CN109069568A

CN109069568A - 用于连接dna结合结构域和切割结构域的组合物

Info

Publication number: CN109069568A
Application number: CN201680080675.9A
Authority: CN
Inventors: J·C·米勒; D·帕斯乔恩; E·J·瑞巴
Original assignee: Sangmore Biotherapy Ltd By Share Ltd
Current assignee: Sangmore Biotherapy Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-02-02
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2036-12-15
Also published as: EP3411056A4; JP7012650B2; US20170218349A1; EP3411056A1; IL277125A; US20200318087A1; EP3769775A3; US10724020B2; WO2017136049A1; AU2016391970A1; IL260613B; AU2016391970B2; JP2022051772A; CA3011049A1; CN109069568B; IL277125B; US11920169B2; JP2019503198A; EP3769775A2; KR20180101442A

Abstract

本文公开用于连接DNA结合结构域和切割结构域(或切割半结构域)以形成具有替代性构型的非天然存在的核酸酶的组合物。还描述了制备和使用包含这些接头的组合物的方法。

Description

用于连接DNA结合结构域和切割结构域的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月2日提交的美国临时申请号62/290,065的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式整体并入本文。

在联邦资助的研究下进行的发明的权利声明

不适用。

技术领域

本公开涉及基因组和蛋白质工程领域。

背景技术

包含可操作地连接至切割结构域的DNA结合结构域(核苷酸或多肽)的人工核酸酶，诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracr RNA('单指导RNA')的CRISPR/Cas系统和/或基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，被称为'TtAgo’(Swarts等(2014)Nature 507(7491):258-261)，已用于基因组序列的靶向改变。例如，核酸酶已用于插入外源序列，使一种或多种内源基因失活，产生基因表达模式改变的生物体(例如作物)和细胞系等等。参见，例如9,255,250；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960以及20150056705。例如，核酸酶对(例如，锌指核酸酶，TALEN)可用于切割基因组序列。所述对中的每个成员通常包括连接至核酸酶的一个或多个切割结构域(或半结构域)的工程化(非天然存在的)DNA结合蛋白。当DNA结合蛋白结合其靶位点时，结合那些DNA结合蛋白的切割结构域被定位成使得基因组的二聚化和随后切割可以发生，通常在锌指核酸酶对或TALEN对之间。

已经显示，核酸酶对的切割活性与连接锌指和切割结构域的接头(“ZC”接头)长度、氨基酸组成和靶位点(结合位点)之间的距离(间隙)有关。参见，例如美国专利号9,394,531；8,772,453；7,888,121及8,409,861；Smith等(2000)Nucleic Acids Res.28:3361-3369；Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21:289-297；美国公布号20150064789。当使用核酸酶融合蛋白对时，已经在融合蛋白的结合位点相隔5或6个核苷酸(如从每个结合位点的近边所测量)定位时获得用当前可用的ZC接头和切割半结构域进行的最佳切割。参见，例如美国专利号7,888,121。美国专利公布20090305419和20150064789描述通过使用各种接头序列(用于各种间隙间隔)和/或修饰FokI切割结构域的N端残基来连接DNA结合结构域和切割结构域。

然而，仍然需要允许靶向修饰的方法和组合物，其中人工核酸酶可在替代性架构中切割内源基因组序列，并且结合位点隔开为6、7、8个或更多个碱基对。

发明内容

本文公开了用于连接DNA结合结构域和切割结构域以形成核酸酶的组合物，所述核酸酶例如与常规接头(其使用尾对尾架构)相比具有相同或改变的靶位点构型(架构)和/或隔开(间隙)偏好的核酸酶，所述靶位点构型(架构)和/或隔开(间隙)偏好包括但不限于头对尾架构(其中二聚体的DNA结合结构域结合相同DNA链)、头对头架构(其中DNA结合结构域可操作地连接至切割结构域的N端)，以及对称和不对称的尾对尾架构。还描述了用于靶向切割DNA的包含这些接头的融合分子以及这些融合分子的二聚体。本公开还提供了使用这些融合分子及其组合物以靶向切割目标区域中的细胞染色质和/或在细胞中的预定目标区域进行同源重组的方法。

因此，在一个方面，本文描述了用于将DNA结合结构域(例如，锌指蛋白、TAL效应物结构域或CRISPR/Cas核酸酶系统的单指导(sg)RNA)连接至功能结构域，诸如核酸酶(切割)结构域(例如，野生型或工程化FokI切割结构域)。接头用于将任何DNA结合结构域连接至功能结构域(例如，切割结构域)。在某些实施方案中，接头从蛋白质DNA结合结构域(ZFP或TALE)的N或C端延伸，或从多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)的5’或3’端延伸。在某些实施方案中，氨基酸接头序列在蛋白质DNA结合结构域的N或C端的最后残基与切割结构域的N或C端的最后残基之间延伸。在其他实施方案中，氨基酸接头序列与多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)的任何部分缔合。接头可具有任何长度，例如长度介于4与22之间个氨基酸，包括长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个残基。在其他实施方案中，接头包括图4、5、6、7、8、9、11或19中所示的任何接头(SEQ ID NO:6-281)。在某些实施方案中，接头包括如图11或图19B中所示的接头。此外，接头可用于由5、6、7、8、9、10、11个或更多个碱基对隔开的成对靶位点。

在另一些方面，本文描述了包含DNA结合结构域(例如，锌指蛋白、TALE、sgRNA)、功能结构域(例如，核酸酶切割结构域(例如，FokI、Cas核酸酶等)的融合分子，并且还包含如本文所述的在(连接)DNA结合结构域与功能结构域之间的接头。在某些实施方案中，融合分子包含DNA结合结构域、切割结构域以及DNA结合结构域与切割结构域之间的接头，其中接头包含如SEQ ID NO:6-281中任一种所示的序列或由其组成。在某些实施方案中，接头包括如图11或图19B中所示的接头或由其组成。在某些实施方案中，融合分子包含DNA结合结构域(例如，ZFP或TALE)以及DNA结合结构域的N或C端的FokI切割结构域。在某些实施方案中，接头在DNA结合结构域的N端与切割结构域的C端之间延伸。核酸酶切割结构域可以任何方式来修饰，所述任何方式包括添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。任何融合分子均可包含野生型或工程化切割结构域，包括但不限于具有对二聚化界面的一个或多个修饰的切割结构域，使得仅形成异源二聚体；和/或对催化结构域的一个或多个修饰，使得核酸酶为一种切口酶，因为其进行单链切割。在某些实施方案中，切割结构域可为切割半结构域。

在另一方面，本文描述包含第一融合分子和第二融合分子的二聚体，所述第一融合分子包含如本文所述的接头，所述第二融合分子包含第二DNA结合结构域和第二野生型或工程化切割结构域。在某些实施方案中，至少一种融合分子包含如本文所述的接头。在其他实施方案中，两种融合分子均包含如本文所述的接头。在另一些实施方案中，二聚体靶序列(例如，在双链DNA中)的DNA结合结构域由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个(或更多个)碱基对，优选6至11个碱基对隔开。重要的是，本文所述的接头允许二聚体在组分以常规尾对尾构型(使用对称或不对称接头)结合相对DNA链时和/或在组分结合相同DNA链(头对尾)或以替代性(例如，头对头)构型结合相对DNA链时形成。因此，本文描述的接头提供核酸内切酶(例如，FokI)切割结构域为新型头对头或头对尾构型或尾对尾构型的二聚体(具有任何DNA结合结构域)。参见，例如图1B、1C和图19B。这些构型可使用任何DNA结合结构域来采用，所述DNA结合结构域包括但不限于锌指蛋白质DNA结合结构域、TAL效应物DNA结合结构域和sgRNA。因此，本文所述的任何二聚体可结合双链靶DNA中的相对或相同DNA链，并且可以在靶双链DNA中进行双链或单链切割。

在另一方面，提供了编码如本文所述的任何接头或融合分子(或其组分)的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸为RNA。

在又一方面，还提供了包含如本文所述的任何多肽(例如，融合分子)和/或多核苷酸的细胞。在一个实施方案中，细胞包含融合分子对，每种融合分子包含如本文所公开的接头(和/或切割结构域)。

在又一方面，提供用于靶向切割基因组的目标区域中的细胞染色质的方法；引起在细胞中发生同源重组的方法；治疗感染的方法；和/或治疗疾病的方法。所述方法包括通过表达融合分子对来在细胞中的预定目标区域切割细胞染色质，所述融合分子对中的至少一个包含如本文所述的接头。在某些实施方案中，一种融合多肽包含如本文所述的接头，并且在其他实施方案中，两种融合分子均包含如本文所述的接头。此外，在本文所述的任何方法中，当锌指核酸酶的结合位点相隔5、6、7、8、9、10、11个或甚至更多个碱基对时，融合多肽对切割靶区域。在某些实施方案中，所述对中的每个成员结合相同的DNA链。在其他实施方案中，所述对中的每个成员以头对头或尾对尾构型结合相对DNA链。靶向切割可导致包括通过插入和/或缺失(通过非同源和/或同源修复机制)来对靶DNA进行的修饰，所述修饰包括整合供体(例如，转基因)序列。

如本文所述的接头可用于靶向切割目标区域中的细胞染色质和/或在细胞中的预定目标区域进行同源重组的方法中。细胞包括培养的细胞、生物体中的细胞以及已从生物体中移除以在细胞和/或其子代将返回处理后的生物体的情况下进行处理的细胞。细胞染色质中的目标区域可为例如基因组序列或其部分。

融合分子可例如通过将融合分子(或其组分)递送至细胞或通过将编码融合分子的多核苷酸递送至细胞来在细胞中表达，其中使多核苷酸(如果为DNA)转录，且使递送至细胞的RNA分子或递送至细胞的DNA分子的转录物翻译，以产生融合蛋白。本公开在别处提出了用于向细胞递送多核苷酸和多肽的方法。

因此，在另一方面，用于切割目标区域中的细胞染色质的方法可包括(a)选择目标区域中的第一序列；(b)将第一DNA结合结构域工程化以结合第一序列；(c)在细胞中表达第一融合分子，第一融合分子包含第一DNA结合结构域(例如，锌指、TALE、sgRNA)和切割结构域(或半结构域)；(d)在细胞中表达第二融合蛋白，第二融合分子包含第二DNA结合结构域和第二切割结构域(或半结构域)，其中至少一种融合分子包含如本文所述的接头，且进一步地其中第一融合分子结合第一序列，并且第二融合分子结合位于自第一序列2个核苷酸与50个核苷酸之间的第二序列，使得在目标区域中切割细胞染色质。在某些实施方案中，两种融合分子均包含如本文所述的接头。

在其他实施方案中，本公开提供了通过以下来切割细胞染色质的方法：将包含如本文所述的接头的一种或多种核酸酶引入至细胞中，使得核酸酶靶向并切割细胞的细胞染色质。核酸酶可包括锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)、TtAgo或CRISPR/Cas核酸酶系统或其组合。核酸酶可以任何形式，例如以蛋白质形式、以mRNA形式来引入至细胞中或在病毒(AAV、IDLV等)载体或非病毒载体(例如，质粒)上携带。在某些实施方案中，所述方法包括(a)选择目标区域中的第一序列和第二序列，其中第一序列和第二序列相隔2与50之间个核苷酸；(b)将第一DNA结合结构域工程化以结合第一序列；(c)将第二DNA结合结构域工程化以结合第二序列；(d)在细胞中表达第一融合分子，第一融合分子包含第一工程化DNA结合结构域、如本文所述的第一接头和第一切割结构域(或半结构域)；(e)在细胞中表达第二融合分子，第二融合分子包含第二工程化DNA结合结构域、第二接头和第二切割半结构域；其中第一融合分子结合第一序列，并且第二融合分子结合第二序列，从而切割目标区域中的细胞染色质。在某些实施方案中，第一融合分子和第二融合分子包含如本文所述的接头。

还提供了改变细胞染色质区域例如引入靶向突变的方法。在某些实施方案中，改变细胞染色质的方法包括向细胞中引入一种或多种靶向核酸酶，以在预定位点处的细胞染色质中产生双链断裂；以及供体多核苷酸，其与断裂区域中的细胞染色质的核苷酸序列具有同源性。细胞DNA修复过程通过双链断裂的存在来活化，并且供体多核苷酸用作用于断裂修复的模板，导致将供体的全部或部分核苷酸序列引入至细胞染色质中。因此，可改变细胞染色质中的序列，并且在某些实施方案中，可转换成存在于供体多核苷酸中的序列。

