CN108926579A - 口服液体益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防和/或治疗关节炎的液体制剂，该液体制剂包括活性干酪乳杆菌(L.casei)益生菌株。本发明也涉及活性干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗关节炎的药物的应用；以及一种制备液体益生菌制剂的方法。

Description

口服液体益生菌制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种适用于预防和/或治疗关节炎的液体制剂，具体地是口服液体益生菌制剂，以及活性干酪乳杆菌益生菌株在制备预防和/或治疗关节炎的药物中的应用。本发明也涉及一种制备液体益生菌制剂的方法。

背景技术

类风湿性关节炎(类风关)是临床常见的系统性自身免疫病，以免疫失调为主要特征，发病原因不明，药物治疗效果有限。类风关患者关节致残率高，两年致残率达50％，三年致残率70％以上，且病情反复发作，严重影响患者的生活质量和社会劳动力。基因变异对类风关的发病、发展及预后相关，但并不能完全解释类风关的疾病发病机制和病理变化。环境因素如肠道菌群、吸烟等对类风关发生、发展亦有重要影响。基于该病的复杂性、个体的差异性及高度的致残性，对疾病进行多因素深入剖析及探索发现新的预防性、早期有效的治疗方法尤为重要。

关于菌群与类风关存在密切关系的观点由来已久。早期的类风关患者胃肠道菌群中，Prevotella copri(革兰氏阴性菌Prevotella的其中一个菌种)较健康人明显富集。后续在中国人群中对类风关患者口腔及肠道菌群进行研究，发现存在着多个与类风关密切相关的肠道及口腔的微生物菌种，关联分析证实这些菌群与抗环瓜氨酸抗体(ACPA)及C-反应蛋白(CRP)的表达水平密切相关，且在经过有效的药物治疗后菌群失调得到了一定的逆转(例如张煊等,The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoidarthritis and partly normalized after treatment.Nature Medicine(自然医学)21,895-905,doi:10.1038/nm.3914(2015))。目前已有一些临床研究证实通过服用益生菌等方法调节肠道菌群的组成可在一定程度上缓解类风关的病情。但对目前已发表临床研究进行荟萃分析发现益生菌对类风关的改善作用并不明显，因为临床上对使用哪种益生菌治疗类风关存在很大的疑惑(例如潘胡丹等,益生菌辅助治疗类风湿性关节炎的益处：临床随机对照试验荟萃分析和系统综述.Engineering(工程)3,115-121,doi:10.1016/j.eng.2017.01.006(2017))。益生菌对人类健康的有益作用存在明显的菌株特异性(例如Aktas,B.等,J.L.The Impact of Lactobacillus casei on the Composition of theCecal Microbiota and Innate Immune System Is Strain Specific.PloS one 11,e0156374,doi:10.1371/journal.pone.0156374(2016))。不同的益生菌菌株会通过菌群与宿主的相互作用对宿主产生不同的作用。常作为益生菌的L.casei菌株中即被发现在不同菌株中存在显着的基因差异。菌株与菌株间的巨大的变异性使其调节宿主肠道菌群及宿主免疫系统的能力有很大差别。

干酪乳杆菌01是干酪乳杆菌的其中一种菌株，其能降低患有类风湿的患者中的血清高敏C-反应蛋白(hs-CRP)水平、减轻关节肿胀、降低全身健康(GH)指数和28个关节疾病活动评分(DAS28)(如Alipour,B.等的“一项随机双盲临床试验：干酪乳杆菌补充剂对类风湿性关节炎患者疾病活动性和炎性细胞因子的影响”，国际风湿性疾病杂志17，519-527，doi:10.1111/1756-185X.12333(2014)中所述)。

