胞增殖行为的评估。作为一个非限制性实例，此类评估可以通过使用例如CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(可从Thermo Fisher Scientific获得)在CFSE染料稀释度测定中进行。对于后一种测定，T细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色，CFSE是一种可渗透的荧光染料，其细胞内浓度随每次细胞分裂而降低。因此，每细胞荧光信号在分裂细胞群中也减少。为了解决效应T细胞的细胞毒性潜力，将靶细胞接种在96孔板中，然后与效应细胞一起孵育。去除效应T细胞后，测量靶细胞的细胞存活力。
进行该研究所需的方法和试剂是本领域技术人员已知的。例如，包含HLA-A*02:01蛋白质和体现PRAME(VLDGLDVLL或ALYVDSLFFL)或ERBB2/HER2(RLLQETELV)肽的五聚体可从ProImmune(ProImmune Ltd.,Oxford,UK；ProImmune Inc.,Sarasota,FL)获得。
HLA-DRB3*02:02-特异性免疫作用的体外评估
为了评估过表达单独的HLA-DRB3*02:02或与HLA-A*02:01组合的HLA-DRB3*02:02的SV-BR-1-GM细胞是否可以活化T辅助细胞，可以采用本领域技术人员已知的方法。在(102)中描述了适合的方法的一个非限制性实例，其出于所有目的在此通过引用并入本文。在经工程化的SV-BR-1-GM细胞的背景中，来自携带HLA-DRB3*02:02等位基因的供体的外周血单核细胞(PBMC)被与HLA-DRB3*02:02四聚体相互作用(102)的破伤风毒素(TT)肽(如，MSLLTEVETYVLSIIPSGPL、TYVLSIIPSGPLKAEIAQRL和/或GLQRRRFVQNALNGNGDPNN)刺激。在刺激约14天后，分离CD4+T细胞(即，富含TT-HLA-DRB3*02:02-特异性T细胞)，然后将其用过表达HLA-DRB3*02:02的SV-BR-1-GM细胞共孵育，所述SV-BR-1-GM细胞已经或未曾与TT肽预孵育。此后，回收T细胞，并通过ELISpot和/或流式细胞术分析细胞因子诸如干扰素-γ或IL-2的产生，并例如通过CSFE染料稀释测定分析它们的增殖行为。
如果TT肽刺激的SV-BR-1-GM细胞诱导比未与TT肽预孵育的SV-BR-1-GM细胞更高水平的T辅助细胞相关的细胞因子和/或更显著的T细胞增殖率，则异位HLA-DRB3*02:02等位基因对T辅助细胞活化有功能性贡献。
对全细胞免疫原性的MHC匹配贡献的体内评估
为了评估全细胞疫苗的HLA/MHC类型与体内多种效应免疫细胞之间的功能性联系，生成小鼠疫苗细胞系，并将其在具有不同MHC单倍型的不同小鼠品系上进行测试。然而，临床前模型还必须允许结合免疫检查点抑制剂诸如抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA4抗体来测试疫苗。
NF639细胞(ATCC:CRL-3090)是具有表达Erbb2/neu的FVB/N本底的小鼠乳腺肿瘤细胞，并因此类似于SV-BR-1-GM细胞。为了还过表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，使用本领域技术人员已知的技术将细胞工程化以稳定地表达小鼠Csf2基因，产生被称为NF639-GM的细胞系。
FVB/N小鼠在MHC I基因座H-2K、H-2D和H-2L以及MHC II基因座I-A和I-E处携带“q”等位基因。相反，Balb/c小鼠在这些MHC I和II基因座处携带“d”等位基因。为了获得NF639-GM(FVB/N本底)和Balb/c效应细胞之间的MHC I或MHC I和II匹配，NF639-GM细胞使用本领域技术人员已知的技术进一步工程化，以表达表18中列出的(Balb/c)“d”MHC I和II等位基因。
表18：MHC等位基因
(103)解决了具有Balb/c来源的同基因乳腺癌细胞系诸如等基因系67NR、168FARN、4TO7和4T1的Balb/c小鼠中的同种异体肿瘤的生成，允许通过使用所示的10种经工程化的NF639来源的细胞系的全部或子集(表18)作为疫苗测试HLA/MHC等位基因匹配假设。肿瘤缩小或生长动力学用作主要的终点。本领域的技术人员很熟悉评估肿瘤体积的方法，其非限制性实例是在疫苗接种之前和之后的几个时间点进行基于卡尺的测量。
实施例4：经由基于锌指核酸酶的工程化进行的HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02的过表达。
使用锌指核酸酶(ZFN)进行的细胞系工程化是基于质粒的转染的替代方法。与基于质粒的稳定转染相比，异位表达盒的染色体整合针对限定的基因座。对于使用人细胞的过表达研究，染色体19上的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)是优选的整合位点。可商购获得的试剂盒，称为CompoZr靶向整合试剂盒-AAVS1(可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO获得)，允许定制地整合到该位点。试剂盒采用的方法利用克隆质粒pZDonor，其中ORF待表达。插入ORF的多克隆位点(MCS)的侧接有在AAVS1整合位点中发现的DNA元件。携带具有编码AAVS1特异性ZFN的mRNA的ORF的pZDonor质粒的共转染(作为非限制性实例，通过核转染(即，电穿孔方法))允许ORF整合到AAVS1基因座中。鉴于该方法的高功效，可能将ORF整合到存在于二倍体细胞中的染色体19的两个拷贝的AAVS1基因座中。因此，例如，HLA-A*0201和HLA-DRB3*02:02都可以在同一细胞中过表达。
应注意，上述实施例2中描述的pcDNA3.4-A0201和pcDNA3.4-DRB30202质粒，分别携带HLA-A*02:01和HLA-DRB3*02:02ORF，允许直接转移HLA插入物到pZDonor质粒的MCS中。两个ORF都可以作为XbaI-EcoRV片段转移并克隆到pZDonor的XbaI和PmeI位点中。
实施例5：评估患者和疫苗HLA型之间的相关关系及疫苗功效。
为了评估SV-BR-1-GM疫苗有效性与疫苗-患者HLA等位基因同一性之间的相关程度，确定I/IIa期研究(BB-IND 10312)募集的HLA类型的临床试验受试者。
背景
该临床研究包括一系列疫苗循环，从而每个疫苗施用包括疫苗的四个真皮内注射(即，每个位置具有约五百万个辐照的SV-BR-1-GM细胞的四个不同位置处)。每个疫苗循环包括四个研究事件：1)预-疫苗环磷酰胺，2)疫苗接种，3)疫苗后约48小时施用干扰素-α-2b(可从Merck获得)，和4)在疫苗后约96小时(例如，在医生办公室进行)的干扰素-α-2b施用。在开始疫苗疗法循环后的每次研究随访时评估安全性和临床发展的评价。
如表19所示，前三个循环在一个月内的0周、2周和4周发生。接下来是每月循环，共6个月，其中任选的治疗延长至一年。第五次接种后进行成像和再分期。在没有进行性疾病(下文定义)或主要安全性问题的情况下，患者继续进行另外的疫苗疗法周期以完成6个月的实验性疫苗施用，并在最后一次治疗后约3周，每3个月进行再分期。如果患者仍然是非进行性的并且希望在六个月后继续治疗，则另外提供三个月的治疗，然后在九个月再分期。同样，如果患者患有非进行性疾病并希望继续治疗，则提供另外3个月的治疗，在12个月时完成治疗。
表19：研究设计
在首席研究员批准的特殊情况下，循环之间的灵活性可以在一周内+/-
为了增强免疫应答，将患者用低剂量环磷酰胺预处理，其在每次苗接种前48-72小时下调T调节细胞机制。低剂量干扰素-α-2b用作佐剂，并在疫苗接种后约48小时和约96小时通过真皮内注射至接种部位来进行接种。每个方案定期收集生物样品，并存储在贮藏室中。
