CN108884436B - 诱导的扩展的多潜能干细胞、制备及使用方法 - Google Patents

Abstract

用于在体外培养后扩展分离的多潜能干细胞在体内产生胚外谱系的能力的因子(在本文中称为多潜能性的化学扩展剂(CEP))。扩展多潜能细胞产生胚胎谱系和胚外谱系的能力的方法。待重编程的细胞与有效量的CEP接触足够的时间段以将细胞重编程为化学诱导的扩展的多潜能干细胞(ciEPSC)。基于包括以下的性质将ciEPSC鉴定为扩展的多潜能细胞：(i)形态学上和(ii)功能上，例如基于它们在体内贡献TE和ICM二者的能力。可以培养或诱导ciEPSC以分化成所需类型的细胞，并且用于许多应用，包括但不限于细胞疗法和组织工程。

Description

诱导的扩展的多潜能干细胞、制备及使用方法

发明领域

本发明总体上涉及用于扩展体外培养的多潜能(pluripotent)干细胞的体内多潜能性的组合物和方法。

发明背景

早期胚胎中的全潜能(totipotent)细胞是所有干细胞的祖先，并且能够发育为整个生物体，包括胚外组织(诸如胎盘)。内细胞团(ICM)中的多潜能细胞是全潜能细胞的后代并且能够分化成除胚外组织之外的身体的任何细胞类型。

动物发育通过精子对卵子的受精作用来启动，紧接着是有丝细胞分裂或卵裂，以产生卵裂球。在大多数动物中，细胞类型多样化的第一步是创造原胚层，即内胚层、中胚层和外胚层。通常，内胚层是营养吸收所必需的胃肠道的前体；中胚层产生分别参与运动和心血管循环的肌肉和血细胞；并且外胚层分别发育成对于免受环境危害和感知环境至关重要的表皮和神经元。因此，所述三种胚层的形成为产生动物生命所必需的各种组织奠定了基础，并且是在动物发育开始时发生的进化上保守的事件。

然而，对于哺乳动物的发育，特别是真哺乳亚纲动物(诸如小鼠和人类)的发育，情况略有不同。哺乳动物发育的第一个细胞分化事件不是形成所述三种胚层，而是建立两种不同的细胞谱系：滋养外胚层(TE)和内细胞团(ICM)。TE通过直接与母亲的子宫相互作用来参与着床，并且产生胎盘中的组织。只有在植入之后所述三种胚层才由ICM形成，最终产生动物体内的所有组织。综述于Marikawa等人,Mol.Reprod.Dev.,76(11):1019-1032(2009)。

ESC(胚胎干细胞)是存在于胚泡的ICM中的多潜能细胞的体外对应物。虽然正在发育的胚胎中的天然多潜能细胞短暂地存在，但是ESC能够在体外维持，这提供了未分化细胞的无限来源。Tachiban等人,Cell,148(1-2):285-295(2012)。分离的体外培养的多潜能干细胞的下游应用依赖于它们的潜能，即它们分化成其它细胞类型的能力以及通过它们体外快速扩增细胞的难易度/体外快速扩增细胞的能力。形成畸胎瘤和嵌合体二者的细胞体内分化是评价细胞发育潜能的基本且可靠的工具。几项研究已经证明培养的多潜能干细胞产生全部三种胚胎胚层的能力(Takashima等人,Cell,158:1254-1269(2014)；Chan等人,CellStem Cell,13:663-675(2013)；Theunissen等人,Cell Stem Cell15:471-487(2014)；Evans等人,Nature,292:154-156(1981)，Li等人,Cell,135:1299-1310(2008)；Buehr等人,Cell,135:1287-1298(2008)；和Thomson等人,Science,282:1145-1147(1998)。然而，体外培养的多潜能干细胞显示由例如通过形成嵌合体和/或在体内产生胚外谱系的无能性确定的有限/限制的细胞潜能，由通过它们形成嵌合体的无能性/无效性确定的有限的发育潜能，和/或呈现与体外快速扩增细胞的能力、培养中稳定维持细胞有关的限制性，这限制了这些细胞的下游应用。例如，研究表明多潜能细胞，诸如幼稚

NHSM(幼稚人干细胞培养基)-hES(人胚胎干)细胞，不能贡献嵌合小鼠胚胎中的TE(滋养外胚层)和ICM(内细胞团)二者(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))。外胚层干细胞(EpiSC)容易形成畸胎瘤，然而，它们很少形成嵌合体。Han等人,(Cell,143:617-627(2010))描述了EpiSC的亚群，其构成培养物中的约99％(EpiSC)并且显示未贡献嵌合体。作为另外的实例，细胞解离后人胚胎干细胞的存活不佳妨碍了进一步的操作和开发。

因此，需要扩展多潜能干细胞在体内的细胞潜能的方法，以及在体外快速扩增细胞和稳定维持细胞的方法。

因此，本发明的目的在于提供在体内具有扩展的细胞潜能的多潜能干细胞。

本发明的目的也在于提供用于扩展分离的多潜能干细胞在体内的细胞潜能的组合物。

本发明的目的还在于提供扩展分离的多潜能干细胞在体内的细胞潜能的方法。

本发明的另外的目的在于提供使用具有扩展的细胞潜能的多潜能干细胞的方法。

发明概述

已经鉴定了可以用于在用鉴定的因子混合物进行体外培养之后扩展(extend)分离的多潜能细胞(isPSC)在体内的细胞潜能的因子混合物(本文中称为多潜能性的化学扩展剂(CEP))。当与从相同生物体获得的未处理的相应细胞相比，CEP例如通过将在体内产生胚外谱系的能力赋予isPSC来扩展isPSC的细胞潜能。

CEPS包括：(1)细胞因子；(2)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂；(3)G蛋白偶联受体抑制剂，乙酰胆碱受体拮抗剂；和(4)聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)抑制剂。在优选的实施方案中，细胞因子是白血病抑制因子(LIF)(“L)；GSK抑制剂是氨基嘧啶，化学名为[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈]的CHIR99021(“C”)；G蛋白偶联受体抑制剂是乙酰胆碱受体拮抗剂，更优选是mAChR(毒蕈碱型乙酰胆碱受体)，例如M2、DiM((S)-(+)-马来酸二甲茚定)(“D”)；并且PARP1抑制剂是MiH(盐酸米诺环素)(“M”)。这种优选的CEP混合物(本文中称为LCDM)可以用于体外调理多潜能细胞，从而扩展它们产生胚胎谱系和胚外谱系的能力。

还提供通过使用本文公开的CEP对供体细胞进行重编程来扩展分离的多潜能干细胞的体内细胞潜能的方法。待重编程的细胞(即供体细胞)与CEP接触足够的时间段以将细胞重编程为化学诱导的/重编程的扩展的多潜能干细胞(CiEPSC)。在优选的实施方案中，将细胞首先在含有CEP的重编程培养基中培养14-30天的时期。在一些实施方案中，在使细胞接触CEPS之前，将细胞在含有Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂(例如Y27632[(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺+++二盐酸盐)])的培养基中培养12至48小时的时间段、优选24至48小时的时间段、最优选24小时。ciEPSC是分离的并且能够被进一步培养。在该实施方案中,ROCK激酶抑制剂可以在传代之前12小时和传代之后12小时期间添加到细胞培养基。在另外的实施方案中，ROCK抑制剂还可以在最初几次传代(例如最初2-6次传代，优选最初3-5次传代)期间存在于细胞培养基中。

还公开了ciEPSC。基于包括以下的性质将与本文公开的CEP接触的重编程细胞鉴定为扩展的多潜能干细胞：(i)形态学上，(ii)功能上：(a)细胞分化成三种胚胎胚层的组织的能力；(b)一种或多种胚外标志物(诸如CDX2、GATA6、HAND1和EOMES)的上调表达，(c)多潜能性的一种或多种标志物(诸如OCT4、NANOG、KL2、SOX2和UTF1(未分化的胚胎细胞转录因子))的下调；(d)多潜能性的一种或多种标志物(诸如TBX3和GBX2)的上调；和(e)在体内形成胚胎的和胚外的嵌合状态二者的能力。ciEPSC与已经暴露于本文公开的CEPS的细胞的不同之处在于，当与未经CEPS处理的细胞相比，它拥有这些性质中的至少一种，优选这些性质中的两种、三种、四种或全部。通过比较从中获得ciEPSC的相应多潜能干细胞中的测量的因子水平来确定上调或下调。

本文公开的ciEPSC能够至少通过用于产生它们的方法(即通过它们的来源)与人或小鼠ESC或iPSC区分开。在ESC是天然存在的细胞的情况下，当如本文所述通过用小分子的组合处理多潜能细胞来获得ciEPSC时，ciEPSC在另一方面不是天然存在的(如拥有从中获得它们的相应的天然存在的ESC中未发现的特性所证明)。

可以培养或诱导CEPSC以分化成所需类型的细胞。CEPSC和它们的后代能够用于许多应用，包括但不限于细胞疗法和组织工程。

附图简述

图1A是显示用于筛选化合物的策略的示意图。图1B是显示在E10.5的嵌合体测定的总结的柱状图。总孕体：回收的E10.5孕体的总数；Em(胚胎)&ExEm(胚外)：人类细胞整合到Em组织和ExEM组织二者的孕体的数量。

图2A显示了胚外基因在引发的(primed)hES细胞(n＝4，生物复制物)、幼稚NHSM-hES细胞(n＝4，生物复制物)和hEPS细胞(n＝4，生物复制物)中的代表性相对转录水平。对于每个样品，将来源于RNA-序列的基因表达值标准化为相应基因在引发的hES细胞中的平均值。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。图2B和2C显示了hEPS细胞(H1-EPS,H9-EPS)、引发的hES细胞(H1,H9)和幼稚hES细胞(H1-NHSM,H9-NHSM)中的所选胚外基因表达的Q-PCR分析。对于每个样品，将基因表达值分别针对在初始引发的H1和H9细胞中的基因表达值标准化。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。(n＝2，技术复制物)。图2D展现了Q-PCR(定量聚合酶链式反应)分析，其显示胚外基因在hEPS细胞和在来源于hEPS细胞的分化型EB(胚样体)细胞中的表达。D0：在EB形成测定之前收集的hEPS细胞；D3:在EB形成的第3天收集的来源于hEPS的细胞。将基因表达值针对D0细胞标准化。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。(n＝2，技术复制物)。

图3A显示了代表性的与多潜能性相关的基因在引发的hES细胞(n＝4，生物复制物)、hEPS细胞(n＝4，生物复制物)和幼稚NHSM-hES细胞(n＝4，生物复制物)中的相对转录物水平。对于每个样品，将来源于RNA-序列的表达值标准化为引发的hES细胞中的平均表达值。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。图3B和3C显示hEPS细胞(H1-EPS,H9-EPS)、引发的hES细胞(H1,H9)和幼稚NHSM-hES细胞(H1-NHSM,H9-NHSM)中的所选多潜能性基因表达的Q-PCR分析。对于每个样品，将基因表达值标准化为分别在初始引发的H1和H9细胞中的基因表达值。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。(n＝3，技术复制物)。图3D和3E显示了对于每个所示基因显示为小提琴状图的，来自hEPS细胞(n＝16，生物复制物)和引发的hES细胞(n＝25，生物复制物)的单细胞qPCR分析的表达值的频率分布。为了进行比较，将表达值表示为ΔCT值加20。对于每个样品，白色的圆表示基因表达值的中位数。

图4A和4B显示了H3K4me3和H3K27me3染色质标记在引发的hES细胞(n＝2，技术复制物)和hEPS细胞(n＝2，技术复制物)中全部基因上的分布图。计算跨区域的均值标准误差(SEM)并显示为均值曲线周围的半透明阴影。图4C-D是显示在第7代在不同条件下hEPS细胞中的所选基因表达的Q-PCR分析的柱状图。将DiM(((S)-(+)-马来酸二甲茚定)(图4C)和MiH(盐酸米诺环素)(图4D)替换为靶向LCDM[hLIF(人白血病抑制因子)、CHIR99021、DiM和MiH]条件中的相同靶标的小分子。hEPS细胞分别与添加的选自DiM(2μM)、TH(5μM)、DES(5μM)的小分子在LCM条件下进行培养，或者与DMSO(二甲基亚砜)进行培养(图4C)，或者与添加的选自以下的小分子在LCD条件下进行培养：MiH，BSI-201(5μM)，NAM(100μM)，PJ34(N-(6-氧代-5,6-二氢-菲啶-2-基)-N,N-二甲基乙酰胺.HCl)(5μM)，或DMSO(图4D)。将表达值标准化为LCM+DiM(图4C)和LCD+MiH(图4D)样品的平均值。LCM：人LIF+CHIR99021+MiH；LCD：人LIF+CHIR99021+DiM。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。(n＝3，技术复制物)。TH:盐酸曲吡那敏；DES：地氯雷他定；BSI：BSI-201；NAM：烟酰胺。图4E显示了PARP1敲低(knockdown)对于所选基因在敲低后第3代的hEPS细胞中的表达的影响。hEPS细胞在LCD条件下进行培养。将表达值标准化为混杂(scramble)对照的平均值。中心值表示平均值。误差棒表示标准偏差。(n＝3，技术复制物)。图4F是显示在E12.5的嵌合体测定的总结的柱状图。柱状图显示嵌合体(灰色，整合到胚胎组织(Em)；黑色，整合到胚胎组织和胚外胎盘组织(Em&ExEm)二者)在回收的E12.5孕体中的百分比。图4G是显示在8-细胞胚胎阶段中单细胞注射的嵌合测定的总结的柱状图。柱状图显示嵌合体在回收的胚泡中的百分比。ICM&TE,小鼠细胞整合到ICM和TE二者的胚胎。

图5A显示代表性TS标志物基因在传统TS培养基中培养的细胞中的相对表达。LCDM条件中培养的mEPS细胞(TT2-6 p0和mc6-1 p0)或2i条件中培养的mES细胞(TT2-2i p0和mc2i-1p0)分别用作对照。在至少三个独立的实验中获得了相似的结果。误差棒表示标准偏差。(n＝3)。图5B是基于Transwell的侵袭测定的示意图。图5C显示了在E17.5胎盘组织中，滋养层标志物基因在来源mEPS的细胞中的表达。对两批样品进行分析。使用FACS纯化Tdtomato(Td)阳性细胞。分析滋养层标志物在这些细胞中的表达并且与原始EPS细胞(TT2-6)和Td阴性宿主胎盘细胞进行比较。图5D显示人线粒体DNA的定量PCR分析表明在E10.5小鼠胚胎中存在来源于hEPS的细胞。人DNA对照(H，红色柱)和人-小鼠细胞稀释物(蓝色柱)用于评估人类细胞贡献程度。虚线表示相当于1个人类细胞在10,000个小鼠细胞中的稀释度的人线粒体DNA检测水平。M，未注射的小鼠胚胎。图5E显示了人线粒体DNA的定量PCR分析表明在8-细胞或胚泡阶段注射hEPS细胞后，在E10.5在小鼠胎盘中存在人类细胞。人DNA对照(H，红色柱)和一系列人-小鼠细胞稀释物(蓝色柱)并行运行以评估人类细胞贡献程度。虚线表示相当于1个人类细胞在10,000个小鼠细胞中的稀释度的人线粒体DNA检测水平。M，未注射的小鼠胎盘。

图6A和6B显示RNA-序列的PCA以及来自EPS细胞和已知的多潜能细胞类型的微阵列数据。对于(6A)，分析来自mEPS细胞(该研究)、mES细胞、2C-样细胞(Macfarlan等人(2012))和外胚层干细胞(Najm等人(2011))的数据。在每项研究中将数据标准化为mES细胞。在(a)中选择了总计17,243个基因。对于(6B),分析来自hEPS细胞(该研究)、幼稚hPSC(Takashima等人(2014)，Chan等人(2013)，Gafni等人(2013)和Theunissen等人(2014))和引发的hPSC的数据。在每项研究中将数据标准化为引发的hPSC。在(6B)中选择了总计15,958个基因。圆形：RNA-数据；三角形：微阵列数据。图6C显示DiM或MiH取代对mEPS细胞嵌合能力的影响的分析。在不具有MiH(-MiH)的LCDM条件下培养敲除Parp1的mEPS细胞(Parp1-KO)。在注射前，将mEPS细胞在不同的条件下培养至少5代。将多个细胞注射到8-细胞胚胎中，在进一步分析前将其培养额外的60小时。柱状图显示嵌合体在回收的胚泡中的百分比。ICM&TE,小鼠细胞整合到ICM和TE二者的胚胎。图6D显示DiM或MiH取代对hEPS嵌合能力的影响的分析。将hEPS细胞在不同的条件下培养至少5代，然后将多个细胞注射到8-细胞胚胎中，在进一步分析前将其培养额外的60小时。柱状图显示嵌合体在回收的胚泡中的百分比。ICM&TE,小鼠细胞整合到ICM和TE二者的胚胎。TH:盐酸曲吡那敏；DES:地氯雷他定；NAM:烟酰胺。PD：PD0325901；SB：SB203580；SP：SP600125。