靶向改变包括但不限于点突变(即，将单个碱基对转换为不同的碱基对)、取代(即，将多个碱基对转换为相同长度的不同序列)、一个或多个碱基对的插入、一个或多个碱基对的缺失以及前述序列改变的任何组合。

供体多核苷酸可为DNA或RNA，可为线型或环状的，并且可为单链或双链的。其可作为裸核酸递、作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、泊洛沙姆)的复合物或包含在病毒递送媒介物(例如像腺病毒或腺相关病毒(AAV))中来递送至细胞。供体序列的长度范围可为10至1,000个核苷酸(或其间任何整数值的核苷酸)或更长。在一些实施方案中，供体包含由具有靶向切割位点的同源区侧接的全长基因。在一些实施方案中，供体缺少同源区域并且通过与同源性无关的机制(即NHEJ)来整合至靶基因座中。在其他实施方案中，供体包含侧接用于细胞(即，用于基因校正)的同源区的核酸的较小片段。在一些实施方案中，供体包含编码功能或结构组分，诸如shRNA、RNAi、miRNA等。在其他实施方案中，供体包含编码调控元件的序列，所述调控元件结合目标基因和/或调节目标基因的表达。在其他实施方案中，供体为结合和/或调节目标基因的表达的目标调控蛋白(例如，ZFP TF、TALE TF或CRISPR/CasTF)。

在某些实施方案中，同源重组的频率可通过使细胞停滞在细胞周期的G2期和/或通过活化参与同源重组的一种或多种分子(蛋白质、RNA)的表达和/或通过抑制参与非同源末端连接的蛋白质的表达或活性来增强。

在使用核酸酶对的本文所述的任何方法中，核酸酶对的第一核酸酶和第二核酸酶可结合相隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个碱基的靶位点。在某些实施方案中，成对靶位点的靶位点相隔6、7、8、9或10个碱基对。另外，在任何方法中，第二锌指结合结构域可经工程化以结合第二序列。

此外，在本文所述的任何方法中，融合分子可由单个多核苷酸编码。

对于任何上述方法，细胞染色质可处于染色体、游离基因或细胞器基因组中。细胞染色质可存在于任何类型的细胞中，所述细胞包括但不限于原核和真核细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。

在另一方面，本文描述包含以下的试剂盒：如本文所述的接头或编码如本文所述的接头的多核苷酸；辅助试剂；以及任选的说明和合适的容器。试剂盒还可包含一种或多种核酸酶或编码此类核酸酶的多核苷酸。

在本文所述的任何蛋白质、方法和试剂盒中，切割结构域(或切割半结构域)可包含TypeIIS切割结构域，诸如来自FokI的切割半结构域。

鉴于总体公开内容，这些和其他方面将对本领域技术人员显而易见。

附图说明

图1A至1C描绘了核酸酶设计的示例性架构。图1A示出当前使用的典型架构。图1B示出头对尾架构。图1C示出头对头架构。

图2描绘了用于选择的FokI-ZFP接头文库的设计。将长度和组成随机化的接头克隆在N端FokI结构域(SEQ ID NO:1)和C端ZFP结构域(SEQ ID NO:2-5中所示之示例性序列)之间。

图3A至3F描绘了使用美国公布号20150064789中描述的筛选程序的ccdB诱导。简而言之，用含有接头文库的第二ZFN转化带有具有靶位点的ccdB质粒以及恒定配偶体ZFN的细菌细胞，所述靶位点由指定的间隔隔开，所述第二ZFN在N端FokI结构域与C端ZFP结合结构域之间含有接头文库。诱导ZFN表达，随后诱导ccdB毒素。将细胞培育过夜，并将样品铺在LB、氨苄青霉素/壮观霉素(A/S)和卡那霉素(Kan)平板上。将所选接头亚克隆到新鲜载体中，并重复选择九轮。每个图的左侧条示出LB平板上的细胞数目。中间条示出A/S平板上的细胞数目，并且左侧条示出Kan平板上的细胞数目。图3A示出在靶位点之间使用6个碱基对间隔的ccdB诱导结果；图3B示出在靶位点之间使用7个碱基对间隔的ccdB诱导结果；图3C示出在靶位点之间使用8个碱基对间隔的ccdB诱导结果；图3D示出在靶位点之间使用9个碱基对间隔的ccdB诱导结果；图3E示出在靶位点之间使用10个碱基对间隔的ccdB诱导结果；并且图3F示出在靶位点之间使用11个碱基对间隔的ccdB诱导结果；

图4(SEQ ID NO:6-84)示出使用4至22个氨基酸的接头文库在指定轮后从细菌选择获得的示例性接头。

图5(SEQ ID NO:85-161)示出使用4至22个氨基酸的接头文库从细菌选择获得的靶间间隔为7个碱基对的示例性接头。

图6(SEQ ID NO:162-220)示出使用4至22个氨基酸的接头文库从细菌选择获得的靶间间隔为8个碱基对的示例性接头。

图7(SEQ ID NO:221-229)示出使用4至22个氨基酸的接头文库从细菌选择获得的靶间间隔为9个碱基对的示例性接头。

图8(SEQ ID NO:230-253)示出使用4至22个氨基酸的接头文库从细菌选择获得的靶间间隔为10个碱基对的示例性接头。

图9为用在体内在靶向至CCR5或AAVS1的核酸酶内测试的接头(从顶部，SEQ IDNO:78、80、62、71、81、82、83、9、36、16、72、69、84、55、37、51、77、45、40、10、41、47、24、63和9(6bp间隔)；以及从顶部，SEQ ID NO:114、138、100、91、109、154、147、136、88、160、142、161、132和93(7bp间隔))获得的结果的概述。产生AAVS1基因座被修饰为具有带有6或7个碱基对间隔的头对尾CCR5靶位点的细胞系。在这些位点处测试的接头的NHEJ活性位于“CCR5”栏中。同样地，产生CCR5基因座被修饰为具有带有6或7个碱基对间隔的头对尾AAVS1靶位点的细胞系。在这些位点处测试的接头的NHEJ活性位于“AAVS1”栏中。阴影框指示用于进一步研究的接头。

图10A至10D示出在指定靶位点上的指定接头情况下的核酸酶活性(NHEJ活性)。如图9中，在具有在AAVS1基因座处具有指定间隔的CCR5靶位点的细胞系中测试CCR5ZFN，反之亦然。图10A示出使用选自6bp间隔筛选的接头的核酸酶活性，在所述接头中DNA结合结构域靶向至CCR5。图10B示出使用选自6bp间隔筛选的接头的核酸酶活性，在所述接头中DNA结合结构域靶向至AAVS1。图10C示出使用选自7bp间隔筛选的接头的核酸酶活性，在所述接头中DNA结合结构域靶向至CCR5。图10B示出使用选自7bp间隔筛选的接头的核酸酶活性，在所述接头中DNA结合结构域靶向至AAVS1。在图10A和10C中，最左侧条示出6bp间隔下的活性；左侧起第二个条示出7bp间隔下的活动；左侧起第三个条示出8bp间隔下的活性；中间条示出9bp间隔下的活性；右侧起第三个条示出10bp间隔下的活性；右侧起第二个柱示出11bp间隔下的活性；并且最右侧条示出AAVS1基因座处的野生型CCR5靶位点(AW)上的活性。在图10B和10D中，最左侧条示出6bp间隔下的活性；左侧起第二个条示出7bp间隔下的活动；左侧起第三个条示出8bp间隔下的活性；右侧起第三个条示出9bp间隔下的活性；右侧起第二个柱示出10bp间隔下的活性；并且最右侧条示出CCR5基因座处的野生型AAVS1靶位点(CW)上的活性。

图11(SEQ ID NO:78、62、80、81、71、82、83和84(对于6bp间隔，L1至L8)以及88、109、114、100、91、138、147、154(对于7bp间隔，L1至L8))示出选择用于在便携性研究中进一步测试的接头。

图12示出用于便携性研究的实验设置。针对以下架构中的每一种设计十种ZFN对：1)尾对尾架构；2)具有6个碱基对间隔的头对尾架构；3)具有7个碱基对间隔的头对尾架构；以及4)具有8个碱基对间隔的头对尾架构。对于二聚体的DNA结合结构域的靶位点之间的7个和8个碱基对间隔，还测试另外的接头(L7c5)以与恒定ZFN(ZFN#1)中的标准接头(L0)比较。ZFN#2的6.1-6.8表示选择用于6个碱基对间隔的接头L1-L8(参见图10)。ZFN#2的7.1-7.8表示选择用于7个碱基对间隔的接头L1-L8(参见图10)。ZFN#2的8.1-8.2表示选择用于8个碱基对间隔的接头(未示出)。

图13示出在靶位点之间具有6个碱基对间隔的头对尾架构中用各种接头进行的便携性研究的结果(NHEJ百分比)。L0对指示使用尾对尾架构的那些对。

图14示出在核酸酶二聚体靶位点之间具有7bp间隔的头对尾架构中用各种接头进行的便携性研究的结果(NHEJ百分比)。L0对指示使用尾对尾架构的那些对。

图15为来自便携性研究的指定ZFN的NHEJ活性上的专性异源二聚体FokI结构域极性的比较(参见图11和13；L7/N6a(SEQ ID NO:83)；L5/N6b(SEQ ID NO:71)；L8/N6c(SEQ IDNO:84)；L8/N7a(SEQ ID NO:154)；L3/N7b(SEQ ID NO:114)；L4/N7c(SEQ ID NO:100))。用FokI结构域以任一可能的取向上测试ZFN。

图16为具有尾对尾构型(左小图)；头对尾6bp间隔构型(中间小图)和头对尾7bp间隔构型(右小图)的指定接头的AAVS1靶向核酸酶的NHEJ活性的概述。ZFN靶向至AAVS1基因的内含子1内的超敏感位点。

图17为具有尾对尾构型(左小图)；头对尾6bp间隔构型(中间小图)和头对尾7bp间隔构型(右小图)的指定接头的AAVS1靶向核酸酶的NHEJ活性的概述。ZFN靶向至AAVS1基因的不包括超敏感位点的内含子1(图16)。

图18为具有以指定间隔以头对头构型的指定接头(N6a，SEQ ID NO:83：N6b，SEQID NO:71；N7a，SEQ ID NO:154以及N7b，SEQ ID NO:114)的AAVS1靶向核酸酶的NHEJ活性的概述。

图19A和19B示出使用对称或不对称接头选择尾对尾架构的接头的结果。图19A示出用于选择的实验设置，并且选择程序在美国公布号20150064789中有所描述。图19B示出在指定间隔处选择的示例性接头，以及这些接头在CCR5ZFN中在具有指定构型和间隔的CCR5基因座处的体内活性。还示出每种细胞系的AAVS1对照。

具体实施方式

本文描述了用于连接DNA结合结构域和切割结构域以形成人工核酸酶的组合物；以及使用这些核酸酶以通过以下靶向改变细胞核苷酸序列的方法：例如通过靶向切割，随后进行非同源末端连接；通过靶向切割，随后在外源多核苷酸(包含具有细胞核苷酸序列的一个或多个同源区)与基因组序列之间进行同源重组；通过一种或多种内源基因的靶向失活。

本发明包括置于切割结构域(或半结构域)与DNA结合结构域之间的蛋白质(氨基酸)接头，使得处于除常规构型(图1A)之外的构型的核酸酶为活性的。接头可被定位成使得其在DNA结合结构域的N或C端与核酸酶(切割)结构域的N或C端之间延伸。因此，如本文所述的接头提供在处于头对尾架构(其中二聚体的两个DNA结合组分结合相同DNA链，图1B)以及处于头对头构型(图1C)时为活性的核酸酶二聚体。任何DNA结合结构域可与这些接头一起使用以提供所需构型，所述任何DNA结合结构域例如锌指蛋白、TAL效应物结构域结合蛋白、sgRNA等。

总则

除非另外指示，否则方法的实施以及本文公开的组合物的制备和用途采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA以及本领域技术内的相关领域中的常规技术。这些技术在文献中得以充分说明。参见，例如Sambrook等MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989和第三版,2001；Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第三版,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),Academic Press,San Diego,1999；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第119卷,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编)Humana Press,Totowa,1999。