使用不良事件的常用术语标准(即CTCAE v 4.03)量表密切监测研究参与者的不良事件(如，毒性)。新的或进行性肿瘤或治疗相关的III级过敏/超敏反应的发展缩短了进一步向任何特定受试者接种。
成功量度
虽然核心成功措施是安全性和毒性缺乏，但以下任何一项都可用作成功措施：1)在25％患者中，如irRC RECIST 1.1标准所定义的客观临床响应，2)如SF-36问卷(生活质量)中一个或多个量表的显著变化所证明，50％或更多的患者中生活质量改善，3)与已发表的文献中的其它援救疗法报告的历史对照相比，无疾病存活和总体存活延长，4)免疫应答的发展或扩增的证据，特别是如果与存活的延长相关。
客观临床响应主要通过肿瘤负荷的放射学评估来评估。作为非限制性实例，这可以通过计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI)和/或正电子发射断层摄影术(PET)来进行。参见(16)。为了评估在具有SV-BR-1-GM细胞中也发现的HLA等位基因的患者中客观肿瘤消退是否特别明显，确定作为非限制性实例的来自临床试验受试者的口腔细胞或血细胞的HLA类型。本领域的技术人员已知的数种方法适用于确定HLA等位基因。对于非限制性示例，参见(104)。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且对于本领域技术人员而言提示对其进行各种修改或改变，并且这些都包括在本申请的精神和范围内及所附权利要求书的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利、专利申请和序列登记号出于所有目的在此均以引用的方式整体并入本文。
V.参考文献
出于所有目的，所有参考文献均以其整体并入本文。
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VI.示例性实施方案
根据目前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
1.经修饰的人癌细胞，其包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
2.如实施方案1所述的经修饰的人癌细胞，其包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
3.经修饰的人癌细胞，其包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
4.如实施方案3所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码HLA I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
5.如实施方案1至4中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述重组多核苷酸存在于所述细胞中的载体上。
6.如实施方案1至4中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述重组多核苷酸被整合至所述细胞的基因组中。
7.如实施方案1至6中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
8.如实施方案7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
9.如实施方案7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
10.如实施方案7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-C基因的等位基因选自：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
11.如实施方案2至10中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
12.如实施方案2至10中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
13.如实施方案12所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
14.如实施方案12所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
15.如实施方案14所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
16.如实施方案2至15中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
17.如实施方案1至16中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组多核苷酸。
18.如实施方案1至17中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码干扰素α(IFNa)的重组多核苷酸。
19.如实施方案1至18中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)或它们的组合。
20.如实施方案1至19中任一项所述的经修饰的人癌细胞，其中所述人癌细胞是人癌细胞系。
21.如实施方案20所述的经修饰的人癌细胞，其中所述人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
22.为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，所述方法包括：
(a)检测从所述受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，以生成所述受试者的HLA等位基因谱；
(b)基于全细胞癌症疫苗中一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，将所述受试者的HLA等位基因谱与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱进行比较；和
(c)当所述受试者的HLA等位基因谱与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择所述全细胞癌症疫苗。
23.如实施方案22所述的方法，其中所述一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
25.如实施方案24所述的方法，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
26.如实施方案24所述的方法，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
27.如实施方案24所述的方法，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
28.如实施方案23所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
29.如实施方案23所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
30.如实施方案29所述的方法，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
31.如实施方案29所述的方法，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
32.如实施方案31所述的方法，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