图7A和7B显示参与MAPK信号传导的蛋白质在mES细胞(TT2-2i，mc2i-1)和mEPS细胞(TT2-6，mc6-1)(图7A)以及hEPS细胞和引发的hPSC(图7B)中的总水平和磷酸化水平的蛋白质印迹分析。在三个独立的实验中获得了相似的结果。图7C是显示产生敲除Parp1的mEPS细胞系的示意图。gRNA分别靶向Parp1基因座中外显子1和2中的序列，其共转染到mEPS细胞中。在表达Cas9蛋白后，将外显子1至外显子2的基因组片段从Parp1基因座中删除。图7D显示了基因组PCR分析证实mEPS细胞系TT2-6的三个亚克隆(2B1、2A1和1A5)中的Parp1基因座被成功靶向。野生型mES TT2-2i和mEPS TT2-6用作对照。图7E和7F显示了基因组Q-PCR和QRT-PCR分析证实在敲除Parp1的mEPS亚克隆(Parp1 KO)中不存在Parp1外显子(7E)和mRNA表达(7F)。野生型mEPS细胞系TT2-6用作对照。图7G显示了证实敲除Parp1的mEPS克隆(2B1、2A1和1A5)中不存在PARP1蛋白质表达的蛋白质印迹分析。野生型mEPS细胞系TT2-6用作对照。

发明详述

已经鉴定了能够使新干细胞(称为扩展的多潜能干(EPS)细胞)在人类中衍生的化学混合物，所述细胞具有改善的/扩展的产生胚胎谱系和胚外谱系二者的能力。重要的是，单个人EPS(hEPS)细胞具有贡献小鼠嵌合胚胎中的胚胎谱系和胚外谱系(特别是胎盘中的谱系)的能力。如本文所述研究所确定的，当与引发的人胚胎干(引发的hES)细胞或者由NHSM(幼稚人干细胞培养基)条件支持的幼稚人ES细胞(幼稚NHSM-hES细胞)(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))相比，hEPS细胞显示多个胚外基因的基础mRNA活性的上调。显著地，hEPS细胞能够通过转变引发的hES细胞产生，通过体细胞重编程产生，或者直接由胚泡产生。更重要的是，使用相同的培养条件成功地建立了猪EPS、大鼠EPS和小鼠EPS(mEPS)细胞，并且单个mEPS细胞在胚胎第10.5天(E10.5)和E12.5能够贡献嵌合孕体中的胚外组织和胚胎组织。

本文所述的研究证明了体外培养的细胞(例如多潜能干细胞)的细胞潜能可以在体内扩展超过现有水平，即超过未与本文公开的因子接触的来自相同生物体的相应细胞中的水平。另外，EPS细胞能够被快速扩增和稳定维持。因此，EPS细胞为疾病建模(例如，使用人源化的动物模型研究早期发育)以及产生用于再生医学的对患者具有特异性的细胞提供了新细胞来源。

I.定义

如本文所用，术语“细胞潜能”是指细胞分化成其它细胞类型的能力。细胞能够分化成的细胞类型越多，其潜能越大。

如本文所用，术语“化学诱导的多潜能干细胞”(CiPSC)是指通过将非多潜能细胞与化学化合物接触(并非通过表达一个或多个转染的基因)而来源于非多潜能细胞(即多能(multipotent)细胞或分化细胞)的多潜能细胞。

如本文所用，术语“化学诱导的扩展的多潜能干细胞(“ciEPSC”)”是指当与其来源于的多潜能干细胞类型相比，通过将供体细胞与化学化合物接触，具有改善的体内产生胚外谱系的能力的多潜能干细胞。例如，当与未经CEPS处理的引发的人胚胎干细胞相比，来源于引发的人ESC的ciEPSC在接触CEPS后显示改善的体内产生胚外组织的能力。

术语“相应细胞”用来指与从中获得ciEPSC的供体细胞具有相同类型且来自相同生物体的细胞。例如,对于从小鼠胚胎干细胞获得的ciEPSC，相应细胞是未与CEPS接触/未经CEPS重编程的小鼠胚胎干细胞。

如本文所用，术语“供体细胞”是指与CEPS接触以诱导/赋予扩展的细胞潜能的细胞。

本文所用的与ciEPSC有关的术语“扩展的细胞潜能”是指ciEPSC分化成不是相应细胞的至少一种细胞类型的能力。

如本文所用，术语“表观遗传”是指不基于突变但在某些情况下仍能够代代相传的DNA共价修饰。在没有任何DNA序列改变的情况下被激活或抑制的基因是通过表观遗传控制的。表观遗传修饰是稳定的，但是在没有DNA序列永久改变的情况下发生的基因表达中可能是可逆的改变。已经鉴定了许多类型的表观遗传过程-它们包括甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化，和组蛋白的苏素化(sumolyation)以及DNA甲基化。

如本文所用，术语“诱导的多潜能干细胞”(iPSC)是人为地来源于非多潜能细胞的一类多潜能干细胞。CiPSC是iPSC；然而，它们与一些iPSC的不同之处在于，它们未被基因工程改造以赋予多潜能性。

术语“人源化的动物模型”在本文中用来指移植有功能化的人类细胞或组织或者表达人类转基因的非人类哺乳动物。

如本文所用，“改善的体内产生胚外谱系的能力”可以根据材料和方法例如通过在本文所述嵌合测定中进行显微注射之后测量滋养外胚层标志物的表达和/或对滋养外胚层(TE)和ICM(内细胞团)二者的贡献来确定。

当提及ciEPSC时，术语“分离的”或“纯化的”意指至少10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含有污染的细胞类型(其是非扩展的多潜能细胞)的化学诱导的扩展的多潜能干细胞。分离的EPSC也可以基本上不含有可溶的天然存在的分子。

如本文所用，“培养基”是指细胞培养环境。培养基通常是等渗溶液，并且可以是液体、凝胶状或半固体，例如，以提供细胞粘附或支撑的基质。如本文所用，培养基可以包括培养细胞所必需的营养、化学和结构支持的组分。

如本文所用，术语“多潜能性”(或多潜能)是指具有分化成以下三种胚层中的任一种的潜能的干细胞：内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)，中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)，或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)。多能干细胞塑性较差且更易分化，并且能够成为给定器官中的几类细胞之一。例如，多能造血干细胞可以发育成红血细胞祖细胞，白血细胞或血小板生成细胞。成人干细胞是多能干细胞。脂肪源性干细胞是多能的。

“多潜能细胞”在本文中可与“多潜能干细胞”互换地使用。

如本文所用，“重编程”是指将一种特定细胞类型转变成具有额外的/不同的功能和/或结构特征的另一种细胞类型。例如，不是本文定义的ciEPSC的细胞在体外培养之后可以被重编程为具有扩展的体内产生胚外谱系的能力的细胞。

术语“小分子”是指分子量小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于1,000道尔顿的分子(诸如有机化合物或有机金属化合物)。

如本文所用，“转化生长因子β(TGFβ)受体抑制剂”是指抑制TGFβ受体的药剂。TGFβ受体是单程(single pass)丝氨酸/苏氨酸激酶受体。三种TGF-β受体类型包括受体I、II和III型受体，即TGF-β受体1、TGF-β受体2和TGF-β受体3。

如本文所用，“2i”是指具有糖原合酶激酶-3和促分裂原活化蛋白激酶信号传导的双重抑制作用的ESC培养基，例如，补充有2i(CHIR99021和PD0325901)的ESC培养基。

II.组合物

已经鉴定了可以用于在体外培养之后扩展分离的多潜能干细胞在体内的细胞潜能的因子混合物(本文中称为多潜能性的化学扩展剂(CEP))。当与未处理的相应细胞相比，CEP例如通过将在体内产生胚外谱系的能力赋予isPSC来扩展isPSC的细胞潜能。CEP可以用于提供含有至少10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含有污染的细胞类型(诸如非扩展的多潜能细胞)的ciEPSC的分离群。

CEPS包括：(1)细胞因子；小分子，包括(1)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂；(2)G蛋白偶联受体抑制剂，乙酰胆碱受体拮抗剂；和(3)聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)抑制剂。组合物包括有效量的CEP以优选在体外将多潜能细胞重编程为当与来自供体多潜能细胞的多潜能细胞相比时具有扩展/增强的产生胚胎谱系和胚外谱系的能力的细胞。使用体外测定基于针对属内特定种类公开的有效浓度来确定细胞因子、GSK抑制剂、GPCR拮抗剂或PARP1抑制剂的组中其它成员的等价有效浓度(例如，如本文中用具有相似活性的小分子取代MiH或DIM的实验中所示例的(图4C和D))在本领域普通技术人员的能力范围内。

可用于本文公开的方法中的任选的化合物是浓度范围为0.5至20μM、优选5-15μM、最优选10μM的Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂(例如Y27632[(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺+++二盐酸盐)])，或者等价浓度的法舒地尔(fasudil)。

甚至更优选的实施方案包括能够稳定轴蛋白(Axin)-β连环蛋白复合物的至少一种小分子。优选的分子包括内-IWR1(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺；CAS No.1127442-82-3)和XAV939(3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮；CASNo.284028-89-3)。

A.多潜能性的化学扩展剂

1.细胞因子

优选的细胞因子是以1-100ng/ml、优选1-50ng/ml且甚至更优选1至30ng/ml的浓度范围使用的人白血病抑制因子(LIF)(“L)，即白细胞介素6类细胞因子。IL-6是原型的四螺旋束细胞因子，其是神经生成素(neuropoietin)(一组结构相关的细胞因子)的创始成员，包括IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、白血病抑制因子、制瘤素M、心肌营养蛋白-1(cardiotrophin-1)、神经生成素和心肌营养蛋白样细胞因子1(也称为新神经营养蛋白1和B细胞刺激因子-3)以及IL-6的两种病毒类似物。细胞因子的白细胞介素6家族的这些成员能够以针对LIF公开的等价浓度在本文公开的组合物中使用。

2.小分子

扩展多潜能性的化学化合物，即多潜能性的化学扩展剂(CEP)，包括单独的或与蛋白质组合的分子量小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于1,000道尔顿的小分子。小分子可以具有小于或等于900道尔顿或者小于或等于500道尔顿的分子量。更大的分子可以在化学-诱导的重编程中使用，其优选靶向与本文鉴定的小分子相同的途径。

(i)PARP1抑制剂

PARP1抑制剂优选地是以0.5-5μM、更优选的浓度使用的MiH(盐酸米诺环素)(“M”)(即一种有效的PARP1选择性抑制剂)。例如，MiH在组合物中的浓度可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或5μM。其它PARP1抑制剂包括，但不限于，BSI-201(4-碘-3-硝基苯甲酰胺)，NAM(烟酰胺)，和PJ34(N-(6-氧代-5,6-二氢-菲啶-2-基)-N,N-二甲基乙酰胺(pPARP1和PARP2抑制剂)；PARP抑制剂XIV；4-[(1-甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1,3(2H,4H)-异喹啉二酮(有效的PARP1抑制剂)；Veliparib；2-[(2R)-2-甲基吡咯烷-2-基]-1H-苯并咪唑-4-甲酰胺二盐酸盐(有效的PARP-1和PARP-2抑制剂)；Olaparidb(1-(环丙基羰基)-4-[5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰基]哌嗪)；6-氨基-1H-苯并[de]异喹啉-1；和INH2BP(5-碘-6-氨基-1,2-苯并吡喃酮；PARP抑制剂II)。包括PARP1和/或PARP2抑制剂的其它已知PARP抑制剂是可商购的，并且可以以将细胞重编程为ciEPSC的有效量包含在本文公开的CEP组合物中。使用体外测定来确定其它PARP1抑制剂的等价浓度(例如，如本文中用TH和DES取代MiH或者用NAM取代DIM的实验中所示例的)在本领域普通技术人员的能力范围内。

(ii)GSK抑制剂

GSK抑制剂优选抑制GSK3，并且优选对GSK3具有选择性。合适的GSK抑制剂是氨基嘧啶CHIR99021(“C”)，其是糖原合酶激酶3抑制剂。CEP组合物包括浓度范围为0.1至5μM、优选1至3μM且甚至更优选1.5至3μM的CHIR99021。例如，CEP可以包括浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5μM的CHIR99021。考虑落入这些数值之间的浓度，因为本领域普通技术人员可以容易地微调所需的有效量。

然而，其它GSK抑制剂是可商购的，并且可以在本文公开的组合物中使用。实例包括，但不限于，BIO-丙酮肟；GSK 3I抑制剂XV；SB-216763；CHIR 99021三盐酸盐，其是CHIR99021的盐酸盐；GSK-3抑制剂IX[((2Z,3E)-6’-溴-3-(肟基)-[2,3’-联二氢亚吲哚基]-2’-酮]；GSK 3IX[6-溴靛红-3’-肟]；GSK-3β抑制剂XII[3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚]；GSK-3抑制剂XVI[6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙基-氨基)-烟酰腈]；SB-415286[3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮]；和Bio[(2’Z,3’E)-6-溴靛红-3'-肟]。

(iii)G蛋白偶联受体(GPCR)抑制剂

最优选的GPCR抑制剂是以1-5μM的浓度范围使用的(S)-(+)-马来酸二甲茚定(“D”)。马来酸二甲茚定是一种对映体，其是亚型选择性mAChR(毒蕈碱型乙酰胆碱受体)M2、mAChR M1、mAChR M3和mAChR M4拮抗剂以及组胺H1受体拮抗剂。然而，其它GPCR抑制剂可以包括在本文公开的CEP组合物中，并且它们包括但不限于，乙二胺类，例如，盐酸曲吡那敏(竞争性阻断中枢和外周组胺H1受体的组胺H1拮抗剂)、美吡拉敏(mepyramine)和安他唑啉(antazoline)；三环类或四环类，诸如氯雷他定(loratidine)或其代谢物地氯雷他定(选择性组胺H1拮抗剂)。其它药剂是本领域中已知的，并且包括但不限于，左西替利嗪(levocetirizine)，非索非那定(fexofenadine)，阿司咪唑(Astemizole)，酮替芬(Ketotifen)，西替利嗪(Cetirizine)，氯雷他定(Loratadine)，卢帕他定(Rupatadine)，咪唑斯汀(Mizolastine),阿伐斯汀(Acrivastine)，依巴斯汀(Ebastine)，比拉斯汀(Bilastine)，贝他斯汀(Bepotastine)，特非那定(Terfenadine)，奎非那定(Quifenadine)，赛克利嗪(cyclizine)，氯环嗪(chlorcyclizine)，hydroxine，非尼拉敏(peniramine)，氯苯那敏(chlorphenamine)，曲普利啶(tripolidine)，苯海拉明(diphenhydramine)，卡比沙明(carbinoxamine)，溴马秦(bromazine)等。

特别优选的混合物包括以下的组合：(1)细胞因子；小分子，包括(1)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂；(2)G蛋白偶联受体抑制剂，乙酰胆碱受体拮抗剂；(3)聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)抑制剂；ROCK抑制剂和能够稳定轴蛋白-β连环蛋白复合物的小分子。在该实施方案中，所述混合物优选包括：LCDM加内-IWR1(以0.5-10μM的优选浓度范围)和Y27632(以2-5μM的优选浓度范围)，或者LCDM加XAV939(0.5-10μM的优选浓度范围)和Y27632(2-5μM)。

B.待诱导的细胞(供体细胞)

在优选的实施方案中，从多潜能细胞(例如，胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞(iPSC))获得ciEPSC。iPSC包括通过基因工程改造和/或纯化学重编程获得的细胞。在其它实施方案中，从胚泡获得ciEPSC。

优选地，从化学诱导的成纤维细胞、脂肪源性干细胞、神经干细胞或来自肠上皮的细胞获得iPSC。在一些实施方案中，从化学诱导的新生儿成纤维细胞(例如包皮)或成人成纤维细胞获得CiPSC。然而，可以从其它细胞类型获得iPSC，包括但不限于：多能干细胞，血液来源的细胞，胚胎来源的细胞，皮肤源性细胞，成纤维细胞，脂肪细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，神经细胞和结缔组织细胞。