定义

术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”可互换使用，并且是指呈线型或环状构象，以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不应被解释为相对于聚合物的长度为限制性的。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸主链)中被修饰的核苷酸。一般而言，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基成对特异性；即A的类似物将会与T进行碱基配对。

术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可交换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于一种或多种氨基酸是对应的天然存在氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。

“结合”是指大分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)序列特异、非共价相互作用。不是所有的结合相互作用的组分都需要是序列特异性的(例如，与DNA主链中磷酸盐残基接触)，只要相互作用总体上是序列特异性的即可。此类相互作用特征通常在于10^-6M^-1或更低的分解常数(K_d)。“亲和力”是指结合强度：结合亲和力增加与K_d较低相关。“非特异性结合”是指在任何目标分子(例如，工程化核酸酶)与不依赖于靶序列的大分子(例如，DNA)之间发生的非共价相互作用。

“DNA结合分子”为可结合DNA的分子。此类DNA结合分子可为多肽、蛋白质结构域、较大蛋白质内的结构域或多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸为DNA，而在其他实施方案中，多核苷酸为RNA。在一些实施方案中，DNA结合分子为核酸酶的蛋白质结构域(例如，FokI结构域)，而在其他实施方案中，DNA结合分子为RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cfp1)的指导RNA组分。

“结合蛋白”是能够非共价结合另一种分子的蛋白质。结合蛋白可结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可结合其自身(以形成同源二聚体、同源三聚体等)，并且/或者它可结合不同蛋白质的一种或多种分子。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合以及蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一种或多种锌指以序列特异的方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述一种或多种锌指是结构通过锌离子配位稳定的结合结构域内的氨基酸序列区。术语锌指DNA结合蛋白常缩写为锌指蛋白或ZFP。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单一“重复单元”(也称为“重复序列”)通常为33-35个氨基酸长度，并且展现出至少一些与天然存在TALE蛋白质内的其他TALE重复序列的序列同源性。参见，例如美国专利号8,586,526和9,458,205。

锌指和TALE结合结构域可经“工程化”以结合预定核苷酸序列，例如通过天然存在锌指或TALE蛋白的识别螺旋区的工程化(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。用于将DNA结合蛋白工程化的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，所述蛋白质的设计/组成主要是合理标准的结果。用于设计的合理标准包括取代规则以及用于处理数据库中的信息的计算机化算法的应用，所述数据库存储现有ZFP和/或TALE设计(规范及非规范RVD)和结合数据的信息。参见，例如美国专利9,458,205；8,586,526；6,140,081；6,453,242；以及6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536以及WO 03/016496。

“所选”锌指蛋白、TALE蛋白或CRISPR/Cas系统是未在自然界中发现的蛋白质，并且所述蛋白质的产生主要是经验过程诸如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂种选择的结果。参见，例如U.S.5,789,538；U.S.5,925,523；U.S.6,007,988；U.S.6,013,453；U.S.6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197、WO 02/099084以及美国公布号20110301073。

“TtAgo”是被认为参与基因沉默的原核Argonaute蛋白质。TtAgo来源于细菌嗜热栖热菌。参见，例如Swarts等,同上,G.Sheng等,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652)。“TtAgo系统”是所需要的所有组分，包括例如用于由TtAgo酶切割的指导DNA。

“切割”是指DNA分子共价主链的断裂。可通过各种各样的方法来开始切割，所述方法包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链切割和双链切割均是可能的，并且双链切割可由于两个相异单链切割事件而发生。DNA切割可导致平末端或交错末端产生。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA切割。

“切割半结构域”是与第二多肽(相同的或不同的)结合形成具有切割活性(优选地是双链切割活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二切割半结构域”；“+和-切割半结构域”以及“右和左切割半结构域”可交换使用，是指二聚化的切割半结构域对。

“工程化切割半结构域”是已经过修饰以便与另一种切割半结构域(例如，另一种工程化切割半结构域)形成专性异源二聚体的切割半结构域。关于6个或更多个氨基酸长度的示例性接头序列，还参见美国专利号8,623,618；7,888,121；7,914,796；和8,034,598以及美国公布号20110201055，所述专利以引用方式整体并入本文。

术语“序列”是指具有任何长度的核苷酸序列，所述核苷酸序列可为DNA或RNA；可为线型、环状或分枝的，并且可为单链或双链。术语“供体序列”是指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如2与10,000之间个核苷酸的长度(或其间或其上的任何整数值)，优选地约100与1,000之间个核苷酸的长度(或其间的任何整数)，更优选地约200与500之间个核苷酸的长度。

“同源、不相同的序列”是指与第二序列共有一定程度的序列同一性，但是其序列不同于第二序列的第一序列。例如，包含突变基因野生型序列的多核苷酸与突变基因序列是同源的，并且是不同的。在某些实施方案中，两个序列之间的同源程度足以使得利用标准的细胞机理在其间产生同源重组。两个同源不相同的序列可以是任何长度，并且它们的非同源程度可以小至单个核苷酸(例如，通过靶向同源重组用于校正基因组点突变)或大至10个或更多千碱基(例如，用于在染色体中预定异位位点中插入基因)。两个包含同源不相同序列的多核苷酸不需要是相同的长度。例如，可以使用20与10,000之间个核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。

用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。还可以这种方式测定和比较基因组序列。一般而言，同一性是指两个聚核苷酸或多肽序列的分别核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应。两个或更多个序列(聚核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同一性百分比来进行比较。两个序列(无论核酸或氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度且乘以100。关于本文所述的序列，序列同一性的所需程度范围是约80％至100％以及介于其之间的任何整数值。通常，序列之间的同一性百分比为至少70-75％、优选地80-82％、更优选地85-90％、甚至更优选地92％、再更优选地95％以及最优选地98％序列同一性。

可替代地，多核苷酸之间的序列类似程度可通过以下步骤来测定：在允许同源区之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，随后用单链特异核酸酶进行酶切，以及酶切片段的大小确定。当如使用上述方法所测定，序列在所定义的分子长度上展现至少约70％-75％、优选地80％-82％、更优选地85％-90％、甚至更优选地92％、还更优选地95％以及最优选地98％序列同一性时，两个核酸或两个多核苷酸序列彼此是大致同源的。如本文所使用，大致同源还是指展示与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。大致同源的DNA序列可以在例如如对于所述具体系统所定义的严格条件下，在Southern杂交实验中识别。确定的适当杂交条件处于本领域的技术内。参见，例如Sambrook等,同上；Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach,B.D.Hames和S.J.Higgins编,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。

两个核酸片段的选择性杂交可以如下测定。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响这些分子之间的杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列将至少部分地抑制完全相同序列与靶分子的杂交。完全相同序列的杂交抑制可以使用杂交实验来评价，所述杂交实验在本领域是众所周知的(例如，Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)Cold SpringHarbor，N.Y.)。此类测定可以使用不同程度的选择性，例如，使用从低到高严格性的不同条件来进行。如果采用低严格性的条件，非特异结合的缺少可以使用二级探针来评价，所述二级探针甚至缺乏部分程度的序列同一性(例如，具有与靶分子小于约30％的序列同一性)，这样使得在缺少非特异结合的情况下，二级探针将不会与靶杂交。

当利用基于杂交的检测系统时，选择与参考核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择探针和参考序列会选择性地彼此杂交或结合以形成双链分子的适当条件。能够在适度严格的杂交条件下与参考序列选择性杂交的核酸分子通常在允许检测具有与选定的核酸探针序列具有至少约70％序列同一性的长度至少为约10-14个核苷酸的靶核酸序列的条件下杂交。严格的杂交条件通常允许检测具有与选定的核酸探针序列具有大于约90-95％序列同一性的长度为至少约10-14个核苷酸的靶核酸序列。适用于探针/参考序列杂交的杂交条件(在所述条件下探针和参考序列具有特定程度的序列同一性)可如本领域所知来测定(参见，例如Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins编,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。

杂交条件为本领域技术人员所熟知的。杂交严格性指的是杂交条件不利于形成含有不匹配核苷酸的杂种的程度，较高的严格性与对于不匹配杂种的较低耐受性相关。影响杂交严格性的因素为本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于温度、pH值、离子强度和有机溶剂(如甲酰胺和二甲基亚砜)的浓度。本领域技术人员已知，杂交严格性随着较高的温度、较低的离子强度和较低的溶剂浓度而增加。

相对于杂交的严格性条件，本领域已知可以通过改变例如以下因素来采用许多等价的条件以确立具体的严格性：序列长度和性质、各种序列的碱基组成、盐和其他杂交溶液组分的浓度、在杂交溶液中存在或不存在封端剂(例如，葡聚糖硫酸酯和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数，以及改变洗涤条件。“重组”是指两个多核苷酸之间基因信息交换的过程。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指例如在细胞中的双链断裂的修复期间发生的此类交换的特殊形式。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子以成为“靶”分子(即，经历双链断裂的那个分子)的修复模板，并且这个过程分别被称为“无交叉基因转换”或“短序列基因转换(short tract gene conversion)”，因为其导致基因信息从供体转移至所述靶。不希望受任何具体理论束缚，所述转移可以涉及在断裂的靶和供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”，在所述退火中供体用来重新合成将成为靶一部分的基因信息，和/或相关的过程。这种特定的HR经常导致靶分子序列的变化，这样使得供体多核苷酸的部分或所有序列掺入靶多核苷酸中。

“染色质”是包括细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要为DNA)以及蛋白质，所述蛋白质包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包括近似150个与八聚物相关的DNA碱基对，所述八聚物包括组蛋白H2A、H2B、H3以及H4的每两个；并且接头DNA(取决于生物体具有可变长度)在核小体核心之间伸展。组蛋白H1分子一般与接头DNA缔合。出于本公开的目的，术语“染色质”意在涵盖所有类型的原核和真核的细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体染色质和游离基因染色质。

“染色体”是包含所有或部分的细胞基因组的染色质复合物。细胞基因组的特征常常在于其核型，所述核型是包含细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可包括一种或多种染色体。

“游离基因”是包含并非细胞染色体核型的一部分的核酸的复制型核酸、核蛋白复合物或其他结构。游离基因的实例包括质粒和某些病毒基因组。

“可进入区”是细胞染色质中的位点，在所述位点中存在于核酸中的靶位点可被识别靶位点的外源分子结合。不希望受任何具体理论束缚，据信可接近区是未被包装成核小体结构的区。可接近区的独特结构经常可通过其对化学和酶探针(例如核酸酶)的敏感性来检测。

“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子将结合(条件是存在用于结合的充足条件)的核酸部分的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性核酸内切酶的靶位点。

“外源”分子是通常不存在于细胞中，但可通过一种或多种基因的、生物化学的或其他方法来引入细胞中的分子。“通常存在于细胞中”是相对于细胞的具体发育阶段和环境条件而确定的。因此，例如，仅在胚胎肌肉发育期间存在的分子相对于成人肌肉细胞是外源分子。相似地，通过热休克诱导的分子相对于非热休克的细胞是外源分子。外源分子可包括例如功能失常的内源分子的功能形式、功能正常的内源分子的功能失常形式或直向同源物(来自不同物种的内源分子的功能形式)。

在其他情况中，外源分子可为诸如通过组合化学过程产生的小分子，或大分子诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修饰的衍生物或包含一种或多种上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链的；可为线型、分枝或环状的；并且可具有任何长度。参见，例如美国专利号8,703,489和9,255,259。核酸包括能够形成双链体以及三链体的那些核酸。参见，例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。

外源分子可为与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包括感染性病毒基因组、引入细胞中的质粒或游离基因或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导的传递(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的传递以及病毒载体介导的传递。

相比之下，“内源”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包括染色体、线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组、或天然存在的游离核酸。另外的内源分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。

“融合”分子是两个或更多个亚基分子优选共价地连接的分子。亚基分子可为相同化学类型的分子，或者可为不同化学类型的分子。融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，蛋白质DNA结合结构域和切割结构域之间的融合)、与一个或多个切割结构域可操作地缔合的多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)之间的融合，以及融合核酸(例如，编码融合蛋白的核酸)。