33.如实施方案23至32中任一项所述的方法，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
34.如实施方案22至33中任一项所述的方法，其中当所述受试者的HLA等位基因谱中的一种或多种等位基因与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗。
35.如实施方案34所述的方法，其中当所述受试者的HLA等位基因谱中的两个或更多个等位基因与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择所述全细胞癌症疫苗。
36.为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，所述方法包括：
(a)(i)检测从所述受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的存在或水平；和/或
(a)(ii)测量从所述受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量；
(b)将在(a)(i)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或在步骤(a)(ii)中测量的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量，与在对照样品中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量进行比较；和
(c)基于步骤(b)中的比较，为所述受试者选择所述全细胞癌症疫苗，其中所述全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。
37.如实施方案36所述的方法，其中所述乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
38.如实施方案36或37所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)、α-1,3-葡糖基转移酶(ALG8)、肌动蛋白相关的蛋白2/3复合体、亚基5样(ARPC5L)、染色盒同系物2(CBX2)、胶原VIII型α1链(COL8A1)、DDB1和CUL4相关因子10、(DCAF10)、真核翻译起始因子3亚基H(EIF3H)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、组蛋白簇1H4家族成员h(HIST1H4H)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)、整合因子复合体亚基7(INTS7)、角蛋白19(KRT19)、角蛋白81(KRT81)、甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶、同工酶A(MGAT4A)、迁移和侵袭增强子1(MIEN1)、后-GPI附着蛋白3(PGAP3)、重构和间隔因子1(RSF1)、含SH2结构域的衔接子蛋白B(SHB)、可溶载体家族35成员A2(SLC35A2)、含血影蛋白重复的核被膜家族成员4(SYNE4)、转运蛋白1(TNPO1)以及它们的组合。
39.如实施方案36至38中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
40.如实施方案39所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物是PRAME。
41.如实施方案39所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
42.如实施方案36至41中任一项所述的方法，其中相较于所述对照样品，当从所述受试者获得的样品中所述一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达时，为所述受试者选择疫苗，其中所述对照样品包含从所述受试者获得的正常细胞或组织、从不同受试者获得的正常细胞或组织、或从受试者群体获得的正常细胞或组织。
43.如实施方案42所述的方法，其中相较于对照样品，当所述一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达至少约1.5倍时，为所述受试者选择疫苗。
44.如实施方案36至43中任一项所述的方法，其中相较于对照样品，当从所述受试者获得的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量更高时，为所述受试者选择疫苗，其中所述对照样品包含从未患有癌症的不同的受试者或受试者群体获得的一种或多种免疫细胞。
45.如实施方案44所述的方法，其中相较于对照样品，从所述受试者获得的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量高至少约1.5倍。
46.如实施方案36至45中任一项所述的方法，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。
47.如实施方案46所述的方法，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
48.如实施方案36至47中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法检测所述一种或多种生物标志物的存在或水平：ELISA、多重测定、测量编码抗原的基因的RNA转录物水平、免疫组织化学、蛋白质印迹、基于珠粒的方法以及它们的组合。
49.如实施方案36至48中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC多聚体测定、流式细胞术测定以及它们的组合。
50.如实施方案36至49中任一项所述的方法，其中在用抗原刺激后测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
51.如实施方案36至50中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因。
52.如实施方案51所述的方法，其中所述一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。
53.如实施方案52所述的方法，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
54.如实施方案53所述的方法，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
55.如实施方案53所述的方法，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
56.如实施方案53所述的方法，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
57.如实施方案52所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
58.如实施方案52所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
59.如实施方案58所述的方法，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
60.如实施方案58所述的方法，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
61.如实施方案60所述的方法，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
62.如实施方案52至61中任一项所述的方法，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