可以在本文公开的方法中使用的多潜能细胞是本领域中已知的并且已经被描述，包括在培养中维持细胞的方法。小鼠胚胎干(ES)细胞从胚泡的内细胞团分离，并且可以通过提供白血病抑制因子(LIF)的外源性刺激以及ERK1/ERK2和GSK3β信号传导的小分子抑制(称为2i/LIF条件)以幼稚内细胞团样构型在体外保持。幼稚多潜能性的标志包括通过其远端增强子驱动Oct4(也称为Pou5f1)转录，保留预失活X染色体状态，以及全面减少DNA甲基化和发育调控基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积。一旦撤销2i/LIF，幼稚小鼠ES细胞可以向着与着床后外胚层类似的引发的多潜能状态漂变。尽管人ES细胞与幼稚小鼠ES细胞共享多个分子特征，但是它们也与引发的小鼠外胚层干细胞(EpiSC)共享各种表观遗传性质。这些包括主要使用近端增强子元件以维持OCT4表达，在大多数女性人类ES细胞中显著的X染色体失活倾向，DNA甲基化的增加以及H3K27me3的突出沉积和在谱系调节基因上的二价结构域获得。Gafni等人,Nature,504(7479):282-286(2013)中公开了未经基因修饰的人幼稚多潜能干细胞从已经建立的引发的人ES细胞衍生，经由诱导的多潜能干(iPS)细胞重编程从体细胞衍生，或者直接从胚泡衍生。

可以通过使用本领域技术人员已知的技术解聚用作细胞来源的合适器官或组织来分离供体细胞。例如，组织或器官可以机械地解聚和/或使用减弱邻近细胞之间的连接的消化酶和/或螯合剂进行处理，使得组织可以分散以在不具有明显的细胞破裂的情况下形成单个细胞的悬浮液。酶促解离可以通过切碎组织并用一种或多种酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等)处理切碎的组织来完成。机械破碎也可以通过若干方法完成，所述方法包括但不限于使用研磨机，搅拌器，筛网，均化器，压力室或超声器。

C.化学诱导的扩展的多潜能干细胞(ciEPSC)

基于包括以下的性质将CiEPSC鉴定为扩展的多潜能细胞：(i)形态学上-小鼠ESC样形态，和(ii)在功能上基于：(a)细胞分化成三种胚胎胚层的组织的能力；(b)一种或多种胚外标志物的上调表达，(c)多潜能性的一种或多种标志物的上调和/或下调；和(d)体内贡献为TE和ICM二者。当与相应细胞相比，ciEPSC在体内显示扩展的细胞潜能。在优选的实施方案中，ciEPSC在体内产生/贡献一种或多种胚外谱系。可以通过在使用本领域已知方法的体内移植之后并如实施例中所述，确定胚外标志物的一个或多个标志物的存在(如下讨论)来确定ciEPSC对体内一种或多种谱系的贡献。

1.形态学

从人供体细胞获得的ciEPSC在形态学上类似于小鼠胚胎干(ES)细胞。人EPS细胞形成类似于小鼠胚胎干细胞的圆顶状集落。小鼠EPS细胞在形态学上与小鼠胚胎干细胞相同。

2.分化成三种胚层的组织的能力

使用本领域已知的方法，ciEPSC具有由三种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)中的每一种分化成一种或多种细胞/组织的能力。

外胚层产生胚胎的外层，并且其由胚胎的外胚层形成。外胚层发育成表面外胚层，神经嵴和神经管。表面外胚层发育出表皮，毛发，指甲，眼睛的晶状体，皮脂腺，角膜，牙釉质，口鼻的上皮。外胚层的神经嵴发育成：外周神经系统，肾上腺髓质，黑素细胞，面部软骨。外胚层的神经管发育成：脑，脊髓，垂体后叶，运动神经元和视网膜。

内胚层首先由扁平细胞组成，所述扁平细胞随后变成柱状。它形成整个消化管的上皮衬里，除了口和咽的一部分以及直肠的末端部分(其通过外胚层的内转(involution)成衬)。它还形成了所有通向消化管的腺体的衬细胞，包括肝脏和胰腺的衬细胞；耳咽管和鼓室的上皮；肺的气管、支气管和气室；膀胱和部分尿道；以及甲状腺和胸腺的卵泡衬里。内胚层形成：胃，结肠，肝脏，胰腺，膀胱，气管的上皮部分，肺，咽，甲状腺，甲状旁腺和肠。

中胚层形成结缔组织，肌肉(平滑肌和横纹肌)，淋巴系统，骨骼，浆膜，软骨，脂肪组织，循环系统，真皮，泌尿生殖系统和脊索。

3.体内贡献TE和ICM二者/胚外标志物的上调

体内贡献TE和ICM二者的能力，在相应细胞不能如此贡献的情况下，是改善的体内产生/贡献胚外谱系的能力的标记。例如，通过将体内贡献TE和ICM二者的能力赋予与本文公开的CEPS接触的hES，能够由三种胚层中的每一种分化成一种或多种细胞/组织的人胚胎干(hES)细胞的细胞潜能得以改善/扩展。细胞在体内贡献TE和ICM的能力可以使用本领域已知的方法来确定。在一些实施方案中，通过将ciEPSC显微注射到小鼠E2.5或E3.5胚胎中并允许其在体内发育成E10.5胚胎以及如实施例中所公开的确定注射的细胞对TE和ICM的贡献，确定贡献TE和ICM的能力。

当与从相应生物体分离的未经处理的体外培养的相应细胞相比时，ciEPSC显示一种或多种胚外标志物(诸如CDX2，GATA6，HAND1和EOMES)的上调表达。例如，如果产生于引发的hESC，那么当与引发的hESC相比，ciEPSC显示一种或多种胚外标志物的上调；如果产生于幼稚hESC，那么当与幼稚hESC等相比，ciEPSC显示一种或多种胚外标志物的上调，等等。一种或多种胚外标志物的上调指示改善的体内产生胚外谱系的能力。在优选的实施方案中，胚外基因的mRNA基础活性在CiEPSC中上调。

4.多潜能性的标志物的上调和/或下调

当与从相应生物体分离的未经处理的相应细胞(即，不与本文公开的CEPS接触的相应细胞)相比时，ciEPSC显示出多潜能性的一种或多种标志物(诸如TBX3和GBX2)的上调。几种多潜能性标志物基因(包括OCT4，REX1，DPPA3，TBX3和GBX2)在hEPS细胞中的mRNA表达比在未经CEP处理的引发的hES细胞中的mRNA表达更均匀。

当与从相同生物体分离的未经处理的相应细胞相比时，ciEPSC显示出多潜能性的一种或多种标志物(诸如OCT4，NANOG，KL2，SOX2和UTF1(未分化的胚胎细胞转录因子))的下调。这与iPSCS(例如Hou等人,Science,341(6146):651-4(2013)中公开的细胞)相反，其显示出标记物(诸如NANOG，UTF1和SOX2)的上调。

ciEPSC与未经处理的相应体外培养细胞的不同之处在于，当与未经CEPS处理的相应细胞相比，它拥有这些性质中的至少一种，优选这些性质中的两种、三种、四种或全部。例如，ciEPSC拥有本文公开的形态，其具有由所有三种胚层分化成一种或多种细胞/组织的能力，并且其显示出一种或多种胚外标志物的上调，或者另外地，其能够在体内贡献TE和ICM两者，或者另外地，它显示出一种或多种如本文公开的多潜能性标志物的上调和/或下调。例如，与2i条件下的小鼠胚胎干细胞培养相比，小鼠EPS细胞显示体内贡献胚胎和胚外(特别是胎盘)嵌合状态二者，下调OCT4的蛋白质表达，下调胚外基因(诸如Cdx2和Eomes)的基因座中的抑制性表观遗传标志物H3K27me3。其它特性，诸如LIF信号传导和/或GSK3β磷酸化，可以用于进一步将细胞鉴定和区分为ciEPSC。例如，当与引发的hES细胞相比时，hEPS细胞显示LIF信号传导的激活，其可以例如通过测量GP130、STAT3和-p-STAT3的水平来确定。另外，当与hES相比，hEPS细胞中的GSK3β磷酸化降低。LIF信号传导的激活和GSK3β信号传导的水平可以用于进一步鉴定从任何生物获得的ciEPSC，并将ciEPSC与其它分离的多潜能干细胞区分开。

与引发的hPSC相比，在hEPS细胞中上调的其它基因包括HOXA1(同源盒A1)、MIXL1(Mix1同源盒样1)和DERA(脱氧核糖-磷酸醛缩酶)基因。唯独在hEPS细胞(而不是其它hPSC类型)中上调的基因包括，例如，CHD7(克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白7))，CHD4(克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4)，MIXL1和LEF1(淋巴增强子-结合因子1)。

III.制备方法

A.多潜能干细胞中的扩展的多潜能性的诱导

通过将待诱导/重编程的细胞(本文中的供体细胞)与含有CEP的培养基接触足够的时间段以使细胞重编程为化学诱导的扩展的多潜能干细胞(ciEPSC)来产生ciEPSC。

将供体细胞与有效诱导和/或增强细胞重编程为延伸的多潜能干细胞的量的本文公开的CEP接触。通过使用下述实施例中概述的方法或本领域中已知的其它方法，本领域技术人员可以容易地确定提供完全重编程所需的本文公开的CEP化合物的浓度。在优选的实施方案中，供体是多潜能细胞，例如胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞(iPSC)。iPSC包括通过基因工程改造和/或纯化学重编程获得的细胞。在其它实施方案中，从胚泡获得ciEPSC。

在供体细胞是引发的人胚胎干细胞(hESC)的示例性方法中，可以将细胞作为单细胞或作为小集落接种到饲养细胞上。在接触CEPS之前，hESC优选在常规hES培养基上培养3至6天，例如在最后一次传代后培养3天、4天、5天或6天。在细胞作为单细胞进行接种的实施方案中，在转化前将Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂的选择性抑制剂(例如Y27632)以5-20μM、优选5-15μM且更优选10μM的浓度范围任选地添加至培养基中12至48小时，优选24至48小时，最优选24小时。在该实施方案中,ROCK激酶抑制剂可以在传代之前12小时和传代之后12小时期间添加到细胞培养基。在另外的实施方案中，ROCK抑制剂还可以在最初几次传代(例如最初2-6次传代，优选最初3-5次传代)期间存在于细胞培养基中。

将细胞在本文公开的浓度下在CEPS(优选LCDM)中培养1-5代(优选3-5代)，该时间范围有效诱导本文公开的在形态学和功能上确定的扩展的多潜能性。

对于在传代之前培养需要3-4天的细胞，该时间范围转换成在LCDM中培养3-20天(最优选9-20天)。在一些实施方案中，供体细胞是幼稚ESC。在这些实施方案中，细胞在接种后可以与LCDM接触12或24小时。在其它实施方案中，供体细胞作为胚泡提供。在这些实施方案中，使用本领域已知的常规方法接种胚泡，随后将细胞在含有LCDM的细胞培养基中培养(优选地，在去除透明带之后)4-7天的时间，之后可以看到初始生长晕(outgrowth)。例如，在可以看到初始生长晕之前，胚泡可以在LCDM中培养4天，5天，6天或7天。

将LCDM中的培养持续有效诱导本文公开的扩展的多潜能性的一段时间。在一些优选的实施方案中，细胞在LCDM中培养至少10代(约40天)。通过使用例如胰蛋白酶-EDTA，培养的胚泡可以解离成小片或单细胞，在饲养细胞上再接种，并传代。使用本文公开的用于培养EPSC的方法维持新建立的细胞系。

使用诸如以下特性在形态学和功能上将所得到的细胞鉴定为ciEPSC：细胞分化成三种胚胎胚层的组织的能力；(b)一种或多种胚外标志物(诸如CDX2、GATA6、HAND1和EOMES)的上调表达，(c)多潜能性的一种或多种标志物(诸如OCT4、NANOG、KL2、SOX2和UTF1(未分化的胚胎细胞转录因子))的下调；(d)多潜能性的一种或多种标志物(诸如TBX3和GBX2)的上调；和(e)形成嵌合胚胎的能力。

在从体细胞(诸如成纤维细胞)产生EPS细胞的一些实施方案中，通过将细胞在LCDM中培养足以获得圆顶状集落的一段时间，可以将体细胞直接诱导成EPS细胞，其如本文所述在LCDM条件下进一步扩增。

B.ciEPSC的分离

可以例如通过从培养源中提取(例如，通过密度梯度离心和/或流式细胞术)来获得基本上纯化的ciEPSC群。可以通过任何适当的方法来测量纯度。通过例如流式细胞术(例如FACS分析)，多潜能细胞可以99％-100％被纯化。可以通过例如利用与诱导的多潜能干细胞上的标志物或标志物组合结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子)并由此阳性地选择结合所述分子的细胞(即阳性选择)来分离人的诱导的扩展的多潜能干细胞。阳性选择方法的其它实例包括在所需和非所需细胞类型的混合群中优先促进所需细胞类型的生长的方法。或者，通过使用与不存在于所需细胞类型但存在于非所需细胞类型上的标志物结合的分子，可以从所需细胞中去除含有此类标志物的非所需细胞(即阴性选择)。其它阴性选择包括在所需和非所需细胞类型的混合群中优先杀死非所需细胞类型或抑制非所需细胞类型的生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择或其组合，可以制备富集的干细胞群。

分离程序可以包括磁性分离(使用抗体包被的磁珠、亲和层析、与单克隆抗体结合的细胞毒剂或与单克隆抗体结合使用的此类试剂(例如补体和细胞毒素)，以及用附于固体基质(例如平皿)的抗体进行“淘选(panning)”)，或者使用其它便利的技术。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道。可以将抗体与以下缀合以使得易于分离特定细胞类型：允许直接分离的标志物(诸如磁珠)，可以用结合至支撑物的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白去除的生物素，或者可以与荧光激活细胞分选仪一起使用的荧光染料。可以使用不过度损害诱导的多潜能干细胞的生存力的任何技术。在一个实施方案中，用针对标志物的抗体(例如TRA-1-81抗体)温育细胞，并且手动选择对标志物呈染色阳性的细胞并将其传代培养。

富集方法的组合可以用于改善纯化或富集的时间或效率。例如，在富集步骤(以去除具有不指示目标细胞类型的标志物的细胞)之后，可以通过荧光激活细胞分选仪(FACS)或具有高特异性的其它方法来进一步分离或富集细胞。多色分析可以用于FACS。可以基于特定抗原的染色水平或其缺乏来分离细胞。荧光染料可以用于标记对特定抗原具有特异性的抗体。这种荧光染料包括藻胆蛋白(例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白)，荧光素和德克萨斯红(Texas red)。

C.ciEPSC(及它们的后代)的培养和保存

ciEPSC可以在培养中扩增，并进行储存以供后续检索和使用。一旦建立了细胞的培养物或干细胞的混合培养物，则在存在或不存在组织形成的情况下，通过在有助于细胞增殖的条件下根据细胞密度传代至新鲜培养基将细胞群在体外有丝分裂地扩增。这样的培养方法可以包括，例如，将细胞在缺少诱导分化的特定生长因子(例如IGF、EGF、FGF、VEGF和/或其它生长因子)的培养基中传代。当达到足够的细胞密度时，可以将培养的细胞转移至新鲜的培养基。

在优选的实施方案中，用于维持ciEPSC的细胞培养基是例如补充有与用于诱导扩展的多潜能性的浓度相同的本文公开的CEPS(优选LCDM)的N2B27培养基，即，本文公开的CEP用于扩展细胞中的多潜能性并维持扩展的多潜能性。例如,用于维持ciEPSC的细胞培养基可以是N2B27培养基(不含BSA)，补充有5％KSR(敲除血清替代物)的N2B27培养基(不含BSA)。也可以使用其它基础培养基，例如，补充有20％KSR的DF12培养基。这些基础培养基补充有如上公开的CEP。根据本发明的一些实施方式，LCDM可以在培养中将ciEPSC维持在未分化的且扩展的多潜能状态达2代至超过100代。例如，LCDM可以在培养中将ciEPSC维持为未分化的且扩展的多潜能的达2、3、4、5、6、7、8、9或10代，优选多于10代，例如在培养中维持约20代，例如在培养时维持至少约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75和约80代。在优选的实施方案中，在培养中，ciEPSC在2、3、4、5、6、7、8、9、10、多于10代(例如约20代)期间维持正常核型，例如在培养时维持正常核型至少约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75和约80代。在一些实施方案中，用于促进CiEPSC增殖和单克隆形成的细胞培养基包括低浓度的ROCK抑制剂，例如2-5μM的Y27632。