细胞中融合分子的表达可以由融合蛋白向细胞递送或通过编码融合蛋白的多核苷酸向细胞递送而引起，其中使多核苷酸转录并且使转录物翻译以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割以及多肽连接也可参与细胞中蛋白质的表达。本公开在别处提出了用于向细胞递送多核苷酸和多肽的方法。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物(参见下文)的DNA区，以及调控基因产物产生的所有DNA区，无论所述调控序列是否相邻于编码和/或转录序列。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质结合位点以及基因座控制区。

“基因表达”是指将包含在基因中的信息转变成基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化以及编辑的方法来修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻基化以及糖基化来修饰的蛋白质。

基因表达的“调节”或“修饰”是指基因活性的变化。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因抑制，包括通过外源分子(例如，工程化转录因子)的结合来修饰基因。调节还可通过基因组编辑(例如，切割、改变、失活、随机突变)修饰基因序列来实现。基因失活是指与尚未如本文所述修饰的细胞相比，任何基因表达的减少。因此，基因失活可能是部分的或完全的。

“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如，T细胞)。

“目标区域”是任何细胞染色质区，例如像基因或基因内或基因所相邻的非编码序列，在所述基因中希望结合外源分子。结合可以是出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。目标区域可存在于例如染色体、游离基因、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染病毒基因组中。目标区域可处于基因编码区内，处于转录的非编码区(例如像前导序列、尾随序列或内含子)内，或者处于编码区上游或下游内的非转录区内。目标区域的长度可小至单个核苷酸对，或高达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。

关于并列的两种或更多种组分(诸如序列元件)，术语“有效的连接”或“有效地连接”(或“可操作地连接”)可互换使用，其中组分被布置以便组分正常发挥作用并且允许以下可能性：至少一种组分可介导施加在至少一种其他组分上的功能。作为说明，如果响应于一种或多种转录调控因子存在或不存在，转录调控序列控制编码序列转录水平，则转录调控序列(诸如启动子)可有效连接至编码序列。转录调控序列一般以顺式与编码序列有效连接，但无需直接邻近编码序列。例如，增强子是有效连接至编码序列的转录调控序列，虽然它们不是邻接的。

相对于融合多肽，术语“有效地连接”可以是指以下事实：各组分在与其他组分连接的情况下进行与如果其未如此连接时将进行的功能相同的功能。例如，相对于DNA结合结构域融合至切割结构域的融合多肽，如果在融合多肽中DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，同时切割结构域能够同时切割结构域能够切割靶位点附近(例如，靶位点任一侧上的1至500个碱基对或其间的任何值)的DNA，则DNA结合结构域和切割结构域处于有效连接。

在本公开的方法中，如本文所述的一种或多种靶向核酸酶在预定位点处的靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂(DSB)。DSB可通过同源引导的修复或非同源引导的修复机制而导致缺失和/或插入。缺失可包括任何数目的碱基对。类似地，插入可包括任何数目的碱基对，包括例如“供体”多核苷酸的整合，任选地与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性。供体序列可以物理整合或，可替代地，供体多核苷酸被用作用于通过同源组合来修复断裂的模板，这将导致引入供体中的全部或部分核酸序列至细胞染色质中。因此，可改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可转换成存在于供体多核苷酸中的序列。因此，使用术语“替换(replace)”或“替换(replacement)”可理解为表示用另一核苷酸序列来替换一个核苷酸序列，(即，在信息意义上替换序列)，并且不必然需要用另一多核苷酸来物理或化学地替换一个多核苷酸。

另外的锌指蛋白、TALEN、TtAgo或CRIPSR/Cas系统对可用于细胞内另外靶位点的另外双链切割。

在本文所述的任何方法中，另外的锌指蛋白、TALEN、TtAgo或CRIPSR/Cas系统对可用于细胞内另外靶位点的另外双链切割。

蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列不同于全长蛋白质、多肽或核酸但保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段与对应天然分子相比可具有更多、更少或相同数目的残基，并且/或者可包含一个或多个氨基酸或核酸取代。用于测定核酸功能(例如，编码功能，可杂交另一核酸的能力)的方法是本领域中熟知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是熟知的。例如，多肽的DNA结合功能可以例如通过过滤结合、电泳迁移位移或免疫沉淀实验来测定。DNA切割可通过凝胶电泳来分析。参见Ausubel等，上文。蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可以通过例如免疫共沉淀、双杂交试验或基因和生物化学的互补作用来测定。参见，例如Fields等(1989)Nature 340:245-246；美国专利号5,585,245以及PCT WO 98/44350。

术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物诸如人类患者和非人灵长类以及实验动物诸如兔、狗、猫、大鼠、小鼠以及其他动物。因此，如本文所用的术语“受试者”或“患者”意指可将本发明的表达盒施用至的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括患有病症或处于发展病症的风险中的那些受试者。

本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指降低症状严重性和/或频率、消除症状和/或潜在原因、预防症状和/或其潜在原因的发生，以及改善或修复损坏。癌症和移植物抗宿主病为可使用本文所述的组合物和方法治疗的病状的非限制性实例。因此，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)包括：

(i)防止疾病或病症在哺乳动物中发生，特别是当此类哺乳动物易患所述病状，但尚未诊断为患有所述病症时；

(ii)抑制疾病或病状，即阻止其发展；q(iii)缓解疾病或病状，即引起疾病或病症消退；或

(iv)缓解由疾病或病症引起的症状，即在不解决潜在疾病或病状的情况下缓解疼痛。如本文所使用，术语“疾病”和“病状”可互换地使用或可为不同的，因为具体疾病或病状可以不具有已知的致病因素(以致于尚未找出病因)，并且因此它是还没有确认为疾病而是仅仅作为不希望的病状或综合症，其中或多或少的一组具体症状已由临床医生鉴定出。

“药物组合物”是指本发明的化合物和本领域中普遍接受用于递送生物活性化合物至哺乳动物(例如，人)的介质的制剂。这种介质包括其所有药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

“有效量”或“治疗有效量”是指本发明化合物的量，其在向哺乳动物(优选为人)时，足以在哺乳动物(优选为人)中产生治疗。构成“治疗有效量”的本发明的化合物的量将根据化合物、病状及其严重性、施用方式和待治疗的哺乳动物年龄而改变，但常规可通过本领域普通技术人员考虑其自己的知识和本公开内容来确定。

接头

本文描述了融合(连接)DNA结合结构域(例如，锌指蛋白、TALE、sgRNA等)和核酸酶(例如，切割结构域或切割半结构域)的氨基酸序列。

当前，核酸酶二聚体结合相对DNA链(参见，图1A)，这可限制核酸酶的设计。本文描述的接头允许以当前构型和头对尾构型(图1B)结合，这与当前使用的架构相比使可用于设计靶向核酸酶的潜在靶位点增加至少3倍。此外，当锌指核酸酶对的靶位点未相隔0-6个碱基对，例如靶位点相隔7、8、9、10个或更多个碱基对时，本文所述的接头允许切割。本文所述的接头序列的长度通常在约8与17个氨基酸之间，并且可连接到蛋白质DNA结合结构域的N端或C端、连接至切割结构域，或可替代地可与多核苷酸DNA结合结构域的任何部分缔合。在某些实施方案中，接头在蛋白质DNA结合结构域的N或C端残基与切割结构域的N或C端残基之间延伸。在某些实施方案中，接头在切割结构域与DNA结合结构域的N端之间延伸。

如本文所述的接头的非限制性实例示于图3、4、5、6、7、10、11和19B中。

本文描述的融合分子还可包括对所选切割结构域的N端区域的改变。改变可包括切割结构域的一个或多个N端残基的取代、添加和/或缺失。在某些实施方案中，切割结构域来源于FokI，并且野生型FokI N端区域的一个或多个氨基酸被替换，并且另外的氨基酸被添加到此区域。参见，例如，美国专利公布号20150064789。

本文还描述了包含以下的融合蛋白：DNA结合结构域、修饰的FokI切割结构域和DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的ZC接头。FokI切割结构域可以任何方式来修饰。修饰的非限制性实例包括FokI的N端区域的添加、缺失和/或取代(SEQ ID NO:320的残基158-169。参见，例如美国专利公布20090305419。在某些实施方案中，修饰的FokI切割结构域包含从FokI的N端区域缺失1、2、3、4个或更多个氨基酸(例如，缺失如SEQ ID NO:320中所示的野生型FokI结构域的残基158、159、160和/或161中的一个或多个))。在其他实施方案中，修饰的FokI切割结构域包含从FokI的N端区域的一个或多个缺失以及一个或多个取代(例如，缺失残基158-161中的一个或多个并且取代剩余残基中的一个或多个))。在N端FokI氨基酸残基中具有缺失和取代的蛋白质的非限制性实例包括如图15中所示的命名为V2、V4、V5、V6和V8的蛋白质。在其他实施方案中，修饰的FokI切割结构域在FokI的N端区域中包含一个或多个取代。在FokI的N端氨基酸残基中具有取代的蛋白质的非限制性实例包括如图15中所示的命名为V9至V16的蛋白质。在另一些实施方案中，修饰的FokI切割结构域包含FokI的最N端残基(SEQ ID NO:320的残基158)的N端的一个或多个另外氨基酸残基(例如，1、2、3、4个或更多个)。在其他实施方案中，修饰的FokI切割结构域包含FokI的最N端残基(SEQ ID NO:320的残基158)的N端的一个或多个另外氨基酸残基(例如，1、2、3、4个或更多个)以及FokI的N端区域内的一个或多个取代。具有添加的蛋白质的非限制性实例包括图15或图16中所示的那些蛋白质，并且N端FokI氨基酸残基内的取代如美国专利公布号20090305419中所述。

通常，本发明的接头通过制备编码接头和DNA结合结构域的重组核酸来制备，所述DNA结合结构域通过接头氨基酸序列融合。任选地，接头还可使用肽合成来制备，然后连接至多肽DNA结合结构域。

核酸酶

本文所述的接头序列有利地用于将DNA结合结构域(例如锌指蛋白、TALE、归巢核酸内切酶、CRISPR/Cas指导RNA和/或Ttago指导RNA)连接至核酸酶切割结构域或半结构域，以形成特异性靶向的非天然存在的核酸酶。DNA结合结构域可结合基因内的任何靶序列，所述靶序列包括但不限于任何基因组序列中的具有12个或更多个核苷酸的任何靶序列。

A.DNA结合结构域

任何DNA结合结构域均可用于本文公开的方法中。在某些实施方案中，DNA结合结构域包括锌指蛋白。优选地，锌指蛋白为非天然存在的，因为其经工程化以结合所选靶位点。参见，例如Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列缔合。参见，例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，所述专利以引用方式整体并入本文。

包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759以及6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197以及GB 2,338,237中。此外，用于锌指结合结构域的结合特异性增强已经在例如共有的WO 02/077227中有所描述。

靶位点的选择；ZFP和设计并构建融合蛋白(和编码所述蛋白质的多核苷酸)的方法为本领域技术人员已知并且详细描述于美国专利申请公布号20050064474和20060188987中，所述公布以引用方式整体并入本文。

另外，如这些和其他参考文献中所公开，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适接头序列(包括例如5个或更多个氨基酸长度的接头)来连接在一起。关于6个或更多个氨基酸长度的示例性接头序列，还参见美国专利号6,479,626；6,903,185；以及7,153,949。本文所述的蛋白质可包括单独的蛋白质锌指之间的合适接头的任何组合。

在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法采用大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)DNA结合结构域，以结合供体分子和/或结合细胞基因组中的目标区域。天然存在的大范围核酸酶识别15-40个碱基对切割位点，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GH-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等(1989)Gene82:115–118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353以及the New England Biolabs catalogue。另外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程化以结合非天然靶位点。参见，例如Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature 441:656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公布号20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA-结合结构域可在核酸酶的总体情况下改变(即，使得核酸酶包括同源切割结构域)或可融合至异源切割结构域。

