CN108851199B - 一种酶解葡甘聚糖与药用菌发酵物复合保润剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶解魔芋葡甘聚糖和药用菌发酵物复合保润剂的制备方法。本发明直接利用药用菌葡甘聚糖粗酶液酶解魔芋粉，获得一系列具有不同分子量的酶解葡甘聚糖，并与药用菌液体深层发酵物复配，制成保润效果不同的新型魔芋保润剂。本发明是一种将葡甘聚糖和药用菌有效成分相结合的魔芋深加工技术，具有高效率、可操作性强、低成本制备等优点，制备的保润剂喷洒到烟丝上，其吸食更安全，无污染，能提高烟气中水分含量与吃味舒适度，相比普通的保润剂其保润效果明显提升。

Description

一种酶解葡甘聚糖与药用菌发酵物复合保润剂的制备方法

技术领域

本发明涉及发酵工程、酶工程领域和烟用保润剂领域，具体地说，涉及通过将以魔芋粉为原料获取不同分子量的魔芋聚糖，并在此基础上复配药用食用菌发酵物，制备出一种复合保润剂的生物制备方法。

背景技术

现有技术中，在卷烟生产过程中，为了改善烟草的物理性能，增强烟草的耐加工性，减少加工时的造碎，通常需要加入具有保润作用的保润剂。在烟叶(叶片)和烟丝中加入保润剂，可改善烟丝的物理性能，增加韧性，保持水分，增加烟叶(叶片)、烟丝的柔软程度，减少加工时的造碎、损耗、有利于产品香味透发，对烟草品质具有十分重要的作用。

目前我国卷烟工业中主要采用甘油、丙二醇、山梨醇等多羟基物质为保润剂。但使用此类保润剂的主要目的在于维持加工过程中烟丝的含水率，提高烟丝的耐加工性，而对于成品卷烟含水率的维持，吸食舒适度的改善则效果不太理想。另外，添加保润剂的卷烟水分受到环境温湿度的影响，保润效果并不十分理想，存在烟丝持水能力差、主流烟气水分含量较低、吸食时干燥感明显等问题，所以，保润剂的性能改进仍是一个当前必须解决的技术问题。

魔芋为我国南方较为广泛种植的经济作物，因其唯一能大量提供葡甘露聚糖(KGM)，则在医药、食品、化工等领域具有广阔的应用价值。现研究表明，不同分子量的魔芋聚糖因含不同数量的亲水性基团，因而具有不同的保润效果。目前，以魔芋粉或魔芋精粉作底物生产不同分子量的聚糖的工艺很多，最主要是将生物酶法与发酵法结合，但均须对生物酶进行了分离纯化才能达到显著的效果，增加了工艺的复杂性及成本。用该工艺由一个最大的优点在于底物比较集中，得率高，但也存问题，就是必须使用KGM比较纯的原料，这样就增加了成本，同时在水解过程中也使得原料中非KGM底物部分流失，并产生严重的环境污染。研究表明某些药用菌可以很好的降解KGM，同时可产生淀粉酶、纤维素酶等，可彻底水解魔芋粉中的有效底物，实现魔芋有效组分的全面降解，同时其产物不同类别分子量的葡聚糖聚合度比较集中。

药用菌一般是指那些用于医药的大型真菌。我国对药用菌的应用已经有2500多年的历史，它们虽功效不一，但无毒副作用，因此深受人们的喜爱。野生药用菌通常及其稀缺珍贵，目前主要通过人工栽培进行药用菌的生产供应，但是高昂的管理费用和漫长的生长周期远远不能满足人们的需求。深层发酵技术因其低廉的成本和短暂的发酵周期已成为获取药用菌的一个有效途径。在药用菌发酵液中含有丰富的多糖、萜类、生物碱、维生素等药用菌活性物质，其有效成分的种类和含量均高于栽培获得的子实体，显著较好的保健作用。