DAS28被广泛用作类风湿性关节炎的疾病活性和治疗反应的指标。在DAS28中的关节包括(双侧的)：近端指间关节(10个关节)、掌指关节(10)、腕关节(2)、肘关节(2)、肩关节(2)和膝关节(2)。当观察这些关节时，计数接触时触痛(TEN28)和肿胀(SW28)的关节数量。另外，测量红血球沉降率。此外，受影响的人在0到100之间的范围内对前七(7)天的疾病活动进行主观评估，其中0是“无活动”，100是“可能的最高活动”。有了这些参数，DAS28的计算公式如下：

由此可见，迫切需要发明可用于预防、治疗关节炎的方法及制剂，来预防关节炎高危患者其关节炎的发生及治疗关节炎患者的关节破坏。为了能够就临床应用和机制研究方面建立稳定的质量控制，迫切需要研究干酪乳杆菌对类风湿性关节炎的影响，尤其是在菌株方面。因此，本发明的目的之一是提供适用于预防和/或治疗关节炎的液体制剂，以及预防和/或治疗关节炎的方法。

发明内容

本发明的第一个方面涉及一种液体制剂，所述液体制剂包括活性干酪乳杆菌(L.casei)益生菌株。

本发明的第二个方面涉及活性干酪乳杆菌益生菌株在制备預防和/或治疗关节炎的药物中的应用。

本发明的第三个方面涉及一种制备液体益生菌制剂的方法，该方法包括将活性干酪乳杆菌分散于粘稠剂中。

本领域技术人员将会理解，除了具体描述的这些以外，可以对本文所述的发明进行变化和修改。本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包含说明书中单独地或共同地提及或指出的所有步骤和特征，以及任何和所有步骤或特征的组合。通过下面的详细描述和附图，本发明的其它特征和方面将变得显而易见。

附图说明

图1为大鼠在佐剂性关节炎造模后30天的研究过程中平均体重变化情况(每组包括7只大鼠)，“对照组”代表正常大鼠，“模型组”代表造模后患有佐剂性关节炎但没有进行治疗的大鼠，“MTX组”代表患有佐剂性关节炎并进行了甲氨蝶呤(MTX)治疗的大鼠，和“L.case组”代表患有佐剂性关节炎并进行了液体益生菌制剂的口服治疗的大鼠。每个时间点的测量数据采用均值±标准差表示(双因子方差分析，*P<0.05，***P<0.001与模型组比较)。

图2a为L.casei ATCC334对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的作用(每组包括7只大鼠，双因子方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

图2b为L.casei ATCC334对佐剂性关节炎大鼠关节(尤其是后爪)肿胀程度的影响作用(双因子方差分析，每组包括7只大鼠，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

表格1为L.casei ATCC334对佐剂性关节炎大鼠血液中紅血球沉降率(ESR)的作用(每组包括7只大鼠，t检验，###P<0.001与对照组比较,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

图3为表格1结果的图表展示。

图4a至4f为L.casei ATCC334对血浆中炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β，IL-6，IL-17,IFN-γ，IL-2表达的影响(单因子方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

图5a为通过下肢的照片、X射线及Micro-CT照片展现了L.casei ATCC334对骨的骨保护作用。

图5b为大鼠后足的放射学评价指数及基于微计算机断层扫描技术(Micro-CT)分析软件对大鼠跟骨骨密度、骨体积等的分析评价指标。包括骨小梁骨密度(BMD)、骨体积比例(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、孔隙率和骨皮质骨密度(TMD)(单因子方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

图6a为对照组、模型组、“MTX”组和“L.casei”组大鼠膝关节的组织病理图片,其展示了L.casei ATCC334对佐剂性关节炎大鼠膝关节组织病理学改变的保护作用(单因子方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

图6b展示了图6a中的四组大鼠的膝关节病理学指数的变化情况(单因子方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较)。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如在此所使用的，“包含”是指包含以下元素但不排除其他元素。“基本上由...组成”是指该材料由相应的元素以及通常不可避免的杂质例如通常由各自的制备或获得该材料的方法(例如痕量的其他组分或溶剂)产生的副产物和组分组成。在此使用的材料“是”某一元素的表述意味着材料基本上由所述元素组成。如本文所使用的，形式“一”、“一个”和“该”旨在包含单数和复数形式，除非上下文另有明确指示。