63.如实施方案51至62中任一项所述的方法，其中当从所述受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因与所述疫苗中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因匹配时，为所述受试者选择疫苗。
64.如实施方案36至63中任一项所述的方法，其中从所述受试者获得的样品是全血样品、血浆样品、血清样品、口腔拭子样品、肿瘤组织样品、生物流体样品、胸腔积液样品、尿液样品、毛发样品、皮肤样品或它们的组合。
65.如实施方案36至64中任一项所述的方法，其中所述样品从活检获得、从手术切除物获得、作为细针抽吸物(FNA)获得或它们的组合。
66.如实施方案36至65中任一项所述的方法，其中所述样品包括肿瘤组织、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)或它们的组合。
67.包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
68.如实施方案67所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码HLAII类基因的等位基因的重组多核苷酸。
69.包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
70.如实施方案69所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码HLAI类基因的等位基因的重组多核苷酸。
71.如实施方案67至70中任一项所述的组合物，其中所述重组多核苷酸存在于所述细胞中的载体上。
72.如实施方案67至70中任一项所述的组合物，其中所述重组多核苷酸被整合至所述细胞的基因组中。
73.如实施方案67至72中任一项所述的组合物，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
74.如实施方案73所述的组合物，其中的等位基因HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
75.如实施方案73所述的组合物，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
76.如实施方案73所述的组合物，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
77.如实施方案68至76中任一项所述的组合物，其中所述HLA II类基因选自：HLAII类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
78.如实施方案68至76中任一项所述的组合物，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
79.如实施方案78所述的组合物，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
80.如实施方案78所述的组合物，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
81.如实施方案80所述的组合物，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
82.如实施方案68至81中任一项所述的组合物，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
83.如实施方案67至82中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)或它们的组合。
84.如实施方案67至83中任一项所述的组合物，其还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
85.如实施方案84所述的组合物，其中所述GM-CSF由重组多核苷酸编码并且由经修饰的细胞表达。
86.如实施方案85所述的组合物，其中所述GM-CSF由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
87.如实施方案85所述的组合物，其中所述GM-CSF不由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
88.如实施方案84所述的组合物，其中所述GM-CSF以可溶形式存在。
89.如实施方案67至88中任一项所述的组合物，其还包含干扰素α(IFNa)。
90.如实施方案89所述的组合物，其中所述IFNa由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
91.如实施方案89所述的组合物，其中所述IFNa以可溶形式存在。
92.如实施方案67至91中任一项所述的组合物，其中所述人癌细胞是人癌细胞系。
93.如实施方案92所述的组合物，其中所述人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
94.药物组合物，其包含如实施方案67至93中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。
95.治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的实施方案94所述的药物组合物。
96.如实施方案95所述的方法，其还包括用选自由以下组成的组的疗法治疗所述受试者：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、分化剂、小分子药物以及它们的组合。
97.如实施方案96所述的方法，其中所述免疫疗法包括选自由以下组成的组的药剂：免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、小分子药物以及它们的组合。
98.如实施方案96所述的方法，其中所述化学疗法包括选自由以下组成的组的药剂：烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇以及它们的组合。
99.如实施方案95至98中任一项所述的方法，其还包括根据实施方案22至66中任一项所述的方法，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗。
100.如实施方案95至99中任一项所述的方法，所述受试者患有I期、II期、III期或IV期癌症。
101.如实施方案95至100中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、眼癌、软组织癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、间皮瘤、急性白血病、慢性白血病、成神经管细胞瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤以及它们的组合。
102.如实施方案95至101中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过注射施用。
103.如实施方案102所述的方法，其中所述注射是真皮内和/或淋巴管内注射。
104.如实施方案95至103中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者使得肿瘤体积减小。
105.如实施方案95至104中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者缓解或消除癌症的一种或多种的体征或症状。
106.如实施方案95至105中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致一种或多种免疫细胞的活性和/或数量的增加。
