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CN108795900A - Dna聚合酶及其制备方法 - Google Patents

Dna聚合酶及其制备方法 Download PDF

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CN108795900A
CN108795900A CN201710287578.3A CN201710287578A CN108795900A CN 108795900 A CN108795900 A CN 108795900A CN 201710287578 A CN201710287578 A CN 201710287578A CN 108795900 A CN108795900 A CN 108795900A
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Abstract

本发明公开了DNA聚合酶及其制备方法。本发明公开的DNA聚合酶为如下A1)‑A3)中的任一种：A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。

Description

DNA聚合酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，DNA聚合酶及其制备方法。
背景技术
DNA聚合酶(DNA polymerase)是一种参与DNA复制的酶。DNA聚合酶的结构通常由拇指(thumb)、掌(palm)、指(finger)三个亚结构域组成。每个亚结构域都有自己的特殊作用，掌是DNA聚合酶的催化中心，指的主要功能是与核苷酸或核苷酸类似物结合，而拇指的功能与结合模板DNA、持续合成能力有关。已有的研究表明，对拇指结构域的突变主要影响聚合酶与模板DNA的结合与持续合成能力，但是并不会较大的影响聚合酶的其它性质，如催化活性、与核苷酸或核苷酸类似物的亲和力等。
Thermococcus sp.9°N-7聚合酶，来源于嗜热海洋古菌Thermoccocuss sp.9°N-7，该菌是在东太平洋海隆9°N海底热液喷口中分离得到的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何降低DNA聚合酶与模板DNA的结合能力并且不降低DNA聚合酶活性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了在9°N DNA聚合酶(简称为DC)序列的基础上，对部分氨基酸残基进行置换或修饰得到的具有DNA聚合酶活性的蛋白质，将其命名为DCm。
本发明所提供的具有DNA聚合酶活性的蛋白质DCm，为如下A1)-A3)中的任一种：
A1)对DC的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；
A2)对DC的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；
A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；
A1)或A2)所述突变蛋白质与DC相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。
为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在A1)或A2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述DCm可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述DCm的编码基因可通过将编码DC的DNA序列中进行一个或几个核苷酸的突变，和/或在其序列中间和/或5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码DC的DNA序列可为在序列10的第43-2367位的5′端添加ATG得到的序列。序列10的第1位核苷酸为其5′端核苷酸。
上述DCm中，DC可为将NCBI中ID为AAA88769.1的第141位的天冬氨酸置换为丙氨酸和第143位的谷氨酸置换为丙氨酸得到的外切酶失活处理的蛋白质。所述DC可为序列表中序列1所示的蛋白质。
上述DCm中，所述氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加为一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加。A1)中所述DCm与DC具有75％或75％以上同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述DCm中，所述置换可为将氨基酸残基置换为丙氨酸残基。所述置换可为一个或几个氨基酸残基的置换。
所述置换具体可为对DC的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行置换。
上述DCm中，所述氨基酸残基的修饰为一个或几个氨基酸残基的修饰。
所述修饰具体可为对DC的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行修饰。
上述DCm中，A3)所述融合蛋白质具体可为在A1)或A2)的蛋白质的中间或其氨基末端或羧基末端连接his标签和/或TEV酶识别序列得到的蛋白质。A3)所述融合蛋白质具体可为在A1)或A2)的蛋白质的第1位和第2位氨基酸残基中插入序列表中序列2的第2-14位氨基酸残基得到的蛋白质。
上述DCm可为如下B1)-B8)中的任一种：
B1)将DC自N端起的第674位的赖氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC5)；
B2)将DC自N端起的第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC24)；
B3)将DC自N端起的第668位的精氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC4)；
B4)将DC自N端起的第665位的谷氨酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC35)；
B5)将DC自N端起的第667位的苏氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC36)；
B6)将DC自N端起的第735位的天冬酰胺残基、第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC40)；
B7)将DC自N端起的第679位的组氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC17)；
