CN109001190A - 基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法 - Google Patents
基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法。该制备方法包括以下步骤：（1）制备显色剂；（2）制备40μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液；（3）制备pH3.0盐酸溶液；（4）制备pH 6.5盐酸溶液；（5）制备0.02 mol/L氢氧化钠溶液；（6）制备0.1 mol/L硼酸溶液；（7）制备比色卡；（8）得出评价试剂；（9）比色卡与评价试剂组成试剂装置。本发明通过制作黄曲霉毒素B1浓度‑颜色关系显色卡，调节溶液pH值等反应条件，与显色卡进行比较，得出吸附剂的吸附率。本发明制作方便、操作简单、成本低廉、适于现场操作。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法。
背景技术
霉菌毒素尤其是黄曲霉毒素对动物饲料的污染非常普遍，从而给动物养殖业带来巨大的经济损失。为减少霉菌毒素对动物的危害，生产实践中往往需要通过各种手段对霉菌毒素加以控制。霉菌毒素吸附剂是一类具有吸附霉菌毒素能力的饲料添加剂，能够在动物消化道内与饲料中的霉菌毒素相结合，从而达到减少动物胃肠道对霉菌毒素吸收，增加霉菌毒素通过粪便排出的目的。其中，对特定霉菌毒素的吸附率是评价霉菌毒素吸附剂质量优劣的重要指标。
目前，霉菌毒素吸附剂吸附率的评价主要有体外法和体内法两种。体外法评价的应用最为广泛，一般用不同pH值的磷酸缓冲液来模拟动物胃液和小肠液，向其中加入一定量的毒素与吸附剂，在37℃左右的温度下震荡一定的时间，使吸附剂与毒素充分接触并发挥吸附作用，然后离心分离吸附剂与溶液，用高效液相色谱仪等仪器测定溶液中毒素的浓度，此时溶液中毒素的含量与吸附剂的吸附率呈反比关系，以此来测定吸附剂对某种霉菌毒素的吸附能力。体内法评价需要进行动物饲喂实验，耗时长，费用高，影响因素多，一般仅用于实用效果的验证，不能得出准确的吸附率。由于霉菌毒素吸附剂主要在养殖场应用，但是现行的体外法评价往往需要用到高效液相色谱仪等仪器设备，只能在大中型企业实验室内完成，无法在生产现场使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了解决现有的评价设备无法在生产现场使用的不足，本发明提供了一种基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，通过按照霉菌毒素吸附剂吸附率评价体系所需的黄曲霉毒素B1浓度及反应的溶液体系，制作黄曲霉毒素B1浓度-颜色关系显色卡，通过调节溶液pH值等反应条件，可利用2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺与溶液中游离黄曲霉毒素B1进行反应，所得产物绿色的深浅直接与显色卡进行比较，即可直接得出吸附剂的吸附率。本发明制作方便、操作简单、成本低廉、适于现场操作。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备0.8～1.2mg/mL的2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液的显色剂；
(2)制备40μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液；
(3)制备pH3.0盐酸溶液；
(4)制备pH 6.5盐酸溶液；
(5)制备0.02mol/L氢氧化钠溶液；
(6)制备0.1mol/L硼酸溶液；
(7)利用显色剂、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B1甲醇溶液、氢氧化钠溶液、制备比色卡；
(8)将黄曲霉毒素B1、pH3.0盐酸溶液、氢氧化钠溶液、硼酸溶液、显色剂进行反应，或将黄曲霉毒素B1、pH 6.5盐酸溶液、氢氧化钠溶液、硼酸溶液、显色剂进行反应得出评价试剂；
(9)比色卡与评价试剂组成试剂装置。
具体地，所述显色剂的制备方法为：取100mg 2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺，用色谱纯甲醇溶液定容至100mL，摇晃使之完全溶解，取100uL于4℃保存。
具体地，所述黄曲霉毒素B1甲醇溶液的制备方法为：取4mg黄曲霉毒素 B1标准品，用色谱纯甲醇溶液定容至100mL，取2mL保存。
具体地，所述pH3.0盐酸溶液的制备方法为：取38％浓盐酸0.0365g，加去离子水，取100mL保存。
