CN109055303A - 一种皮肤组织的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种皮肤组织的构建方法，包括以下步骤：成纤维细胞种在三维流式生物反应器的支架内，支架内加入上述的优化的Green培养液；在支架周围加入RPMI1640培养液，培养90‑110h，在所述支架表面加入角质形成细胞，培养；形成气液交界面，定期更换培养液，继续培养21±1天即可。本发明通过三维流式生物反应器将成纤维细胞和角质形成细胞共同立体培养，得到符合需求的皮肤组织，该组织可用于皮肤的移植。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种皮肤组织的构建方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官。大面积皮肤缺失的主要原因是烧伤和烫伤。据1952年统计调查，在15-44岁人群中，当体表总面积的60％以上皮肤损失，患者死亡率为100％(Bulland Fischer，1954)；但该死亡率在2003年降到41.4％(Chua et al 2003)。死亡率降低的主要原因是治疗技术的提高。目前治疗皮肤大面积缺失的治疗主要是自体游离皮片移植和人工合成皮肤移植。
人工合成皮肤可以及时的救助患者，挽救生命。而组织工程皮肤细胞相容性高，具有更明显的优势，也更适合患者。但价格昂贵是患者无法接受的，特别是在中国。每次大面积皮肤移植的(所需费用在50万美元以上)，限制了组织工程皮肤在国内的开展与应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤组织的构建方法，能在较低价格的基础上培养出面积较大的全层皮肤，该皮肤组织同时具有较好的生物相容性，满足患者的需求。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种优化的Green培养液，DMEM培养基和Ham’s F12营养液按体积比为3±0.2：1组成的混合液中加入以下组分：以所述混合液的体积计，EGF 10±1ng/ml，氢化可的松0.4±0.05μg/ml，腺嘌呤0.18±0.02mM，胰岛素5±0.5μg/ml，转铁蛋白5±0.5μg/ml，谷氨酰胺2±0.2mM，碘甲状腺原氨酸0.2±0.05μM,FCS以及抗生素，所述FCS添加的体积百分数为所述混合液体积的10％±1％。
本发明提供的优化的Green培养液，涉及角质形成细胞和皮肤组织的培育过程，为角质形成细胞和皮肤组织的培育提供良好的基础。
各组分的范围均是可能在实验过程中涉及的误差范围，因此，各组分在该范围内均在本发明的保护范围内。
Green培养液中添加抗生素主要是防止细菌对培养基的污染，根据所涉及的细菌可选用添加不同的抗生素。
进一步地，所述抗生素包括两性霉素B、青霉素、链霉素中的任一种或多种。
进一步地，以所述混合液的体积计，各抗生素的添加量为：两性霉素B0.625±0.05μg/ml，青霉素100±5U/ml，链霉素100±5μg/ml。
本发明还提供了一种角质形成细胞培养方法，包括以下步骤：
角化细胞重悬于上述的优化的Green培养液中，加入辅助3T3细胞，培养；
7-8小时后更换KSFM培养基，加入EGF 10±1ng/ml；
每3天更换培养液，PBS清洗，培养得到所述角质形成细胞。
KSFM培养基为(Keratinocyte Serum-free Growth medium的缩写，是一种市售培养基。
进一步地，所述角化细胞与所述3T3细胞的个数比例为1:0.8-1.2。
进一步地，所述角化细胞由表皮组织消化分离得到。
进一步地，所述表皮组织由大腿皮肤分离得到，优选为大腿内侧皮肤。
进一步地，所述培养的时间为10-15天，细胞达70％-90％汇合，得到所述角质形成细胞。
进一步地，所述细胞达70％-90％汇合后，还包括：稀释细胞，继续传代培养，得到所述角质形成细胞。
