CN108866160A - 一种hrm鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。明显提高了基因插入缺失的检测准确度，基因型鉴定效率约提高3‑5倍。通过PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳方法证明该方法所进行的分型可靠有效。为分子标记检测工作提供更为丰富的鉴定手段，为家畜育种工作提供新的可靠的评价方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、细胞工程技术领域，具体涉及一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法。
背景技术
生命的遗传信息存贮于DNA序列之中，高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础，是生物多样性的最初变异来源。基因组中大量存在插入缺失位点，相较单核苷酸多态性的检测与应用，插入缺失引起更容易被检测到且检测准确性较高被视为一种新的分子选育标记，具有较为明显的应用价值备受关注。目前基因插入缺失的检测方法存在一定的局限性，多采用直接测序法和DNA片段长度多态性检测法，前者费用高昂，而后者实验操作难度大，鉴定花费时间长，结果存在一定程度的假阳性概率，不利于大批量对基因插入缺失位点的鉴定工作。因此，有必要研发一种新型基因插入缺失的鉴定方法，快速准确对基因插入缺失位点进行鉴定，从而降低成本，体高鉴别效率。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法，该方法可以在绵羊PLAGL1基因插入缺失位点中的应用。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行确认无其它多态位点，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。
根据本发明，所述的无其它多态位点包括SNP和插入缺失。
进一步的，所述的特异性引物为：
PLAGL1-P1：
F：TAAACTATCTTCAAAGGGCTTA；
R：TCAACTCCCCATTATCTGTG；
PLAGL1-P2：
R：CGGCCTCCACTCCAGAGGTAT；
F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；
PLAGL1-P3：
F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；
R：CACAAAATGAAGAAACCTG；
PLAGL1-P5：
F：AATACACCTCTGTCTTGGTCATC；
R：TTGGGTAGGGATTGGACTTT；
PLAGL1-P7：
F：TTCTTTGTCCCTTCTTTATCCC；
R：TTTGAGTTTACAGCCTTTGCTC；
PLAGL1-P8：
F：ACAGGACGCTCCCACGAC；
R：CATACAAGTATAGGAACTGGCTCA；
PLAGL1-P9：
F：CACCACCACTTCACCATGCTAC；
R：TCCCTCCTTGTCTGAGATTTCCTT；
PLAGL1-P10：
F：CCACCAATCTGTTCCAGG；
R：AGACAAACCCAAACTGATGAA；
PLAGL1-P11：
F：AAACCCACCTGCCACCTA；
R：CATTTGGATTTCCCCGTAA；
PLAGL1-P12：
F：AAATACGGTCCCGTCACTTGG；
R：GAATGTATAGAATGGATACGTGCAGAA；
PLAGL1-P13：
F：TTCCACAGGATGCTACAA；
R：TCCAGTAATATTCTTAAATTCC；
PLAGL1-P14：
F：CCCCGACATTCCATAAATAAACTGC；
R：CGCCCTCCTGTCATCAGCAAC。
本发明的HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，能够显著提升基因插入缺失位点的基因型分辨通量和显著降低基因插入缺失位点的分型时间，为分子标记检测工作提供更为丰富的鉴定手段，为育种工作提供新的可靠的评价方法，从而达到快速、准确鉴别基因插入缺失位点的目的。
与现有技术相比，具有以下优点：
(1)通过HRM(高分辨率溶解曲线，High Resolution Melting)对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，准确度高，分型通过荧光定量PCR仪进行，避免人为因素对基因型判定的干扰。
(2)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，速度快，分型整个时间约为1小时30分钟，较原有直接测序和电泳DNA片段长度多态性分析方式花费时间减少约一半。
(3)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，通量大，每次分型可进行96个样品的同时操作，若换用384孔板，则通量仍将扩大4倍，较原有电泳分型通量提升约2-8倍。
(4)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，每个样品分型鉴定过程的费用不超过1元，应用成本低廉。
附图说明
图1是采用高分辨率溶解曲线基因型鉴定图；
图2是高分辨率溶解峰基因型鉴定图；
图3是不同基因型测序图与聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
申请人通过前期研究发现，现有基因插入缺失检测方法中存在检测通量小，费用高等缺陷，鉴于基因插入缺失位点在分子育种中的重要价值，申请人通过比较现有凝胶电泳手段和直接测序等手段，希望通过高分辨率溶解曲线分析动物基因插入缺失位点基因型。
本实施例给出一种新型的HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行特异性引物设计，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认(无其它多态位点包括SNP和插入缺失)，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。
特异性引物设计要求尽量短，保证变异位点和野生位点之间存在较大的退火温度差异。
申请人经过严格的引物鉴定工作之后，通过荧光定量PCR采用饱和荧光染料扩增目的片段，在进行溶解曲线分析过程中尽量降低升温速率和提高荧光信号的采集频率，保证高分辨率溶解曲线分析过程中的准确性，对分析出的结果进行聚丙烯酰胺凝胶电泳基因型验证和测序验证，确保分型正确，对分型结果进行统计，分析其品种间基因型分布差异和品种间基因频率分布差异，对基因插入缺失位点不同基因型与生长发育相关性状进行关联分析，并对其育种价值进行相应的评估。
以下是发明人给出的具体操作过程。
以下实施例涉及的试剂、DNA样本来源如下：
本实施例的动物大群体品种选择绵羊，绵羊的DNA样本采集自新疆、兰州、陕西和浙江等4个省份，样本采集信息见表1。
表1：绵羊品种样本信息
DNA提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司；