B8)将DC自N端起的第735位的天冬酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC8)。
DC5融合蛋白可为序列表中序列2所示的蛋白质；
DC24融合蛋白可为序列表中序列3所示的蛋白质；
DC4融合蛋白可为序列表中序列4所示的蛋白质；
DC35融合蛋白可为序列表中序列5所示的蛋白质；
DC36融合蛋白可为序列表中序列6所示的蛋白质；
DC40融合蛋白可为序列表中序列7所示的蛋白质；
DC17融合蛋白可为序列表中序列8所示的蛋白质；
DC8融合蛋白可为序列表中序列9所示的蛋白质。
上述DCm具有以下特征：DCm与DNA分子、cDNA分子或含有DNA分子或cDNA分子的生物芯片的亲和力较DC下降。
所述生物芯片是指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)。
DCm可以以核苷酸或核苷酸类似物为底物。所述核苷酸类似物为对核苷酸进行修饰得到的物质。所述核苷酸类似物具体可为用荧光基团修饰核苷酸得到的物质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与DCm相关的生物材料。
本发明所提供的与DCm相关的生物材料为下述C1)至C5)中的任一种：
C1)编码DCm的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因细胞系。
上述生物材料中，C1)所述核酸分子可为下述1)、2)或3)：
1)将DC的编码基因的序列进行至少一个核苷酸的置换得到的编码DCm的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码DCm的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码DCm的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列10的第43-2367位所示的DNA分子编码序列1的第2-775位所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码DCm的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的DCm的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码DCm且具有DCm功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码DCm的氨基酸序列的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，编码所述DC5融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列11所示的DNA分子；
编码所述DC24融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列12所示的DNA分子；
编码所述DC4融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列13所示的DNA分子；
编码所述DC35融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列14所示的DNA分子；
编码所述DC36融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列15所示的DNA分子；
编码所述DC40融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列16所示的DNA分子；
编码所述DC17融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列17所示的DNA分子；
编码所述DC8融合蛋白的核酸分子可为序列表中序列18所示的DNA分子。
上述生物材料中，C2)所述的含有编码DCm的核酸分子的表达盒(DCm基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达DCm的DNA，该DNA不但可包括启动DCm基因转录的启动子，还可包括终止DCm基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述DCm基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。
所述重组载体可为在所述载体的多克隆位点插入所述编码DCm的核酸分子得到的重组载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体为将pET-28a的AlwNI和HpaI识别序列间的DNA片段替换为所述编码DCm融合蛋白的核酸分子得到的表达DC融合His标签与TEV酶识别序列的融合蛋白的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的实施例中，所述重组微生物具体向大肠杆菌BL21(DE3)中导入所述重组载体得到的载体。
上述生物材料中，所述转基因细胞系可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了DCm的制备方法。
本发明所提供的DCm的制备方法，包括将DCm的编码基因导入生物细胞中使DCm的编码基因表达，得到DCm。
上述方法中，所述将DCm的编码基因导入生物细胞可为将含有所述DCm的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞中，得到重组细胞。
所述DCm的编码基因具体可为上文中C1)所述核酸分子。
所述重组表达载体可为将所述DCm的编码基因导入表达载体中得到重组载体。所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。
上述方法中，所述生物细胞可为微生物、动物细胞或植物细胞。所述微生物具体可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法中，所述使DCm的编码基因表达具体可为培养所述重组细胞，得到培养物，使所述重组细胞中的所述DCm的编码基因得到表达。
上述方法还可包括从所述培养物中纯化DCm。从所述培养物中纯化DCm具体可利用亲和层析的方法和离子交换层析的方法进行纯化。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
E1)DCm在作为DNA聚合酶中的应用；
E2)所述生物材料在制备DNA聚合酶中的应用；
E3)DCm在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中的应用；
E4)DCm在制备聚合酶链式反应产品中的应用；