本发明提供一种液体制剂，所述液体制剂包括活性干酪乳杆菌(L.casei)益生菌株。干酪乳杆菌是人类肠道与口腔常见的乳杆菌属的一种。能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等，干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、调节人体免疫失调等作用。在一个实施例中，活性干酪乳杆菌益生菌株是L.casei ATCC334。优选地，所述活性干酪乳杆菌益生菌株在所述液体制剂的数目为1*10⁵至1*10¹²CFU/mL、1*10⁷至1*10⁹CFU/mL或1*10⁸至5*10⁸CFU/mL，或具体地2*10⁸CFU/mL。

L.casei ATCC334是干酪乳杆菌的新型菌株，它的基因组最近被揭示出来，基因组大小估计为2.2Mbp。有调查发现，在蒸馏水中的干酪乳杆菌ATCC334(购自Hi Media，未显示基因组测序)能减少由胶原诱导的关节炎(CIA)的炎症性关节损伤(参见Amdekar S.等人，“干酪乳杆菌通过减少促炎细胞因子减少与胶原诱导的关节炎(CIA)有关的炎性关节损伤，doi：10.1007/s10875-010-9457-7(2011))。2012年后期，有研究发现，与AIA模型组相比，干酪乳杆菌ATCC334中可帮助大鼠在诱导佐剂诱导的关节炎(AIA)后保持肝脏和肾脏匀浆的抗氧化状态。然而，模型组中的爪的体积没有发现显着变化(参见Amdekar，S.等人“乳酸杆菌保护雌性Wistar大鼠的骨损伤并维持肝脏和肾脏匀浆的抗氧化状态”。分子和细胞生物化学368,155-165，doi：10.1007/s11010-012-1354-3(2012))。但是，以上对干酪乳杆菌ATCC334的研究与本发明有很大不同。

首先，虽然胶原诱导的关节炎(CIA)和佐剂诱导的关节炎(AIA)是两种最广泛使用的实验性关节炎模型，但这两种模型的发病机制完全不同。与CIA不同，AIA模型是T细胞和嗜中性粒细胞依赖性的(参见Hegen M.等人在“用于鉴定类风湿性关节炎的潜在治疗剂的动物模型的效用风湿性疾病”中所述，67,1505-1515，doi：10.1136/ard.2007.076430(2008))。T辅助(Th)1和Th17炎症细胞因子与AIA有关。在AIA大鼠的淋巴结和/或发炎关节中检测到TNF、干扰素c(INFc)、IL1、IL6和IL17A的信使核糖核酸(mRNA)的水平升高。此外，AIA大鼠提供了研究关节以外的各种组织的病理变化的机会，以用于开发各种类型的药物的活性。此外，AIA广泛用于许多处于临床前或临床研究阶段的抗关节炎药物的临床前试验，或者是目前已用于治疗关节炎的抗关节炎药物的。除了类风湿性关节炎之外，人类受试者中的许多临床实体可以被认为与正在考虑的AIA具有一些相似性，包括强直性(类风湿性)脊椎炎和瑞特氏病(参见Pearson，Carl M.等人在“分枝杆菌佐剂注射引起的大鼠关节炎和其他损伤的研究”中所述，佐剂关节炎第42卷，No.1，1963年1月)。

在一个实施例中，所述液体制剂进一步包括粘稠剂。干酪乳杆菌的水溶液容易出现水析与沉淀现象产生，从而影响益生菌制剂的品质。粘稠剂可用来提高益生菌株液体制剂的稳定性。优选地，粘稠剂包含羧甲基纤维素钠。羧甲基纤维素钠可用于稳定乳状液，具体地稳定含有益生菌的液体制剂。羧甲基纤维素钠的耐酸性进一步提高干酪乳杆菌活性，保障液体益生菌制剂的品质。