即本发明培养得到的角质形成细胞可通过传代培养，得到更多的角质形成细胞，以满足实际的数量需求。
本发明所用的材料可取自自体组织，如大腿皮肤，特别是大腿内侧皮肤，所取的皮肤经酶消化如可按以下步骤操作：
无菌条件下，取大腿内侧皮肤组织，置于含有10％新生小牛血清(FBS)及双抗(100IU/ml青霉素100μg/ml链霉素)的DMEM中，4℃保存。
皮肤组织剪切，用含有50U/ml青霉素、50g/ml链霉素和50g/ml庆大霉素的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中清洗数次。
将清洗后的组织浸泡在含有双抗剂(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和胰蛋白酶消化液的PBS混合液，保持温度4℃，放置过夜。
将消化后的皮肤倒入培养皿中，用镊子将表皮和真皮分离，分别得到表皮组织和真皮组织。
分离得到的表皮组织经酶消化后，得到单细胞悬液，然后分离得到角化细胞，得到的角化细胞经上述的方法培养得到角质形成细胞。
本发明还提供了一种成纤维细胞的培养方法，包括以下步骤：
真皮组织采用胶原酶消化，经分离得到成纤维细胞单细胞悬液；
所述成纤维细胞单细胞悬液加入含有胎牛血清和氢化可的松的的DMEM培养液中，以所述DMEM培养液的体积计，所述胎牛血清的添加体积为10％±1％，所述氢化可的松的0.4μg/ml；
培养，24-48小时后第一次培养液更换，然后每2-3天更换一次培养液，至85％-90％汇合后，得到所述成纤维细胞。
本发明提供的成纤维细胞的培养方法，经过培养，得到数量更多的成纤维细胞，该培养为原代培养，为了得到更多的成纤维细胞可以对原代培养的成纤维细胞进行传代培养。
其中，成纤维细胞可采用以下步骤制得：
上述制得的真皮组织，用PBS清洗3次，切成很小的碎片，将碎片转移到含有双抗剂和胶原酶II型(200IU/ml)的离心管中酶解，经过滤得到成纤维细胞单细胞悬液。
进一步地，所述培养为：在37±2℃和5％CO2下培养细胞。
进一步地，所述真皮组织由大腿皮肤分离得到，优选为大腿内侧皮肤。
进一步地，所述真皮组织与上述的表皮组织来源于同一块皮肤。
进一步地，得到的所述成纤维细胞还包括传代培养的步骤，得到更多所述成纤维细胞。传代培养的培养基以及培养条件同原代培养。
如按照以下步骤操作：
当成纤维细胞达到85％-90％汇合，移除培养液，PBS清洗，加入胰蛋白酶消化液，消化；
终止消化后用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，离心，弃上清液，传代培养，在37℃和5％CO2下培养细胞，24-48小时后第一次培养液更换，然后每2-3天更换一次。
85％-90％汇合后，细胞备用，或立刻冷冻于-150℃液氮存储罐中。
通过上述培养，得到更多的成纤维细胞。
本发明还提供了一种皮肤组织的构建方法，包括以下步骤：
成纤维细胞种在三维流式生物反应器的支架内，支架内加入上述的优化的Green培养液；
在支架周围加入RPMI1640培养液，培养90-110h，在所述支架表面加入角质形成细胞，培养；
形成气液交界面，定期更换培养液，继续培养21±1天即可。
本发明通过三维流式生物反应器将成纤维细胞和角质形成细胞共同立体培养，得到符合需求的皮肤组织，该组织可用于皮肤的移植。
本发明所用的三维流式生物反应器来自德国麦德克斯生物技术有限公司研发的3维流式生物反应器，更好的模拟皮肤细胞的生存环境，更方便的控制皮肤细胞的生存条件，同时利用生物载体材料即支架为生物支架，采用自体细胞，免除了排斥反应的隐患，培育出和人皮肤在生物特性、物理机械特性等同的全层皮肤等效物。
进一步地，所述成纤维细胞在所述支架内的密度为5×105/cm2。
进一步地，所述成纤维细胞采用上述方法制得的成纤维细胞。
进一步地，所述角质形成细胞的加入量为1×106cells/ml。
进一步地，所述角质形成细胞采用上述方法制得的角质形成细胞。