根据已知的方法，诸如Doyle等人,(eds.),1995,Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester中所述的那些方法，可以将细胞冷藏保存以供储存。例如，细胞可以以例如约4-10×10⁶个细胞/ml的密度在含有或不含有5-10％甘油的情况下悬浮于“冷冻培养基”，诸如含有15-20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基。将细胞分配到小玻璃瓶或小塑料瓶中，然后将其密封并转移至程序控制的或被动的冷冻机的冷冻室。最佳冷冻速率可以凭经验确定。例如，可以使用通过熔化热给出-1℃/分钟的温度变化的冷冻程序。一旦含有细胞的小瓶已经达到-80℃，则将它们转移至液氮储存区域。冷冻保存的细胞可以储存数年。

IV.使用方法

鉴定能够产生所需细胞类型或形态的容易获得的干细胞来源对于治疗性处理、组织工程和研究是重要的。干细胞的可用性在移植、组织工程、血管生成的调节、血管发生、器官再生、人源化的动物模型、细胞替代疗法或细胞疗法以及疾病的预防等方面是非常有用的。作为基因治疗方案的一部分，这样的干细胞也可以用来将基因引入受试者。

A.提供分化的体细胞(再分化的细胞)

一旦建立，则干细胞的培养物可以用来产生后代细胞，例如能够产生新组织的成纤维细胞。可以诱导ciEPSC分化成来自三种胚层中的任一种的细胞，例如，皮肤细胞和毛细胞(包括上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞)，形成骨骼、肌肉和结缔组织的细胞(诸如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞)，实质细胞(诸如肝细胞、肾细胞、肾上腺细胞和胰岛细胞)，血细胞，视网膜细胞(和涉及感官知觉的其它细胞，诸如在耳中形成毛细胞或在舌上形成味蕾的那些细胞)，以及神经组织(包括神经)。

在一个实施方案中，通过将细胞暴露于“外胚层分化”培养基来诱导ciEPSC分化成外胚层来源的细胞。在另一个实施方案中，通过将细胞暴露于“中胚层分化培养基”来诱导ciEPSC分化成中胚层来源的细胞。在又一个实施方案中，通过将细胞暴露于“内胚层培养基”来诱导ciEPSC分化成内胚层来源的细胞。本领域技术人员已知“内胚层”、“中胚层”和“外胚层”培养基的组分。已知的细胞表面标志物可以用于证实细胞确实分化成相应细胞培养基的谱系的细胞。确认三种胚层的分化的最普遍接受的标志物是α胎蛋白(对于内胚层细胞)、α平滑肌肌动蛋白(对于中胚层)和β-III微管蛋白(对于内胚层)的表达，所有这些标志物通常在这些组织的发育中很早表达。

可以通过特定的外源性生长因子或通过改变干细胞培养的培养条件(例如密度)来触发干细胞向成纤维细胞或其它细胞类型的分化，随后由其产生组织。诱导细胞分化成所需细胞类型的细胞的方法是本领域已知的。例如，可以通过向细胞环境添加物质(例如生长因子，酶，激素或其它信号传导分子)来诱导ciEPSC分化。可以用于诱导分化的因子的实例包括促红细胞生成素，集落刺激因子(例如GM-CSF、G-CSF或M-CSF)，白细胞介素(例如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8，白血病抑制因子(LIF)，或青灰因子(Steel Factor)(Stl))，具有组织定型细胞的共培养物，或诱导干细胞变为定型于特定谱系的其它谱系定型细胞。

再分化的细胞可以在培养中扩增，并进行储存以供后续检索和使用。

B.细胞疗法

诱导的多潜能干细胞的治疗用途包括将诱导的多潜能干细胞、干细胞群或其后代移植到个体以治疗多种病理状态，包括由癌症、创伤、肿瘤(neoplasms)、损伤、病毒感染、糖尿病等引起的疾病和病症。根据本领域中目前已知的任何方法，治疗可能需要使用细胞来产生新的组织，以及使用如此产生的组织。可以将细胞植入、注射或以其它方式直接施用于组织损伤部位，以使它们在体内产生新的组织。在一个实施方案中，施用包括施用基因修饰的ciEPSC或它们的后代。

在优选的实施方案中，从自体细胞获得ciEPSC，即供体细胞是自体的。然而，可以从异源细胞获得所述细胞。在一个实施方案中，从与受体在遗传上相关的供体获得供体细胞。在另一个实施方案中，从与受体在遗传上不相关的供体获得供体细胞。

如果人ciEPSC来源于与受体受试者相比的异源(非自体的/异体的)来源，则通常施用伴行的免疫抑制疗法，例如施用免疫抑制剂环孢菌素或FK506。然而，由于人的诱导的多潜能干细胞的不成熟状态，所以可能不需要这样的免疫抑制疗法。因此，在一个实施方案中，可以在不存在免疫调节(例如免疫抑制)疗法的情况下向受体施用人的诱导的多潜能干细胞。或者，细胞可以囊封于膜中，其允许流体交换但是防止细胞/细胞接触。微囊化细胞的移植是本领域已知的，例如Balladur等人,Surgery,117:189-94,1995；和Dixit等人,CellTransplantation 1:275-79(1992)。

(i)糖尿病

糖尿病(DM)是由于胰腺不产生足够的胰岛素或者由于细胞不响应产生的胰岛素，因而受试者具有高血糖的一组代谢性疾病。胰岛素疗法的有希望的替代物是向需要胰岛素的患者提供胰岛细胞。Shapiro等人,N Engl J Med.,343(4):230-8(2000)已经证明β细胞/胰岛的移植为糖尿病患者提供了治疗。尽管许多胰岛素类型是可商购的，但是这些制剂作为注射剂提供。人的诱导的多潜能干细胞提供了胰岛细胞的替代来源以预防或治疗糖尿病。例如，可以分离诱导的多潜能干细胞并将其分化成胰细胞类型并递送给受试者。或者，可以将诱导的多潜能干细胞递送至受试者的胰腺并使其在体内分化成胰岛细胞。因此，细胞可用于移植以预防或治疗糖尿病的发生。例如在Naziruddin等人的美国专利号8,637,494中公开了减少细胞因子暴露后的炎症而不影响胰岛细胞活力和效力的方法。

(ii)神经退行性疾病

神经退行性疾病的特征在于涉及由疾病、遗传病或损伤(诸如外伤性或缺血性脊髓损伤或脑损伤)引起的神经元恶化的病症。神经退行性病症包括涉及神经元损伤或恶化的任何疾病或病况，或其症状或原因或影响。神经退行性病症可以包括，但不限于，亚历山大病(Alexander Disease)，阿尔珀病(Alper’s Disease)，阿尔茨海默病(AlzheimerDisease)，肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis)，共济失调性毛细血管扩张症(Ataxia Telangiectasia)，卡纳万病(Canavan Disease)，科克恩综合征(CockayneSyndrome)，皮质基底节退化症(Corticobasal Degeneration)，克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)，亨廷顿病(Huntington Disease)，肯尼迪病(Kennedy’s Disease)，克拉伯病(Krabbe Disease)，路易体痴呆(Lewy Body Dementia)，马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph Disease)，多发性硬化症(Multiple Sclerosis)，帕金森病(Parkinson Disease)，佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)，尼-皮二氏病(Niemann-Pick’sDisease)，原发性侧索硬化症(Primary Lateral Sclerosis)，雷夫叙姆病(Refsum’sDisease)，桑德霍夫病(Sandhoff Disease)，谢耳德病(Schilder’s Disease)，斯-里-奥三氏病(Steele-Richardson-Olszewski Disease)，脊髓痨(Tabes Dorsalis)，或与受损神经元相关的其它病症。其它神经退行性病症可以包括或由其导致：外伤性脊髓损伤，缺血性脊髓损伤，中风，外伤性脑损伤和遗传病。

特别地，所公开的方法包括将NSC、神经祖细胞或已经在体外扩增的神经前体移植到有需要的受试者中，使得所述细胞可以改善神经退行性病症。扩增的神经干细胞的移植可以用于改善患有各种形式的脊髓病的患者(带有痉挛、僵直、发作(seizures)、瘫痪或任何其它肌肉过度活动的症状)的行走功能。例如，在Johe等人的美国专利号8,236,299中公开了扩增和移植神经细胞和神经祖细胞以治疗不同的神经退行性疾病的方法。

(iii)癌症疗法

ciEPSC及其后代的治疗用途包括将诱导的多潜能干细胞、干细胞群体或其后代移植到个体以治疗和/或改善与癌症相关的症状。例如，在一个实施方案中，可以将ciEPSC施用至已经经历杀死、减少或损伤受试者细胞的化学疗法的癌症患者。在典型的癌症干细胞移植中，使用非常高剂量的化学疗法(通常与放射疗法一起)，以试图消灭所有的癌细胞。这种治疗也杀死了骨髓中的干细胞。治疗后不久，给予干细胞替代那些被毁坏的干细胞。

在另一个实施方案中，可以用至少一种另外的治疗因子转染或转化ciEPSC(除了去分化因子之外)。例如，一旦分离出ciEPSC，细胞可以用编码治疗性多肽的多核苷酸转化，然后植入或施用至受试者，或者可以分化成所需的细胞类型并植入和递送至受试者。在这样的条件下，多核苷酸在受试者内表达用于递送多肽产物。

(iii)组织工程

使用本领域已知的方法，ciEPSC及它们的后代可以用于制造组织工程构建体。组织工程构建体可以用于各种目的，包括修复或替代受损器官或组织的假体装置。它们也可以用作用于由构建体的细胞分泌的蛋白质或其它分子的体内递送系统，或者通常用作药物递送系统。组织工程构建体也用作组织功能的体外模型或用作测试各种治疗或药物的效果的模型。用于移植干细胞的最常用生物材料支架综述于用于移植干细胞的最常用生物材料支架综述于Willerth,S.M.和Sakiyama-Elbert,S.E.,Combining stem cells andbiomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery(2008年7月9日),StemBook,ed.The Stem Cell Research Community,StemBook。组织工程技术经常涉及选择合适的培养基质以支撑和促进组织生长。通常，这些基质应该是三维的并且应该是可加工的以形成目标组织的所需形状的支架。

美国专利号6,962,814大体上公开了生产组织工程构建体和工程改造的天然组织的方法。关于具体的实例，Vacanti等人的美国专利号7,914,579公开了组织工程韧带和肌腱。美国专利号5,716,404公开了使用与聚合基质结合植入的分离的肌肉细胞来重建或增大乳房组织的方法和组合物。美国专利号8,728,495公开了使用自体皮肤成纤维细胞修复软骨。Duailibi等人的美国公开申请号20090029322公开了使用干细胞以形成用于制造牙齿替代物的牙组织。美国公开申请号2006/0019326公开了用于治疗颅内动脉瘤的细胞-接种组织工程聚合物。Atala的美国公开申请号2007/0059293公开了可以用于替代受损器官(例如肾脏，心脏，肝脏，脾脏，胰腺，膀胱，输尿管和尿道)的组织工程构建体(和用于制造这种构建体的方法)。

(ii)由ciEPSC产生的细胞(后代)

可以诱导ciEPSC分化成来自三种胚层中的任一种的细胞，例如，皮肤细胞和毛细胞(包括上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞)，形成骨骼、肌肉和结缔组织的细胞(诸如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞)，实质细胞(诸如肝细胞、肾细胞、肾上腺细胞和胰岛细胞(例如α细胞、δ细胞、PP细胞和β细胞))，血细胞(例如白细胞、红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)，视网膜细胞(和涉及感官知觉的其它细胞，诸如在耳中形成毛细胞或在舌上形成味蕾的那些细胞)，以及神经组织(包括神经)。

(iii)治疗性组合物

可以配制ciEPSCs用于施用、递送或接触受试者、组织或细胞以促进体内或体外/离体的去分化。可以并入其它因子，诸如生长因子，诱导分化或去分化的其它因子，分泌产物，免疫调节剂，抗炎剂，退化因子，促进神经支配、血管化或增强淋巴网络的生物活性化合物，以及药物。

诱导的多潜能细胞可以通过组合物的方式施用至患者，所述组合物包含单独的ciEPSC或ciEPSC后代的群，或者在载体或支撑结构上或在载体或支撑结构中的ciEPSC或ciEPSC后代的群。在许多实施方案中，将不需要载体。细胞可以通过注射施用到需要细胞的部位上或施用到其中。在这些情况下，通常将细胞洗涤以去除细胞培养基，并将其悬浮在生理缓冲液中。

在其它实施方案中，细胞被提供或并入到支撑结构上或支撑结构中。支撑结构可以是网状物，固体支撑物，支架，管，多孔结构，和/或水凝胶。支撑结构可以是全部或部分可生物降解的或不可生物降解的。支撑物可以由天然或合成聚合物，金属(诸如钛)，骨或羟基磷灰石，或者陶瓷形成。天然聚合物包括胶原蛋白，透明质酸，多糖和糖胺聚糖。合成聚合物包括多羟基酸(诸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物)，聚羟基链烷酸酯(诸如聚羟基丁酸酯)，聚原酸酯，聚酐，聚氨酯，聚碳酸酯和聚酯。这些可以呈植入物、管、网状物或水凝胶的形式。

固体支撑物

支撑结构可以是松散的编织网或非编织网，其中细胞被接种在网中和网上。该结构可以包括固体结构支撑物。支撑物可以是管，例如，用于神经轴突再生的神经管。支撑物可以是支架(stent)或瓣膜。支撑物可以是关节假体，诸如膝盖或臀部或其一部分，其具有允许细胞向内生长和/或将细胞接种到多孔结构中的多孔界面。许多其它类型的支撑结构也是可能的。例如，支撑结构可以由海绵状物，泡沫状物，珊瑚状物或具有内孔的生物相容性无机结构，或交织聚合物纤维的网状片形成。可以使用已知的方法制备这些支撑结构。

支撑结构可以是具有使水凝胶-细胞混合物成形并支撑水凝胶-细胞混合物的孔样腔或间隙的可渗透结构。例如，支撑结构可以是多孔聚合物网状物，天然或合成的海绵状物，或由金属或诸如骨或羟基磷灰石的材料形成的支撑结构。支撑结构的孔隙度应该使得营养素可以扩散到结构中，从而有效地到达内部的细胞，并且由细胞产生的产物可以扩散到结构外。

支撑结构可以成形为符合新组织所需的空间。例如，支撑结构可以成形为符合已经被烧伤的皮肤区域的形状或已经丢失的软骨或骨的部分的形状。取决于制造它的材料，支撑结构可以通过切割，模制，铸造，或任何其它产生所需形状的方法成形。如下所述，可以在支撑结构接种细胞或填充水凝胶-细胞混合物之前或之后或者使支撑物成形。

合适的聚合物的实例是polyglactin，其是乙交酯和丙交酯的90:10共聚物，并且被制造为VICRYL^TM编织的可吸收缝线(Ethicon Co.,Somerville,N.J.)。聚合物纤维(诸如VICRYL^TM)可以被编织或压缩成毡样聚合物片材，其然后可以切割成任何所需的形状。或者，聚合物纤维可以在将它们铸造成支撑结构所需形状的模具中一起压缩。在一些情况下，可以在聚合物纤维被模制时将另外的聚合物添加到聚合物纤维中以修改或赋予纤维网的附加结构。例如，可以将聚乳酸溶液添加到这种聚乙二醇纤维网的片材中，并且可以将这种组合一起模制以形成多孔支撑结构。聚乳酸结合聚乙醇酸纤维的交联，由此涂覆这些单独的纤维并固定模制纤维的形状。聚乳酸也填充纤维之间的空间。因此，孔隙率可以根据引入到载体中的聚乳酸的量而变化。将纤维网模制成所需形状所需的压力可以相当温和的。所需要的是，将纤维保持就位足够长的时间以使聚乳酸的结合和涂覆作用生效。

备选地或另外地，支撑结构可以包括通过本领域已知的技术生产的其它类型的聚合物纤维或聚合物结构。例如，可以通过从聚合物溶液中蒸发溶剂来获得聚合物薄膜。如果聚合物溶液从具有所需形状的浮雕图案的模具蒸发，则这些薄膜可以被铸造成所需的形状。还可以使用本领域已知的压模技术将聚合物凝胶模制成薄的、可渗透的聚合物结构。

水凝胶

在另一个实施方案中，将细胞与水凝胶混合以形成细胞-水凝胶混合物。水凝胶可以通过注射或导管施用，或者在植入其它支撑结构时施用。交联可以在施用之前、施用期间或施用之后发生。

