CN108753616B

CN108753616B - 一种基于全基因组信息学分析定向筛选角鲨烯菌株的方法

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Publication number: CN108753616B
Application number: CN201810535693.2A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 刘延峰; 陈良强; 胡光源; 林琳; 王和玉; 王莉; 陈坚
Original assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Current assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108753616A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产目标产物菌株的方法，尤其是一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产角鲨烯菌株的方法。本发明基于生物信息学的方法，对角鲨烯的合成代谢途径及关键基因进行分析，根据已测序完成的微生物全基因组数据，获得具有产角鲨烯的代谢途径和潜在能力的菌株；然后根据其代谢途径的类别、关键酶特性和底物要求，针对性的设计和优化发酵培养基和发酵条件，从而定向筛选获得产角鲨烯的目标菌株。最终获得了酱香型白酒酿造过程中具有产角鲨烯能力的粟酒裂殖酵母。本发明可高效、定向筛选产角鲨烯菌株，对其它目标产物的筛选也同样具有重要的指导和应用价值。

Description

一种基于全基因组信息学分析定向筛选角鲨烯菌株的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产目标产物菌株的方法，尤其是一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产角鲨烯菌株的方法。

背景技术

角鲨烯是一种萜烯类物质，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性，一直以来作为健康食品在世界各地使用，也广泛应用于制作疫苗乳液、化妆品和机械润滑油等方面。但由于该类物质主要存在于深海鲨鱼体内，获取困难，且会破坏自然生态环境，因此寻求角鲨烯生产的替代方法迫在眉睫。

微生物发酵生产角鲨烯是一种可行的替代方案。有文献报道部分微生物可从头合成角鲨烯。在中国传统白酒中也检测到了该类萜烯物质(应用多级液液微萃取结合气质联用定量白酒中的角鲨烯，分析测试学报，2017，36(4)，534-538)，这表明白酒酿造过程中可能具有合成角鲨烯的菌株存在。

现有文献和研究对产角鲨烯菌株的筛选方法主要是通过非目标性的大量筛选，然后直接测定目标产物（高产角鲨烯类酵母Pseudozyma sp.SD 301的筛选、鉴定及发酵条件的优化，中国海洋大学，2015，王晓龙）。由于角鲨烯测定方法较为复杂，非目标性的筛选会耗费大量的时间、精力与资金。迄今为止，对酒醅中产角鲨烯菌株的筛选还未见有报道。

由于中国传统白酒酿造是开放式的固态发酵，工艺环节复杂、参与微生物种类繁多，如何快速高效筛选产角鲨烯的目标菌株是亟待解决的一个难题。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产目标产物菌株的方法。

本发明的进一步目的在于提供一种基于全基因组结合生物信息学定向筛选产角鲨烯菌株的方法。

本发明的进一步目的在于提供一种产角鲨烯菌株的定向筛选方法。

本发明的进一步目的在于提供一种用于培养粟酒裂殖酵母合成角鲨烯的培养基。

本发明的进一步目的在于提供一种获得角鲨烯的方法。

本发明的进一步目的在于提供一种筛选粟酒裂殖酵母的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用的具体方案如下：

一方面，本发明提供了一种定向筛选产角鲨烯菌株的方法，其包括以下步骤：

（1）基于酒醅样品中微生物的全基因组序列数据，对基因预测和功能注释，得到基因注释集合；

（2）基于数据库收集角鲨烯合成的代谢通路信息；

（3）将（2）中找到的信息与（1）中的基因注释集合进行比对，获得具有角鲨烯合成代谢通路或角鲨烯合成代谢通路关键酶的候选菌株；

（4）根据（3）中候选菌株产角鲨烯代谢通路类型、关键酶和底物，设计候选菌株的培养基、优化发酵培养基和发酵条件，筛选出目标菌株。

其中，步骤（1）和步骤（2）的顺序可互换，或者同时进行。

作为优选的实验方式，步骤（1）中，微生物的全基因组序列通过第二代HiSeq测序平台或第三代Pacbio测序平台获得。

作为优选的实施方式，步骤（1）中利用数据库KOG、GO、KEGG、NR、SwissProt或TrEMBL对基因预测和功能注释；更优选地，利用数据库KEGG或SwissProt对基因预测和功能注释。

KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。把从已经完整测序的基因组中得到的基因目录与更高级别的细胞、物种和生态系统水平的系统功能关联起来是KEGG数据库的特色之一。人工创建了一个知识库，这个知识库是基于使用一种可计算的形式捕捉和组织实验得到的知识而形成的系统功能知识库。它是一个生物系统的计算机模拟。与其他数据库相比，KEGG的一个显著特点就是具有强大的图形功能，它利用图形而不是繁缛的文字来介绍众多的代谢途径以及各途径之间的关系，这样可以使研究者能够对其所要研究的代谢途径有一个直观全面的了解。各个数据库中包含了大量的有用信息。基因组信息存储在GENES数据库里，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在PATHWAY数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息；KEGG的另一个数据库LIGAND，包含关于化学物质、酶分子、酶反应等信息。

通过与世界上其它一些大型生物信息学数据库的连接，KEGG可以为研究者提供更为丰富的生物学信息(LinkDB)。KEGG提供了Java的图形工具来访问基因组图谱，比较基因组图谱和操作表达图谱，以及其它序列比较、图形比较和通路计算的工具，可以免费获取。

因此，作为优选的实施方式，步骤（2）中使用KEGG数据库找到角鲨烯合成的代谢通路信息。所述的代谢通路信息包括通路类型和关键酶信息，而关键酶信息包括关键酶名称、编号以及编码酶的基因序列。

作为优选的实施方式，步骤（2）中的代谢通路类型为甲羟戊酸(mevalonatepathway，MVA)通路和脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP)通路。

优选的，步骤（2）中，所述的关键酶包括焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、法尼基焦磷酸合成酶、香叶基焦磷酸合成酶、法尼酰二磷酸酯法尼酰基转移酶等甲羟戊酸通路涉及到的酶；

进一步优选的，步骤（2）中，所述的关键酶包括法尼基焦磷酸合成酶或香叶基焦磷酸合成酶。

合成角鲨烯的通路必须含有法尼基焦磷酸合成酶或香叶基焦磷酸合成酶，通过对一些菌株的全基因序列比较发现，许多微生物都具有合成角鲨烯途径的其他酶，但由于缺少这两种酶，因而不能合成角鲨烯。例如扣囊复膜孢酵母因缺少这两种酶，而不能合成角鲨烯。

作为优选的实施方式，步骤（3）中，比对采用Excel软件或R语言。

比对结果显示，步骤（3）中候选菌株为地衣芽孢杆菌、粟酒裂殖酵母、扣囊复膜孢酵母和拟青霉。

作为进一步优选的实施方式，步骤（3）中候选菌株指的是粟酒裂殖酵母、扣囊复膜孢酵母；更为优选的，步骤（3）中候选菌株指的是粟酒裂殖酵母。具有MVA合成角鲨烯途径的菌株可以以葡萄糖或乙酸为最初底物，关键底物为乙酰CoA，然后经过萜烯类骨架生物合成途径代谢生成异戊烯焦磷酸（IPP），再经过法尼基焦磷酸合成酶、法尼酰二磷酸酯法尼酰基转移酶合成最终的角鲨烯。

另一方面，本发明还提供了一种用来培养粟酒裂殖酵母液体发酵培养基，其成分包括：葡萄糖30-60 g/L，蛋白胨10-30 g/L，酵母膏5-20 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5 g/L，氯化钠0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.05-0.15 g/L，硫酸锰0.05-0.15 g/L,乙酸5-15g/L，余量为水。

作为优选的实验方式，所述培养基的配方包括如下组分：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，氯化钠1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸10 g/L，余量为水。

实验发现向培养基中添加5-15g/L乙酸时，粟酒裂殖酵母能够产生角鲨烯，而扣囊复膜孢酵母不能产生。因此，作为优选的方案，步骤（4）中的目标菌株为粟酒裂殖酵母。这是因为扣囊复膜孢酵母也存在MVA途径，但缺少法尼基焦磷酸合成酶来合成法尼基焦磷酸（FPP）。