进一步地，所述成纤维细胞和所述角质形成细胞来源于同一块皮肤组织，经分离得到。可选自于自体皮肤组织，优选为腿部内侧皮肤。
进一步地，皮肤组织的构建方法中培养的条件为37±1℃，5％CO2，培养过程中，每2-3天更换一次培养液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种优化的Green培养液，用于制备角质形成细胞以及皮肤组织的培育过程中，为两者的制备提供良好的生长和分化需求。
(2)本发明提供了角质形成细胞培养方法，由皮肤组织分离得到的角化细胞分化而成，可根据实际需求对培养得到的角质形成细胞进行传代培养。
(3)本发明提供的成纤维细胞的培养方法，由皮肤真皮组织分离得到，可根据实际需求对培养得到的成纤维细胞进行传代培养。
(4)本发明提供的皮肤组织的构建方法，角质形成细胞和成纤维细胞放入三维流式生物反应器中经培养得到皮肤组织，可用于皮肤组织移植。
(5)本发明提供的皮肤组织的生产成本低，生物相容性佳，无排斥反应，大幅降低皮肤组织移植的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例2中三维培养过程中细胞和支架的电镜图；
图2为本发明实施例2中培养得到的皮肤组织的外观图；
图3为本发明实施例2中培养得到的皮肤组织的电镜图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种角质形成细胞和成纤维细胞，采用以下方法制备：
配置以下培养基：
优化的Green培养液：DMEM培养基和Ham’s F12营养液按体积比为3：1混合，然后以两者混合后的体积计，加入以下组分：加入体积百分数为10％的FCS，EGF 10ng/ml，氢化可的松0.4μg/ml，腺嘌呤0.18mM，胰岛素5μg/ml，转铁蛋白5μg/ml，谷氨酰胺2mM，碘甲状腺原氨酸0.2μM,两性霉素B 0.625μg/ml,青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
1.皮肤活检取样
1.1无菌条件下，取大腿内侧皮肤组织1.5cm2大小，置于含有10％新生小牛血清(FBS)及双抗(100IU/ml青霉素100ug/ml链霉素)的DMEM中，4℃保存。
1.2皮肤组织剪成三块1x5mm大小，用含有50U/ml青霉素、50g/ml链霉素和50g/ml庆大霉素的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中清洗10次。
1.3浸泡在15ml含有3ml双抗剂(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和4ml胰蛋白酶消化液的PBS混合液中，保持温度4℃，放置过夜。
1.4将消化后的皮肤倒入培养皿中，用眼科镊子将表皮和真皮分离。
2.角质形成细胞培养
2.1将分离的表皮，用PBS清洗3次，然后放入锥形管中，加入4ml胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶和0.02％EDTA混合液)，37℃，5％CO2,培养30min，定时轻晃；
用20％小牛血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，过200目筛网以去除剩余残渣，收集滤液，离心200g 5分钟，去除消化液，用PBS清洗3次，得到keratinocyte细胞。
2.2轻轻的吸出keratinocyte细胞，重悬于5ml优化的Green培养液中，37℃，5％CO2。取得到的keratinocyte细胞8x105个，等个数比例加入辅助8x105个3T3细胞。
2.3 48小时后更换新鲜培养液KSFM，加入EGF 10ng/ml。
2.4每3天更换培养液，PBS清洗。
2.5细胞培养10-15天，细胞可达70-90％汇合，得到角质形成细胞，可稀释细胞，继续传代培养，也可以立刻冷冻于-150℃液氮存储罐中。