当前魔芋产品主要是原始魔芋聚糖，其分子量约为2000000左右，具有极高的粘度和极低的溶解性，严重影响了魔芋在食品、化工及生物保健中的应用开发。开发出不同分子量的酶解魔芋葡聚糖系列，实现魔芋产品功能的最大应用和魔芋产品生产的多样化势在必行。由于不同来源的生物多糖功效不同，如能在实现得到不同系类魔芋聚糖分子量的前提下，与药用食用菌多糖进行复配，将有望进一步拓展魔芋的深加工途径。

发明内容

本发明需要解决的技术问题直接利用源于药用菌的粗酶液生物酶解魔芋粉，定向调控反应条件得到一系列具有不同平均分子量的魔芋葡甘聚糖，并根据产品需求，将所得特定平均分子量的酶解魔芋葡甘聚糖与含有魔芋有效成分的药用菌菌丝体发酵物复配，调制一系列具有不同保润效果的新型魔芋药用菌的复合保润剂。

为解决上述技术问题，本发明技术方案为：所述一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：

(1)以浓度为0.5～3.0％的魔芋粉水溶液作为培养基，并将能产生胞外葡甘露聚糖酶的药用菌种子液按照体积百分比1％～20％的比例加入魔芋培养基中，并置于发酵罐中，在转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，温度24～32℃的条件下培养2～8d，培养结束后过滤获得的培养液即为药用菌葡甘聚糖粗酶液；

(2)配制浓度为0.5％～30％的魔芋粉水溶液，然后加入魔芋粉水溶液总质量5％～20％的步骤(1)中制备的药用菌葡甘聚糖粗酶液，并在温度为30℃～70℃，搅拌器转速为20～100r/min的条件下酶解10～360min后，收集酶解产物，灭菌分装，即得酶解葡甘聚糖平均分子量为500～1000000的酶解魔芋葡甘聚糖溶液；

(3)以质量体积比为0.3％～3％魔芋粉水溶液为培养基，在温度20～37℃的条件下，取药用菌种子液按照体积百分数5％～20％的比例加入到魔芋培养基中，并置于发酵罐中，在发酵罐通气量为0.8～2.0dm³/min，转速为100～250r/min的条件下培养5～10d得到菌丝球混悬液即为菌丝体发酵物；

(4)将步骤(2)中得到酶解魔芋葡甘聚糖溶液与步骤(3)中的菌丝体发酵物按质量比0.1:1～1:0.1的比例混合复配，得到魔芋聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂。

本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中能产生胞外葡甘露聚糖酶的药用菌种子液是将药用菌菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养3～6d，待菌丝长满斜面；然后以浓度为0.5～3％魔芋粉水溶液为摇瓶培养基，取活化后的药用菌斜面块接入魔芋粉摇瓶培养基中在温度为24～32℃、转速为100～250r/min的条件下摇瓶培养3～4d得到的种子液。

本发明较优的技术方案：所述步骤(3)中的接种的药用菌种子液是将药用菌菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养3～6d，待菌丝长满斜面后，取斜面块接入浓度为0.2～3％魔芋粉水溶液中，在温度为20～40℃、转速100～200r/min的条件下摇瓶培养3～7d获得的种子液。

本发明较优的技术方案：所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的魔芋粉包括魔芋芋角粉、魔芋精粉、魔芋微粉、纯化魔芋葡聚糖中的任意一种；且三个步骤中的魔芋粉选用相同的魔芋粉。

本发明较优的技术方案：所述步骤(1)和步骤(3)中的药用菌包括灵芝、香菇、平菇、云芝、金针菇、乳白耙菌、茯苓、蛹虫草、云南块菌、竹荪中的任意一种；且两个步骤的药用菌选择相同的或不同的药用菌。

本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中的药用菌葡甘聚糖粗酶液中含有β－葡甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶，该粗酶液可实现魔芋粉中多种成分得以水解。