E5)所述生物材料在聚合酶链式反应中的应用；
E6)所述生物材料在制备聚合酶链式反应产品中的应用；
E7)所述DCm的制备方法在制备聚合酶链式反应产品中的应用；
E8)DCm在测序中的应用；
E9)所述生物材料在测序中的应用；
E10)DCm在制备测序产品中的应用；
E11)所述生物材料在制备测序产品中的应用；
E12)所述DCm的制备方法在制备测序产品中的应用。
本发明中，所述DNA聚合酶可以以核苷酸或核苷酸类似物为底物。所述核苷酸类似物为对核苷酸进行修饰得到的物质。所述核苷酸类似物具体可为用荧光基团修饰核苷酸得到的物质。
实验证明，相对于DC，本发明所提供的对DC序列中的部分氨基酸残基进行置换得到的具有DNA聚合酶活性的蛋白质(DCm)与模板DNA的亲和力降低，而酶活并未降低。在保持酶的活性的前提下适当的亲和力降低是有益的，如在测序中与模板DNA的亲和力的降低有益于洗脱附着于芯片上的聚合酶，使得每轮加入的聚合酶能更好的发挥作用，进而提高测序结果的质量。
附图说明
图1为纯化后的DC5融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC5融合蛋白，泳道2为纯化后的DC5融合蛋白稀释20倍后样品，泳道3为蛋白分子量标准。
图2为纯化后的DC24融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为纯化后的DC24融合蛋白，泳道3为纯化后的DC24融合蛋白稀释20倍后样品。
图3为纯化后的DC4融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC4融合蛋白，泳道2为纯化后的DC4融合蛋白稀释20倍后样品，泳道3为蛋白分子量标准。
图4为纯化后的DC35融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC35融合蛋白，泳道2为纯化后的DC35融合蛋白稀释20倍后样品，泳道M为蛋白分子量标准。
图5为纯化后的DC36融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC36融合蛋白，泳道2为纯化后的DC36融合蛋白稀释20倍后样品，泳道M为蛋白分子量标准。
图6为纯化后的DC40融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC40融合蛋白，泳道2为纯化后的DC40融合蛋白稀释20倍后样品，泳道M为蛋白分子量标准。
图7为纯化后的DC17融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为纯化后的DC17融合蛋白，泳道3为纯化后的DC17融合蛋白稀释20倍后样品。
图8为纯化后的DC8融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为纯化后的DC8融合蛋白，泳道2为纯化后的DC8融合蛋白稀释20倍后样品，泳道3为蛋白分子量标准。
图9为纯化后的DC融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为纯化后的DC融合蛋白，泳道3为纯化后的DC融合蛋白稀释20倍后样品。
图10为DC5融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC5融合蛋白，NC表示阴性对照。
图11为DC24融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC24融合蛋白，NC表示阴性对照。
图12为DC4融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC4融合蛋白，NC表示阴性对照。
图13为DC35融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC35融合蛋白，NC表示阴性对照。
图14为DC36融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC36融合蛋白，NC表示阴性对照。
图15为DC40融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC40融合蛋白，NC表示阴性对照。
图16为DC17融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC17融合蛋白，NC表示阴性对照。
图17为DC8融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC8融合蛋白，NC表示阴性对照。
图18为DC融合蛋白内切酶活性检测结果。其中，S表示DC融合蛋白，NC表示阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pUC19为NEB产品。
下述实施例中的ICR缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为Trizma Base 50mM(pH 8.0)、NaCl 50mM、EDTA 1mM、MgSO4 10mM和Tween-20 0.05％(体积百分比)。
实施例1、DNA聚合酶的制备
本申请对外切酶失活处理的9°N DNA聚合酶(以下简称DC)序列中的部分氨基酸残基进行置换，得到名称分别为DC5、DC24、DC4、DC35、DC36、DC40、DC17和DC8的DNA聚合酶。DC为将NCBI中ID为AAA88769.1的蛋白质的第141位的天冬氨酸置换为丙氨酸、第143位的谷氨酸置换为丙氨酸得到的蛋白质，DC的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
DC5为将DC第674位的赖氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC5的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC5融合蛋白的序列为序列表中序列2；
DC24为将DC第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC24的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC24融合蛋白的序列为序列表中序列3；
DC4为将DC第668位的精氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC4的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC4融合蛋白的序列为序列表中序列4；
DC35为将DC第665位的谷氨酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC35的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC35融合蛋白的序列为序列表中序列5；