虽然本发明筛选得到目标菌株为粟酒裂殖酵母，其含有角鲨烯代谢MVA通路所包含的所有的酶，且发明人在验证粟酒裂殖酵母的产角鲨烯能力时，在培养基中也加入了角鲨烯代谢的最初底物葡萄糖和其他常规的培养粟酒裂殖酵母的成分，然而，此种培养环境下，粟酒裂殖酵母并不能产生角鲨烯。而当在培养基中加入乙酸，尤其是特定浓度的乙酸，才能够使培养的粟酒裂殖酵母产角鲨烯。因此，并非随意的选择现有技术中的粟酒裂殖酵母的培养基就可以筛选得到产角鲨烯的目标菌株，还需要对得到的菌株验证和进行培养条件的优化，对于粟酒裂殖酵母来说，加入特定浓度的乙酸作为培养成分是必须的。

另一方面，本发明还提供了一种用于培养粟酒裂殖酵母使其合成角鲨烯的培养基，组分包括：葡萄糖30-60 g/L，蛋白胨10-30 g/L，酵母膏5-20 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，氯化钠0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.05-0.15 g/L，硫酸锰0.025-0.075 g/L，乙酸5-15 g/L，余量为水。

作为进一步优选的实施方式，所述的培养基组分包括：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，氯化钠1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸10 g/L，余量为水。

本发明的有益效果：

（1）本发明以角鲨烯为目标产物，利用微生物全基因组数据和生物信息学工具进行菌株产角鲨烯代谢途径的构建和初步筛选，将具有目标产物完整代谢途径或关键酶的菌株列为候选菌株，可有效减轻工作量，针对性强，筛选效率较高。

（2）根据解析获得的候选菌株代谢途径的类别、关键酶特性和底物要求，可针对性的设计和优化发酵培养基和发酵条件，确保菌株是在最适合产目标产物的条件下进行发酵，从而可减少目标菌株筛选的遗漏问题。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

图1为基于粟酒裂殖酵母全基因组解析构建的角鲨烯代谢途径。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1 菌株全基因组测序结果分析

对酱香型白酒酿造过程中使用的酒醅样品（进行全基因组测序，共获得超过100亿以上碱基信息数据。

利用KOG、GO、KEGG、NR、SwissProt和TrEMBL等数据库对基因组序列进行综合比对，基因预测和功能注释，获得最终的基因注释集合：有效注释功能基因2.1万个，解析代谢产物途径940条以上。

实施例2 角鲨烯代谢途径的构建

基于KEGG数据库，发现角鲨烯生物合成主要有两个代谢途径：一是甲羟戊酸(mevalonate pathway，MVA)途径，另一条途径是脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP)途径，这两条途径合成角鲨烯所需要的酶信息见表1。

表1 MVA途径合成角鲨烯所需要酶类的情况

注：EC编号或EC号是酶学委员会（Enzyme Commission）为酶所制作的一套编号分类法，是以每种酶所催化的化学反应为分类基础。这套分类法亦同时会为各种酶给予一个建议的名称，所以亦称为酶学委员会命名法。EC编号也是EINECS的缩写。

表2 DXP途径合成角鲨烯所需要酶类的情况

再利用KEGG数据库将得到的通路相关信息与实施例1中的基因注释集合所得到的酶的信息与表1中关键酶类信息进行比对，分析是否具有该两途径合成相关的酶，

通过比对发现，只有只有粟酒裂殖酵母和扣囊复膜孢酵母具有MVA合成角鲨烯途径（见图1），但扣囊复膜孢酵母缺少该途径中的法尼基焦磷酸合成酶。

从图1中可以看出，有此通路的菌株可以以葡萄糖或乙酸为最初底物，但关键底物为乙酰CoA，然后经过萜烯类骨架生物合成途径代谢生成异戊烯焦磷酸（IPP），再经过法尼基焦磷酸合成酶、法尼酰二磷酸酯法尼酰基转移酶合成最终的角鲨烯。

因此，根据上述的分析，将粟酒裂殖酵母和扣囊复膜孢酵母作为筛选产角鲨烯的候选菌株进行发酵验证试验。

实施例3 候选菌株产角鲨烯的发酵验证

（1）液体发酵培养基的配制以及菌株的培养

称取葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钠1 g，硫酸镁0.1 g，硫酸锰0.05 g于容器中，加入纯水，定容为1 L。

将候选菌株粟酒裂殖酵母和扣囊复膜孢酵母分别接种于上述液体发酵培养基进行培养，接种后培养液菌落数量都为1×10⁶CFU/mL，培养条件为30℃，180 rpm，5 d。