RT-PCR试剂盒天根生物科技有限公司；
相关引物购自上海生工生物科技有限公司。
实施例1：7个绵羊品种PLAGL1基因HRM鉴定插入缺失位点
绵羊血液样品和耳组织样本采集：小尾寒羊样本262个，采集自甘肃省兰州市，同羊样本166个，采集自陕西省白水县，兰州大尾羊样本67个，采集自甘肃省兰州市，湖羊样本200个，采集自浙江省湖州市，多浪羊样本96个，采集自新疆石河子市，巴什拜羊样本93个，采集自新疆石河子市，阿勒泰羊样本92个，采集自新疆阿勒泰市，绵羊样本共计976个，全部样本通过干冰运输处理并保存至-80℃冰箱中。
绵羊样本DNA提取工作：
采用艾德莱生物科技有限公司全血DNA提取试剂盒操作步骤：取新鲜血液200微升放入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K溶液(20mg/mL)20微升，充分混匀，在加入200微升结合液CB，立即旋涡震荡充分混匀，在70℃放置10min，待溶液变得清亮。冷却后加入100微升异丙醇，立即旋涡震荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；将上一步混合物加入一个吸附柱AC当中，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，加入500微升抑制物去除剂IR，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；加入700微升漂洗液WB，
所提取DNA完整，质量好，并进行均质化处理，使基因组DNA浓度均为10ng每微升。
申请人通过NCBI SNP数据库中检索得到INDEL位点14个，针对这些位点设计特异性引物共计12对，引物设计结果如表2所示。
表2：绵羊PLAGL1基因潜在插入缺失位点引物设计
针对所设计引物采用PCR扩增结合测序技术鉴定其中插入缺失位点在绵羊基因组中存在情况，针对以存在位点PLAGL1-5进行SNP位点排除，经过检测，在该序列当中，除插入缺失位点之外，其他位点均为保守序列，不存在多态现象，则证明此引物可使用与HRM对动物基因插入缺失位点的基因分型工作。
HRM实时定量PCR体系配置(10μL，如表3所示)：
表3：HRM实时定量PCR体系
HRM实时定量PCR运行程序(表4)：
表4：HRM实时定量PCR运行程序
按照表3所述实时定量PCR体系配置反应液，按照表4所述HRM实时定量PCR运行程序进行实时定量PCR扩增，并采用gene scanning软件对所得数据进行HRM基因分型。
如图1所示，率先溶解的PCR产物为DD(缺失/缺失)基因型，最后溶解的PCR产物为II(插入插入)基因型，分两次分别溶解的产物为ID(插入/缺失)基因型。
将图1溶解曲线转换为溶解峰图(图2)，溶解温度靠前的为DD(缺失/缺失)基因型，溶解温度靠后的为II(插入插入)基因型，溶解温度介于二者之间的为ID(插入/缺失)基因型。将上述产物加loading buffer后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果验证了上述利用HRM对动物基因插入缺失位点进行检测的相应结果，证明该基因分型方法在动物基因插入缺失位点分析的应用当中效果可靠。申请人对该扩增产物进行二代测序验证，其结果与上述所有实验结果相一致，证明了采用HRM在动物基因插入缺失位点检测中真实可靠。
申请人通过对7个品种基因型与基因频率统计发现，该位点在不同品种的绵羊个体中分布广泛(如表5所示)，且基因型频率分布与基因频率分布差异不显著(如表6所示)，在不同品种间均可作为分子筛选标记进行使用。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120>一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法
<160>
<210> 1
<211> 22
<212>特异性引物PLAGL1-P1的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
TAAACTATCTTCAAAGGGCTTA
<210> 2
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<212>特异性引物PLAGL1-P1的下游引物R：
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<220>
<400>
TCAACTCCCCATTATCTGTG
<210> 3
<211> 19
<212>特异性引物PLAGL1-P2的上游引物F：
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<220>
<400>
GCCTGTCCCGGCTTTCAGA
<210> 4
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<400>
CGGCCTCCACTCCAGAGGTAT
<210> 5
<211> 23
<212>特异性引物PLAGL1-P3的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
TAAAATGTTCACAGTACTATCTG
<210> 6
<211> 19
<212>特异性引物PLAGL1-P3的下游引物R：
<213> DNA
<220>
<400>
CACAAAATGAAGAAACCTG
<210> 7
<211> 23
<212>特异性引物PLAGL1-P5的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
AATACACCTCTGTCTTGGTCATC
<210> 8
<211> 20
<212>特异性引物PLAGL1-P5的下游引物R：
<213> DNA
<220>
<400>
TTGGGTAGGGATTGGACTTT
<210> 9
<211> 22
<212>特异性引物PLAGL1-P7的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
TTCTTTGTCCCTTCTTTATCCC
<210> 10
<211> 22
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<213> DNA
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TTTGAGTTTACAGCCTTTGCTC
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<211> 18
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<220>
<400>
ACAGGACGCTCCCACGAC
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<213> DNA
<220>
<400>
CATACAAGTATAGGAACTGGCTCA
<210> 13
<211> 22