DC36为将DC第667位的苏氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC36的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC36融合蛋白的序列为序列表中序列6；
DC40为将DC第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸以及第735位的天冬酰胺残基均置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC40的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC40融合蛋白的序列为序列表中序列7；
DC17为将DC第679位的组氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC17的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC17融合蛋白的序列为序列表中序列8；
DC8为将DC第735位的天冬酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶，在DC8的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的DC8融合蛋白的序列为序列表中序列9。
各DNA聚合酶的具体制备方法如下：
1、重组菌的制备
将pET-28a(Novagen)的AlwNI和HpaI识别序列间的DNA片段替换为DC融合蛋白的编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为V-DC。其中，DC融合蛋白为在DC的第一位甲硫氨酸残基后加入6个组氨酸残基组成的his标签以及由ENLYFQG七个氨基酸残基组成的TEV酶切位点得到的融合蛋白质，DC融合蛋白的编码基因的序列为序列表中序列10。
将V-DC导入大肠杆菌BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-V-DC。BL21-V-DC表达DC融合蛋白。
按照上述方法，将DC融合蛋白的编码基因分别替换为DC5融合蛋白的编码基因、DC24融合蛋白的编码基因、DC4融合蛋白的编码基因、DC35融合蛋白的编码基因、DC36融合蛋白的编码基因、DC40融合蛋白的编码基因、DC17融合蛋白的编码基因和DC8融合蛋白的编码基因，其他均不变，得到分别表达DC5融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白的重组菌(BL21-V-DC5、BL21-V-DC24、BL21-V-DC4、BL21-V-DC35、BL21-V-DC36、BL21-V-DC40、BL21-V-DC17和BL21-V-DC8)。
其中，DC5融合蛋白的编码基因为序列11所示的DNA分子，DC24融合蛋白的编码基因为序列12所示的DNA分子，DC4融合蛋白的编码基因为序列13所示的DNA分子，DC35融合蛋白的编码基因为序列14所示的DNA分子，DC36融合蛋白的编码基因为序列15所示的DNA分子，DC40融合蛋白的编码基因为序列16所示的DNA分子，DC17融合蛋白的编码基因为序列17所示的DNA分子，DC8融合蛋白的编码基因为序列18所示的DNA分子。
将pET-28a导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-V。
2、DC5融合蛋白的制备
2.1诱导表达
将步骤1得到的重组菌BL21-V-DC5接种于5ml Kan-LB培养基(Kan-LB培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为25μg/ml的液体培养基)中进行培养，37℃，220rpm，过夜；将所得菌液，按1:50接种于30ml Kan-LB培养基中培养，37℃，220rpm，4h；将所得菌液，按1:50接种于250ml Kan-LB培养基中，37℃，220rpm培养约4h；待OD600值达0.6左右，按向培养所得菌液中添加IPTG至其在菌液中的浓度为0.5mM，然后30℃220rpm下培养过夜(约16h)；8000rpm，10min收集BL21-V-DC5菌体。同时设不加IPTG作为空白对照，收集未诱导BL21-V-DC5菌体。
按照上述诱导表达方法，将重组菌BL21-V-DC5替换为BL21-V，其他均不变，得到BL21-V菌体。
2.2菌体破碎与纯化
取步骤2.1的BL21-V-DC5菌体，按1g菌体:20ml亲和液(50mM KPO4，500mM NaCl，5％Glycerol，PH 7.4)的比例用亲和A液重悬菌体，得到菌体重悬液1；向菌体重悬液1中加入苯甲基磺酰氟、Triton X-100与溶菌酶，得到菌体重悬液2，菌体重悬液2中苯甲基磺酰氟、Triton X-100与溶菌酶的终浓度分别为0.25mM、0.5％(体积百分比浓度)和2.5mg/100mL；将菌体重悬液2室温孵育30min，40％功率(约400W)超声2s停2s共30min，12000rpm 4℃离心超声产物30min后收集上清液。
将上清液用0.45μm的注射式滤器(Life Sciences)过滤后，将上清液以适当流速上样进行Ni柱亲和层析(亲和层析预装柱HisTrap HP，5ml，17-5248-02，GE healthcare)，上样后利用亲和buffer 1(50mM KPO4，500mM NaCl，10mM imidazole，5％Glycerol，PH7.4)平衡10CV；3％亲和buffer 2(50mM KPO4，1M NaCl，500mM imidazole，5％Glycerol，PH7.4)洗脱5CV；50％亲和buffer 2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的Ni柱亲和层析洗脱液。
将大于等于100mAU峰值对应的洗脱液使用离子buffer1(25mM KPO4，50mM NaCl，5％Glycerol，PH 7.4)稀释10倍后，按一定的流速上样进行阴离子交换层析(离子交换预装柱HiTrap Q HP，5ml，17-1154-01，GE healthcare)，上样后收集阴离子交换层析穿透液。
将阴离子交换层析穿透液按一定的流速进行阳离子交换层析(离子交换预装柱HiTrap SP HP，5ml，17-1152-01，GE healthcare)，上样后用离子buffer1平衡10CV；3％离子buffer2(50mM KPO4，1M NaCl，5％Glycerol，PH 7.40)洗脱5CV；50％离子buffer 2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的SP柱阳离子交换层析洗脱液收集洗脱液使用透析袋(spectrumlabs，131267)于透析液(20mM Tris，200mM KCl，0.2mM EDTA，5％Glycerol)中透析24小时后，定量至1mg/ml并含50％的甘油，即得到纯化后的DC5融合蛋白。