优选地，所述羧甲基纤维素钠的浓度为0.05％至2％、0.1％至1％或0.2％至0.5％。在一个实施例中，所述羧甲基纤维素钠的浓度为0.3％。

优选地，所述液体制剂是口服液体制剂。

在本发明的另一方面提供了一种制备如上所述的液体益生菌制剂的方法。该方法包括将活性干酪乳杆菌分散于粘稠剂中。活性干酪乳杆菌和粘稠剂如上所定义。在一个实施例中，所述活性干酪乳杆菌的益生菌株是L.casei ATCC334，所述粘稠剂包含羧甲基纤维素钠，优选地羧甲基纤维素钠的浓度为0.05％～2％。该方法进一步包括在分散活性干酪乳杆菌于粘稠剂前，将所述活性干酪乳杆菌的干粉接种于培养基中进行活化。所述活化在以下条件进行：接种量为1％-3％、活化代数为2-3代、活化温度35-40℃，在得到纯培养物后，在0-5℃下保藏。

进一步地，本发明涉及活性干酪乳杆菌益生菌株在制备预防和/或治疗关节炎的药物中的应用。在一个实施例中，所述关节炎是类风湿性关节炎。活性干酪乳杆菌益生菌株如上所定义，并优选地是L.casei ATCC334。具体地，所述活性干酪乳杆菌益生菌株分散于包含羧甲基纤维素钠的粘稠剂中。优选地，所述药物是口服制剂。

实施例1

液体益生菌制剂的制备

实施例中用到的活性干酪乳杆菌(L.casei)ATCC334购买自美国菌种保藏中心，批号:6062923(基因库编号:CP000423)；以及羧甲基纤维素钠购买自意大利西格玛公司。

本发明的液体益生菌制剂的制备方法包括以下步骤：

步骤1.将L.casei(ATCC334)干粉在MRS肉汤培养基中(购买自意大利西格玛公司)接种培养，接种量为2％，培养条件为37℃、厌氧。活化代数2代。得到纯培养物，在4℃下保藏备用。

步骤2.L.casei(ATCC334)在MRS肉汤培养基中厌氧培养36小时后，将培养溶液进行离心处理(3000rpm、15分钟、4℃)，去上清液，并将余下的益生菌沉淀用平衡盐溶液(例如磷酸盐缓冲生理盐水)重悬洗两次。计数，以2*10⁸CFU/ml重悬于0.3％羧甲基纤维素钠配成最后液体益生菌制剂。

实施例2

干酪乳杆菌L.casei ATCC334对小鼠佐剂性关节炎的治疗作用

完全弗氏佐剂诱导产生佐剂性关节炎，与人类的类风湿性关节炎相似，被认为是研究人类类风湿性关节炎的理想模型。实施例中在大鼠佐剂性关节炎模型上，以关节炎症状(小鼠体重、关节炎指数、致炎足肿胀度、炎性因子表达改变)以及关节骨破坏放射学、病理学改变情况为指标，说明采用d本发明的液体口服益生菌制剂进行预防性干预对类风湿性关节炎的预防及治疗作用。佐剂性关节炎模型被广泛应用于大量抗关节炎药物的临床前研究或是对临床抗关节炎药物的机制探索。不光是类风关，一系列的临床疾病被认为与佐剂性关节炎模型存在一定的相似性，包括强直性脊柱炎、瑞特综合症。

一、方法

1.动物

Sprague-Dawley(SD)雄性、3-4周龄(离乳)、体重50-60g的大鼠，由广州中医药大学动物中心提供，并饲养于广州中医药大学国际中医药转化医学研究所动物房。大鼠饲养于25℃、湿度55％的环境中，12小时/12小时昼夜交替，无限制取水及取食。大鼠经喂养1周以适应实验环境。