V.试剂盒

提供包括本文公开的扩展的多潜能性的化学诱导剂(CEP)的试剂盒。CEP如上所描述。这些可以呈具有限定浓度的形式以便于添加到细胞培养基以产生所需浓度。试剂盒可以包括基于供体细胞类型提供所需浓度范围和施用时间的说明书。试剂盒还可以包括与CEP预混合的细胞培养基，用于培养供体细胞以诱导扩展的多潜能性。

参照以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例

方法

小分子文库

用于筛选的小分子文库如表1中所述购买或内部生成。

表1.用于筛选的小分子化合物文库

*该文库由内部生成，包括108个与多潜能性或表观遗传修饰有关的所选择的小分子。

基于荧光素酶报告基因测定的化学筛选

最初的努力集中于鉴别支持人类幼稚多潜能性的新小分子。基于支持小鼠中的幼稚多潜能性的2i加LIF条件(ERK抑制剂PD0325901，GSK3β抑制剂CHIR99021，和人LIF(hLIF))，使用引发的hES细胞进行初始筛选以鉴定能够激活幼稚多潜能性标志物OCT4远端增强子(DE)的化合物(Yeom等人,Development,122:881-894(1996)；Tesar等人,Nature,448:196-199(2007)(图1A和表1)。

Oct4位于多潜能细胞中的多潜能性调控层次的顶端。Oct4基因的转录起始位点的上游区域含有三个用于基因转录的调控元件：远端增强子(DE)，近端增强子(PE)，和无TATA的近端启动子(PP)。每个增强子都含有多个可以激活或抑制Oct4的表达的潜在的转录因子结合位点。

使用建立的引发的hES H9细胞(人胚胎干细胞系H9)进行第一次筛选，以鉴定激活OCT4 DE的小分子。引发的hES/hPS(人多潜能干)H9细胞在

(细胞脱离溶液)(Millipore)中解离。然后，通过核转染(4D-Nucleofector^TM系统,Lonza)将OCT4-DE荧光素酶质粒(Addgene)转染到H9细胞中。将对照载体pGL4.74[hRluc/TK](Promega,E6921)共转染用于标准化。

转染后，将引发的hES/hPS H9细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到基质胶(matrigel)包被的24孔板中，并在常规人胚胎干细胞(ES)培养基(DF12加20％KSR，在下文提供详细配制)加Y27632[(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺+++二盐酸盐)],即Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂(10μm)中培养。

12小时后，用补充有hLIF(人白血病抑制因子)+2i(10ng/mL hLIF(Peprotech)，1μm ERK(细胞外信号调节激酶)抑制剂PD0325901(Tocris)，和3μm GSKβ抑制剂CHIR99021(Tocris)的N2B27培养基(在下文提供N2B27培养基的详细配制)替代所述培养基。将来自文库的单个化合物分别添加到每个孔中。测试表1中的所有化合物。处理6天后，裂解H9细胞用于使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega,E1960)检测萤光素酶活性。

与引发的hES细胞对照相比，基于DE萤光素酶活性的两倍上调将化学品被鉴定为阳性候选物。筛选后，获得了超过100个候选物，其与传统引发的hPSC培养基中培养的细胞相比，OCT4 DE活性提高了2倍以上。

支持圆顶状hES细胞集落形成的小分子的鉴定

引发的hES是扁平集落。相比之下，幼稚人多潜能细胞是圆顶状集落。因此，任何所得的人EPS细胞都可以在形态学上与引发的人类多潜能干细胞区分开来。

进一步筛选来自上述第一次筛选的阳性候选物以鉴定支持hES细胞的不依赖TGFβ信号传导的自我更新的小分子(Tesar等人,Dev.,448:196-199(2007)；James等人,Dev.,132:1273-1282(2005)；Vallier等人,J.Cell.Sci.,118:4495-4509(2005))。在处理后期(图1A)，将TGFβ抑制剂SB431542添加到化学混合物(2i+LIF+候选物)中。

特别地，使用

(细胞脱离溶液)将引发的hES/hPS H9细胞消化成单细胞，并在第0天在常规hES培养基加Y27632中接种到基质胶包被的24孔板(1×10⁴个细胞/孔)。在第1天，将常规hES培养基替换为补充有hLIF+2i基质的N2B27培养基，并将来自第一轮筛选的候选物分别添加到每个孔中。培养基每两天更换一次，并用补充有hLIF+2i的新鲜N2B27培养基替代。6天后(即第7天)，将TGF(转化生长因子)β抑制剂SB431542(10μm,Tocris)添加到未分化细胞的孔中达额外6天。在本次筛选后，获得了30多个短期内支持不依赖TGF-β信号传导的自我更新的候选物。

引发的hES/hPS和幼稚NHSM-hES细胞的培养

使用如下已经建立的引发的hES/hPS细胞系(用于EPS转变的细胞系的传代数在括号中显示)：H1(30代)，0227E(约20代)，HSF1(约50代)和HSF6(约60代)和H9(40代)。从WiCell获得hES/hPS细胞系H1(WA01)和H9(WA09)，并通过核型分析进行验证。在常规的hES/hPS细胞培养基中：补充有20％敲除血清替代物(KSR)(Invitrogen)、1mm谷氨酰胺(Invitrogen)或1％GlutaMAX(Invitrogen,35050)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mmβ-巯基乙醇(Invitrogen)和4-10ng/ml bFGF(基础成纤维细胞生长因子)(Peprotech)的DMEM-F12(Invitrogen)，在丝裂霉素C灭活的MEF饲养细胞(2x 10⁴/cm²)或基质胶包被的培养皿上，在20％O₂、5％CO₂的条件下维持引发的hES细胞。每5-7天以1:3至1:5的分流比使用分散酶传代细胞系。根据先前的报道(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))，培养幼稚NHSM-hES细胞。

小鼠幼稚ES细胞的培养。

在含有补充有10ng/mL hLIF(Peprotech)、3μm CHIR99021(Tocris)和1μmPD0325901(Tocris)的无血清N2B27培养基的的2i培养基中，在丝裂霉素C灭活的MEF饲养细胞或明胶包被的培养皿上，在20％O₂、5％CO₂的条件下维持小鼠幼稚ES细胞。细胞每2-4天通过0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)进行传代。

将非-hEPS细胞转变成hEPS细胞。

N2B27-LCDM培养基的制备

500ml的N2B27培养基由以下产生，包括：240ml DMEM/F12(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)/营养素混合物F-12)(Invitrogen,11320)，240ml

培养基(基础细胞培养基)(Invitrogen,21103-049)，2.5ml N-2补充物(Invitrogen,17502048)，5ml B-27补充物(Invitrogen；17504010)，1mm谷氨酰胺或GlutaMAXTM(Invitrogen)，1％非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mmβ-巯基乙醇(Invitrogen)，青霉素-链霉素(Invitrogen)，(任选的)5mg/mL BSA(牛血清白蛋白)(Sigma)，和如下小分子抑制剂。

小分子和细胞因子(购自Peprotech，Tocris或Santa Cruz)如所示以以下终浓度补充：hLIF：10ng/mL；CHIR99021：3μm(对于小鼠EPS细胞)以及1-1.5μm(对于人EPS细胞)；(S)-(+)-马来酸二甲茚定(DiM)：2μm；盐酸米诺环素(MiH)：2μm。将补充有小分子和细胞因子的N2B27培养基称为N2B27-LCDM。使用基于PCR的方法或MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)按照制造商的建议对所有细胞系进行支原体污染的测试。

(a)将引发的hES/hPS细胞转变成hEPS细胞。

通常在引发的hES/hPS细胞的最后一次传代后的第3天或第4天(如果它们每5-6天传代一次)进行转变。集落通常达到60-70％会合(confluence)。

在转变之前，引发的hES细胞保持未分化状态，其在转变当天没有过度生长。

在将引发的细胞(3×10⁴个细胞/cm²)传代前的那天接种丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞。

使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将引发的hES/hPS细胞消化成单细胞。消化后，将细胞以1:3至1:4的分流比正常地接种于人ES培养基中。随后，在人ES培养基中接种12小时后，用N2B27-LCDM培养基替代人ES培养基。每天更换N2B27-LCDM培养基。对于在单细胞传代后几乎不能存活的引发的hES细胞系，在转变前24小时将Y27632(1-10μm)添加到培养基中，并在最初几代(3-5代)保存在LCDM培养基中。或者，使用分散酶将引发的hES细胞消化成小集落，并使用常规hES培养基接种。12或24小时后，将hES培养基替换为含有LCDM的培养基。任选地，如果引发的人PS细胞在Y27632处理后耐受单细胞消化，则可以使用0.05％胰蛋白酶-EDTA将引发的人PSC消化成单细胞。Y27632应该在传代前后12小时期间添加到培养基。

在此期间逐渐出现了圆顶状集落。然后，3-6天后，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen,25300)在培养箱中在37℃将细胞进行胰蛋白酶消化3分钟。MEF培养基用来停止胰蛋白酶消化。通过上下缓慢吸移培养基将细胞从培养皿表面洗掉：将其收集在适当大小的管中并在室温下以1,200-1,600rpm(250-450xg)离心3分钟。将细胞重悬于适当体积的N2B27-LCDM培养基(根据细胞系和生长比率)，并且接种到具有MEF饲养细胞的平皿上。对于一个六孔板，接种大约50,000-100,000个细胞/孔。分流比通常为1:3至1:10。然后，在37℃，在20％O₂、5％CO₂下温育细胞。如果传代后细胞仍然难以存活，则在最初几代(3-5代)期间添加Y27632以确保成功转变：在传代前后12小时期间添加。如果在单细胞传代后细胞生长缓慢，则建议在最初几代(3-5代)期间降低分流比(从2:1到1:3)。几次传代后，在LCDM培养基中培养的细胞逐渐可以良好增殖。

对于嵌合实验，建议使用具有较高代数(转变后代数＞10)的来源于引发的hPSC的hEPS细胞，以确保人EPS细胞重编程为扩展的多潜能状态。在我们的实验中，在第10代转变的圆顶状集落在嵌合实验中显示双潜能性，这表明转变的最小培养期可以是10代(约40天)。由我们实验室的六位不同的同事在至少20个独立的实验中重复了人的引发的多潜能干细胞向EPS细胞的转变。

(b)从胚泡衍生人EPS细胞。

通过临床目的的体外受精产生的胚泡期的人胚胎在获得书面同意和批准的情况下获得。将整个胚胎接种到丝裂霉素C灭活的MEF饲养细胞上(4×10⁴/cm²)，并在用蛋白酶(Sigma,P8811)去除透明带之后在LCDM培养基中培养。在接种胚胎前至少半小时将MEF细胞培养基更换为FBS-LCDM培养基。

FBS-LCDM培养基由以下制备，包括：补充有10％敲除血清替代物(KSR)(Invitrogen,10828010)、10％FBS(Hyclone,SH30070.03E)、1％GlutaMAX(Invitrogen,35050)、1％非必需氨基酸(Invitrogen,21103)和0.1mmβ-巯基乙醇(Invitrogen,21985)和LCDM(10ng/mL；分别为1.5μM、2μM和2μM)的敲除DMEM(10829-018,Invitrogen)。为了提高胚胎在一些实验中的存活率，将Y27632(10μM,Tocris,1254)添加到FBS-LCDM培养基。

对于未孵化的胚泡，通过蛋白酶(Sigma,P8811)去除透明带。处理蛋白酶的时间在不同胚泡之间是不同的，从半分钟到5分钟不等。当透明带逐渐开始消失时，将胚泡转移到先前制备的G2 PLUS培养基中。将胚胎洗涤3-5次以尽可能去除残留的蛋白酶，然后将它们接种到制备的MEF饲养细胞上。两天后，如果胚胎附着在MEF饲养细胞上，则将FBS-LCDM培养基更换为N2B27-LCDM培养基。否则，去除培养的FBS-LCDM培养基的一半并转换成N2B27-LCDM培养基。

在4至7天后可以看到初始生长晕，并将其机械解离成小块，并用FBS-LCDM培养基重新接种于MEF饲养细胞。使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将新建立的细胞系进一步传代，然后冷冻或用于进一步分析。

在最初几代(3-5代)期间，集落应该机械解离并在接种后的前2天在补充有Y27632(10μM)的FBS-LCDM培养基中培养。之后将FBS-LCDM培养基更换为N2B27-LCDM培养基。逐渐出现形态学上类似于小鼠ES集落的集落。如果这些集落存活且增殖良好，可以使用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化细胞。使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将新建立的细胞系进一步传代，然后将它们冷冻或用于进一步分析。

(c)体细胞的重编程和细胞感染。

为了用基于oriP/EBNA1的附加型载体进行重编程，通过核转染(4D-Nucleofector^TM系统,Lonza)将包括pCXLE-hOCT3/4(插入物：人OCT3/4)、pCXLE-hSK(插入物：人SOX2和LKF4)、pCXLE-hUL(插入物：人L-MYC)和pCXLE-EGFP(插入物：eGFP)(Addgene27076,27078,27080,27082)(Okita等人,Nat.Methods,8(5):409-12(2011))共转染到成纤维细胞中。

将转染的成纤维细胞(大约1.0×10⁶个细胞/核转染)直接铺在一个含有10％胎牛血清(Invitrogen)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；Hyclone)中的三个10cm饲养细胞接种皿中。在感染后7天将成纤维细胞重新铺板，并在含有10％胎牛血清和含有50ng/mlbFGF(Origene)、3μm CHIR99021、10ng/ml人LIF(Peprotch)、10μm毛喉素(Forskolin)(Tocris)的10％KSR的敲除DMEM(Gibco)中培养。培养基每隔一天更换一次。在转染后第12天，用LCDM培养基替换所述培养基。在转染后第15天可以看到具有与EPS集落相似形态的集落。挑取集落并用0.05％胰蛋白酶-EDTA传代用于进一步分析。

小鼠

所有的小鼠工作都得到了机构性动物管理和使用委员会的批准。本研究中使用的小鼠品系包括C57BL/6J-Tg(GOFGFP)11Imeg/Rbrc(OG)，C57BL/6NCrlVr(C57)，ICR和STOCKTg(Sox2-cre)1Amc/J与B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J之间的F1杂交体(它们购自Jackson实验室)，以及C57BL/6NCrlVr(C57)与129之间的F1杂交体或C57BL/6NCrlVr(C57)与DBA之间的杂交体。用于畸胎瘤形成测定的免疫缺陷小鼠是商购的。

小鼠EPS细胞的建立和培养。

对于直接来源于胚泡的mEPS细胞，将OG、C57、ICR或STOCK Tg(Sox2-cre)1Amc/J与B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠之间的F1杂交体、或C57BL/6NCrlVr(C57)与129之间的杂交体的胚囊在LCDM培养基的情况下接种到MEF饲养细胞。4天后，观察生长晕并将其切成单细胞。mEPS细胞每2-3天传代一次，并冷冻或用于进一步分析。

对于直接由小鼠幼稚ES细胞TT2-2i(小鼠幼稚ES细胞)转变的mEPS细胞，在接种后12小时将2i培养基替换为LCDM培养基。2-3天后，将集落传代用于进一步分析。

人和小鼠的扩展的多潜能干细胞的培养。

将人和小鼠的扩展的多潜能干细胞在20％O₂、5％CO₂条件下在无血清的N2B27-LCDM培养基中培养。为了使人类EPS细胞维持未分化状态，使用以下标准：a)避免过度稀疏地将人类EPS细胞铺板；b)使用适量的新鲜制备的MEF饲养细胞；和c)不允许人类EPS细胞过度生长(例如，达到多于90％会合；优选地，细胞应该低于90％会合)。因此，将人和小鼠的EPS细胞在丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞(3×10⁴个细胞/cm²)，并通过单细胞胰蛋白酶消化(0.05％胰蛋白酶-EDTA,Invitrogen)每2-4天传代一次(通常以1:6至1:10的分流比)。EPS细胞的传代次数表示获得扩展的多潜能状态后计数的传代次数。将N2B27-LCDM培养基每天更换为新鲜的LCDM培养基。

小鼠胚胎显微操作、整装染色和成像。

跨物种嵌合测定得到了道德委员会的批准。

对于嵌合实验，在人和小鼠EPS细胞应该进行传代之前1天使用它们；这些细胞表现出最佳的未分化形态，并呈指数增长。在这个时间点，集落应该处于亚会合密度(大约70％密度)。

对于hEPS细胞注射，将hEPS细胞用胰蛋白酶消化(通过0.05％胰蛋白酶-EDTA)，并且将消化的细胞通过细胞过滤器(40μm)过滤。之后，将细胞在室温下以1,200-1,500rpm(250-390×g)离心3分钟。去除上清液，将细胞以适当的密度(2-6×10⁵个细胞/mL)重悬于培养基中。对于人类细胞注射，建议将10μM Y27632添加到悬浮液中。在注射前将悬浮液置于冰上20-30分钟，并且显微注射到ICR二倍体小鼠胚胎的E2.5或E3.5胚胎(10–15个细胞/胚胎)。将大约15个注射的胚胎转移到交配后0.5或2.5天假孕女性的每个子宫角。