具体地，所述pH 6.5盐酸溶液的制备方法为：取所述pH 3.0盐酸溶液0.3162 mL，加去离子水，取100mL保存。
具体地，所述氢氧化钠溶液的制备方法为：取0.8g分析纯氢氧化钠，加去离子，取2mL保存。
具体地，所述硼酸溶液的制备方法为：取6.2g分析纯硼酸，加去离子水，取1mL保存。
具体地，所述比色卡的制备方法为：分别移取10μL浓度为0,1,2,3,4, 5,7.5,10μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液，与490μL pH 9.0的氢氧化钠溶液混合均匀，配制成浓度分别为0,20,40,60,80,100,150,200ng/mL 的黄曲霉毒素B1标准反应液，静置10分钟，再分别加入10μL 1.0mg/mL的 2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液，涡旋混合0.5分钟，静置反应10分钟，此时显示出随黄曲霉毒素B1浓度递增而逐渐加深的绿颜色，即为标准色，将与黄曲霉毒素B1标准反应液浓度对应的颜色制成比色卡，黄曲霉毒素B1浓度0,20, 40,60,80,100,150,200ng/mL反应后显示的颜色分别依次对应的吸附率数值为100％,90％,80％,70％,60％,50％,25％,0％，将此吸附率数值标记在对应的颜色下，即为标准比色卡。
具体地，所述评价试剂的制备方法为：吸取100μL黄曲霉毒素B1标准溶液于50mL旋盖塑料离心管中，加入9.90mL的pH 3.0盐酸溶液或pH 6.5盐酸溶液，于37±1℃震荡孵育1～2小时，静置10分钟，取0.21mL上层溶液于 1.0mL，再向其中加入0.02mol/L氢氧化钠溶液0.21mL后涡旋10秒，静置3～ 10分钟，加入80μL 0.1mol/L硼酸溶液，震荡混匀，再向其中加入10uL显色液后涡旋10秒，静置6～12分钟。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，通过按照霉菌毒素吸附剂吸附率评价体系所需的黄曲霉毒素B1浓度及反应的溶液体系，制作黄曲霉毒素B1浓度-颜色关系显色卡，通过调节溶液pH值等反应条件，可利用2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺与溶液中游离黄曲霉毒素B1进行反应，所得产物绿色的深浅直接与显色卡进行比较，即可直接得出吸附剂的吸附率。本发明制作方便、操作简单、成本低廉、适于现场操作。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的黄曲霉毒素B1显色反应原理图；
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的黄曲霉毒素B1显色反应原理图。
本评价试剂装置包括以下物品：显色剂，标准比色卡，黄曲霉毒素标准溶液，pH3.0盐酸溶液，pH 6.5盐酸溶液，0.02mol/L氢氧化钠溶液，0.1mol/L 硼酸溶液，1.0mL透明旋盖玻璃瓶。
为保证评价操作的顺利进行，还需要一些不包含在本试剂盒内的常规辅助性材料和器具，具体包括：待测吸附剂产品，50mL旋盖塑料离心管，移液器(1～1000μL量程)，水浴锅或恒温振荡器(可设置37±1℃)，涡旋仪。
本发明中使用的化学试剂，如无特殊说明均为分析纯。
显色剂为0.8～1.2mg/mL的2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液，具体可选用1.0mg/mL，配制方法为：精密称量100mg 2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺，用色谱纯甲醇溶液定容至100mL，摇晃使之完全溶解，取100uL于1.0mL棕色橡胶压盖玻璃瓶中4℃保存。
标准比色卡为浓度分别为0,20,40,60,80,100,150,200ng/mL的黄曲霉毒素B1与显色剂反应后显示的由浅至深的绿颜色，制备方法为：分别移取 10μL浓度为0,1,2,3,4,5,7.5,10μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液，与490μL pH 9.0的氢氧化钠溶液在1.0mL透明旋盖玻璃瓶中混合均匀，配制成浓度分别为0,20,40,60,80,100,150,200ng/mL的黄曲霉毒素B1标准反应液，静置10分钟，再分别加入10μL 1.0mg/mL的2,6-二溴苯醌-4- 氯亚胺甲醇溶液，涡旋混合0.5分钟，静置反应10分钟，此时各玻璃瓶中显示出随黄曲霉毒素B1浓度递增而逐渐加深的绿颜色，即为标准色。经进一步专业拍照和颜色保真处理，将与黄曲霉毒素B1标准反应液浓度对应的颜色制成比色卡，黄曲霉毒素B1浓度0,20,40,60,80,100,150,200ng/mL反应后显示的颜色分别依次对应的吸附率数值为100％,90％,80％,70％,60％,50％,25％, 0％，将此吸附率数值标记在对应的颜色下，即为标准比色卡。