在其他实施方案中，本文所述的方法和组合物中使用的一种或多种核酸酶的DNA结合结构域包含天然存在的或工程化(非天然存在的)TAL效应物DNA结合结构域。参见，例如美国专利号8,586,526，其以引用方式整体并入本文。黄单孢菌属(Xanthomonas)的植物病原菌已知在重要农作物中引起许多疾病。黄单孢菌属的病原性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，其将多于25种不同效应蛋白质注入到植物细胞中。在这些注入蛋白质之中的是转录活化剂样(TAL)效应物，其模拟植物转录活化剂并且操纵植物转录组(参见Kay等(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录活化结构域。最良好表征的TAL效应物之一为来自野油菜黄单胞菌疱病致病变种(Xanthomonas campestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(参见，Bonas等(1989)Mol Gen Genet 218:127-136，以及WO2010079430)。TAL效应物含有集中的串联重复结构域，每个重复含有约34个氨基酸，所述重复对于这些蛋白质的DNA结合特异性至关重要。另外，其含有核定位序列和酸性转录活化结构域(关于综述，参见Schornack S,等(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。另外，在植物病原细菌青枯菌中，已经命名为brg11和hpx17的两种基因，所述基因与青枯菌生物变型1菌株GMI1000和生物变型4菌株RS1000中的黄单孢菌的AvrBs3家族同源(参见Heuer等(2007)Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。这些基因的核苷酸序列彼此98.9％相同，但是不同之处在于在hpx17的重复结构域中缺失1,575bp。然而，两种基因产物与黄单孢菌属的AvrBs3家族蛋白质具有小于40％序列同一性。参见，例如美国专利号8,586,526，其以引用方式整体并入本文。

这些TAL效应物的特异性取决于串联重复序列中发现的序列。重复序列包含约102bp，并且重复序列通常彼此91-100％同源(Bonas等，同上)。重复序列的多态性通常位于位置12和13并且在位置12和13处的高变双残基(RVD)的同一性与TAL效应物的靶序列中的邻接核苷酸的同一性之间似乎存在一一对应的关系(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science 326:1501和Boch等(2009)Science 326:1509-1512)。在实验上，已经确定了这些TAL效应物的DNA识别的天然密码，以便位置12和13处的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG与T结合，NI与A、C、G或T结合，NN与A或G结合，并且ING与T结合。这些DNA结合重复序列已经以新的组合和多个重复序列来组装成蛋白质，制得人工转录因子，所述因子能够与新的序列相互作用并且活化植物细胞中的非内源性报道基因的表达(Boch等，同上)。工程化TAL蛋白质已经连接至FokI切割半结构域以产生TAL效应物结构域核酸酶融合体(TALEN)。参见，例如美国专利号8,586,526；Christian等((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)。在某些实施方案中，TALE结构域包含如美国专利号8,586,526中所述的N-帽和/或C-帽。在另一些实施方案中，核酸酶包含致密TALEN(cTALEN)。这些核酸酶是将TALE DNA结合结构域连接到TevI核酸酶结构域的单链融合蛋白。融合蛋白可充当由TALE区定位的切口酶，或可产生双链断裂，取决于TALE DNA结合结构域相对于TevI核酸酶结构域位于的位置(参见，Beurdeley等(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。任何TALEN均可与具有一个或多个mega-TAL的另外TALEN(例如，一种或多种TALEN(cTALEN或FokI-TALEN))组合使用。

在某些实施方案中，DNA结合结构域为CRISPR/Cas核酸酶系统的一部分。参见，例如美国专利号8,697,359和美国专利公布号20150056705。编码所述系统的RNA组分的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列)基因座和编码蛋白质的Cas(CRISPR相关)基因座(Jansen等(2002)Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等,2002.Nucleic AcidsRes.30:482-496；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Haft等,2005.PLoSComput.Biol.1:e60)组成CRISPR/Cas核酸酶系统的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因的组合以及能够设计CRISPR介导核酸切割的特异性的非编码RNA元件。

II型CRISPR为最良好表征的系统之一，并且在四个相继步骤中进行靶向DNA双链断裂。首先，两个非编码RNA，前crRNA阵列和tracrRNA，从CRISPR基因座转录。其次，tracrRNA杂交至前crRNA的重复序列区，并且介导将前crRNA加工成含有单独间隔区序列的成熟crRNA。第三，通过crRNA上的间隔区与靶DNA上的原型间隔区相邻基序(PAM)附近的原型间隔区之间的Watson-Crick碱基配对，成熟crRNA:tracrRNA复合物将Cas9引导至靶DNA，这是靶识别的附加要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割以在原型间隔区内产生双链断裂。CRISPR/Cas系统的活动包括三个步骤：(i)将外来DNA序列插入CRISPR阵列以阻止将来攻击，这是称为‘适应’的过程，(ii)表达相关蛋白质，以及表达并处理阵列，随后(iii)RNA介导干扰外来核酸。因此，在细菌细胞中，多个所谓‘Cas’蛋白质涉及CRISPR/Cas系统的天然功能并且在诸如插入外来DNA等的功能中发挥作用。

在某些实施方案中，Cas蛋白质可为天然存在Cas蛋白质的“功能衍生物”。原生序列多肽的“功能衍生物”是具有与原生序列多肽相同定性生物特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于原生序列的片段和原生序列多肽及其片段的衍生物，只要其具有与相应原生序列多肽相同的生物活性。在本文中涵盖的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、其共价修饰和融合。Cas多肽或其片段的合适衍生物包括但不限于Cas蛋白质或其片段的突变体、融合、共价修饰。Cas蛋白(其包括Cas蛋白或其片段以及Cas蛋白或其片段的衍生物)可从细胞获得或化学合成或通过这两种程序的组合获得。细胞可为天然产生Cas蛋白质的细胞，或天然产生Cas蛋白质并且遗传工程化以在较高表达水平下产生内源性Cas蛋白质或从外源引入核酸产生Cas蛋白质的细胞，所述核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，细胞不天然产生Cas蛋白质并且遗传工程化以产生Cas蛋白质。

在一些实施方案中，DNA结合结构域为TtAgo系统的一部分(参见，Swarts等,同上；Sheng等,同上)。在真核生物中，基因沉默是由Argonaute(Ago)蛋白质家族介导的。在这个范例中，Ago结合小(19-31nt)RNA。这种蛋白质-RNA沉默复合物通过小RNA与靶标之间的沃森-克里克碱基配对来识别靶RNA，并且以核酸内切方式切割靶RNA(Vogel(2014)Science344:972-973)。相比之下，原核Ago蛋白结合小的单链DNA片段，并可能用于检测和去除外来的(经常为病毒性)DNA(Yuan等,(2005)Mol.Cell 19,405；Olovnikov等(2013)Mol.Cell51,594；Swarts等,同上)。示例性原核Ago蛋白包括来自超嗜热菌(Aquifex aeolicus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和嗜热栖热菌的那些蛋白质。

最良好表征的原核Ago蛋白之一为来自嗜热栖热菌的蛋白质(TtAgo；Swarts等，同上)。TtAgo与具有5'磷酸基团的15nt或13-25nt单链DNA片段缔合。TtAgo所结合的这种“指导DNA”用于引导蛋白质-DNA复合物结合第三方DNA分子中的沃森-克里克互补DNA序列。一旦这些指导DNA中的序列信息允许识别靶DNA，则TtAgo-指导DNA复合物切割靶DNA。这种机制还由TtAgo-指导DNA复合物在结合其靶DNA时的结构支持(G.Sheng等，同上)。来自类球红细菌的Ago(RsAgo)具有类似的特性(Olivnikov等，同上)。

可将具有任意DNA序列的外源指导DNA加载到TtAgo蛋白上(Swarts等，同上)。由于TtAgo切割的特异性由指导DNA引导，与外源、研究者指定的指导DNA形成的TtAgo-DNA复合物将因此将TtAgo靶DNA切割引导至互补性、研究者指定的靶DNA。以此方式，可在DNA中产生靶向双链断裂。TtAgo指导DNA系统(或来自其他生物体的直系同源Ago-指导DNA系统)的使用允许细胞内基因组DNA的靶向切割。此类切割可为单链的或双链的。为了切割哺乳动物基因组DNA，将优选使用经密码子优化以哺乳动物细胞中表达的TtAgo形式。此外，可优选用体外形成的TtAgo-DNA复合物处理细胞，在所述TtAgo-DNA复合物中TtAgo蛋白融合至细胞穿透肽。此外，可优选使用已通过诱变改变以在37℃下具有改善的活性的TtAgo蛋白形式。Ago-RNA介导的DNA切割可用于使用用于开发DNA断裂的本领域技术标准来实现包括以下的一系列结果：基因敲除、靶向基因添加、基因校正、靶向基因缺失。

B.切割结构域

本文描述的核酸酶(例如，ZF、TALEN、CRISPR/Cas核酸酶)还包括核酸酶(切割结构域、切割半结构域)。核酸酶可在靶DNA中诱导双链断裂(DSB)或单链断裂(切口)。在一些实施方案中，使用两种切口酶通过引入两种切口来产生DSB。在一些情况下，切口酶是ZFN，而在其他情况下，切口酶是TALEN或CRISPR/Cas切口酶。

本文公开的融合蛋白质的切割功能域部分可以从任何核酸内切酶或核酸外切酶中获得。切割结构域可来源于的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；以及Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的另外酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等(编)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作切割结构域和切割半结构域的来源。

类似地，切割半结构域可来源于如上提出的对于切割活性需要二聚化的任何核酸酶或其部分。一般而言，如果融合分子包含切割半结构域，则切割需要两个融合分子。可替代地，可使用包含两个切割半结构域的单个蛋白质。所述两个切割半结构域可来源于相同核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个切割半结构域均可来源于不同的核酸内切酶(或其功能片段)。

另外，两个融合蛋白的靶位点是优选地相对于彼此布置的，这样使得两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合将切割半结构域放置于使得切割半结构域例如通过二聚作用来形成功能切割结构域的彼此空间定位中。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边由5-8个核苷酸或由15-18个核苷酸来隔开。然而，任何整数的核苷酸或核苷酸对可介于两个靶位点之间(例如，2至50个核苷酸对或更多)。一般而言，切割的位点位于靶位点之间。

如上所指出，切割结构域可与DNA结合结构域异源，例如锌指DNA结合结构域和切割结构域来自核酸酶或TALEN DNA结合结构域和切割结构域，或大范围核酸酶DNA结合结构域和切割结构域来自不同核酸酶，或DNA结合结构域来自CRISPR/Cas系统并且切割结构域来自差异核酸酶。异源切割结构域可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。切割结构域可来源于的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。切割DNA的其他酶是己知的(例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作切割结构域和切割半结构域的来源。

类似地，切割半结构域可来源于如上提出的对于切割活性需要二聚化的任何核酸酶或其部分。一般而言，如果融合分子包含切割半结构域，则切割需要两个融合分子。可替代地，可使用包含两个切割半结构域的单个蛋白质。所述两个切割半结构域可来源于相同核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个切割半结构域均可来源于不同的核酸内切酶(或其功能片段)。另外，两个融合蛋白的靶位点是优选地相对于彼此布置的，这样使得两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合将切割半结构域放置于使得切割半结构域例如通过二聚作用来形成功能切割结构域的彼此空间定位中。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边由5-8个核苷酸或由15-18个核苷酸来隔开。然而，任何整数的核苷酸或核苷酸对可介于两个靶位点之间(例如，2至50个核苷酸对或更多)。一般而言，切割的位点位于靶位点之间。

限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够以序列特异性方式结合至DNA(在识别位点处)，并且在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点处切割DNA且具有可分开的结合结构域和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I在距其于一条链上的识别位点9个核苷酸处，并且在距其于另一条链上的识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.et al.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)以及一个或多个锌指结合结构域，所述锌指结合结构域可能是或可能不是工程化。FokI的野生型序列(SEQID NO:282)在以下示出：

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF

切割结构域与结合结构域分离的示例性IIS型限制酶为FokI。这种特定的酶作为二聚体是有活性的。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，出于本公开的目的，认为用于公开的融合蛋白中的Fok I酶的一部分是切割半结构域。因此，为了使用锌指-FokI融合体进行细胞序列的靶向双链切割和/或靶向替换，各自包含FokI切割半结构域的两种融合蛋白可用来重建催化活性的切割结构域。可替代地，也可以使用包含锌指结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。本公开在别处提供了使用锌指-Fok I融合体进行的靶向切割和靶向序列改变的参数。

切割结构域或切割半结构域可为保留切割活性或保留多聚化(例如，二聚化)以形成功能切割结构域的能力的蛋白质的任何部分。

示例性的IIS型限制酶描述于国际公布WO 07/014275中，所述公布以引用方式整体并入本文。另外的限制酶也包含可分开的结合结构域和切割结构域，并且这些酶为本公开所涵盖。参见，例如Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。