本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中药用菌葡甘聚糖粗酶液的发酵培养分两次进行，均以浓度为0.5～3.0％的魔芋粉水溶液作为培养基，先将摇瓶培养得到的种子液按照体积百分比1～10％的接种量接种到50L的一级发酵罐中，在搅拌转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，温度24～32℃的条件下培养1～4d后，再按体积百分比5～20％的接种量转接入500L的二级发酵罐中，在搅拌转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，温度24～32℃的条件下培养1～4d。

本发明较优的技术方案：所述土豆斜面培养基的配方为：土豆：200g～300g/L，蔗糖：15～25g/L。

本发明中的药用菌菌种均为直接购买的菌种产品。

本发明所用粗酶液进行酶解魔芋粉具有以下特点：随着酶解魔芋粉时间的增长，魔芋葡甘聚糖的分子量急剧下降，具有较高的酶解速度；随着酶解魔芋粉时间的增长，多分散性指数(PD)和重均分子量急剧降低，酶解魔芋葡甘聚糖重均分子量为500～1000000，分散性指数为2～20，产物具有较好的均一性。通过控制不同酶解时间，获得具有特定分子量的均一魔芋葡甘聚糖溶液。

本发明所述复合保润剂，测得100ml的保润剂中含有药用菌多糖含量平约为1.5～15g，酶解魔芋葡甘聚糖糖含量为1.5～15g，酶解魔芋葡甘聚糖平均分子量为500～1000000。

本发明的优点是：

⑴本发明采用魔芋、药用菌作为原材料，利用绿色、健康、高效的生物发酵和酶解技术，生产出具有不同保润效果的的新型复合保润剂，同时具有魔芋、药用菌两者的有效成分，其保润效果更好，并能很好的应用与卷烟中；

⑵本发明中的保润剂富含一系列较小、均一、不同分子量的魔芋聚糖，相比其他保润剂，具有保润效果可控和与卷烟产品的多样匹配性，应用价值更广泛。

⑶本发明的生产操作简单易行，生产成本低廉、周期较短，生产过程无污染、无废弃。

本发明具有高效率、可操作性强、低成本制备等优点，制备的保润剂喷洒到烟丝上，其吸食更安全，无污染，能提高烟气中水分含量与吃味舒适度，相比普通的保润剂其保润效果明显提升。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例中的所述土豆斜面培养基的配方为：土豆：200g～300g/L，蔗糖：15～25g/L。所述的魔芋培养基均是由魔芋粉与纯净水调配而成的魔芋粉水溶液，其中所述的魔芋粉包括魔芋芋角粉、魔芋精粉、魔芋微粉、纯化魔芋葡聚糖中的任意一种；每个步骤中的魔芋粉培养基选用相同的魔芋粉。

实施例1提供的是一种低分子量酶解葡甘聚糖和云芝菌丝体发酵物复合保润剂的制备方法，其具体步骤如下：

(1)粗酶液获取：将平菇菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养4天，待菌丝长满斜面，取平菇斜面菌种接种到1％魔芋粉(质量体积比)摇瓶培养液中，在温度28℃、转速为150r/min下培养96h得到的种子液，然后将种子液以5％(体积百分比)接种量转接入50L的一级种子罐中(培养基与摇瓶一样)，在转速150r/min、通气量为1.5dm³/min、温度28℃的条件下培养48h后，再按5％接种量转接入500L二级发酵罐中(培养基与摇瓶一样)，在转速100r/min、通气量为1.5dm³/min、温度28℃的条件下培养48h后结束，培养结束后过滤获得的培养液即为平菇葡甘聚糖粗酶液；所述1％魔芋粉摇瓶培养液是以魔芋粉加水配制而成的培养液；

(2)低分子量魔芋聚糖获取：将105kg魔芋粉放入5000L反应器中，加水配置成3500L浓度3％的魔芋粉溶液(不用灭菌)，后将350L步骤(1)中配制的平菇葡甘聚糖粗酶液转入5000L反应器中，控制温度为60℃，搅拌器转速100r/min的条件下搅拌降解300min，降解完毕灭菌，获得酶解液即重均分子量为5000左右的魔芋聚糖溶液，其魔芋粉水解率达80.2％；