3.皮肤真皮层培养
3.1自体皮肤成纤维细胞原代培养
3.1.1分离真皮组织和表皮组织后，真皮组织用PBS清洗3次，使用新的无菌手术刀将真皮切成很小的碎片，将碎片转移到含有0.5ml双抗剂和10ml胶原酶II型(200IU/ml)的50ml离心管中。
3.1.3放置，37℃，2小时，适当摇动。
3.1.4加入2ml PBS，反复吹打，然后通过70μm细胞过滤器，获得成纤维细胞单细胞悬液。
3.1.5单细胞悬液，500G离心5min，弃上清液，重悬于2ml含10％胎牛血清和0.4μg/ml氢化可的松的DMEM培养液。
3.1.6以2x105cells/cm2密度接种细胞。
3.1.7在37℃和5％CO2下培养细胞，24-48小时后第一次培养液更换，然后每2-3天更换一次。
3.2成纤维细胞传代培养
3.2.1当成纤维细胞达到90％汇合，移除培养液，2ml PBS清洗3次，几分钟后移除PBS，加入1ml胰蛋白酶消化液，37℃，培养3-5分钟。
3.2.2用20％小牛血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，225G离心5min，弃上清液，种于2ml含10％胎牛血清，0.4μg/ml氢化可的松的DMEM培养液，1000cell/cm2。
3.2.3标记新的培养皿，细胞系，时间及传代数，在37℃和5％CO2下培养细胞，24-48小时后第一次培养液更换，然后每2-3天更换一次。
3.2.4 90％汇合后，得到的成纤维细胞备用，或立刻冷冻于-150℃液氮存储罐中。
实施例2
一种皮肤组织的构建方法，包括以下步骤：
配置以下培养基：
优化的Green培养液：DMEM培养基和Ham’s F12营养液按体积比为3：1混合，然后以两者混合后的体积计，加入以下组分：加入体积百分数为10％的FCS，EGF 10ng/ml，氢化可的松0.4μg/ml，腺嘌呤0.18mM，胰岛素5μg/ml，转铁蛋白5μg/ml，谷氨酰胺2mM，碘甲状腺原氨酸0.2μM,两性霉素B 0.625μg/ml,青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
采用实施例1制得的成纤维细胞和角质形成细胞。
把成纤维细胞种在支架内，密度5x105/cm2，支架内加入1ml优化的Green培养液。
在支架周围加入2ml RPMI1640培养液。
37℃，5％CO2培养3天，每2天换1次培养液。
第四天，在支架表面种角质形成细胞(1x106cells/ml),24小时后粘附。
在3-5天，形成气液交界面。具体见图1所示。图1中，图1A为800倍扫描电子显微镜图，图1B为3000倍扫描电子显微镜图，图1C为3000倍扫描电子显微镜图，图1D为6000倍扫描电子显微镜图，图1E为800倍扫描电子显微镜图，图1F为1600倍扫描电子显微镜图，图1B和1F中K表示角质形成细胞或成纤维细胞，F表示支架。从图1A和1B可以看出，成纤维细胞和角质形成细胞很好有序的粘附在三维支架结构上；图1C和1D可以看出，角质细胞和成纤维细胞很好的黏附在三维支架结构上，并互相作用刺激生长，在支架上层，形成角质细胞层；图1E和1F可以看出，每种细胞都很好的和支架周围细胞互相融合促进。
37℃，5％CO2，继续培养，每3天换1次培养液，自形成气液交界面计算，继续培养21天即可得到可移植用的皮肤组织。
得到的皮肤组织的外观图如图2所示，电镜图如图3所示。
从图3可以看出，本发明制得的皮肤组织具有正常组织的结构，经检测符合相关皮肤组织的规定。
其中，设备为德国麦德克斯生物科技有限公司的三维流式生物反应器。
本发明提供的一种皮肤组织的构建方法，得到的皮肤组织为人自身皮肤组织的等效物，均具有良好的皮肤特性以及稳定的生化特性，并且由于原料取自人体自身，具有良好的生物相容性，无排斥反应，并且整个生产过程所需的成本较低。