在某些实施方案中，如例如美国专利号8,623,618；8,409,861；8,034,598；7,914,796；以及7,888,121中所述，切割结构域包含最小化或防止同源二聚化的一个或多个工程化切割半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，所述专利的全部公开内容均以引用方式整体并入本文。在Fok I的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537以及538上的氨基酸残基全部是用于影响FokI切割半结构域二聚的靶标。

形成专性异源二聚体的Fok I的示例性工程切割半结构域包括如下对，在所述对中第一切割半结构域包含在FokI的位置490和538上的氨基酸残基的突变，并且第二切割半结构域包括在氨基酸残基486和499上的突变。

因此，在一个实施方案中，490处的突变用Lys(K)替换Glu(E)；在538处的突变用Lys(K)替换Iso(I)；486处的突变用Glu(E)替换Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)替换Iso(I)。具体地，本文所述的工程化切割半结构域通过在一个切割半结构域中位置490(E→K)和538(I→K)突变以产生命名为“E490K:I538K”工程化切割半结构域，以及通过在另一切割半结构域中位置486(Q→E)和499(I→L)突变以产生命名为“Q486E:I499L”工程化切割半结构域来制备。本文所述的工程化切割半结构域是异常切割被最小化或消除的专性异源二聚突变体。参见，例如美国专利号7,888,121，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入。

可使用具有多于一个突变的切割结构域，例如一个切割半结构域中的位置490处的突变(E→K)以及538处的突变(I→K)，以产生命名为“E490K:I538K”的工程化切割半结构域，并且通过使另一个切割半结构域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突变，以产生命名为“Q486E:I499L”的工程化切割半结构域；用Glu(E)残基替换位置486处的野生型Gln(Q)残基、用Leu(L)残基替换位置499处的野生型Iso(I)残基并且用Asp(D)或Glu(E)残基替换位置496处的野生型Asn(N)残基的突变(也分别称为“ELD”和“ELE”结构域)；工程化切割半结构域，其包含位置490、538和537(相对于野生型FokI来编号)处的突变，例如用Lys(K)残基替换位置490处的野生型Glu(E)残基、用Lys(K)残基替换位置538处的野生型Iso(I)残基、用Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别称为“KKK”和“KKR”结构域)；和/或工程化切割半结构域，其包含位置490和537(相对于野生型FokI来编号)处的突变，例如用Lys(K)残基替换位置490处的野生型Glu(E)残基并且Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别称为“KIK”和“KIR”结构域)。参见，例如美国专利号7,914,796；8,034,598以及8,623,618，其公开内容出于所有目的以引用方式整体并入。在其他实施方案中，工程化切割半结构域包含“Sharkey”和/或“Sharkey”突变(参见，Guo等,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。

可替代地，可在体内在核酸靶位点处使用所谓的“分裂酶”技术来组装核酸酶(参见，例如，美国专利公布号20090068164)。此类分裂酶的组分可在分开的表达构建体上表达，或者可在单独组分由例如自切割2A肽或IRES序列分开的一个开放阅读框中连接。组分可为单独锌指结合结构域或具有大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。

可在使用之前，例如在如美国专利号8,563,314中所述的基于酵母的染色体系统中筛选核酸酶的活性。

Cas9相关的CRISPR/Cas系统包含两个RNA非编码组分：tracrRNA和含有由相同的直接重复序列(DR)间隔的核酸酶指导序列(间隔区)的前crRNA阵列。为了使用CRISPR/Cas系统来完成基因组工程，这些RNA的两种功能均必须存在(参见，Cong等,(2013)Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrRNA和前crRNA由隔开的表达构建体或作为隔开的RNA来供应。在其他实施方案中，构建嵌合RNA，在所述嵌合RNA中工程化成熟crRNA(赋予靶特异性)融合至tracrRNA(供应与Cas9的相互作用)，以产生嵌合cr-RNA-tracrRNA杂交体(也称为单指导RNA)。(参见，Jinek，同上以及Cong，同上)。

靶位点

如以上所详述，融合分子的包含如本文的接头的DNA结合结构域可经工程化以结合任何所选序列。与天然存在的DNA结合结构域相比，工程化DNA结合结构域可具有新型结合特异性。

合适靶基因的非限制性实例包括β(β)珠蛋白基因(HBB)、gamma(γ)珠蛋白(也被称为胎儿珠蛋白)基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因、Hungtingin(Htt)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜电导调控因子(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细胞抗原(HLA)A基因、HLA B基因、HLA C基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、与抗原加工相关的转运体(TAP)1基因、TAP2基因、tapasin基因(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式活化因子(CIITA)基因、肌营养不良蛋白基因(DMD)、糖皮质激素受体基因(GR)、IL2RG基因、Rag-1基因、RFX5基因、FAD2基因、FAD3基因、ZP15基因、KASII基因、MDH基因和/或EPSPS基因。

在某些实施方案中，核酸酶靶向“安全港”基因座，诸如人细胞中的AAVS1、HPRT、白蛋白和CCR5基因和鼠细胞中的Rosa26(参见，例如美国专利号8,771,985；8,110,379；7,951,925；美国公布号20100218264；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983；20130177960；20150056705和20150159172)，以及植物中的Zp15基因座(参见，美国专利U.S.8,329,986)。

供体

在某些实施方案中，本公开涉及细胞(例如干细胞)基因组的核酸酶介导的修饰。如上所指出，插入外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)，例如以缺失特定区域和/或校正突变基因或增加野生型基因的表达。将显而易见的是，供体序列通常与其所置于的基因组序列不同。供体序列可含有侧接两个同源区的非同源序列，以允许目标位置处的有效HDR，或可通过非同源定向修复机制来整合。另外，供体序列可包含含有与细胞染色质中的目标区不同源的序列的载体分子。供体分子可含有细胞染色质的若干不连续的同源区。此外，为了通常不存在于目标区域中的序列的靶向插入，所述序列可存在于供体核酸分子中并且侧接目标区域中的序列的同源区。

与核酸酶一样，供体可以任何形式来引入。在某些实施方案中，供体以mRNA形式来引入以消除修饰的细胞中的残留病毒。在其他实施方案中，供体可使用DNA和/或病毒载体通过本领域已知的方法来引入。参见，例如美国专利公布号20100047805和20110207221。供体可以环状或线型形式引入至细胞中。如果以线型形式引入，则供体序列的末端可通过为本领域技术人员已知的方法来保护(例如，免受核酸外切降解)。例如，一种或多种双脱氧核苷酸残基添加至线型分子的3’端，并且/或者自补寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如Chang等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls等(1996)Science272:886-889。用于保护外源多核苷酸免受降解的另外方法包括但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

在某些实施方案中，供体包括长度大于1kb(例如介于2kb与200kb之间，介于2kb与10kb之间(或其间的任何值))的序列(例如，编码序列，也被称为转基因)。供体还可包括至少一个核酸酶靶位点。在某些实施方案中，例如对于ZFN、TALEN、TtAgo或CRISPR/Cas核酸酶对，供体包含至少2个靶位点。通常，核酸酶靶位点处于转基因序列之外(例如转基因序列的5’和/或3’)以切割所述转基因。核酸酶切割位点可支持任何核酸酶。在某些实施方案中，双链供体中含有的核酸酶靶位点支持被用来切割内源靶标的相同核酸酶，切割的供体通过同源性非依赖性方法整合至所述内源靶标中。

可插入供体，以便其表达由整合位点处的内源启动子(即，驱动供体所插入的内源基因的表达的启动子)驱动。然而，将显而易见的是，供体可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或者诱导型或组织特异性启动子。供体分子可插入内源性基因中以使得所有、一些或没有内源性基因得以表达。此外，虽然并非为表达所必需，但是外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或多聚腺苷酸化信号的序列。

可使用本领域已知的标准技术诸如PCR来从质粒、细胞或其他来源中分离本文所述的供体序列上携带的转基因。供使用的供体可包含不同类型的拓扑结构，包括超螺旋环状、松弛环状、线型等。可替代地，它们可使用标准寡核苷酸合成技术来以化学方式合成。另外，供体可为甲基化的，或者缺乏甲基化。供体可呈细菌或酵母人工染色体(BAC或YAC)的形式。

本文所述的供体多核苷酸可包含一个或多个非天然碱基和/或主链。具体而言，可使用本文所述的方法来进行具有甲基化胞嘧啶的供体分子的插入，以在目标区域达到转录静止的状态。

外源(供体)多核苷酸可包含任何目标序列(外源序列)。示例性外源序列包括但不限于任何多肽编码序列(例如，cDNA)、启动子序列、增强子序列、表位标签、标记基因、切割酶识别位点以及各种类型的表达构建体。标记基因包括但不限于序列编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码彩色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括例如FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列中的一种或多种拷贝。

在一些实施方案中，供体还包含编码细胞中表达所需的任何多肽的多核苷酸，所述多肽包括但不限于抗体、抗原、酶、受体(细胞表面或核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报道多肽、生长因子及以上中的任一种的功能片段。编码序列可为例如cDNA。

在某些实施方案中，外源序列可包含标记基因(以上所述)，从而允许选择已进行了靶向整合的细胞和编码另外功能性的连接序列。标记基因的非限制性实例包括GFP、药物选择标记等等。

在某些实施方案中，转基因可包括例如野生型基因以替换突变的内源序列。例如，野生型(或其他功能性)基因序列可插入基因的内源拷贝突变的干细胞的基因组中。转基因可在内源基因座处插入，或者可以可替代地靶向至安全港基因座。

按照本说说明书的教义，此类表达盒的构建利用分子生物学领域中熟知的方法(参见，例如，Ausubel或Maniatis)。在使用表达盒产生转基因动物之前，表达盒对与所选控制元件相关的应激诱导物(stress-inducer)的响应性可通过将表达盒引入合适的细胞系(例如，原代细胞、转化细胞或永生化细胞系)中来检测。

此外，虽然并非为表达所必需，但是外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或多聚腺苷酸化信号的序列。此外，目标基因的控制元件可以可操作地连接至报道基因以产生嵌合基因(例如，报道表达盒)。示例性剪接受体位点序列是本领域技术人员已知的，并且仅以举例方式包括CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG(SEQ ID NO:321)(来自人HBB基因)和TTTCTCTCCACAG(SEQ IDNO:322)(来自人免疫球蛋白-γ基因)。

还可实现非编码核酸序列的靶向插入。编码反义RNA、RNAi、shRNA和微小RNA(miRNAs)的序列也可用于靶向插入。

在另外的实施方案中，供体核酸可包含作为用于另外核酸酶设计的特异性靶位点的非编码序列。随后，另外的核酸酶可在细胞中表达，以便通过插入另一种目标供体分子来切割并且修饰原始供体分子。以此方式，可产生供体分子的反复整合，从而允许具体目标基因座处或安全港基因座处的特性叠加。

递送

核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物可通过任何合适手段来递送。在某些实施方案中，核酸酶和/或供体在体内递送。在其他实施方案中，将核酸酶和/或供体递送至分离的细胞(例如，自体同源或异源干细胞)，以提供用于离体递送至患者的修饰的细胞(例如，干细胞)。

如本文所述的递送核酸酶的方法描述于例如美国专利号7,888,121；6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；以及7,163,824中，所有所述专利的公开内容以引用方式整体并入本文。

如本文所述的核酸酶和/或供体构建体还可使用任何核酸递送机制来递送，所述核酸递送机制包括裸DNA和/或RNA(例如mRNA)和含有编码一种或多种组分的序列的载体。可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、DNA微环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体以及腺相关病毒载体等及其组合。还参见，美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824以及美国专利申请号14/271,008，所述专利以引用方式全部并入本文。此外，将显而易见的是，这些系统中的任一种均可包含治疗所需的一种或多种序列。因此，在将一种或多种核酸酶和供体构建体引入细胞中时，可在相同递送系统或不同递送机制上携带核酸酶和/或供体多核苷酸。当使用多个系统时，每个递送机制可包含编码一种或多种核酸酶和/或供体构建体的序列(例如，编码一种或多种核酸酶的mRNA和/或携带一种或多种供体构建体的mRNA或AAV)。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶和供体构建体的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、DNA微环、裸核酸和与递送媒介物诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，所述DNA和RNA病毒在递送至细胞后具有游离基因或整合的基因组。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米粒子/聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、裸RNA、加帽RNA、人工病毒粒子以及试剂增强的DNA摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可用于核酸的递送。