为了注射Tdtomato标记的mEPS细胞和常规幼稚小鼠ES细胞，将mEPS和幼稚小鼠ES细胞用胰蛋白酶消化并以与hEPS细胞相同的方式(除了Y27632没有添加到悬浮液中)进行显微注射。

在E10.5发育阶段解剖孕体以用抗-人细胞核抗体(克隆235-1,1:300；Millipore)进行整装染色，根据Abcam的整装染色方案用抗-GATA4(sc-1237,1:200；Santa Cruz)或抗-SOX2(1:200,sc-17320；Santa Cruz)抗体进行共转染。

对于共聚焦分析，安装的胚胎通过UltraVIEW VoX系统(PerkinElmer)成像。

在E12.5发育阶段解剖孕体，并使用用于检测Tdtomato+细胞定位的免疫荧光立体显微镜进行观察。偶尔地，如果没有从这些小鼠获得小鼠胚胎，则将几个怀孕的小鼠从进一步分析中排除。

对于组织切片的免疫染色，从E10.5孕体中分离胚胎和胎盘，然后进行包埋，冷冻，从矢状侧切片(5μm厚)。用抗-NANOG(1:200,ab80892；Abcam)和抗-Tdtomato/RFP(1:400,ab62341；Abcam)对用Tdtomato报告基因标记的人类细胞进行染色，并且用抗-Tdtomato/RFP(1:400,ab62341；Abcam)、抗-CK8(1:50,sc-52324；Santa Cruz)和抗-hCGβ(1:200,ab131170；Abcam)对胎盘进行染色。从矢状侧切下一些胚胎(5μm厚)。用抗-FOXA2(ab108422,1:50；Abcam)和抗-人细胞核抗体(克隆235-1,1:300；Millipore)对胚胎进行染色。所有这些样品都通过ImageXpress Micro高内容筛选系统(MolDev)进行成像。

从E10.5嵌合小鼠孕体中检测胎盘和卵黄囊中的来源于hEPS的细胞

为了检测hEPS细胞的胚外嵌合状态，从E10.5孕体中分离胎盘和卵黄囊，并使用胶原酶IV进行消化。将分离的原代细胞接种到24孔板中，并且在进一步分析之前将其在补充有10％FBS和10％KSR的敲除DMEM中培养3-4天。

单细胞显微注射的嵌合测定。

本实验中使用的细胞以与多细胞显微注射相似的方式进行培养和制备。注射前将细胞悬液置于冰上20-30分钟。置于冰上后，将消化的单细胞在1小时内用于注射：换言之，整个注射过程不应该超过30分钟。之后，将注射的胚胎在具有5％CO₂的湿润培养箱中在37℃恢复1-2小时。如果将细胞置于冰上超过1小时，则消化另一批细胞用于剩余的注射。将单细胞(Tdtomato标记的人类细胞，未标记的人类细胞，Tdtomato标记的mEPS和幼稚小鼠ES细胞)显微注射到8-细胞阶段ICR二倍体小鼠胚胎中，并允许离体发育直到E5.0(60小时，在补充KSOM(补充K(钾)的单纯优化培养基)中；Summers等人,J.Assist Reprod.Denet.,30(8):995-999*(2013))。在其它实验中，为了产生嵌合胚泡，将注射的胚胎在N2B27-LCDM培养基中培养最初4小时(建议添加10μM Y27632(Tocris,1254)用于培养经单个hEPS细胞注射的嵌合胚胎)，然后将它们转变成G2 PLUS培养基(Vitrolife,10131)。60小时后，将胚胎固定并进行免疫染色。

然后，将胚胎固定并进行免疫染色。对于用Tdtomato标记的人类细胞注射的胚胎，抗体包括OCT4(sc-5279；Santa Cruz或ab181557；Abcam)和CDX2(ab74339；Abcam或CDX2-88,AM392；Biogenex)。对于未标记的人类细胞，抗体包括：抗-人细胞核抗体(MAB1281；Millipore)，CDX2(sc-19478；Santa Cruz)和OCT4(Ab18976-100；Abcam或ab181557；Abcam)。为了注射mEPS和幼稚小鼠ES细胞，将细胞用Tdtomato报告基因进行组成型标记。显微注射和免疫染色与上述相同地进行。抗体包括：CDX2(CDX2-88,AM392；Biogenex)，OCT4(Ab18976-100；Abcam)。

为了检查单个mEPS细胞的体内嵌合能力，经单个mEPS细胞注射的嵌合胚胎在含有5％CO₂的湿润培养箱中在37℃恢复1-2小时，并将其转移至交配后0.5或2.5天假孕女性的子宫角。在E10.5、E12.5或E17.5发育阶段解剖孕体，并使用用于检测Tdtomato+细胞定位的免疫荧光立体显微镜进行观察。从E10.5孕体中分离胎盘，然后进行包埋，冷冻，从矢状侧切片(5μm厚)，然后用CK8(1:50,sc-52324；Santa Cruz)、PROLIFERIN(1:50,sc-47345；SantaCruz)和TPBPA(1:100,ab104401；Abcam)染色。样品进一步通过ImageXpress Micro高内容筛选系统(MolDev)进行分析。

从单个mEPSD嵌合的胚胎衍生滋养层干(TS)样细胞和ES样细胞。

将Tdtomato标记的单个mEPS细胞注射到8-细胞小鼠胚胎中，并在N2B27-LCDM培养基中培养4小时。将注射的胚胎转移至G2 PLUS培养基并培养另外56小时。通过将它们中的一半接种到传统的mES衍生培养基中而将其它接种到传统的TS衍生培养基中，相同的嵌合胚胎被用来产生ES和TS细胞系二者¹³。ES样集落和TS样集落二者同时来源于同一嵌合胚胎。在该测定中分别将Tdtomato标记的传统小鼠ES TT2和mc2i-1用作对照，并且每个8-细胞胚胎被注射10-15个细胞。

TS样细胞和ES样细胞的嵌合测定。

将建立的TS样细胞系或ES样细胞系的10-15个细胞注射到8-细胞小鼠胚胎中。对于体外嵌合分析，注射的胚胎在G2 PLUS培养基中培养60小时。然后，将它们固定并进行免疫染色。对于体内嵌合测定，在E13.5发育阶段解剖孕体，并使用免疫荧光立体显微镜进行观察来检测荧光阳性细胞的存在。

免疫荧光。

将细胞在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟，并且用含有0.2％Triton X-100和3％正常驴血清(Jackson Immuno Research)的PBS在室温下封闭45分钟。细胞与一抗在4℃温育过夜。二抗(Jackson Immuno Research)在室温下温育1小时。细胞核用DAPI(Roche)染色。下面提供了抗体的细节。

对于人类细胞，使用的抗体是：抗-OCT4抗体(Ab18976-100；Abcam；sc-5279；SantaCruz)，抗-人NANOG抗体(AF1997；R&D)，抗-SOX2抗体(sc-17320；Santa Cruz)，抗-三甲基-组蛋白H3(Lys27)抗体(07-449；Millipore)和KLF4(sc-20691；Santa Cruz)。对于小鼠细胞，抗体是：抗-NANOG(ab80892；Abcam)，抗-KLF(kruppel样因子)4(sc-20691；SantaCruz)，OCT4(Ab18976-100；Abcam)，SALL4(ab29112；Abcam)和SOX2(sc-17320；SantaCruz)。

对于嵌合胚泡的免疫荧光分析，使用的抗体包括：OCT4(ab181557；Abcam)，GATA3(ab199428；Abcam)，NANOG(ab80892；Abcam)和CDX2(CDX2-88,AM392；Biogenex)。对于TS样细胞、ES样细胞或TS培养基中培养的细胞的免疫荧光分析,使用的抗体包括：OCT4(sc-5279；Santa Cruz)，NANOG(ab80892；Abcam)，SOX2(sc-17320；Santa Cruz)，CDX2(CDX2-88,AM392；Biogenex)和EOMES(ab23345；Abcam)。

流式细胞术

分离胚胎、卵黄囊和胎盘的嵌合组织并使用胶原酶IV将其消化成单细胞。通过细胞过滤器(40μm)过滤悬浮液。然后，在BD LSRFortessa机器上分析样品。使用FlowJo软件(Ashland)进行数据分析。

分析来源于mEPS的胎盘细胞中的滋养层标志物基因表达

分离嵌合胎盘组织并使用胶原酶IV消化。原代Tdtomato⁺和Tdtomato^-胎盘细胞二者都使用FACS进行纯化。使用Trizol(Invitrogen)提取纯化的细胞的总RNA。如前所述制备cDNA³¹。根据qPCR模板的需要，将扩增的cDNA产物稀释10倍。使用KAPA

FAST qPCR试剂盒在Bio RAD CFX Connect实时系统上进行定量PCR分析。用于实时PCR的引物在表2中列出。

基于Transwell侵袭测定。

分离嵌合胎盘组织并使用胶原酶IV消化。将来自一个或一半嵌合胎盘的原代胎盘细胞接种到24孔板中的Matrigel^TM包被的过滤器(8μm孔径；BD Biosciences,FranklinLakes,NJ,USA)上。简言之，将细胞在无血清DMEM/F12培养基中接种到Transwell的上部室中。Transwell的下部室充满含有10％FBS的DMEM/F12培养基。所述室在5％CO₂的情况下在37℃温育24小时。在温育结束时，使用棉签去除过滤器上表面上的细胞。侵袭通过过滤器至下表面的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，并且通过免疫荧光进行进一步分析。以下抗体用于免疫荧光：CK8(1:200,sc-52324；Santa Cruz)，CK7(1:40,MA5-11986；ThermoScientific)和Tdtomato/RFP(1:400,ab62341；Abcam)。

人OCT4转录调节的评价

为了评价检测的人类细胞系的人OCT4转录调节，通过核转染(4D-Nucleofector^TM系统,Lonza)将OCT4-DE荧光素酶质粒(Addgene)转染到细胞中。将对照载体pGL4.74[hRluc/TK](Promega,E6921)共转染用于标准化。通过用空载体进行转染来分析基线活性。转染后，将细胞系以5×10³个细胞/孔的密度接种到基质胶包被的96孔板中。然后，48小时后，裂解细胞用于使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega,E1960)检测萤光素酶活性。

EB形成测定

将小鼠和人EPS细胞用胰蛋白酶消化成单细胞，通过在明胶包被的平皿上预铺板从MEF饲养细胞分离，并且在补充有15％胎牛血清(Gibco)的IMDM(Iscove改良Bulbecco培养基)(Gibco)中在超低附着板(Corning)上培养6天。然后，收集EB并在相同的培养基中铺板在基质胶包被的板上6天，固定并检测。对于人类细胞，抗体包括：抗-SOX17抗体(AF1924；R&D)，抗-FOXA2抗体(ab108422；Abcam)，抗-LHX5抗体(sc-130469；Santa Cruz)，抗-α-SMA抗体(CBL171；Millipore)，抗-CDX2抗体(ab74339,Abcam)和抗-GATA6抗体(sc-9055,SantaCruz)。对于小鼠细胞，抗体包括：抗-FOXA2抗体(ab60721；Abcam)，抗-β-III TUBULIN抗体(sc-80016；Santa Cruz)，抗-α-SMA抗体(CBL171；Millipore)和抗-CDX2抗体(CDX2-88,AM392；Biogenex)。

畸胎瘤测定

注射前通过胰蛋白酶消化收集人和小鼠EPS细胞。将大约10⁶个细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中。畸胎瘤通常在2-6周内形成，并且在肿瘤直径超过1.5cm之前将动物杀死。然后将畸胎瘤包埋在石蜡中并进行苏木精和伊红染色。

为了分析畸胎瘤测定中hEPS细胞的胚外分化潜能，应用免疫化学测定。在来源于hEPS的畸胎瘤或来源于引发的hPSC的畸胎瘤被固定和包埋后，使用5μ厚的切片进行免疫组织化学染色。脱蜡和水合后，使用3％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶。随后，通过二抗动物来源的10％正常血清封闭组织。将样品与一抗hCGβ(ab131170；Abcam)在4℃温育，并与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗在室温进一步温育30分钟。用二氨基联苯胺(DAB)显色后，用哈里斯苏木精将组织染色。

比较基因组杂交(CGH)分析。

对于CGH实验，提取基因组DNA，并且使用较早代数的细胞系作为参照与Imagenes的Custom SurePrint G3 8x60K人全基因组AGI-CGH阵列杂交。

核型分析

如所报道的进行G带染色体分析(Longo等人,Transgenic Res.,6:321-328(1997)。

倍增时间计算

使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)从平皿上去除细胞：将它们计数并铺在24孔板上，所述24孔板在不含Y27632的适当培养基中以10,000个细胞/孔的密度预先接种饲养细胞。通过使用血细胞计数器计数细胞数量作为时间的函数来确定生长速率。来自指数生长期(48和72小时的时间点)的数据用于获得指数生长曲线。根据下式计算倍增时间：DT＝48*[lg2/(lgNt(第4天的细胞数量)-lgNo(第2天的细胞数量))]。

RNA序列和数据分析

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从引发的hES细胞、hEPS细胞和幼稚NSHM-hES细胞、mES细胞和mEPS细胞中分离总RNA。使用

的

Ultra^TMRNA文库制备试剂盒(NEB,USA)构建RNA测序文库。使用Illumina HiSeq 2000对片段化和随机引发的200-bp末端配对文库进行测序。将基因表达水平计算为FPKM(片段数/转录本的千碱基/百万映射读出)。在其它实验中，使用TopHat比对软件工具将产生的测序读出针对人类基因组构建hg19(对于人类)和GRCm38/mm10(对于小鼠)进行映射。计算每个基因的读出计数，并且使用RPKM(读出/千碱基/百万读出)对每个基因的表达值进行标准化。

使用TopHat2程序对转录组读出进行映射。检测到标准化的差异表达(DE)基因。提供的P值(泊松分布)对应于差异基因表达测试。使用FDR(假发现率)方法进行假阳性(I型)错误和假阴性(II型)错误的校正。使用FDR<0.01和log2比率的绝对值＞1作为阈值来表示基因表达差异是显著的。

使用DAVID程序(在Huang等人,Nature Protocols,4:44-57(2009)中描述)进行DE基因的基因本体分析。P值小于0.01的项被定义为显著富集的。

为了聚类(clustering)不同样品中转录物的整体表达特征，使用FPKM≥0.1的至少一个样品中表达的全部转录物。为了最小化不同细胞系的遗传背景在聚类中的潜在影响，将来自不同细胞系的表达值转化成相对丰度值，通过将每种转录物的表达值标准化为样品间相同转录物中的表达值的平均值来产生所述相对丰度值。对得到的表达矩阵进行分级聚类(斯皮尔曼(Spearman)相关，平均连接)。

为了将EPS细胞与其它多潜能细胞进行比较，包括了人重置PSC、人3iL hESC、人幼稚PSC、人的引发的ESC、小鼠EpiSC、小鼠2C样细胞和小鼠ESC的公开数据。生物信息学分析仅限于每个样本所询问的基因。对于Takashima等人(2014)和Chan等人(2013)中公开的人重置PSC、3iL hESC和常规PSC的表达特征，来自ArrayExpress数据库的原始测序读出(E-MTAB-2857)和(E-MTAB-2031)被重新映射并如上所述进行处理。对于Gafni等人(2013)和Theunissen等人(2014)中公开的人幼稚PSC和人的引发的ESC的表达特征，将NCBI GEO数据库中GSE46872和GSE59430下的标准化微阵列数据分别下载并合并。对于Najm等人(2011)中公开的小鼠ESC(GSM659549,GSM659550)和EpiSC(GSM659551,GSM659552,GSM659553,GSM659554)的表达特征，下载标准化表达表并合并。对于Macfarlan等人(2012)中公开的2C样细胞的表达特征，下载2C::tomato+细胞和2C::tomato-细胞(GSM8351954,GSM8351998)的标准化表达数据并以与如上所述相同的方式进行处理。

为了比较EPS细胞与胚胎植入前细胞，使用人和小鼠胚胎植入前细胞的公开数据(Tang等人,PLoS One,6:e21208(2011)；Yan等人,Nat.Struct.Mol.Biol.,20:1131-1139(2013)。通过取平均值将相同基因的探针组折叠成单一值以表示基因。考虑到不同数据集之间的平台和批次效应，通过将原始数据标准化为其ES细胞样品(引发的hPSC(对于人)和小鼠ESC(对于小鼠))的平均值来重新计算公开的数据和我们的数据的表达值。