<212>特异性引物PLAGL1-P9的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
CACCACCACTTCACCATGCTAC
<210> 14
<211> 24
<212>特异性引物PLAGL1-P9的下游引物R：
<213> DNA
<220>
<400>
TCCCTCCTTGTCTGAGATTTCCTT
<210> 15
<211> 18
<212>特异性引物PLAGL1-P10的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
CCACCAATCTGTTCCAGG
<210> 16
<211> 21
<212>特异性引物PLAGL1-P10的下游引物R：
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<220>
<400>
AGACAAACCCAAACTGATGAA
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<211> 18
<212>特异性引物PLAGL1-P11的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
AAACCCACCTGCCACCTA
<210> 18
<211> 19
<212>特异性引物PLAGL1-P11的下游引物R：
<213> DNA
<220>
<400>
CATTTGGATTTCCCCGTAA
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<211> 21
<212>特异性引物PLAGL1-P12的上游引物F：
<213> DNA
<220>
<400>
AAATACGGTCCCGTCACTTGG
<210> 20
<211> 27
<212>特异性引物PLAGL1-P12的下游引物R：
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<400>
GAATGTATAGAATGGATACGTGCAGAA
<210> 21
<211> 18
<212>特异性引物PLAGL1-P13的上游引物F：
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<220>
<400>
TTCCACAGGATGCTACAA
<210> 22
<211> 22
<212>特异性引物PLAGL1-P13的下游引物R：
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<220>
<400>
TCCAGTAATATTCTTAAATTCC
<210> 23
<211> 25
<212>特异性引物PLAGL1-P14的上游引物F：
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<220>
<400>
CCCCGACATTCCATAAATAAACTGC
<210> 24
<211> 21
<212>特异性引物PLAGL1-P13的下游引物R：
<213> DNA
<220>
<400>
CGCCCTCCTGTCATCAGCAAC
Claims (3)
1.一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，其特征在于，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无其它多态位点包括SNP和插入缺失。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异性引物为：
PLAGL1-P1：
F：TAAACTATCTTCAAAGGGCTTA；
R：TCAACTCCCCATTATCTGTG；
PLAGL1-P2：
F：GCCTGTCCCGGCTTTCAGA；
R：CGGCCTCCACTCCAGAGGTAT；
PLAGL1-P3：
F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；
R：CACAAAATGAAGAAACCTG；
PLAGL1-P5：
F：AATACACCTCTGTCTTGGTCATC；
R：TTGGGTAGGGATTGGACTTT；
PLAGL1-P7：
F：TTCTTTGTCCCTTCTTTATCCC；
R：TTTGAGTTTACAGCCTTTGCTC；
PLAGL1-P8：
F：ACAGGACGCTCCCACGAC；
R：CATACAAGTATAGGAACTGGCTCA；
PLAGL1-P9：
F：CACCACCACTTCACCATGCTAC；
R：TCCCTCCTTGTCTGAGATTTCCTT；
PLAGL1-P10：
F：CCACCAATCTGTTCCAGG；
R：AGACAAACCCAAACTGATGAA；
PLAGL1-P11：
F：AAACCCACCTGCCACCTA；
R：CATTTGGATTTCCCCGTAA；
PLAGL1-P12：
F：AAATACGGTCCCGTCACTTGG；
R：GAATGTATAGAATGGATACGTGCAGAA；
PLAGL1-P13：
F：TTCCACAGGATGCTACAA；
R：TCCAGTAATATTCTTAAATTCC；
PLAGL1-P14：
F：CCCCGACATTCCATAAATAAACTGC；
R：CGCCCTCCTGTCATCAGCAAC。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810601362.4A CN108866160A (zh) | 2018-06-12 | 2018-06-12 | 一种hrm鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021136724A1 (en) * | 2020-01-02 | 2021-07-08 | Patogen As | Method for detecting hydrogen peroxide resistance in crustaceans |
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| WO2010064016A2 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | The Institute Of Cancer Research: Royal Cancer Hospital | Methods for determining a prognosis in multiple myeloma |
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| CN107619857A (zh) * | 2017-10-24 | 2018-01-23 | 西北农林科技大学 | 一种检测肉牛klf8基因cnv标记的方法及其应用 |
-
2018
- 2018-06-12 CN CN201810601362.4A patent/CN108866160A/zh active Pending
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