107.如实施方案106所述的方法，其中活性水平和/或数量增加的一种或免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。
108.如实施方案107所述的方法，其中所述活性水平和/或数量增加的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
109.如实施方案106至108中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC多聚体测定、流式细胞术测定以及它们的组合。
110.如实施方案106至109中任一项所述的方法，其中在用抗原刺激后测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
111.如实施方案106至110中任一项所述的方法，其中免疫细胞活性和/或数量的增加表明应向所述受试者施用一个或多个另外剂量的所述药物组合物。
112.如实施方案95至111中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致增加的存活时间。
113.治疗患有癌症的受试者的试剂盒，其包括实施方案94所述的药物组合物。
114.如实施方案113所述的试剂盒，其还包括使用说明书。
115.如实施方案113或114所述的试剂盒，其还包括一种或多种试剂。
116.如实施方案115所述的试剂盒，其中所述一种或多种试剂用于从所述患有癌症的受试者分离样品，检测一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，检测一种或多种生物标志物的存在或水平，和/或测量一种或多种免疫细胞的活性和/或数量。
117.确定样品细胞的HER2状态的方法，所述方法包括：
(a)检测所述样品细胞中的一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包括：
(i)MIEN1，
(ii)PGAP3，
(iii)ERBB2和MIEN1，
(iv)ERBB2和PGAP3，
(v)MIEN1和PGAP3，或
(vi)ERBB2、MIEN1和PGAP3；
(b)将在步骤(a)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平与在参考细胞中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平进行比较；和
(c)基于步骤(b)中进行的比较，确定所述样品细胞的HER2状态。
118.如实施方案117所述的方法，其中所述样品细胞是癌细胞或是从患有癌症的受试者获得的细胞。
119.如实施方案117或118所述的方法，其中相较于所述参考细胞，当所述样品细胞以更高的水平表达所述一种或多种生物标志物时，所述样品细胞确定为HER2阳性。
120.如实施方案119所述的方法，其中所述参考细胞是从与样品细胞相同的受试者获得的非-癌细胞，或是从不同的受试者或受试者群体获得的非-癌细胞。
121.如实施方案117至120中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平在HER2 3+细胞中比在HER2 2+细胞中更高。
122.如实施方案117至121中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平在HER2 2+细胞中比在HER2 1+细胞中或HER2 0细胞中更高。
123.如实施方案117至122中任一项所述的方法，其中检测所述一种或多种生物标志物的存在或水平包括测量mRNA表达、蛋白丰度或它们的组合。
124.如实施方案117至123中任一项所述的方法，其中以至少约60％的灵敏度进行所述确定。
125.如实施方案124所述的方法，其中以至少约87％的灵敏度进行所述确定。
126.如实施方案125所述的方法，其中以至少约100％的灵敏度进行所述确定。
127.如实施方案117至126中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)、步骤(b)和/或步骤(c)是自动化的。
非正式序列表
优化前的HLA-A*02:01ORF(1098bp)(SEQ ID NO:1)
如由GenBank(NCBI)登录号AY365426.1表示的序列。
优化后的HLA-A*02:01ORF(1098bp)(SEQ ID NO:2)
pcDNA3.4-A0201的序列(7126bp)(SEQ ID NO.3)
经优化的HLA-A*02:01序列，其中将pcDNA3.4-TOPO.5’-BamHI限制性位点(GGATCC)、起始密码子(ATG)、终止密码子(TGA)和3’-ClaI限制性位点(ATCGAT)加下划线。还加下划线是可用于在稳定转染之前质粒线性化的单个PvuI限制性位点(CGATCG)。
优化前的HLA-DRB3*02:02 ORF(801bp)(SEQ ID NO:4)
如由IMGT/HLA Acc No.HLA00895表示的序列。将ApaLI限制性位点(GTGCAC)加下划线。
优化前的HLA-DRB3*02:02 ORF，去除了ApaLI位点(801bp)(SEQ ID NO:5)
ApaLI限制性位点(GTGCAC)中引入的突变，导致GTGCAA(加下划线)。
优化后的HLA-DRB3*02:02 ORF(801bp)(SEQ ID NO:6)
pcDNA3.4-DRB30202的序列(6829bp)(SEQ ID NO.7)
pcDNA3.4-TOPO中的经优化的HLA-DRB3*02:02序列。将5’-XhoI限制性位点(CTCGAG)、起始密码子(ATG)、终止密码子(TGA)和3’-NheI限制性位点(GCTAGC)加下划线。还加下划线的是可用于稳定转染之前质粒线性化的单个PvuI限制性位点(CGATCG)。
pVITRO2-A0201-DRB30202的序列(8030bp)(SEQ ID NO.8)
对于HLA-A*02:01插入物，将5’-BamHI限制性位点(GGATCC)、、起始密码子(ATG)、终止密码子(TGA)和3’-ClaI限制性位点(ATCGAT)加下划线。对于HLA-DRB3*02:02插入物，将5’-XhoI限制性位点(CTCGAG)、起始密码子(ATG)、终止密码子(TGA)和3’-NheI限制性位点(GCTAGC)加下划线。还加下划线的是可用于在稳定转染前质粒线性化的单个ApaLI限制性位点(GTGCAC)。

Claims (127)

1.经修饰的人癌细胞，其包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
2.如权利要求1所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
3.经修饰的人癌细胞，其包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
4.如权利要求3所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码HLA I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
5.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述重组多核苷酸存在于所述细胞中的载体上。
6.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述重组多核苷酸被整合至所述细胞的基因组中。
7.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
8.如权利要求7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