对于基因表达的后续分析，如果在使用RPKM＞5阈值的情况下在至少一个样品中表达，则在两个数据集中保留该基因(Blakeley等人,Dev.,142:3151-3156(2015)。差异表达(DE)基因通过R软件中的DESeq2软件包进行检测。使用调整的p值<0.05和log2比率的绝对值＞1作为阈值来表示基因表达差异是显著的。

基于协方差矩阵使用R stats软件包中的princomp函数进行主成分分析。在每项研究中标准化为来源于胚胎的PSC的表达水平被用于减少由上述不同实验和平台引起的技术差异。使用R软件中pheatmap软件包生成热图。

已经将RNA序列和ChIP序列数据以系列登录号GSE68782存放在基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus)中。

染色质免疫沉淀(ChIP)，测序文库制备，

测序和数据分析。

使用EZ-Magna ChIP A/G试剂盒(Millipore)根据制造商的方案进行ChIP。使用抗-H3K27me3(抗-三甲基-组蛋白H(Lys27)(07-449,Millipore)和抗-H3K4me3(抗-组蛋白H3(三甲基K4)(ab8580,Abcam)抗体。纯化的ChIP DNA用于制备Illumina多重测序文库。按照Illumina 1TruSeq DNA样品制备v2试剂盒方案制备Illumina测序的文库。然后在来自Sage Science装置的Pippin Prep系统中使用2％胶盒对扩增的文库进行尺寸选择以捕获100和500之间的片段。通过以等摩尔比例混合并以成对读取模式关于100个碱基对在Illumina HiSeq 2500的泳道上一起运行，将具有不同TruSeq指数的文库进行多重化。使用Bowtie软件2.0版以将人读出与人参照基因组hg19(UCSC，2009年2月)进行比对。仅考虑在不超过两个错配的情况下与基因组唯一匹配的那些读出序列，用于进一步分析。使用ngsplot分析TSS上游2kb至TES下游2kb之间的读出密度，在所有RefSeq基因上计算染色质特征。人类样本的特征代表引发的和hEPS细胞的平均值和误差棒。使用MACS版本2.0(基于模型的ChIP序列分析)峰值发现算法来鉴定相对于背景的ChIP序列富集的区域，并且使用BAMPE序列模型来找到峰值，并且使用FDR<0.05选择显著峰。最后，使用Hommer和R来标注峰，以分析峰在基因功能元件和基因中的分布和与峰相关的基因本体，以及KEGG(京都基因和基因组学百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics))途径。

蛋白质印迹。

使用补充有蛋白酶抑制剂混合物(78443；Thermo Fisher Scientific)和磷酸酶抑制剂混合物(78428；Thermo Fisher Scientific)的RIPA(放射免疫沉淀测定)裂解缓冲液(P0013B；Beyotime)，从引发的hES细胞和hEPS细胞分离全细胞蛋白质提取物。将印迹在2％BSA(A1470；Sigma-Aldrich)/TBST中在室温温育1小时，然后在5％BSA或5％脱脂奶粉(P1622；Applygen)/TBST(具有0.1％吐温-20的Tris碱盐水缓冲液)中与以下抗体在4℃温育过夜：抗-p-STAT3(磷酸-STAT(转录的信号传导物和激活剂)3(Tyr705)(9145S；CellSignaling Technology)，抗-STAT3(sc-482；Santa Cruz)，抗-GP(glycoprotein)130(3732S；Cell Signaling Technology)，抗-GSK-3β(AG751-1；Beyotime)，抗-p-GSK-3β(Ser9)(9322S；Cell Signaling Technology)，抗-PARP1(sc-7150；Santa Cruz)，抗-TBX3(ab89220,Abcam)，抗-GBX2(sc-22230；Santa Cruz)和抗-β-肌动蛋白(A1978；Sigma)。

对于检测MAPK途径，人和小鼠细胞使用相同的抗体：ERK1/2(AM076-1；Beyotime)，p-ERK1/2(AM071-1；Beyotime)，JNK(AM7518-1；Beyotime)，p-JNK(AM7516-1；Beyotime)，p38(9212S；Cell Signaling Technology)和p-p38(9215S；Cell Signaling Technology)。

二抗是抗-兔IgG、连接HRP(辣根过氧化物酶)的抗体(7074S；Cell SignalingTechnology)和抗-小鼠IgG、连接HRP的抗体(7076S；Cell Signaling Technology)，它们在震荡下在室温温育1小时。使用BeyoECL Plus(P0018；Beyotime)将印迹显影。

定量PCR分析。

使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN)分离来自培养的细胞的整个孔中的总RNA。使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)将RNA转变成cDNA。在ABI Prism 7300序列检测系统上使用Power

Green PCR MasterMix(Applied Biosystems)进行PCR。使用δ-δCT方法分析数据。用于实时PCR的引物在表2中列出。

表2.该研究中使用的PCR引物和shRNA序列的总结

基因组PCR和人线粒体PCR测定

使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN)分离细胞、胚胎和胎盘的总DNA。使用EasyTaq PCR SuperMix(TRANSGEN BIOTECH)进行基因组PCR。为了通过Q-PCR检测人类特异性线粒体DNA元件，使用70ng总DNA/样品。使用δ-δCT方法分析数据，首先将数据标准化为人-鼠保守线粒体DNA元件的值。然后将相对表达值进一步标准化为由分离自未注射的野生型小鼠组织的对照样品产生的值。用于基因组PCR的引物在表2中列出。

单细胞的定量PCR分析。

首先，用0.5％胰蛋白酶-EDTA将细胞解离成1份单细胞悬浮液(1％BSA-PBS)，然后手动挑取每个细胞并转移到含有低渗裂解缓冲液的0.2ml PCR管中。其次，如前所述制备单细胞cDNA(Picelli等人,Nature Protocols,9:(171-181(2014)。根据qPCR模板的需要，将扩增的cDNA产物稀释10倍。使用KAPA

FAST qPCR试剂盒在Bio RAD CFX Connect实时系统上进行定量PCR分析。用于实时PCR的引物在表2中列出。

RNAi

使用shRNA慢病毒载体(Sigma-Aldrich)实现PARP1敲低。shRNA序列在表2中列出。分别用这些载体转染hEPS细胞并且在分析前培养3代。

Parp1敲除mEPS细胞系的产生

将指导RNA序列克隆到质粒px330(Addgene)中。通过核转染(4D-Nucleofector^TM系统,Lonza)将包含gRNA的Px330共转染到消化的单个mEPS细胞中。挑取单个集落并单独进行扩增。使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN)提取集落的基因组DNA，通过基因组PCR对其进行进一步分析。鉴定了缺失Parp1基因座的外显子1和外显子2的集落。

结果和讨论

发现两种小分子，(S)-(+)-马来酸二甲茚定(DiM)和盐酸米诺环素(MiH)，在该条件下支持圆顶状hES集落形成，在形态学上类似于小鼠胚胎干(ES)细胞。在这些小分子的进一步组合和测试后，建立了名为LCDM的新处理组合，其含有hLIF、CHIR99021、DiM和MiH(图1A)。在这种处理组合下，形态学上类似于小鼠ES细胞的细胞系可以通过转变引发的hES细胞(数据未显示)、直接来源于胚泡的细胞(目前显示的数据)而产生，或者通过利用多潜能性因子进行体细胞重编程(数据未显示)而产生。LCDM支持的细胞显示出在体外分化和体内畸胎瘤形成二者中分化成三种胚胎胚层的能力(数据未显示和表3)。

表3.建立的人和小鼠的扩展的多潜能干细胞的总结

H＝人；M＝小鼠；Y＝是；*来源是引发的hES；**来源＝胚泡；##来源＝成纤维细胞；***来源＝TT2 mES；-＝未分析。

这些细胞在胰蛋白酶消化成单细胞后可以稳健地扩增，并且在传代超过50次后显示正常的核型(数据未显示和表3)。因此，LCDM条件支持产生具有多潜能分化潜能的稳定的人类干细胞群，其在形态学上类似于小鼠ES细胞。

由于hEPS细胞展现出胚外潜能，所以检查这些细胞中的胚外标志物的表达(图2A和图2B-C)。与引发的hES细胞或者幼稚NHSM-hES细胞相比，多个胚外基因(诸如CDX2(2至3倍)，GATA6(2.5倍)，HAND1(8倍)和EOMES(1.5倍))在hEPS细胞中上调(图2C和图2D)。单细胞分析表明，这些基因表达在hEPS细胞中的细胞间变异低于在引发的hES细胞中的细胞间变异(数据未显示)，这表明hEPS细胞中胚外基因表达的增加不是由显示EPS细胞被稳定维持的细胞亚群引起的。此外，在mRNA水平上，代表性胚外标志物(COX2、EOMES和SOX17)在hEPS细胞中的表达比这些标志物在来源于hEPS细胞的分化细胞中的表达低几个数量级(CDX2，低30倍；EOMES，低60倍；SOX17，低41倍)(图2D)，这无法在蛋白质水平上使用免疫荧光进行检测(数据未显示)。因此，这些数据显示胚胎外基因的mRNA基础活性在hEPS细胞中上调。进一步分析了hEPS细胞中的多潜能性标志物基因表达。免疫荧光分析显示多潜能性标志物基因，诸如OCT4、NANOG和SOX2，在hEPS细胞中表达(数据未显示)。然而，与引发的hES细胞和幼稚NHSM-hES细胞相比，几种多潜能性基因(诸如NANOG、OCT4和UTF1)在hEPS细胞中下调(图3A-3C)。同时，其它多潜能性基因(诸如TBX3和GBX2)上调(图3A-3C和数据未显示)。显著地，几种多潜能性标志物基因(包括OCT4，REX1，DPPA3，TBX3和GBX2)在hEPS细胞中的mRNA表达比在引发的hES细胞中的mRNA表达更均匀(图3D-3E)。综上，这些数据表明，与引发的hES细胞或幼稚NHSM-hES细胞相比，hEPS细胞拥有几个独特的分子特征。

接着通过分析H3K4me3和H3K27me3标记的全基因组分布(其分别代表染色质的活性和抑制性表观遗传状态)来检查hEPS细胞的表观遗传特征。与引发的hES细胞相比，hEPS细胞显示H3K27me3和H3K4me3水平的整体降低(图4A-4B)。显著地，在胚外标志物(诸如CDX2、GATA4、GATA6和EOMES)的基因组基因座中观察到H3K27me3的减少(数据未显示)，这与胚外基因的基础mRNA活性的上调相一致。同时，几种与幼稚多潜能性相关的基因(包括GBX2、TBX3和LIFR)在hEPS细胞中显示出增加的H3K4me3和减少的H3K27me3(数据未显示)。有趣的是，先前的研究显示，与引发的hES细胞相比，幼稚NHSM-hES细胞也展现出H3K4me3和H3K27me3水平二者的全面降低(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))。因此，类似于幼稚NHSM-hES细胞,hEPS细胞显示全面减少抑制性和活性表观遗传标志二者的趋势，这将hEPS细胞的表观遗传状态与引发的hES细胞的表观遗传状态区分开来。

当与引发的hES细胞相比，hEPS细胞显示出通过使用蛋白质印迹分析测量GP130、STAT3和-p-STAT3的水平(蛋白质水平)而确定的LIF信号传导的激活。数据显示当与引发的hEPS相比，hEPS细胞中的这些蛋白质水平的上调。另外，如通过蛋白质印迹分析确定的，在hEPS细胞中GSK3β磷酸化降低(数据未显示)。

为了确定LCDM细胞的衍生是否是物种特异性的，进行实验以检查LCDM细胞是否也可以在小鼠(mEPS)、大鼠和猪中建立。使用LCDM条件从胚泡成功地建立了小鼠LCDM细胞(数据未显示)。也从大鼠和猪成功地建立了LCDM细胞(数据未显示)。多潜能性标志物的分析显示来自小鼠的LCDM细胞表达多潜能性标志物基因，诸如NANOG、KLF4、SALL4和SOX2；来自猪的LCDM细胞表达SOX2、REX1和OCT4(数据未显示)。这些细胞显示出产生所有三种胚胎胚层(数据未显示)并维持正常核型(数据未显示)的能力。另外，小鼠LCDM细胞还通过种系传递产生嵌合体，并通过四倍体互补允许小鼠产生(数据未显示)。

当使用嵌合体测定检查小鼠LCDM细胞的体内发育潜能时，除胚胎(Em)组织外，还观察到来源于LCDM-mES的细胞整合到胚外(ExEm)组织，诸如整合到胎盘和卵黄囊(24/60个回收的E12.5孕体)(数据未显示)。这与显示胚胎嵌合状态(31/78个回收的胚胎)(数据未显示和图4F)和整合到卵黄囊但不能贡献胎盘的能力(0/78个回收的孕体)的mES细胞相反，结果与先前的报道一致(Beddington等人,Dev.,105:733-737(1989)。这些结果表明LCDM-mES细胞可能已经获得了对ExEm谱系的扩展的发育潜能，并且在下文中我们将它们称为扩展的多潜能干细胞或EPS细胞。

为了明确证明mEPS细胞的发育潜能，使用高度严格的测定来检查单个供体细胞的嵌合体形成能力。为此，将单个荧光标记的mEPS细胞注射到8-细胞阶段的小鼠胚胎中，并且在体外培养60小时后检查其嵌合贡献。显著地，33.2％(86/259)的回收的胚泡显示单个mEPS细胞在嵌合胚泡中同时分化成滋养外胚层(TE)和内细胞团(ICM)二者(图4G和表6)，这由tdTomato与胚泡外层中的TE标志物CDX2或GATA3以及与ICM中的多潜能性标志物OCT4或NANOG的共表达证明(数据未显示)。

表6

一致地，单个mES衍生物对TE和ICM二者(0/138个回收的胚泡)都没有贡献。

超出植入前阶段的来源于单个mEPS的嵌合孕体在独立的实验(包括E10.5、E12.5和E17.5)中进行分析，并且观察到在E10.5(21/90个回收的孕体)和E12.5(10/63个回收的孕体)孕体中单个供体mEPS细胞衍生物在Em组织和ExEm组织二者中的整合(表8)。

表8.基于单个mEPS细胞注射在E10.5、E12.5或E17.5分析的嵌合测定的总结

综上，这些结果表明LCDM条件也支持在小鼠中建立EPS细胞。

为了对单个mEPS细胞的胚泡衍生物进行功能性评价，接下来测试ES和滋养层干(TS)细胞衍生(Tanaka等人,Science,282:2072-2075(1998)。为此，将来源于mEPS的细胞贡献为TE和ICM二者的嵌合胚胎被用于同时衍生ES和TS细胞系。接种将来源于单个mEPS的细胞贡献为TE和ICM二者的嵌合胚泡并进一步传代到2i和TS培养基(如上述方法中讨论的)中，这成功地支持了同时衍生来源于mEPS的Tdtomato⁺ES(EPS-ES)和TS(EPS-TS)集落。ES(EPS-ES)细胞和TS(EPS-TS)细胞二者可以来源于相同的嵌合胚泡。(数据未显示和表9)。

表9.来自相同的嵌合胚胎的TS和ES衍生

作为对照，还从嵌合胚泡建立mES细胞系(2i-ES)，所述嵌合胚泡发育自经多种Tdtomato⁺mES细胞注射的8-细胞胚胎(数据未显示)。将10-15个经Tdtomato标记的mES细胞显微注射到一个小鼠8-细胞胚胎中并且培养另外60小时。将嵌合胚胎分别接种到ES或TS衍生培养基中。与mEPS细胞相反，使用来源于经mES细胞注射的8-细胞胚胎的胚囊(0/48)不能建立Tdtomato⁺TS样集落。只能够衍生出ES(2i-ES)细胞(数据未显示)。

EPS-ES细胞表达多潜能性标志物OCT4和NANOG，但是不表达TS标志物CDX2和EOMES(数据未显示)；EPS-ES细胞还表达SOX2。EPS-ES细胞仅贡献胚泡的ICM(数据未显示)，并且在嵌合胚胎中产生胚胎组织(但不产生胎盘)(数据未显示)。另一方面，EPS-TS细胞表达典型的TS标志物(EOMES和CDX2)，但是不表达多潜能性标志物OCT4和NANOG(数据未显示)。EPS-TS还表达SOX2。EPS-ES细胞仅整合到胚泡的TE层中(数据未显示)，并且专门贡献嵌合胚胎中的胎盘组织(数据未显示)。