另外的示例性核酸输送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne，Germany)，Maxcyte，Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)以及Copernicus Therapeutics Inc提供的那些核酸递送系统(参见，例如美国专利号6,008,336)。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355中)，并且脂转染试剂为商业销售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些脂质。

使用基于RNA或DNA病毒的系统以递送编码工程化CRISPR/Cas系统的核酸利用了使病毒靶向体内的特定细胞并且将病毒有效载荷运输到核的高度进化过程。病毒载体可直接向受试者(体内)施用或其可用于体外处理细胞并且向受试者(离体)施用修饰的细胞。用于递送CRISPR/Cas系统的常规基于病毒的系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯性疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法使宿主基因组中的整合成为可能，常常导致插入的转基因长期表达。此外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

逆转录病毒的趋向性可通过掺入外来包膜蛋白质、扩增靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒效价的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包含封装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复序列。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和封装，其接着用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些逆转录病毒载体。

在优选瞬时表达的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。在此类载体的情况下，已获得高效价和高水平的表达。此载体可在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于用靶核酸转导细胞，例如，在体外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因疗法程序(参见，例如，West等，Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，所述出版物包括美国专利号5,173,414；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat及Muzyczka,PNAS81:6466-6470(1984)；以及Samulski等,J.Virol.63:03822-3828(1989)。可使用任何AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8、AAV 8.2、AAV9和AAV rh10以及假型AAV，诸如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6。

至少六种病毒载体方法当前可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系的基因来补充缺陷性载体以产生转导剂的方法。

pLASN和MFG-S是已被用于临床试验中的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等,Blood85:3048-305(1995)；Kohn等,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等,PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因疗法试验中的第一治疗性载体。(Blaese等,Science 270:475-480(1995))。已经观察到MFG-S包装载体的50％或更大的转导效率。(Ellem等,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。

重组腺相关病毒载体(rAAV)是基于缺陷性和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代性基因递送系统。所有载体来源于仅保留了侧接转基因表达盒的AAV 145碱基对(bp)反向末端重复的质粒。由于整合到转导细胞基因组中所引起的有效基因转移和稳定的转基因递送是这种载体系统的关键特征。(Wagner等,Lancet 351:91171702-3(1998),Kearns等,Gene Ther.9:748-55(1996))。还可根据本发明使用其他AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10以及其所有变体。

复制缺陷重组腺病毒载体(Ad)可以高效价产生并且容易感染许多不同细胞类型。大多数腺病毒载体被工程化以使转基因替换AdE1a、E1b和E3基因；随后使复制缺陷性载体在反式提供缺失的基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂性分化细胞，诸如肝、肾和肌肉组织中发现的那些细胞。常规Ad载体具有大的携带能力。Ad载体在临床试验中使用的实例涉及用肌肉内注射来进行用于抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。用于基因转移的腺病毒载体在临床试验中使用的另外实例包括Rosenecker等,Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等,Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。

封装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括293细胞，其包装腺病毒，以及ψ2细胞或PA317细胞，其包装逆转录病毒。用于基因疗法的病毒载体通常由生产细胞系产生，所述细胞系将核酸载体封装至病毒粒子中。载体通常含有包装并随后整合至宿主中所需要的减少病毒序列(如果可适用)，其他病毒序列由编码待表达的蛋白质的表达盒替换。缺失的病毒功能由封装细胞系以反式提供。例如，用于基因疗法的AAV载体通常只具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，所述序列为封装并整合至宿主基因组中所需要。病毒DNA封装于细胞系中，其含有编码其他AAV基因，即rep和cap的辅助质粒，但是缺少ITR序列。还用作为辅助病毒的腺病毒来感染细胞系。辅助病毒促进AAV载体的复制以及AAV基因从辅助质粒中的表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒未大量地包装。可通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少受腺病毒的污染。另外，AAV可使用杆状病毒系统来制备(参见，例如美国专利6,723,551和7,271,002)。

从293或杆状病毒系统中纯化AAV颗粒通常涉及使产生病毒的细胞生长，随后从细胞上清液中收集病毒粒子，或裂解细胞以及从粗裂解物中收集病毒。AAV然后通过本领域已知的方法来纯化，所述方法包括离子交换色谱(例如，参见美国专利7,419,817和6,989,264)、离子交换色谱和CsCl密度离心(例如，PCT公布WO2011094198A10)、免疫亲和力色谱(例如，WO2016128408)或使用AVB Sepharose进行的纯化(例如，GE Healthcare LifeSciences)。

在许多基因疗法应用中，需要基因疗法载体以针对具体组织类型的高度特异性来递送。因此，病毒载体通常被修饰来通过在病毒外表面上以与病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来对给定细胞类型具有特异性。选择具有对已知存在于目标细胞类型上的受体的亲和性的配体。例如，Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道可将Moloney鼠白血病病毒修饰以表达融合至gp70的人调蛋白，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。此原理可扩展至其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体并且病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可经工程化以展示具有实际上任何选定细胞受体的特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体，但是相同原则可应用于非病毒载体。此类载体可经工程化以含有利于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。

可通过向个体受试者施用，通常通过如下所述的全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部施用来在体内递送基因疗法载体。可替代地，可向活体外细胞诸如从个体患者中移植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检)或万能供血者造血干细胞递送载体，随后通常在选择已掺入载体的细胞后将细胞再植入患者中。

含有核酸酶和/或供体构建体的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可直接施用至生物体以便在体内转导细胞。可替代地，可施用裸DNA。施用是通过通常用于将分子引入成与血液或组织细胞的最终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用此类核酸的合适方法是可用的且为本领域技术人员所熟知，并且虽然一种以上途径可用于施用特定组合物，但是特定途径常常可提供比另一途径更直接且更有效的反应。

适用于引入本文描述的多核苷酸的载体包括非整合慢病毒载体(IDLV)。参见，例如Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-11388；Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等(2000)Nature Genetics25:217-222；美国专利公布号2009/054985。

药学上可接受的载剂部分地通过所施用的具体组合物以及通过用来施用组合物的具体方法来确定。因此，如下所述，存在可用的药物组合物的多种多样的合适制剂(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1989)。

显然核酸酶编码序列和供体构建体可使用相同或不同系统来递送。例如，供体多核苷酸可由AAV携带，而一种或多种核酸酶可由mRNA携带。此外，不同系统可通过相同或不同途径来施用(肌肉内注射、尾静脉注射、其他静脉内注射、腹膜内施用和/或肌肉内注射。载体可同时或以任何相继顺序来递送。

离体和体内施用的制剂包括液体或乳化液体中的悬浮液。活性成分经常与药学上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，组合物可含有少量辅助物质，诸如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物的有效性的其他试剂。

试剂盒

还提供了包含本文所述的任何接头和/或用于进行任何以上方法的试剂盒。试剂盒通常含有如本文所述的接头序列(或编码如本文所述的接头的多核苷酸)。试剂盒可单独提供接头，或者可提供可容易地将所选DNA结合结构域和/或核酸酶插入的载体。试剂盒还可含有细胞、用于转化细胞的缓冲液、用于细胞的培养基和/或用于进行测定的缓冲液。通常，试剂盒还含有包括任何材料诸如说明书、包装或广告传单的标签，所述标签附接到或以其他方式伴随试剂盒的其他组件。

应用

所公开的接头有利地用于与工程化DNA结合结构域以及切割结构域连接，以形成用于切割DNA的核酸酶。当用于切割的核酸酶对的靶位点具有可变间隔，例如靶位点不相隔5或6个碱基对(例如，相隔7、8、9个或更多个碱基对)时，如本文所述的接头允许切割DNA。切割可在细胞染色质中的目标区域(例如，在基因组，例如在突变或野生型基因中的所需或预定位点)处；以用同源的不相同序列替换基因组序列(例如，细胞染色质中的目标区域)(即靶向重组)；以通过切割基因组中的一个或多个位点处的DNA来缺失基因组序列，然后通过非同源末端连接(NHEJ)连接所述切割位点；以筛选促进同源重组的细胞因子；和/或以用突变序列替换野生型序列，或者将一个等位基因转换成不同的等位基因。此类方法详细描述于例如美国专利号7,888,121中，所述专利以引用方式整体并入本文。

因此，所公开的接头可在用于需要特异性靶向切割和/或用同源的不相同序列替换任何基因组序列的任何方法的任何核酸酶中使用。例如，突变基因组序列可被其野生型对应物替换，从而提供用于治疗例如遗传疾病(genetic disease)、遗传性病症(inheriteddisorder)/癌症和自身免疫疾病的方法。以类似的方式，基因的一个等位基因可由不同的等位基因使用本文公开的靶向重组方法来替换。实际上，以任何方式依赖于特定基因组序列的任何病理可使用本文公开的方法和组合物来校正或缓解。

示例性遗传疾病包括但不限于：软骨发育不全、全色盲、酸性麦芽糖酶缺乏症、腺苷脱氨酶缺乏症(OMIM No.102700)、肾上腺脑白质营养不良、艾卡尔迪综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、α地中海贫血、阿尔茨海默氏病(Alsheimer’s disease)、雄激素不敏感综合征、阿佩尔综合征、致心律失常性右心室发育不良、共济失调毛细血管扩张(ataxiatelangictasia)、巴斯综合征、β-地中海贫血、蓝橡皮疱痣综合征、卡纳万病、慢性肉芽肿病(CGD)、猫叫综合症、囊性纤维化、德尔肯氏病、外胚层发育不良、范科尼贫血、进行性骨化性纤维发育不良症(fibrodysplasia ossificans progressive)、脆性X综合征、半乳糖血症(galactosemis)、高雪氏病、全身性神经节苷脂贮积症(例如，GM1)、血色素沉着症、β-珠蛋白第6位密码子血红蛋白C突变(hemoglobin C mutation in the 6th codon of beta-globin，HbC)、血友病、亨廷顿氏病、贺勒综合征、低磷酸酯脢症、克氏综合征、克拉伯病、兰格-吉戴恩综合征(Langer-Giedion Syndrome)、白细胞黏附缺乏症(LAD，OMIMNo.116920)、脑白质营养不良、长QT综合征、马方综合征、莫比乌斯综合征、粘多糖贮积症(MPS)、指甲髌骨综合征、肾源性尿崩症、神经纤维瘤、尼曼-匹克病(Neimann-Pickdisease)、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、帕金森氏病、紫质症、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、早衰症、普罗特斯综合征(Proteus syndrome)、成视网膜细胞瘤、雷特综合征(Rett syndrome)、鲁宾斯坦-泰必综合征(Rubinstein-Taybisyndrome)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)、严重联合免疫缺陷(SCID)、舒瓦克曼综合征(Shwachman syndrome)、镰状细胞病(镰状细胞贫血)、史密斯-马吉利综合征(Smith-Magenis syndrome)、史蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、血小板减少伴桡骨缺失(TAR)综合征(Thrombocytopenia Absent Radius(TAR)syndrome)、特雷彻柯林斯综合征(Treacher Collins syndrome)、三体性、结节性硬化症、特纳氏综合征(Turner's syndrome)、尿素循环障碍、冯希普尔-林道综合征(vonHippel-Landau disease)、瓦登伯格综合征(Waardenburg syndrome)、威廉姆斯综合征(Williams syndrome)、威尔逊氏病(Wilson's disease)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、X连锁淋巴组织增生综合征(XLP，OMIM No.308240)以及X连锁SCID。

可由靶向DNA切割和/或同源重组治疗的另外示例性疾病包括获得性免疫缺陷、溶酶体贮积症(例如，高雪氏病、GM1、法布里病和泰-萨二氏病)、粘多糖病(例如，亨特氏病、贺勒氏病)、血红蛋白病(例如，镰状细胞疾病、HbC、α-地中海贫血、β-地中海贫血)和血友病。