9.如权利要求7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
10.如权利要求7所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
11.如权利要求2或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
12.如权利要求2或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
13.如权利要求12所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
14.如权利要求12所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
15.如权利要求14所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
16.如权利要求2或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
17.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组多核苷酸。
18.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码干扰素α(IFNa)的重组多核苷酸。
19.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)或它们的组合。
20.如权利要求1或3所述的经修饰的人癌细胞，其中所述人癌细胞是人癌细胞系。
21.如权利要求20所述的经修饰的人癌细胞，其中所述人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
22.为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，所述方法包括：
(a)检测从所述受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，以生成所述受试者的HLA等位基因谱；
(b)基于全细胞癌症疫苗中一种或多种HLA基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，将所述受试者的HLA等位基因谱与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱相比较；和
(c)当所述受试者的HLA等位基因谱与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择所述全细胞癌症疫苗。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLAII类β亚基基因以及它们的组合。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
34.如权利要求22所述的方法，其中当所述受试者的HLA等位基因谱中的一种或多种等位基因与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗。
35.如权利要求34所述的方法，其中当所述受试者的HLA等位基因谱中的两个或更多个等位基因与所述全细胞癌症疫苗的HLA等位基因谱匹配时，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗。
36.为患有癌症的受试者选择全细胞癌症疫苗的方法，所述方法包括：
(a)(i)检测从所述受试者获得的样品中一种或多种生物标志物的存在或水平；和/或
(a)(ii)测量从所述受试者获得的一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量；
(b)将在(a)(i)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或在步骤(a)(ii)中测量的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量，与在对照样品中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平和/或一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量进行比较；和
(c)基于步骤(b)中的比较，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗，其中所述全细胞癌症疫苗来源于乳腺癌细胞系或乳腺癌细胞。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述乳腺癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：黑素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、PDZ结合激酶(PBK)、中心体蛋白55(CEP55)、驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)、胎盘-特异性蛋白1(PLAC1)、Opa相互作用蛋白5(OIP5)、钙结合酪氨酸磷酸化调控蛋白(CABYR)、精子相关抗原1(SPAG1)、α-1,3-葡糖基转移酶(ALG8)、肌动蛋白相关的蛋白2/3复合体、亚基5样(ARPC5L)、染色盒同系物2(CBX2)、胶原VIII型α1链(COL8A1)、DDB1和CUL4相关因子10(DCAF10)、真核翻译起始因子3亚基H(EIF3H)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、组蛋白簇1H4家族成员h(HIST1H4H)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)、整合因子复合体亚基7(INTS7)、角蛋白19(KRT19)、角蛋白81(KRT81)、甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶、同工酶A(MGAT4A)、迁移和侵袭增强子1(MIEN1)、后-GPI附着蛋白3(PGAP3)、重构和间隔因子1(RSF1)、含SH2结构域的衔接子蛋白B(SHB)、可溶载体家族35成员A2(SLC35A2)、含血影蛋白重复的核被膜家族成员4(SYNE4)、转运蛋白1(TNPO1)以及它们的组合。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：PRAME、PBK、CEP55、KIF2C、ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物是PRAME。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自：ERBB2、MIEN1、PGAP3以及它们的组合。
42.如权利要求36所述的方法，其中相较于所述对照样品，当从所述受试者获得的样品中所述一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达时，为所述受试者选择疫苗，其中所述对照样品包含从所述受试者获得的正常细胞或组织、从不同受试者获得的正常细胞或组织、或从受试者群体获得的正常细胞或组织。
43.如权利要求42所述的方法，其中相较于对照样品，当所述一种或多种生物标志物中的至少一种的水平过表达至少约1.5倍时，为所述受试者选择疫苗。