为了排除在TS培养基中EPS细胞可以直接转变成TS细胞的可能性，将mEPS细胞在TS培养基中培养3代，并且确定TS标志物的水平。LCDM条件中培养的mEPS细胞(TT2-6 p0和mc6-1 p0)或2i条件中培养的mES细胞(TT2-2i p0和mc2i-1p0)分别用作对照。数据显示TS培养的mEPS细胞不上调TS标志物(图5A和数据未显示)并且仍然保持NANOG表达(数据未显示)。这些结果支持EPS-TS来源于EPS分化的TS细胞而不是经由直接转变的结论。总的来说，这些数据证明了植入前小鼠发育期间单个mEPS细胞向着ICM和TE谱系二者的发育潜能。

FACS分析进一步证实了来源于单个mEPS的细胞在E10.5嵌合胚胎、卵黄囊和胎盘中的广泛整合(表10)。

表10.来源于单个mEPS的嵌合细胞在E10.5嵌合孕体中的FACS分析的总结

单细胞注射

相反地，没有获得通过注射单个mES细胞(0/44个回收的胚胎)产生的E10.5嵌合体(表8)。显著地，来源于单个mEPS的细胞整合到嵌合胎盘的滋养层中，并且表达滋养层标志物CK8(数据未显示)。也在滋养层巨细胞(TGC)和成胶质细胞的层中观察到这些细胞，并且分别表达TGC标记物PLF(PROLIFERIN)和成胶质细胞标记物TPBPA(数据未显示)。来源于单个mEPS的细胞也在妊娠后期E17.5孕体(13/94个回收的孕体)中嵌合Em和ExEm组织二者(数据未显示和表8)，并且单个mEPS细胞衍生物贡献E17.5嵌合胎盘的百分比可以高达19％(数据未显示)。为了进一步评价来源于单个EPS的滋养层的功能，使用基于transwell的侵袭测定(图5B)测试它们的侵袭能力，因为滋养层最显著的功能特征之一是它们侵入蜕膜化子宫的能力。表达滋养层标记物CK8或CK7的Tdtomato⁺来源于单个mEPS的胎盘细胞能够通过膜孔迁移并到达膜的底表面(数据未显示)，这突显了它们的侵袭性质。此外，与mEPS细胞相比，多种滋养层标志物的mRNA表达在来源于mEPS的胎盘细胞中显著上调(图5C)。

进一步的实验测试了是否有可能获得来源于单个mEPS的产后嵌合小鼠，这被认为是用于证明真正的多潜能性的金标准(De Los Angeles,Nature,525:569-478(2015)。在87个出生幼崽中，获得了43个来源于单个mEPS的嵌合体(49.4％)，在其中24个显示出如通过毛色判断的高度嵌合状态(数据未显示和表11)。

表11.来自不同幼崽的嵌合水平

综上，这些数据证明了EPS细胞的真实的多潜能性以及它们在单细胞水平上对Em和ExEm谱系二者的嵌合能力。

mEPS细胞的嵌合体形成能力导致进一步的实验以检查hEPS细胞是否也可以产生种间人-小鼠孕体。将荧光标记的单个hEPS细胞注射到8-细胞阶段的小鼠胚胎(数据未示出)，并且在60小时的体外培养后使用TE(CDX2，GATA3)和ICM(OCT4，NANOG)标志物通过共染色对它的嵌合贡献进行检查。结果显示单个hEPS细胞同时分化成嵌合胚泡中的分别表达TE或ICM标志物的细胞(51/345个回收的胚胎，14.7％)(数据未显示，表12-15)。作为对照，引发的hPSC在单细胞注射后不能形成嵌合胚泡(0/143个回收的胚胎)(数据未显示，表12、13a、13b和13c)，这与先前报道的灵长类的引发的PSC的较差嵌合状态相一致(Gafni等人,Nature,504:282-(2013)；Tachibana等人,Cell,148:285-295(2012)；James等人,Dev.Biol.,295:90-102(2006))。

表12.

表13a：通过将单个hEPS细胞注射到8-细胞胚胎的人-小鼠嵌合测定的总结

GFP：注射的细胞是GFP标记的，并且使用荧光显微镜进行检测

Td：注射的细胞是Tdtomato标记的，并且使用荧光显微镜进行检测

HN：使用抗-人细胞核抗体进行免疫染色

在该测定中，使用的EPS细胞系处于如下列出的这些代：

ES1-EPS：12代至62代

iPS1-EPS：21代至60代

0227E-EPS：15代至28代

表13b.在检测阈值为每10,000个小鼠细胞大约1个人类细胞的情况下基于灵敏的人线粒体PCR测定的测试胚胎和阳性胚胎的总结(中间和下部表格)。

阳性孕体：嵌合水平高于1/10,000(人类细胞/小鼠细胞)。

表13C.

人类细胞贡献的阈值：1/10,000(人类细胞/小鼠细胞)

还检查了hEPS细胞在植入后E10.5小鼠孕体中的嵌合能力。通过用抗-人细胞核(hN)抗体进行免疫染色或者通过检测来自荧光标记的hEPS细胞的荧光信号来鉴定小鼠孕体中人类细胞的存在。在具有hEPS细胞的E10.5胚胎中观察到种间嵌合状态，但是在具有引发的hPSC的E10.5胚胎(数据未显示)或未注射的对照(数据未显示)中没有观察到种间嵌合状态。在44个回收的嵌合E10.5孕体中，17个孕体(38.6％)显示人类细胞整合到胚胎组织和胚外组织二者(图1B)。

嵌合胚胎中的hEPS衍生物丧失了多潜能性标志物NANOG的表达(数据未显示)，并且表达适当的谱系特异性标志物，包括SOX2、GATA4和FOXA2(数据未显示)。有趣的是，还观察到来源于hEPS的细胞整合到ExEm组织(诸如胎盘和卵黄囊)中(数据未显示)。这是意想不到的，因为人和小鼠胎盘在结构上是不同的，这可能是由于异时和/或趋异的胎盘发育程序(Rossant等人,Nat.Rev.Gen.,2:538-548(2001)。发现这些细胞整合到滋养层并且表达滋养层标志物CK8(数据未显示)。此外，在这些细胞中还观察到另一种人类滋养层特异性标志物hCGβ的表达(数据未显示)，就像还在来源于hEPS细胞的畸胎瘤中检测到一样(数据未显示)。相反地，并未观察到人类细胞在经引发的hPSC注射的小鼠胎盘中的存在(数据未显示)。

为了进一步证实种间嵌合状态，使用高灵敏度线粒体PCR测定来定量分析人EPS细胞在人-小鼠嵌合孕体中的贡献程度(Theusen等人,Cell Stem Cell,doi:10.1016/j.stem.2016.06.11)。显著地，回收的来源于hEPS的小鼠胚胎中的35.5％(42/118个回收的胚胎)含有人类细胞(10,000个小鼠细胞中的1个人类细胞被用作阈值)。人类细胞的百分比是变化的，并且在一些情况下达到大于1％(图5D和表12a-12c)。另外，回收的来源于hEPS的小鼠胎盘中的17.6％(24/136个回收的胎盘)显示人类细胞贡献(图5E和表12a-12c)，其百分比可以达到大于0.1％。在54个分析的小鼠孕体中，9个(16.6％)显示出hEPS衍生物对小鼠胚胎和胎盘二者的双重贡献(表12a-12c)。作为对照，引发的hPSC显示对小鼠胚胎或胎盘没有贡献(0/54个分析的小鼠孕体)(表12a-12c)。与mEPS细胞相比，hEPS细胞在小鼠孕体中的嵌合效率仍然是有限的，这在某种程度上可以归因于发育中的物种特异性差异(Malassie等人,Human Reprod.Update,9:531-539(2003)。这些数据表明hEPS细胞确实展现出种间嵌合能力，并且能够在体内采用滋养层归宿。

为了表征EPS细胞的分子特征，评价mEPS细胞、mES细胞、2C样mES亚群的转录组(Macfarlan等人,Nature,487:57-63(2011)，以及外胚层干细胞(Najm等人,Cell StemCell,8:318-325(2011)。主成分分析揭示了与其它细胞类型不同的mEPS细胞的总体基因表达模式(图6a)。同样，hEPS细胞也显示出与幼稚hPSC(Takashima等人,Cell,158:1254-1269(2014)；Chan等人,Cell Stem Cell,13:663-675(2013)；Theunissen多肽,Cell StemCell,15:471-487(2014)；和Gafni等人,Nature,504:282(2013))以及引发的hPSC所不同的转录组学特征(图6b)。进一步的实验检查了mEPS和mES细胞之间是否存在差异表达的基因，两个不同的基因模块(模块A和模块B)在mEPS细胞中上调的基因中脱颖而出(数据显示)。与来自早期植入前发育的小鼠胚胎细胞相比(Tang等人,PLoS One,6:e21208(2011)，模块A独特地存在于mEPS细胞，其功能涉及染色质组织和转录调节。显著地，来自模块B的基因也在2-细胞阶段的胚胎细胞中表达(数据未显示)。有趣的是，来自模块B的基因的表达水平从2-细胞阶段到胚泡阶段逐渐下调。

通过进行类似的分析，与引发的hPSC相比，在hEPS细胞中上调的基因中鉴定了两个基因模块(称为模块C和D)(数据未显示)。与模块A类似，来自模块C的基因参与染色质组织和转录调控，相当数量的这种基因在检查的幼稚hPSC中共享。显著地，在从卵母细胞到桑葚胚阶段的人胚胎细胞中也发现了相当数量的来自模块D的基因(Yan等人,Nat.Struct.Mol.Biol.,20:1131-1139 2013)，诸如GBX2(原肠胚形成大脑同源盒2)、HOXA1(同源盒A1)、MIXL1(Mix1同源盒样1)和DERA(脱氧核糖-磷酸醛缩酶)(数据未显示)基因。进一步的分析导致鉴定了唯独在hEPS细胞(而不是其它hPSC类型)中上调的模块E，诸如CHD7(克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白7))、CHD4(克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4)、MIXL1和LEF1(淋巴增强子-结合因子1)(数据未显示)。有趣的是，GO分析揭示了来自模块E的基因参与生物过程，诸如转录调节和细胞周期，这也标志从卵母细胞到4-细胞(4C)阶段的人胚胎细胞(Nat.Struct.Mol.Biol.,20:1131-1139 2013))。总的来说，这些数据表明EPS细胞拥有不同于已知PSC类型的独特分子特征。

最后，研究了DiM和MiH在维持EPS细胞中的作用。DiM或MiH的撤销导致hEPS细胞在铺板后几天内快速分化(数据未显示)，这表明两种小分子都是维持hEPS细胞所必需的。DiM或MiH的撤销也显著削弱了嵌合胚泡中mEPS细胞的发育潜能(图6C，数据未显示)。已经报道了DiM抑制G蛋白偶联受体(包括组胺和毒蕈碱型受体)(Pfaff等人,Eur.J.,Phamacol.,286-229-240(1995))，而已知MiH抑制PARP1(Alano等人,Proc.Natl.,Acad.Sci.U S A,103:9685-9690(2006))。显著地，DiM或MiH可以被靶向相同靶标用于维持hEPS细胞的其它抑制剂(盐酸曲吡那敏；地氯雷他定；或烟酰胺；BSI-201(4-碘-3-硝基苯甲酰胺))替代(数据未显示)。实际上，用靶向组胺受体和毒蕈碱型受体二者的抑制剂替代DiM不仅支持hEPS细胞的形态和扩增(数据未显示)，而且维持在hEPS细胞中上调的基因(诸如GBX2、TBX3、CDX2和GATA6)的表达(图4C)。用其它PARP1抑制剂替代MiH也维持了hEPS扩增以及在hEPS细胞中上调的标志物基因(数据未显示，和图4D)。此外，当MiE被hEPS细胞中的PARP1敲低所替代时，获得了相似的结果(图4E)。重要的是，在这样的条件下，mEPS细胞和hEPS细胞二者仍然保持其它们贡献胚泡中的TE和ICM二者的能力(图6C、6D，并且数据未显示)。

接下来研究了在EPS细胞中由DiM和MiH调节的分子靶标。已经报道了MAPK信号传导是组胺和毒蕈碱型受体信号传导的主要下游(Morse等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.296:1058-1066(2001)和Ockenga等人,Genes(basel),4:171-79(2013))，并且在mEPS细胞和hEPS细胞二者中都观察到MAPK信号传导活性的下调(图7A-B)。然而，用靶向MAPK信号传导的抑制剂(PD0325901；SB203580；SP600125)替代DiM不能维持hEPS细胞(数据未显示)，并且不能保持mEPS细胞的发育潜能(图6C，并且数据未显示)。为了进一步检查MiH的作用，在mEPS细胞系中敲除了建议的MiH分子靶标Parp1(图7C-G)。重要的是，即使不存在MiH，Parp1缺陷型mEPS细胞仍然可以分化成TE和ICM二者(图6C)。在不同条件下培养的细胞的嵌合分析的总结在表14中显示。

表14.不同条件下培养的EPS细胞的嵌合分析的总结

这些结果表明，Parp1是维持EPS发育潜能的重要调节者。

这些研究提供了论证原理的证据，即多潜能干细胞的发育潜能可以扩展到胚胎谱系和胚外谱系二者。不同于报道的小鼠中具有胚外潜能的不稳定多潜能细胞群(Macfarlan等人,Nature,487:57-63(2012)；Morgani等人,Cell Rep.,3:1945-4957(2012)；和Abad等人,Nature,502:340-345(2013))，EPS细胞可以在体外长期维持，同时维持它们的胚胎和胚外发育潜能。EPS细胞也代表一种新干细胞资源，其具有超过传统多潜能干细胞的若干潜在优点。尽管第一个小鼠ES细胞系是34年前建立的(Evans等人,Nature,292:154-156(1981)；和Martin等人,Proc Natl Acad Sci U S A,78:7634-7638(1981))，但是来自其它哺乳动物的具有嵌合能力的多潜能干细胞的衍生仍然是主要挑战。仍然缺乏在不同的哺乳动物物种中建立多潜能干细胞的稳健方法。EPS细胞可以使用相同的培养条件在不同的哺乳动物物种中产生，这表明在哺乳动物中这种新细胞状态的保守。因此，EPS细胞的发现提供了开发一种通用方法的机会，以稳健地建立在哺乳动物中具有扩展的发育潜能的干细胞。此外，EPS细胞的种间嵌合体能力使得它们对于研究异种嵌合状态和哺乳动物早期发育特别有价值。最后，EPS细胞还为疾病建模、药物发现和产生用于再生医学的功能细胞提供了新细胞资源。

Claims (8)

1.一种用于扩展分离的多潜能细胞的细胞潜能的细胞培养基组合物，所述组合物包含来自下组中每个的多潜能性的化学扩展剂(CEP)：

(1)细胞因子，

(2)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂，

(3)G蛋白偶联受体(GPCR)抑制剂，和

(4)聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)抑制剂，

所述多潜能性的化学扩展剂的量有效诱导未经处理的细胞重编程为扩展的多潜能细胞，

其中所述细胞因子是人白血病抑制因子(LIF，“L”)；所述GSK抑制剂是[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈](“C”)；所述GPCR抑制剂是DiM((S)-(+)-马来酸二甲茚定)(“D”)；并且所述PARP1抑制剂是MiH(盐酸米诺环素)(“M”)，

其中L的浓度范围为1-100ng/ml；C的浓度范围为0.5-5μM；D的浓度范围为1-5μM，并且M的浓度范围为0.5-5μM。

2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，其中所述ROCK抑制剂是Y27632[(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺+++二盐酸盐)]，以0.2至20μM的浓度范围存在。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其包含细胞培养基并且进一步地包含内-IWR1(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)或XAV939(3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮。

4.试剂盒，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中小分子量化合物以相对量存在以将其放入用于分化的细胞的细胞培养基中以诱导扩展的多潜能性。

5.一种诱导供体细胞中扩展的多潜能性的方法，所述供体细胞选自多潜能的部分或完全分化的细胞，所述方法包括：

用根据权利要求1-3中任一项所述的组合物培养所述供体细胞达有效诱导扩展的多潜能性的一段时间，

其中所述供体细胞选自由以下组成的组：小鼠胚胎干细胞，人胚胎干细胞，和诱导的多潜能干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中将所述供体细胞在包含所述CEP的重编程培养基中培养9-20天的时间。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述供体细胞作为单细胞或作为小集落接种。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述供体细胞作为单细胞接种，所述方法进一步包括在包含LCDM的培养基中培养之前，将所述细胞在包含根据权利要求2所述的ROCK抑制剂的细胞培养基中培养12至48小时的时间段。

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