按照步骤2.1-2.2的诱导表达与菌体破碎与纯化方法，将BL21-V-DC5分别替换为BL21-V-DC24、BL21-V-DC4、BL21-V-DC35、BL21-V-DC36、BL21-V-DC40、BL21-V-DC17和BL21-V-DC8，其他均不变，分别得到纯化后的DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白。
3、常规质检
(1)利用SDS-PAGE电泳进行纯度质检
将10μl浓度为1mg/ml的步骤2得到的DC5融合蛋白与10μl上样缓冲液混匀后得到液体1，将10μl浓度为0.05mg/ml的步骤2得到的DC5融合蛋白与10μl上样缓冲液混匀后得到液体2，分别取10μl液体1与液体2进行SDS-PAGE电泳，结果如图1，纯化后的DC5融合蛋白纯度大于95％。
按照上述方法，分别检测纯化后的DC融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白的纯度，结果(图2-图9)发现这些蛋白的纯度均大于95％。
(2)内切酶活性质检
利用表2的反应体系检测步骤2得到的DC5融合蛋白的内切酶活性：
表2、内切酶活性检测反应体系
将表2的反应体系37℃温浴4h后，加入1μl 0.5M EDTA终止反应。使用Gelextraction kit(omega bio-tek)纯化反应产物，而后进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图10，pUC19质粒条带未被降解，证明DC5融合蛋白无内切酶污染。用水替换DC5融合蛋白作为阴性对照(NC)。
按照上述方法，分别对DC融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白的内切酶活性进行质检，结果(图11-图18)证明这些蛋白均无内切酶污染。
(3)外切酶活性质检
1ml TE缓冲液重悬DNase Alert Substrate(Thermo Fisher Scientific)，确保底物完全溶解。取重悬后的DNase Alert Substrate，每孔5μl加入到384孔板内；向样品孔内加入40μl步骤2得到的DC5融合蛋白酶液，混匀。并设置阴性对照与阳性对照，阴性对照为利用等体积的无核酸酶水替换DC5融合蛋白酶液，阳性对照为用无核酸酶水将10×Nuclease Alert Buffer(invitrogen)稀释10倍至1×溶液，再用1×溶液将标准品DNase I五倍稀释后，取2.5μl加入阳性对照孔内，同时加37.5μl无核酸酶水补足体系、震荡混匀。
37℃孵育10min后，Gen5酶标仪检测。根据检测的荧光值，计算得到DC5融合蛋白的Dnase活性为0.002U/μl，几乎无外切酶活性，质检合格。
按照上述方法，分别对DC融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白的外切酶活性进行质检，证明这些蛋白均无外切酶污染。
4、以dNTP为底物检测DC5融合蛋白的DNA聚合酶活性
采用酶稀释缓冲液(酶稀释缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为Trizma Base 10mM(pH 7.4)、KCl 100mM、EDTA 0.1mM和甘油5％(体积百分比))，将20μl步骤2得到的DC5融合蛋白(1mg/ml)于圆底96孔板内按照2、4、8、16、32倍梯度稀释，最后得到稀释32倍的DC5融合蛋白，然后按表3的反应体系进行反应。
表3、反应体系
组分 体积
annealed mixture 2.5μl
10mM dNTP 1.25μl
稀释32倍的DC5融合蛋白 3μl
ICR缓冲液 12.5μl
H2O 5.75μl
表3中的annealed mixture的组分及配比
组分 体积
60μM template 2.5μl
60μM primer 2.5μl
2*Anneal buffer 12.5μl
H2O 7.5μl
以H2O作为阴性对照，设三个平行，PCR仪内60℃孵育10min，迅速置于冰上，10mMEDTA终止反应。其中，2*Anneal buffer(10mM Trizma Base,50mM NaCl,1mM EDTA，pH为7.4)；template(模板)为向去离子水中加入序列表中序列20所示的单链DNA得到的序列20所示的单链DNA浓度为60μM的模板溶液；primer(引物)为向去离子水中加入序列表中序列19所示的单链DNA得到的序列19所示的单链DNA为60μM的引物溶液。
取终反应液2μl至预先加入38μl TE缓冲液的96孔板内，枪头吹打混匀后取10μl至预先加入40μl TE缓冲液的黑色平底96孔板内；在此96孔板其他孔内将500ng/mlλDNA按2倍法进行梯度稀释，取各稀释梯度的稀释液50μl作为标准品至新孔内。使用TE缓冲液将Picogreen(Thermo Fisher Scientific)染料稀释200倍后取50μl加入上述样品孔中混匀，室温避光静置2min。在激发光480nm发射光520nm下检测荧光。
按照上述方法，分别对DC融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC40融合蛋白、DC17融合蛋白和DC8融合蛋白的DNA聚合酶活性进行检测。
通过上述方法，检测得到DC5融合蛋白的32倍稀释酶液聚合dNTP量为0.51nmol，DC融合蛋白的32倍稀释酶液聚合dNTP量为0.43nmol，DC4融合蛋白、DC24融合蛋白、DC17融合蛋白、DC8融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白和DC40融合蛋白的32倍稀释酶液聚合dNTP量分别为0.45、0.52、0.47、0.48、0.46、0.48和0.47nmol。
DNA聚合酶一个酶活单位定义为:在60℃下，在10min内聚合0.35nmoldNTP的酶量为1U。
DC5融合蛋白、DC4融合蛋白、DC6融合蛋白、DC7融合蛋白、DC8融合蛋白、DC9融合蛋白、DC17融合蛋白和DC24融合蛋白的DNA聚合酶活性分别为1.46U、1.29U、1.49U、1.34U、1.37U、1.31U、1.37U和1.34U，DC融合蛋白的DNA聚合酶活性为1.23U。
表明，与DC融合蛋白相比，DC5融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC8融合蛋白、DC40融合蛋白和DC17融合蛋白均具有DNA聚合酶活性。
5、DNA聚合酶单碱基掺入动力学