44.如权利要求36所述的方法，其中相较于对照样品，当从所述受试者获得的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量更高时，为所述受试者选择疫苗，其中所述对照样品包含获自未患有癌症的不同的受试者或受试者群体的一种或多种免疫细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中相较于对照样品，从所述受试者获得的所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量高至少约1.5倍。
46.如权利要求36所述的方法，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。
47.如权利要求46所述的方法，其中测量活性水平和/或数量的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
48.如权利要求36所述的方法，其中使用选自以下的方法检测所述一种或多种生物标志物的存在或水平：ELISA、多重测定、测量编码抗原的基因的RNA转录物水平、免疫组织化学、蛋白质印迹、基于珠粒的方法以及它们的组合。
49.如权利要求36所述的方法，其中使用选自以下的方法测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC多聚体测定、流式细胞术测定以及它们的组合。
50.如权利要求36所述的方法，其中在用抗原刺激后，测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
51.如权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种HLA基因包括HLA I类基因、HLA II类基因或它们的组合。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述HLA-A基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
57.如权利要求52所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLAII类β亚基基因以及它们的组合。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
62.如权利要求52所述的方法，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
63.如权利要求51所述的方法，其中当从所述受试者获得的样品中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因与所述疫苗中的一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因匹配时，为所述受试者选择疫苗。
64.如权利要求36所述的方法，其中从所述受试者获得的样品是全血样品、血浆样品、血清样品、口腔拭子样品、肿瘤组织样品、生物流体样品、胸腔积液样品、尿液样品、毛发样品、皮肤样品或它们的组合。
65.如权利要求36所述的方法，其中所述样品从活检获得、从手术切除物获得、作为细针抽吸物(FNA)获得或它们的组合。
66.如权利要求36所述的方法，其中所述样品包括肿瘤组织、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)或它们的组合。
67.包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
69.包含经修饰的人癌细胞的组合物，所述经修饰的人癌细胞包含编码HLA II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码HLA I类基因的等位基因的重组多核苷酸。
71.如权利要求67或69所述的组合物，其中所述重组多核苷酸存在于所述细胞中的载体上。
72.如权利要求67或69所述的组合物，其中所述重组多核苷酸被整合至所述细胞的基因组中。
73.如权利要求67或69所述的组合物，其中所述HLA I类基因选自：HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、β-2-微球蛋白(B2M)基因以及它们的组合。
74.如权利要求73所述的组合物，其中的等位基因HLA-A*11:01、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*32:01、HLA-A*24:02、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*31:01、HLA-A*02:06以及它们的组合。
75.如权利要求73所述的组合物，其中所述HLA-B基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-B*13:02、HLA-B*41:01、HLA-B*18:03、HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:08、HLA-B*55:01、HLA-B*51:01、HLA-B*44:03、HLA-B*58:01、HLA-B*08:01、HLA-B*18:01、HLA-B*15:01、HLA-B*52:01以及它们的组合。
76.如权利要求73所述的组合物，其中所述HLA-C基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-C*04:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*08:02、HLA-C*15:02、HLA-C*03:03、HLA-C*05:01、HLA-C*08:01、HLA-C*16:01、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02以及它们的组合。
77.如权利要求68或69所述的组合物，其中所述HLA II类基因选自：HLA II类α亚基基因、HLA II类β亚基基因以及它们的组合。
78.如权利要求68或69所述的组合物，其中所述HLA II类基因选自：HLA-DP基因、HLA-DM基因、HLA-DOA基因、HLA-DOB基因、HLA-DQ基因、HLA-DR基因以及它们的组合。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述HLA-DM基因选自：HLA-DMA基因、HLA-DMB基因以及它们的组合。
80.如权利要求78所述的组合物，其中所述HLA-DR基因选自：HLA-DRA基因、HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因、HLA-DRB5基因以及它们的组合。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述HLA-DRB3基因的等位基因是选自以下的等位基因：HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*03:01以及它们的组合。
82.如权利要求68或69所述的组合物，其中所述HLA I类基因的等位基因是HLA-A*11:01或HLA-A*24:02，并且所述HLA II类基因的等位基因是HLA-DRB3*02:02或HLA-DRB3*01:01。
83.如权利要求67或69所述的组合物，其中所述经修饰的人癌细胞还包含编码以下的重组多核苷酸：腺苷脱氨酶(ADA)、粘附G蛋白偶联受体E5(ADGRE5)、小窝蛋白1(CAV1)、CD58分子(CD58)、CD74分子(CD74)、CD83分子(CD83)、C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)、C-X-C基序趋化因子配体16(CXCL16)、胞内粘附分子3(ICAM3)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素18(IL18)、KIT配体(KITLG)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)或它们的组合。