(3)云芝种子液制备：将直接购买并保藏于冰箱中的云芝菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养6d，待菌丝长满斜面后，取斜面块接入盛有100mL浓度为0.5％魔芋培养基的250mL摇瓶中在转速150r/min，26℃下液体培养7d获得种子液；

(4)云芝菌丝体发酵物制备：在浓度为1.5％(质量体积比)的魔芋培养基中，温度20℃，接种量按体积百分数为5％，在发酵罐通气量为1.5dm³/min、转速为150r/min培养7天发酵得到云芝菌丝体发酵物；

(5)将步骤(2)中制备得到的均分子量为5000左右的魔芋聚糖溶液与步骤(4)中发酵得到的云芝菌丝体发酵物按质量比1:2的比例调配成一种重均分子量为10000左右的葡甘聚糖和云芝菌丝体发酵物复合保润剂。

实施例2：一种较高分子量酶解葡甘聚糖和灵芝菌丝体发酵物复合保润剂的制备，其具体步骤如下：

(1)粗酶液获取：将灵芝菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养4d，待菌丝长满斜面，取灵芝斜面菌种接种到1％魔芋粉(质量体积比)摇瓶培养液中，30℃下培养96h得到灵芝种子液，取灵芝种子液以10％(体积百分比)接种量转接入50L一级种子罐中(培养基与摇瓶一样)，在搅拌转速150r/min、发酵罐通气量为1.5dm³/min、温度30℃的条件下培养72h后，再按5％(质量体积比)接种量转接入500L二级发酵罐中(培养基与摇瓶一样)，在搅拌转速100r/min、发酵罐通气量为1.5dm³/min、温度30℃的条件下培养72h后结束，获得的培养液即为灵芝葡甘聚糖粗酶液；

(2)一种较低分子量魔芋聚糖获取：将105kg魔芋粉放入5000L反应器中，配置成3500L浓度为3％的魔芋粉溶液(不用灭菌)，后将350L步骤(1)中得到的灵芝葡甘聚糖粗酶液转入5000L反应器中，控制温度为50℃，100r/min搅拌下分别降解10min、30min、60min，每次酶解完毕后灭菌，分别获得重均分子量为100000、300000、700000左右的魔芋聚糖溶液；

(3)灵芝种子液制备：取直接购买并保藏于冰箱中的灵芝菌种接入土豆斜面上进行活化，培养4d天，待菌丝长满斜面后，取斜面块接入盛有100mL浓度为0.8％魔芋培养基的250mL摇瓶中进行液体培养，转速150r/min，30℃下培养5d获得种子液；

(4)灵芝菌丝体发酵物制备：在浓度为2％(质量体积比)的魔芋培养基中，温度30℃，接种量按体积百分数为5％，发酵罐通气量为1.5dm³/min、搅拌转速为150r/min的条件下培养4天发酵得到灵芝发酵物；

(5)将步骤(2)中制备得到的三种较高分子量酶解魔芋聚糖，分别按照3:1体积比加入灵芝菌丝体发酵物，调配成三种重均分子量分别为100000、300000、700000左右的酶解魔芋葡甘聚糖和灵芝菌丝体发酵物复合保润剂。

实施例三：针对不同分子量复合保润剂的保润效果评价对比，具体选用十个配方比例的复合保润剂样品和一个空白样品，按照卷烟加香的方法，将样品用70％乙醇稀释成重量含量为30％的溶液，按烟丝重量的2％均匀喷洒在空白烟丝中，卷制成烟，在相对湿度60±2％，温度22±1℃的条件下，平衡48h以上，其样品中酶解魔芋聚糖与灵芝菌丝体发酵物的比例，以及复合保润剂的重均分子量具体如表1所示，