黄曲霉毒素标准溶液为40μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液，配制方法为：精密称取4mg黄曲霉毒素B1标准品，用色谱纯甲醇溶液定容至100mL，取2mL 于5.0mL棕色塑料旋盖瓶中保存。本专利中涉及到的其他低浓度黄曲霉毒素B1 标准溶液，均由此10μg/mL黄曲霉毒素B1标准溶液稀释而得。
pH3.0盐酸溶液，配制方法为：量取38％浓盐酸0.0365g，加去离子水定容于1000mL容量瓶中，取100mL于刻度为100mL的塑料瓶中保存。
pH 6.5盐酸溶液，配制方法为：准确量取上述pH 3.0盐酸溶液0.3162mL，加去离子水定容于1000mL容量瓶中，100mL于刻度为100mL的塑料瓶中保存。
0.02mol/L氢氧化钠溶液，配制方法为：称取0.8g分析纯氢氧化钠，加去离子水定容于1000mL容量瓶中，取2mL于刻度为5mL的塑料瓶中保存。
0.1mol/L硼酸溶液，配制方法为：称取6.2g分析纯硼酸，加去离子水定容于1000mL容量瓶中，取1mL于刻度为2mL的塑料瓶中保存。
该评价试剂装置测定霉菌毒素吸附剂对黄曲霉毒素B1的吸附率的方法为：
1、制备实验组和对照组：
实验组：吸取100μL黄曲霉毒素B1标准溶液于50mL旋盖塑料离心管中，加入9.90mL盐酸溶液(pH 3.0盐酸溶液或pH 6.5盐酸溶液)，加入10mg待测霉菌毒素吸附剂，于37±1℃震荡孵育1～2小时(优选为1小时)，静置10 分钟，取0.21mL上层溶液于1.0mL透明旋盖玻璃瓶中，再向其中加入0.02mol/L 氢氧化钠溶液0.21mL，拧紧瓶盖，涡旋10秒，静置3～10分钟(优选为5分钟)，加入80μL 0.1mol/L硼酸溶液，震荡混匀，再向其中加入10uL显色液，拧紧瓶盖，涡旋10秒，静置6～12分钟(优选为10分钟)；
对照组：与所述实验组相比，缺少待测霉菌毒素吸附剂，其余均与所述实验组相同；
2、将经过上述制备方法处理后的对照组溶液颜色与标准比色卡吸附率数值为0％的标准颜色进行对比，如果目测颜色一致或相差不大，则说明本次操作正常，可用于进一步实验组吸附率的测定。
3、将经过上述制备方法处理后的实验组和对照组的反应终溶液的颜色进行对比，空白组颜色显深绿色，实验组溶液颜色无色或较空白组颜色浅，则初步判断所测吸附剂对黄曲霉毒素B1产生了吸附效果。
4、将经过上述制备方法处理后的实验组溶液颜色与标准比色卡的颜色进行比对，颜色最接近的色块对应的吸附率数值即为所测吸附剂的吸附率。
吸附剂吸附率的测定公式如下：
Y＝(1-Ceq/C0)×100％，式中
Y即为所述霉菌毒素吸附剂在所述pH 3.0盐酸溶液或pH 6.5盐酸溶液环境下对所述黄曲霉毒素B1的吸附率；
C0为所述对照组的上清液中所述黄曲霉毒素B1的浓度；
Ceq为所述实验组的上清液中所述黄曲霉毒素B1的浓度。
黄曲霉毒素均具体可为黄曲霉毒素B1；所述霉菌毒素吸附剂均可为蒙脱石类霉菌毒素吸附剂或酵母细胞壁类霉菌毒素吸附剂。
本发明所提供的显色剂，溶剂为水，溶质及浓度为2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液0.8～1.2mg/mL。
本发明所提供的标准显色卡，为浓度分别为0,20,40,60,80,100,150, 200ng/mL的黄曲霉毒素B1在pH 9.0±0.2条件下，与所述显色剂反应所显示的颜色，经吸附率公式换算，成为吸附剂的吸附率数值分别为100％,90％,80％, 70％,60％,50％,25％,0％时对应的颜色。
如附图1所示，本发明利用黄曲霉毒素B1分子包含香豆素结构这一特点，根据香豆素Gibbs显色反应，即香豆素结构与氢氧化钠反应生成香豆素酸，进而在弱碱性条件下与2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺反应显绿色，在反应体系固定的条件下，颜色深浅与黄曲霉毒素B1浓度呈正相关。根据上述原理，首先按照霉菌毒素吸附剂吸附率评价体系所需的黄曲霉毒素B1浓度及反应的溶液体系，制作黄曲霉毒素B1浓度-颜色关系显色卡。在霉菌毒素吸附剂体外评价溶液体系中，没有其他含香豆素结构物质的干扰，通过调节溶液pH值等反应条件，可利用2,6- 二溴苯醌-4-氯亚胺与溶液中游离黄曲霉毒素B1进行反应，所得产物绿色的深浅直接与显色卡进行比较，即可直接得出吸附剂的吸附率。本发明的优点在于制作方便、操作简单、成本低廉、适于现场操作等特点。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种基于比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备0.8~1.2 mg/mL 的2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液的显色剂；