2.治疗干预

根据实施例1制备液体益生菌制剂。

甲氨蝶呤：将甲氨蝶呤(MTX)(Sigma,St.Louis,MT)压碎、重悬于0.3％羧甲基纤维素钠溶液以配成7.6mg/kg的剂量。甲氨蝶呤是化疗药物以及免疫系统抑制剂，其在临床上常用于缓解风湿病。根据使用剂量不同，甲氨蝶呤可用于治疗肿瘤(比如乳腺癌、白血病、肺癌、淋巴瘤)和自身免疫性疾病(包括类风湿关节炎和克罗恩病)。

3.大鼠佐剂性关节炎(AIA)以及给药

所有操作过程均严格遵守中国实验室动物保护条例规定，动物福利和程序严格遵照实验动物的护理和使用指南(美国国家研究委员会，1996)。除7只大鼠作为正常对照组外，对其余大鼠进行造模。造模时固定大鼠，用酒精消毒大鼠尾根部，以玻璃注射器精密吸取0.1ml完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)，然后用Terumo 27G针头以0.1ml皮内注射大鼠距尾根部约2cm的部位，当中完全弗氏佐剂包括0.2mg结核杆菌H37Ra(碧迪，美国)和矿物油(Sigma-Aldrich，美国)。对照组以同样方法注射等量生理盐水作为对照。于注射佐剂后10～20天间(一般在13天左右发生关节炎)，通过测定足体积确定是否造模成功。造模成功的患有佐剂性关节炎的大鼠被分成3组，包括模型组、MTX组和L.casei组。向MTX组大鼠每星期给于剂量7.6mg/kg的甲氨蝶呤，向L.casei组大鼠每日施给2mL液体益生菌制剂(相当在0.3％羧甲基纤维素钠溶液有2*10⁸CFU的干酪乳杆菌)，而模型组刚给予0.3％羧甲基纤维素钠溶液。

4.佐剂性关节炎评价方法

4.1临床症状评价

关节炎症状评价主要通过以下两个指标：足趾肿胀体积和关节炎指数。评价由两个独立的观察者分开来进行。注射完全弗氏佐剂以及之后第9天开始每隔3天(即注射后当天即第0天，以及注射后第9天、第12天、第15天、第18天、第21天、第24天、第27天以及第30天)用足体积肿测量仪测定大鼠左右后足跖容积，以双侧后足跖造模前后及给药前后的容积之差值作为肿胀度。每足跖测定3次以增加准确度。采用关节评分法(脚掌0～4级，尾巴0～3级，见表1-1和图1)得出关节炎指数(为每只大鼠的四肢评分及尾巴评分之和，总分为19分)，评分的依据是关节红肿的程度和范围，以及关节肿大、变形情况。每只大鼠的关节炎指数是其四指的严重程度的总和，即每只大鼠的最高关节炎指数可达16分。

另外，在造模后每隔3天对实验大鼠进行体重测量。

4.2 ESR的测量

在第30天，血液标本取自麻醉后大鼠的腹主动脉。然后将大鼠断颈处死。红血球沉降率(ESR)测量方法是根据国际通用的改良版标准化血液分离方法。

4.3脾脏指数和胸腺指数

大鼠处死后，分别称量大鼠脾脏和胸腺的重量。脾脏指数和胸腺指数的计算方法分别为脾脏的实际重量/大鼠实际体重(mg/g)和胸腺的实际重量/大鼠实际体重(mg/g)。

4.4骨组织破坏评价

大鼠踝关节经过4％多聚甲醛和70％酒精的一系列固定后，通过间接体外的微计算机断层扫描技术(micro-CT)进行扫描(布鲁克公司，比利时)。扫描参数设置为35μm像素大小、电流441μA和电压43kV。骨的3D显微结构特点采用制造商提供的分析软件(CT-Analyser)进行分析。骨侵蚀的严重程度根据放射学指数进行评分：0代表正常，即完整的骨骼轮廓和正常的关节空间；1为轻度异常，即1或2个跖骨出现轻度骨侵蚀；2为异常，即3-5个跖骨出现骨侵蚀；3为中等破坏性异常，即超过5个跖骨出现确切的侵蚀；4为严重破坏性损伤，即大多数跖骨出现确切的侵蚀，以及至少1个内跖骨关节已被完全侵蚀并留下部分跖骨内部呈空洞样改变；5为毁损性骨破坏，即骨的轮廓不清楚或没有轮廓可言。