84.如权利要求67或69所述的组合物，其还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述GM-CSF由重组多核苷酸编码并且由经修饰的细胞表达。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述GM-CSF由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
87.如权利要求85所述的组合物，其中所述GM-CSF不由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
88.如权利要求84所述的组合物，其中所述GM-CSF以可溶形式存在。
89.如权利要求67或69所述的组合物，其还包含干扰素α(IFNa)。
90.如权利要求89所述的组合物，其中所述IFNa由同一经修饰的细胞表达，所述经修饰的细胞包含编码人白细胞抗原(HLA)I类基因和/或II类基因的等位基因的重组多核苷酸。
91.如权利要求89所述的组合物，其中所述IFNa以可溶形式存在。
92.如权利要求67或69所述的组合物，其中所述人癌细胞是人癌细胞系。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述人癌细胞系是SV-BR-1乳腺癌细胞系。
94.药物组合物，其包含如权利要求67或69所述的组合物和药学上可接受的载体。
95.治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求94所述的药物组合物。
96.如权利要求95所述的方法，其还包括用选自以下的疗法治疗受试者：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、分化剂、小分子药物以及它们的组合。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述免疫疗法包括选自以下的药剂：免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、小分子药物以及它们的组合。
98.如权利要求96所述的方法，其中所述化学疗法包括选自以下的药剂：烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇以及它们的组合。
99.如权利要求95所述的方法，其还包括根据权利要求22所述的方法，为所述受试者选择全细胞癌症疫苗。
100.如权利要求95所述的方法，其中所述受试者患有I期、II期、III期或IV期癌症。
101.如权利要求95所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、眼癌、软组织癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、间皮瘤、急性白血病、慢性白血病、成神经管细胞瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤以及它们的组合。
102.如权利要求95所述的方法，其中所述药物组合物通过注射施用。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述注射是真皮内和/或淋巴管内注射。
104.如权利要求95所述的方法，其中治疗所述受试者使得肿瘤体积减小。
105.如权利要求95所述的方法，其中治疗所述受试者缓解或消除癌症的一种或多种的体征或症状。
106.如权利要求95所述的方法，其中治疗所述受试者导致一种或多种免疫细胞的活性和/或数量的增加。
107.如权利要求106所述的方法，其中活性水平和/或数量增加的一种或免疫细胞选自：外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及它们的组合。
108.如权利要求107所述的方法，其中活性水平和/或数量增加的一种或多种免疫细胞选自：PBMC、淋巴细胞、树突细胞以及它们的组合。
109.如权利要求106所述的方法，其中使用选自以下的方法测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量：ELISA、ELISPOT测定、蛋白质印迹、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定、细胞毒性测定、增殖测定、细胞因子产生测定、MHC多聚体测定、流式细胞术测定以及它们的组合。
110.如权利要求106所述的方法，其中在用抗原刺激后，测量所述一种或多种免疫细胞的活性水平和/或数量。
111.如权利要求106所述的方法，其中免疫细胞活性和/或数量的增加表明应向所述受试者施用一个或多个另外剂量的所述药物组合物。
112.如权利要求95所述的方法，其中治疗所述受试者导致增加的存活时间。
113.治疗患有癌症的受试者的试剂盒，其包括权利要求94所述的药物组合物。
114.如权利要求113所述的试剂盒，其还包括使用说明书。
115.如权利要求113所述的试剂盒，其还包括一种或多种试剂。
116.如权利要求115所述的试剂盒，其中所述一种或多种试剂用于从所述患有癌症的受试者分离样品，检测一种或多种人白细胞抗原(HLA)基因的一种或多种等位基因的存在或不存在，检测一种或多种生物标志物的存在或水平，和/或测量一种或多种免疫细胞的活性和/或数量。
117.确定样品细胞的HER2状态的方法，所述方法包括：
(a)检测所述样品细胞中的一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包括：
(i)MIEN1，
(ii)PGAP3，
(iii)ERBB2和MIEN1，
(iv)ERBB2和PGAP3，
(v)MIEN1和PGAP3，或
(vi)ERBB2、MIEN1和PGAP3；
(b)将在步骤(a)中检测的所述一种或多种生物标志物的存在或水平与在参考细胞中的所述一种或多种生物标志物的存在或水平进行比较；和
(c)基于步骤(b)中进行的比较，确定所述样品细胞的HER2状态。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述样品细胞是癌细胞或是从患有癌症的受试者获得的细胞。
119.如权利要求117所述的方法，其中相较于所述参考细胞，当所述样品细胞以更高的水平表达所述一种或多种生物标志物时，所述样品细胞确定为HER2阳性。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述参考细胞是从与样品细胞相同的受试者获得的非癌细胞，或是从不同的受试者或受试者群体获得的非癌细胞。
121.如权利要求117所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平在HER2 3+细胞中比在HER2 2+细胞中更高。
122.如权利要求117所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平在HER2 2+细胞中比在HER2 1+细胞中或HER2 0细胞中更高。
123.如权利要求117所述的方法，其中检测所述一种或多种生物标志物的存在或水平包括测量mRNA表达、蛋白丰度或它们的组合。
124.如权利要求117所述的方法，其中以至少约60％的灵敏度进行所述确定。
125.如权利要求124所述的方法，其中以至少约87％的灵敏度进行所述确定。
126.如权利要求125所述的方法，其中以至少约100％的灵敏度进行所述确定。
127.如权利要求117所述的方法，其中步骤(a)、步骤(b)和/或步骤(c)是自动化的。
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