（2）制备40 μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液；
（3）制备pH3.0盐酸溶液；
（4）制备pH 6.5盐酸溶液；
（5）制备0.02 mol/L氢氧化钠溶液；
（6）制备0.1 mol/L硼酸溶液；
（7）利用显色剂、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B1甲醇溶液、氢氧化钠溶液、制备比色卡；
（8）将黄曲霉毒素B1、 pH3.0盐酸溶液、氢氧化钠溶液、硼酸溶液、显色剂进行反应，或将黄曲霉毒素B1、pH 6.5盐酸溶液、氢氧化钠溶液、硼酸溶液、显色剂进行反应得出评价试剂；
（9）比色卡与评价试剂组成试剂装置。
2.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述显色剂的制备方法为：取100 mg 2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺，用色谱纯甲醇溶液定容至100 mL，摇晃使之完全溶解，取100 uL于4℃保存。
3.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1甲醇溶液的制备方法为：取4 mg黄曲霉毒素B1标准品，用色谱纯甲醇溶液定容至100 mL，取2 mL保存。
4.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述pH3.0盐酸溶液的制备方法为：取38%浓盐酸0.0365g，加去离子水，取100 mL保存。
5.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述pH 6.5盐酸溶液的制备方法为：取所述pH 3.0盐酸溶液0.3162 mL，加去离子水，取100 mL保存。
6.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述氢氧化钠溶液的制备方法为：取0.8g分析纯氢氧化钠，加去离子，取2mL保存。
7.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述硼酸溶液的制备方法为：取6.2 g分析纯硼酸，加去离子水，取1 mL保存。
8.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述比色卡的制备方法为：分别移取10 μL浓度为0, 1, 2, 3, 4, 5,7.5, 10 μg/mL的黄曲霉毒素B1甲醇溶液，与490 μL pH 9.0的氢氧化钠溶液混合均匀，配制成浓度分别为0, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准反应液，静置10分钟，再分别加入10 μL 1.0 mg/mL的2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺甲醇溶液，涡旋混合0.5分钟，静置反应10分钟，此时显示出随黄曲霉毒素B1浓度递增而逐渐加深的绿颜色，即为标准色，将与黄曲霉毒素B1标准反应液浓度对应的颜色制成比色卡，黄曲霉毒素B1浓度0, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 ng/mL反应后显示的颜色分别依次对应的吸附率数值为100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 25%, 0%，将此吸附率数值标记在对应的颜色下，即为标准比色卡。
9.根据权利要求1所述的比色卡鉴别的黄曲霉毒素吸附剂现场评价试剂装置的制备方法，其特征在于：所述评价试剂的制备方法为：吸取100 μL黄曲霉毒素B1标准溶液于50 mL旋盖塑料离心管中，加入9.90 mL的pH 3.0盐酸溶液或pH 6.5盐酸溶液，于37±1℃震荡孵育1～2小时，静置10分钟，取0.21 mL上层溶液于1.0 mL，再向其中加入0.02 mol/L氢氧化钠溶液0.21 mL后涡旋10秒，静置3～10分钟，加入80 μL 0.1 mol/L硼酸溶液，震荡混匀，再向其中加入10 uL显色液后涡旋10秒，静置6～12分钟。
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