4.5细胞因子表达检测

血清中的IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-6水平通过可商购的ELISA试剂盒进行测量(美国R&D公司)。

4.6组织学

简略来说,以5-μm宽度对固定后的关节组织进行切片，采用苏木精-伊红进行染色后，用100x放大显微镜观察。

在本发明中，新型的口服液体益生菌制剂以预防性干预的方法应用于预防和/治疗关节炎，被证实在佐剂性关节炎中有显着地抗炎及骨保护作用。这是首次通过使用有明确基因序列的L.casei ATCC334菌株的稳定液体制剂预防性治疗典型的多关节炎，这展原了本发明的口服液体益生菌制剂可以用于治疗人类关节炎。

二、结果

1.口服液体益生菌制剂(以下代为L.casei ATCC334)缓解佐剂性关节炎大鼠的能量损耗

类风湿性关节炎(类风关)是一个系统性疾病，常伴随有体重减轻和肌肉损耗，称作类风关恶病质。在本实施例中，4个不同组别在11个时间点的平均体重测量值结果显示于图1。结果显示，由第12天起，对照组大鼠体重明显高于模型组大鼠。在给予L.caseiATCC334后，佐剂性关节炎大鼠的体重损耗得到了缓解。

2.L.casei ATCC334缓解佐剂型关节炎大鼠症状

足跖容积肿胀度和关节炎指数是评估L.casei ATCC334抗关节炎作用的两个重要指标。如图2a所示，关节炎一般在造模后10±2天内出现，且模型组大鼠关节炎会不断加重，呈现显着增高的关节炎指数及足跖容积直至大鼠处死牺牲。阳性对照即MTX组和治疗组即L.casei ATCC334组大鼠的关节炎指数在第12-30天较模型组显着降低。足趾容积度的改善情况与关节炎指数变化一致，具体详见图2b。

3.L.casei ATCC334干预下调红血球沉降率

红血球沉降率(ESR)多年来常用于检察与感染、肿瘤及自身免疫性疾病相关的炎症。显着升高的红血球沉降率是关节炎诊断和活性程度判断的一个重要指标。如下方表1和图3所示，升高的红血球沉降率在L.casei ATCC334干预后被显着抑制(P<0.01)。

表1:大鼠的红血球沉降率(均值±标准误)

4.L.casei ATCC334抑制促炎因子的表达

通过ELISA检测促炎细胞因子表达水平。结果显示在关节炎诱导后，细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ的表达明显升高(图4a至4f)。L.casei ATCC334显着抑制了这些细胞因子的表达，且适应性免疫相关的细胞因子IL-17和先天性免疫相关的细胞因子IL-1β均被L.casei显着抑制。这些数据提示L.casei治疗后关节炎症状的改善与减少这些细胞因子的表达有关。

5.L.casei ATCC334保护佐剂性关节炎大鼠以免于/减轻骨组织破坏

骨组织破坏是类风湿性关节炎的一个典型标志，常导致患者的高致残率。采用微计算机断层扫描技术观察L.casei ATCC334对骨结构破坏的影响。在对大鼠进行微计算机断层扫描前，通过肉眼观察发现踝关节是关节炎最严重的部位。因此，对大鼠后足部位进行了扫描以获取其3D-多维微计算机断层扫描图片。与模型组比较，骨侵蚀在L.casei治疗后得到明显缓解(见图5a)。另外，使用广泛用于分析骨破坏程度的整体外部变化的放射学指数，其显示模型组的放射学指数明显高于L.case组，L.case组具有较低的放射学指数(见图5b)，即L.casei保护了骨以免遭侵蚀。但放射学指数评分仅评价了骨的外在变化，未对骨结构的破坏情况进行分析。计算机断层扫描(CT)是另一种用于检察骨破坏的检测方法，因其可以进行三维视角，对骨的结构有更为清晰的观察，所以比放射学指数更为敏感。同时在微计算机断层扫描观察过程中，进一步进行结构分析。微计算机断层扫描征象显示骨的多维结构，包括骨小梁和皮质骨，通过微计算机断层扫描分析转化为定量结果。对大鼠跟骨进行分析，包括骨小梁密度(BMD)、骨体积比例(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、孔隙率和骨皮质骨密度(TMD)。结果显示L.casei ATCC334增加了骨密度、骨体积及骨小梁数目，并降低了孔隙率(见图5b)。