培养结束后，测定角鲨烯含量。

（2）培养液中角鲨烯含量的测定

检测方法参考文献《应用多级液液微萃取结合气质联用定量白酒中的角鲨烯》（分析测试学报，2017，36(4)，534-538），略有改动，具体为：将发酵液8000rpm，离心10min后，取上清液10mL，加适量NaCl过饱和，再加1mL的戊烷－乙醚(1∶3)萃取剂，迅速旋紧瓶盖，涡旋振荡1 min，静置分层后，吸取有机相0.5 mL于液相小瓶中，获得有机相，氮吹浓缩至0.1mL，吸取1μL有机相进GC－MS分析，结果如表3。

表3 角鲨烯含量测定结果

结果发现，该培养条件下，这两株酵母菌都不产目标物质角鲨烯。实验结果说明培养基中添加葡萄糖不能促进粟酒裂殖酵母和扣囊复膜孢酵母合成角鲨烯。液体发酵培养基还需进一步地优化。

实施例4 产角鲨烯培养条件优化与目标菌株获得

1、培养基配方

将实施例3培养基中的葡萄糖换成乙酸，具体培养基配方如表3所示。培养基的配制方法如实施例4。

表4 培养基配方

2、菌株的培养效果验证

候选菌株粟酒裂殖酵母和扣囊复膜孢酵母分别接种于培养基1、培养基2、培养基3和培养基4，培养基5，培养基6中，接种后培养液菌落数量为1×10⁶ CFU/mL，培养条件为30℃，180 rpm，5 d。培养结束后，将发酵液8000 rpm，离心10 min后，取上清液10 mL，加适量NaCl过饱和，再加1 mL的戊烷－乙醚(1∶3)萃取剂，迅速旋紧瓶盖，涡旋振荡1 min，静置分层后，吸取有机相0.5 mL于液相小瓶中，获得有机相，氮吹浓缩至0.1 mL，吸取1 μL有机相进GC－MS分析，测定角鲨烯含量，方法同实施例3中角鲨烯含量的测定方法，结果见表5。

表5 不同乙酸浓度下菌株产角鲨烯的含量（μg/g菌体）

从表3可以看出，粟酒裂殖酵母在添加一定的乙酸（5-15g/L）后，可以在发酵液中检测出角鲨烯，乙酸可以促进菌株合成乙酰CoA，进而通过MVA途径合成角鲨烯，当乙酸浓度为10g/L时，角鲨烯含量最高；当乙酸浓度升到15g/L时，由于对菌株生长存在一定的抑制作用，因此目标产物含量也发生降低。而当乙酸浓度低于5 g/L，高于15 g/L时，发酵液中未检测出角鲨烯。

而扣囊复膜孢酵母在所有条件下均未检出目标产物，主要是由于该酵母不能合成法尼基焦磷酸（FPP），而优化发酵条件并不能使菌株具有合成该中间产物的能力。

通过对扣囊复膜孢酵母MVA代谢途径的分析，我们发现虽然也存在MVA途径，但缺少法尼基焦磷酸合成酶来合成法尼基焦磷酸（FPP）。

因此，本发明通过对角鲨烯的合成途径及关键基因进行分析，基于已测序完成的酱香型白酒酿造过程中微生物全基因组数据，构建了菌株产角鲨烯的代谢途径，然后根据其代谢途径的类别、关键酶特性和底物要求，针对性的设计和优化发酵培养基和发酵条件，从而定向筛选获得产角鲨烯的目标菌株粟酒裂殖酵母。该方法具有针对性、高效性的优点，同时对其它目标产物的筛选也同样具有重要的指导和应用价值。

Claims

1.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

葡萄糖30-60 g/L，

蛋白胨10-30 g/L，

酵母膏5-20 g/L，

磷酸氢二钾0.5-1.5 g/L，

氯化钠0.5-1.5 g/L，

硫酸镁0.05-0.15 g/L，

硫酸锰0.025-0.075 g/L，

乙酸5-15 g/L，

余量为水。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基包括以下组分：

葡萄糖50 g/L，

蛋白胨20 g/L，

酵母膏10 g/L，

磷酸氢二钾1 g/L，

氯化钠1 g/L，

硫酸镁0.1 g/L，

硫酸锰0.05 g/L,

乙酸10 g/L，

余量为水。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述乙酸的浓度为5-10 g/L。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述乙酸的浓度为10-15g/L。

5.权利要求1-4任一所述的培养基在培养粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe ）合成角鲨烯中的应用。