表1 样品情况说明表

本次卷烟的保润效果评价方法采用行业内对保润剂感官舒适度的评分原则进行评分，其中分值越高，保润效果越差，具体的评分结果如表2所示：

表2 复合保润剂感官舒适性平均分值

由表2中可以看出，具有不同分子量的复合保润剂相比空白对照样，其各项得分值具有明显下降趋势，表明复合保润剂在卷烟中的保润效果具有明显的提升。

Claims (8)

1.一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：

(1)以浓度为0.5～3.0％的魔芋粉水溶液作为培养基，并将能产生胞外葡甘露聚糖酶的药用菌种子液按照体积百分比1％～20％的比例加入魔芋培养基中，并置于发酵罐中，在搅拌转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，24～32℃温度下培养2～8d，培养结束后过滤获得的培养液即得到药用菌葡甘聚糖粗酶液；

(2)配制浓度为0.5％～30％的魔芋粉水溶液，然后加入魔芋粉水溶液总质量5％～20％的步骤(1)中制备的药用菌葡甘聚糖粗酶液，并在温度为30℃～70℃，搅拌转速为20～100r/min的条件下酶解10～360min后，收集酶解产物，灭菌分装，即得酶解葡甘聚糖平均分子量为500～1000000的酶解魔芋葡甘聚糖溶液；

(3)以浓度为0.3％～3％魔芋粉水溶液为培养基，在温度20～37℃，取药用菌种子液按照体积百分比5％～20％的比例加入到魔芋培养基中，并置于发酵罐中，在发酵罐通气量为0.8～2.0dm³/min，搅拌转速为100～250r/min的条件下培养5～10天得到菌丝球混悬液即为菌丝体发酵物；

(4)将步骤(2)中得到酶解魔芋葡甘聚糖溶液与步骤(3)中的菌丝体发酵物按质量比0.1:1～1:0.1的比例混合复配，得到酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂。

2.根据权利要求1所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中能产生胞外葡甘露聚糖酶的药用菌种子液是将药用菌菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养3～6d，待菌丝长满斜面；然后以浓度为0.5～3％魔芋粉水溶液为摇瓶培养基，取活化后的药用菌斜面块接入魔芋粉摇瓶培养基中，在温度为24～32℃、转速为100～250r/min的条件下摇瓶培养3～4d得到的种子液。

3.根据权利要求1所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的接种的药用菌种子液是将药用菌菌种接入土豆斜面培养基上进行活化，培养3～6d，待菌丝长满斜面后，取斜面块接入浓度为0.2～3％魔芋粉水溶液中，在温度为20～40℃、转速100～200r/min的条件下摇瓶培养3～7d获得的种子液。

4.根据权利要求1或2所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的魔芋粉包括魔芋芋角粉和纯化魔芋葡聚糖中的任意一种；且三个步骤中的魔芋粉选用相同的魔芋粉。

5.根据权利要求1或2所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(3)中的药用菌包括灵芝、香菇、平菇、云芝、金针菇、乳白耙菌、茯苓、蛹虫草、云南块菌、竹荪中的任意一种；且两个步骤的药用菌选择相同的或不同的药用菌。

6.根据权利要求1所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的药用菌葡甘聚糖粗酶液中含有β－葡甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶。

7.根据权利要求2所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中药用菌葡甘聚糖粗酶液的发酵培养分两次进行，均以浓度为0.5～3.0％的魔芋粉水溶液作为培养基，先将摇瓶培养得到的种子液按照体积百分比1～10％的接种量接种到50L的一级发酵罐中，在搅拌转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，温度24～32℃的条件下培养1～4d后，再按体积百分比5～20％的接种量转接入500L的二级发酵罐中，在搅拌转速为100～250r/min，发酵罐通气量为0.5～2.0dm³/min，温度24～32℃的条件下培养1～4d。

8.根据权利要求2或3所述的一种酶解魔芋葡甘聚糖与药用菌发酵物的复合保润剂的制备方法，其特征在于：所述土豆斜面培养基的配方为土豆：200g～300g/L，蔗糖：15～25g/L。