6.L.casei ATCC334改善佐剂性关节炎大鼠组织病理学的改变

组织病理学结果如图6所示。模型组表现为关节周围软组织肿胀，并在膝关节处伴有不同程度的炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳生成、关节软骨损伤。组织病理学图片显示关节炎大鼠在L.casei ATCC334治疗后软骨损伤明显减轻(图6a)，并且炎性细胞浸润和滑膜增生的情况均有明显改善，这展示了L.casei ATCC334抗关节炎的保护作用。再者，模型组的病理学指数明显地比L.casei ATCC334组的指数为高，由此证明L.casei ATCC334组大鼠经L.casei ATCC334干预后，能保护骨免受侵蚀，关节炎得到缓解(见图6b)。

三、结论

基于以上结果，本发明的口服液体益生菌制剂可预防关节炎的炎症反应，以及保护骨免受破坏。L.casei，具体地L.casei ATCC334菌株，可调节宿主代谢，缓解佐剂性关节炎大鼠的能量损耗。通过使用L.casei，具体地L.casei ATCC334菌株，调节肠道菌群可通过下调细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ等抑制大鼠的免疫失调。同时，L.casei可通过重建关节炎大鼠的骨结构保护骨免受损伤、缓解骨侵蚀和提高骨密度。由此，本发明的口服液体益生菌制剂也可用于临床上防治关节炎的骨质疏松。

以上实施例仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (19)

1.一种液体制剂，所述液体制剂包括活性干酪乳杆菌(L.casei)益生菌株。

2.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于所述活性干酪乳杆菌益生菌株是L.casei ATCC334。

3.根据权利要求1所述的液体制剂，进一步包括粘稠剂。

4.根据权利要求3所述的液体制剂，其特征在于所述粘稠剂包含羧甲基纤维素钠。

5.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于所述活性干酪乳杆菌益生菌株在所述液体制剂的数目为1*10⁵至1*10¹²CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于所述羧甲基纤维素钠的浓度为0.05％至2％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的液体制剂是口服制剂。

8.活性干酪乳杆菌益生菌株在制备预防和/或治疗关节炎的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述活性干酪乳杆菌益生菌株是L.caseiATCC334。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述活性干酪乳杆菌益生菌株分散于粘稠剂中。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述粘稠剂包含羧甲基纤维素钠。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述关节炎是类风湿性关节炎。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的应用，其特征在于所述药物是口服制剂。

14.一种制备液体益生菌制剂的方法，包括将活性干酪乳杆菌分散于粘稠剂中。

15.根据权利要求14中所述的方法，其特征在于所述粘稠剂包含羧甲基纤维素钠。

16.根据权利要求14中所述的方法，其特征在于所述活性干酪乳杆菌的益生菌株是L.casei ATCC334。

17.根据权利要求14中所述的方法，其特征在于所述羧甲基纤维素钠的浓度为0.05％～2％。

18.根据权利要求14中所述的方法，进一步包括在分散活性干酪乳杆菌于粘稠剂前，将所述活性干酪乳杆菌的干粉接种于培养基中进行活化。

19.根据权利要求14中所述的方法，其特征在于所述活化在以下条件进行：接种量为1％-3％、活化代数为2-3代、活化温度35-40℃，在得到纯培养物后，在0-5℃下保藏。