经大量实验验证，本发明提供的皮肤组织均成功应用于皮肤移植手术。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种优化的Green培养液，其特征在于，DMEM培养基和Ham’s F12营养液按体积比为3±0.2：1组成的混合液中加入以下组分：以所述混合液的体积计，EGF 10±1ng/ml，氢化可的松0.4±0.05μg/ml，腺嘌呤0.18±0.02mM，胰岛素5±0.5μg/ml，转铁蛋白5±0.5μg/ml，谷氨酰胺2±0.2mM，碘甲状腺原氨酸0.2±0.05μM,FCS以及抗生素，所述FCS添加的体积百分数为所述混合液体积的10％±1％。
2.根据权利要求1所述的优化的Green培养液，其特征在于，所述抗生素包括两性霉素B、青霉素、链霉素中的任一种或多种；
进一步地，以所述混合液的体积计，各抗生素的添加量为：两性霉素B0.625±0.05μg/ml，青霉素100±5U/ml，链霉素100±5μg/ml。
3.一种角质形成细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
角化细胞重悬于权利要求1-2任一项所述的优化的Green培养液中，加入辅助3T3细胞，培养；
7-8小时后更换KSFM培养基，加入EGF 10±1ng/ml；
每3天更换培养液，PBS清洗，培养得到所述角质形成细胞。
4.根据权利要求3所述的角质形成细胞培养方法，其特征在于，所述角化细胞与所述3T3细胞的个数比例为1:0.8-1.2；
进一步地，所述角化细胞由表皮组织消化分离得到；
进一步地，所述表皮组织由大腿皮肤分离得到，优选为大腿内侧皮肤；
进一步地，所述培养的时间为10-15天，细胞达70％-90％汇合，得到所述角质形成细胞；
进一步地，所述细胞达70％-90％汇合后，还包括：稀释细胞，继续传代培养，得到所述角质形成细胞。
5.一种成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
真皮组织采用胶原酶消化，经分离得到成纤维细胞单细胞悬液；
所述成纤维细胞单细胞悬液加入含有胎牛血清和氢化可的松的的DMEM培养液中，以所述DMEM培养液的体积计，所述胎牛血清的添加体积为10％±1％，所述氢化可的松的0.4μg/ml；
培养，24-48小时后第一次培养液更换，然后每2-3天更换一次培养液，至85％-90％汇合后，得到所述成纤维细胞。
6.根据权利要求5所述的成纤维细胞的培养方法，其特征在于，所述培养为：在37±2℃和5％CO2下培养细胞；
进一步地，所述真皮组织由大腿皮肤分离得到，优选为大腿内侧皮肤；
进一步地，所述真皮组织与权利要求4所述的表皮组织来源于同一块皮肤；
进一步地，得到的所述成纤维细胞还包括传代培养的步骤。
7.一种皮肤组织的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
成纤维细胞种在三维流式生物反应器的支架内，支架内加入权利要求1-2任一项所述的优化的Green培养液；
在支架周围加入RPMI1640培养液，培养90-110h，在所述支架表面加入角质形成细胞，培养；
形成气液交界面，定期更换培养液，继续培养21±1天即可。
8.根据权利要求7所述的皮肤组织的构建方法，其特征在于，所述成纤维细胞在所述支架内的密度为5×105/cm2；
进一步地，所述成纤维细胞采用权利要求5或6所述的成纤维细胞。
9.根据权利要求8所述的皮肤组织的构建方法，其特征在于，所述角质形成细胞的加入量为1×106cells/ml；
进一步地，所述角质形成细胞采用权利要求3或4所述的角质形成细胞。
10.根据权利要求8所述的皮肤组织的构建方法，其特征在于，皮肤组织的构建方法中培养的条件为37±1℃，5％CO2，培养过程中，每2-3天更换一次培养液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181221 |
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