本实施例利用Cy3荧光染料标记的dATP(dATP-Cy3)和Cy5荧光染料标记的DNA模板(模板DNA-Cy5)，利用酶标仪检测DC融合蛋白、DC5融合蛋白、DC1融合蛋白、DC4融合蛋白、DC6融合蛋白、DC7融合蛋白、DC8融合蛋白、DC9融合蛋白、DC17融合蛋白和DC24融合蛋白相对反应速率，具体实验方法如下：
将带有5’Cy5荧光标记的单链引物S1A(序列表中序列21)和S2A(序列表中序列22)(两条引物互为引物模板)按1：1等摩尔浓度进行混合，按65℃1min、40℃1min、4℃10min退火，退火产物避光保存至-20℃，即得到Cy5荧光染料标记的模板DNA-Cy5。
使用BioTek酶标仪进行酶活检测，反应在384板(Corning black,clear bottom384plates)中进行，每孔装液量为50μl，反应体系中dATP过量，模板DNA浓度按2、4、5、8、10、20、40、80nmol/50μl 8个浓度梯度进行实验；反应温度为25℃。具体的反应体系为：
2U DC融合蛋白、DC5融合蛋白、DC4融合蛋白、DC6融合蛋白、DC7融合蛋白、DC8融合蛋白、DC9融合蛋白、DC17融合蛋白或DC24融合蛋白(每个反应体系一种蛋白质)，1μM dATP-Cy3，10μM dTTP,10μM dCTP,10μM dGTP,模板DNA-Cy5按2、4、5、8、10、20、40、80nmol/50μl 8个浓度梯度进行实验(每个反应体系一种模板DNA-Cy5浓度)，该反应在酶反应缓冲液(酶反应缓冲液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4，pH 8.8)中进行。
酶反应以动力学检测模式，每反应5min记录一次数据，检测条件为
可近似计算其相对荧光值的反应速率。
反应速率的大小取决于模板DNA-Cy5的浓度，因此通过在不同浓度的模板DNA-Cy5条件下，检测DNA聚合酶的活性可以近似确定其Km值(即反应速率达到最大反应速率的一半时所对应的底物(即模板DNA-Cy5)的浓度)。
DC融合蛋白、DC5融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC8融合蛋白、DC40融合蛋白和DC17融合蛋白的km值分别为29、38.4、39、42.1、40.3、40.6、38、43.3、42.6和41.4，与DC融合蛋白相比，DC5融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC8融合蛋白、DC40融合蛋白和DC17融合蛋白的km值均明显增加，说明DC5融合蛋白、DC24融合蛋白、DC4融合蛋白、DC35融合蛋白、DC36融合蛋白、DC8融合蛋白、DC40融合蛋白和DC17融合蛋白对模板DNA的亲和力均明显降低。
<110> 深圳华大基因研究院、深圳华大基因科技有限公司
<120> DNA聚合酶及其制备方法
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 2
<211> 788
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ile Leu
1 5 10 15
Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile Arg Val Phe
20 25 30
Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Glu
35 40 45
Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Asp Val
50 55 60
Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys Val Lys Arg
65 70 75 80
Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp
85 90 95
Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Arg
100 105 110
Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro
115 120 125
Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly
130 135 140
Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr Leu Tyr His
145 150 155 160
Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala
165 170 175
Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile Asp Leu Pro
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Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu
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Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly
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Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu Glu Leu Gly
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Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg
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Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp
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Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu
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Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu Lys Val Tyr
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Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly
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Lys Gly Lys Lys
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 2367
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<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
aattgaacat tcatgattat ttaagaaata aattgtttta aaatgcactg gccgtcgttt 60
tac 63
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
cgtgtatgcg taatacgact cactatggac g 31
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
cgtgtatcgt ccatagtgag tcgtattacg c 31

Claims (10)

1.蛋白质，为如下A1)-A3)中的任一种：
A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；
A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；
A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；
A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：9°N DNA聚合酶为序列表中序列1所示的蛋白质；
和/或，所述氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加为一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加；
和/或，所述氨基酸残基的修饰为一个或几个氨基酸残基的修饰。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述置换为将9°N DNA聚合酶的氨基酸残基置换为丙氨酸残基；
和/或，所述蛋白质为对9°N DNA聚合酶的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行置换和/或修饰得到的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下B1)-B8)中的任一种：
B1)将9°N DNA聚合酶自N端起的第674位的赖氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B2)将9°N DNA聚合酶自N端起的第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B3)将9°N DNA聚合酶自N端起的第668位的精氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B4)将9°N DNA聚合酶自N端起的第665位的谷氨酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B5)将9°N DNA聚合酶自N端起的第667位的苏氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B6)将9°N DNA聚合酶自N端起的第735位的天冬酰胺残基、第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B7)将9°N DNA聚合酶自N端起的第679位的组氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；
B8)将9°N DNA聚合酶自N端起的第735位的天冬酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质与DNA分子、cDNA分子或含有DNA分子或cDNA分子的生物芯片的亲和力较9°N DNA聚合酶下降。
6.与权利要求1-5中任一所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述C1)至C5)中的任一种：
C1)编码权利要求1-5中任一所述蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因细胞系。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：C1)所述核酸分子为下述1)、2)或3)：
1)将9°N DNA聚合酶的编码基因的序列进行至少一个核苷酸的置换得到的编码权利要求1-5中任一所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1-5中任一所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-5中任一所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：所述9°N DNA聚合酶的编码基因为在序列表中序列10的第43-2364位所示的核酸分子的5′端添加ATG得到的cDNA分子或DNA分子；
和/或，C1)所述核酸分子为在序列表中序列11-18中任一序列的第43-2364位所示的核酸分子的5′端添加ATG得到的cDNA分子或DNA分子。
9.权利要求1-5中任一所述蛋白质的制备方法，包括将权利要求1-5中任一所述蛋白质的编码基因导入生物细胞中使权利要求1-5中任一所述蛋白质的编码基因表达，得到权利要求1-5中任一所述蛋白质。
10.下述任一应用：
E1)权利要求1-5中任一所述蛋白质在作为DNA聚合酶中的应用；
E2)权利要求6-8中任一所述生物材料在制备DNA聚合酶中的应用；
E3)权利要求1-5中任一所述蛋白质在DNA聚合反应中的应用；
E4)权利要求1-5中任一所述蛋白质在制备聚合酶链式反应产品中的应用；
E5)权利要求6-8中任一所述生物材料在聚合酶链式反应中的应用；
E6)权利要求6-8中任一所述生物材料在制备聚合酶链式反应产品中的应用；
E7)权利要求9所述方法在制备DNA聚合反应产品中的应用；
E8)权利要求1-5中任一所述蛋白质在测序中的应用；
E9)权利要求6-8中任一所述生物材料在测序中的应用；
E10)权利要求1-5中任一所述蛋白质在制备测序产品中的应用；
E11)权利要求6-8中任一所述生物材料在制备测序产品中的应用；
E12)权利要求9所述方法在制备测序产品中的应用。
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