感染或整合的病毒基因组的靶向切割可用于治疗宿主中的病毒感染。另外，编码病毒受体的基因的靶向切割可用于阻断此类受体的表达，从而防止在宿主生物体中的病毒感染和/或病毒传播。编码病毒受体(例如，HIV的CCR5和CXCR4受体)的基因的靶向诱变可用于使受体不能结合病毒，从而防止新的感染并阻断现有感染的传播。参见国际专利公布WO2007/139982。可靶向的病毒或病毒受体的非限制性实例包括单纯疱疹病毒(HSV)，诸如HSV-1和HSV-2、水痘带状疱疹病毒(VZV)、埃-巴二氏(EBV)和巨细胞病毒(CMV)、HHV6以及HHV7。肝炎病毒家族包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)。可靶向其他病毒或其受体，包括但不限于小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒科；披膜病毒科(例如，风疹病毒、登革热病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠孤病毒科；双核糖核酸病毒科；弹状病毒科(例如，狂犬病病毒等)；丝状病毒科；副粘病毒科(例如，腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)；正粘病毒科(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒等)；本扬病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(Retroviradae)；慢病毒属(例如，HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也称为HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等)HIV-II)；猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒以及蜱传脑炎病毒。对于这些和其他病毒的描述，参见，例如Virology,第3版(W.K.Joklik编1988)；Fundamental Virology,第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe编1991)。HIV的受体例如包括CCR-5和CXCR-4。

含有所公开的接头的核酸酶也可用于失活(部分或完全)一种或多种基因组序列。失活可例如通过以下来实现：通过单个切割现象、通过切割后非同源末端连接、通过在两个位点切割后连接以便缺失两个切割位点之间的序列、通过将错义或无义密码子靶向重组至编码区、通过将不相关序列(即，“填充片段”序列)靶向重组至基因或它的调控区以便中断基因或调控区，或通过将拼接受体序列靶向重组至内含子以引起转录错拼接。

核酸酶介导的内源基因的失活(例如，敲除)可用于例如产生参与凋亡或蛋白质生产(例如，翻译后修饰，诸如岩藻糖基化)的基因缺陷的细胞系。ZFN介导的失活也可用于产生转基因生物体(例如，植物、啮齿动物和兔)。

另外，因为核酸酶似乎对两个成对半位点之间的DNA序列没有特异性，所以可以设计具有如本文所述的接头的核酸酶来切割DNA，使得所得单链突出端具有任何所需序列。特别地，可设计如本文所述的接头以影响这些单链突出端相对于起始序列的大小和位置。因此，当掺入核酸酶对中的一个或多个核酸酶中时，如本文所述的接头可在切割后产生更均匀的末端。因此，本文所述的接头还可用于更有效地克隆用核酸酶切割的DNA，这广泛适用于生物技术和基础科学的许多领域。

因此，本文描述的接头提供用于改善基因修饰应用中的核酸酶介导的切割的广泛效用。本文所述的接头可通过定点诱变或亚克隆容易地掺入任何现有的核酸酶中，以用于标准克隆的许多应用、构建用于合成生物学的大型基因组、大序列的新型RFLP分析或甚至允许涉及极大的DNA序列的新类型克隆。具有刚性接头的核酸酶的潜在性质还可能是诸如DNA计算的应用中的理想选择。

以下实施例涉及本公开的示例性实施方案，其中核酸酶包含一个或多个ZFN。应当理解，这仅用于例证的目的，并且可使用其他DNA结合结构域，例如TAL-效应物DNA结合结构域、sgRNA(CRISPR/Cas核酸酶系统)等。还可使用其他核酸酶，包括具有工程化DNA结合结构域和/或天然存在的工程化归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)DNA结合结构域和异源切割结构域的融合体的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)，以及使用工程化单指导RNA的核酸酶系统，诸如TtAgo和CRISPR/Cas。

实施例

实施例1：接头的选择

从如20150064789中所述的细菌选择系统中选择接头。将4-22个氨基酸的完全随机化接头文库克隆在ZFN二聚体中的一个ZFN的N端FokI结构域与C端ZFP结合结构域之间(图2)。对在两个DNA结合结构域(ZFN)结合位点之间具有6、7、8、9、10或11个碱基对间隔的靶标进行选择，其中结合位点处于相同DNA链上。

为了选择，用编码ZFN的质粒(由阿拉伯糖诱导型启动子驱动的ZFN表达)和从T7启动子表达细菌ccdB毒素并包括ZFN靶位点的质粒(pTox)转化细菌。此系统有能力查询具有约10⁸的复杂性和高严格性选项(存活所需的>100个切割事件)的极大接头文库。

表达的ZFN切割pTox导致pTox降解；然后开启ccdB毒素以进行细胞杀伤；扩增存活者(具有ZFN切割的pTox)并将编码接头的基因重新克隆到新质粒中以进行下一个循环。在4、6和9轮选择后对接头进行测序。对所选接头的分析显示出与结合位点之间的间隔区长度相关的长度趋势。所选接头序列示于图4-8和11中。

实施例2：体内活性

然后筛选接头的体内活性。使用所选接头制备靶向CCR5和AAVS1靶位点(但在相同DNA链上)的锌指核酸酶构建体，所述所选接头将切割结构域(野生型或工程化FokI)融合至美国专利号7,951,925(CCR5)和8,110,379(AAVS1)中所公开的锌指蛋白DNA结合结构域。

由于在人类基因组中未发现所选架构，因此将K562细胞工程化以具有在AAVS1基因座处具有指定间隙间隔的头对尾CCR5靶位点。用AAVS1靶位点，以头对尾构型在CCR5基因座处使用来自头对尾CCR5筛选的表现最佳的接头来工程化第二组细胞系。将所选接头作为选择用于的间隙间隔上的ZFN来测试。

如图9和10所示，鉴定了与示例性CCR5和AAVS1基因座处的尾对尾对照相比显示相似或更好的活性的许多接头。

数据表明，当靶位点在相同链上时(头对尾构型)，包含所述接头的核酸酶为活性的。

实施例3：便携性研究

从前两个筛选中选择6个和7个碱基对间隔(如图11所示)中的每一个的前8个接头以进行进一步测试。此便携性研究的实验设计示于图12中。针对三种以下架构中的每一种设计CTLA4基因的十种ZFN对：1)尾对尾；2)具有6个碱基对间隔的头对尾；以及3)具有7个碱基对间隔的尾对尾。对于头对尾架构，用每个间隔的前8个接头中的每一个测试10个ZFN对的组。对于7个碱基对间隔，恒定ZFN含有标准(L0)或延伸接头(L7c5)。还包括选择用于8个碱基对间隔的另外2种接头。在K562细胞中进行转染。

图13和14显示了在恒定ZFN中使用标准接头(L0)的便携性研究中每对的NHEJ活性。将10个ZFN对列在左侧，且将8种接头列在顶部。下面为10个尾对尾ZFN对。如图所示，6个和7个碱基对间隔的头对尾ZFN的最佳接头的平均活性高于尾对尾架构的平均值。

图15示出来自图13和14的头尾构型的6个ZFN的NHEJ活性的比较。在此处，FokI结构域的极性在每对中的两个ZFN之间切换。这些结果显示，所选接头能够在专性异源二聚体FokI极性方面实现高活性ZFN。

图16和17示出AAVS1内含子1的设计的ZFN的NHEJ活性，所述NHEJ活性比较6个(N6a、N6b、N6c)和7个(N7a、N7b、N7c)碱基对间隔中的每一个的前3种接头。图16示出靶向AAVS1基因的内含子内的超敏感位点的ZFN，而图17示出靶向AAVS1基因的不包括过敏性位点的所有内含子1的ZFN。针对以下架构中的每一种设计十九种ZFN对：1)尾对尾架构；2)具有6个碱基对间隔的头对尾架构；以及3)具有7个碱基对间隔的头对尾架构。数据显示，所述接头使ZFN具有在多个基因和设计中高度活性的头对尾架构。

实施例4：头对头架构

然后选择实施例3中鉴定的6个和7个碱基对间隔中的每一个的两种最佳接头，以在头对头架构中进行测试(参见，图1C)。针对5、6、7、8或9个碱基对间隔中的每一个设计十一种对。6、7和8个碱基对间隔使用所有四种接头，而5个碱基对间隔仅使用两个最佳的6个碱基对接头，并且9个碱基对间隔仅使用两个最佳的7个碱基对接头。

如图18所示，在所有测试接头的情况下实现了7、8和9个碱基对间隔处的高水平基因修饰。

因此，当掺入设计成以与标准(例如，尾对尾架构)反向的架构结合相同DNA链上的靶位点(例如，头对尾构型)或相对DNA位上的靶位点(例如，头对头架构)的核酸酶中时，本文所述的接头显示出高活性。

实施例5：具有扩展间隔的尾对尾架构

与使用5至6个碱基对间隔的常规ZFN相比，还对具有7、8或9个碱基对间隔的尾对尾架构的ZFN进行选择。所选ZFN的设置示于图19A中。对于两种ZFN含有相同所选接头的情况(图19A顶部)，此架构被称为对称尾对尾。使用具有接头文库和同源二聚体靶位点的单个ZFN选择此架构。对于一种ZFN含有所选接头而另一种ZFN含有L0接头(即LRGSQLVKS，SEQ IDNO:283)的情况，此架构被称为不对称尾对尾。使用具有L0接头的恒定ZFN和在异源二聚体靶位点上含有接头文库的一种ZFN来选择此架构。如实施例1和美国公布号20150064789中进行选择。

图19B示出在体内测试的每种架构构型和间隔的示例性接头。将K562细胞工程化具有在CCR5基因座处具有指定间隔的CCR5靶位点。示出使用CCR5ZFN的这些构型中的每一种的表现最佳的接头。表中还示出每种细胞系的阳性对照AAVS1ZFN。数据显示，在大于标准间隔处使用不对称或对称尾对尾构型的ZFN以及典型的尾对尾ZFN均有作用。

使用来自图19B的示例性接头以在便携性研究中进行进一步测试。针对以下架构的每一种设计八种ZFN对：1)具有5个或6个碱基对间隔的尾对尾(用于比较)；2)具有7个碱基对间隔的尾对尾；3)具有8个碱基对间隔的尾对尾；以及4)具有9个碱基对间隔的尾对尾。对于7、8和9个碱基对间隔，将示例性接头组克隆到所述对中的一个ZFN中并在体内测试(以与实施例3类似的方式)。所有ZFN均显示为活动的。

本文提到的所有专利、专利申请和公布特此以引用方式整体并入。

虽然出于清楚理解的目的，已通过说明和实施例详细地提供了公开内容，但是将为本领域技术人员所显而易见的是，可在没有背离本公开精神或范围的情况下实施各种变化和修改。因此，前面的描述和实施例不应理解为具有限制性。

Claims

1.一种融合分子，其包含DNA结合结构域、野生型或工程化切割结构域以及所述DNA结合结构域与所述切割结构域之间的氨基酸接头，其中所述接头包含如SEQ ID NO:6-281中任一种所示的序列。

2.根据权利要求1所述的融合分子，其中所述DNA结合结构域包含锌指蛋白、TAL效应物结构域或单指导RNA(sgRNA)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的融合分子，其中所述接头在所述DNA结合结构域的N端与所述切割结构域的C端之间延伸。

4.一种二聚体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的第一融合分子以及包含第二DNA结合结构域和第二野生型或工程化切割结构域的第二融合分子。

5.根据权利要求4所述的二聚体，其中所述第二融合分子还包含所述DNA结合结构域与所述切割结构域之间的接头，其中所述接头包含如SEQ ID NO:6-281中任一种所示的序列。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的二聚体，其中所述DNA结合结构域结合双链靶DNA中的相对或相同的DNA链。

7.据权利要求4至6中任一项所述的二聚体，其中所述二聚体在靶双链DNA中进行双链或单链切割。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的二聚体，其中所述第一融合分子的DNA结合结构域和所述第二融合分子的DNA结合结构域结合由6至11个碱基对隔开的靶位点。

9.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的融合分子或根据权利要求4至7中任一项所述的二聚体。

10.一种分离的细胞，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的一种或多种融合分子或根据权利要求4至7中任一项所述的二聚体。

11.一种修饰细胞中的细胞染色质的方法，所述方法包括：

用根据权利要求4至7中任一项所述的二聚体切割所述细胞染色质，使得修饰所述细胞染色质，其中使用一种或多种多核苷酸将所述二聚体引入至所述细胞中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述修饰包括将插入和/或缺失引入至所述细胞染色质中。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述修饰包括整合供体序列。

14.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的融合分子。

15.根据权利要求1至3中任一项所述的融合分子或根据权利要求4至7中任一项所述的二聚体，其用于在治疗人或动物受试者的方法中使用，其中所述方法包括将所述融合分子或所述二聚体引入至所述受试者的细胞中，其中所述融合分子或所述二聚体切割所述细胞的内源基因座，使得修饰所述内源基因座。