CN108728399A - 基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3d培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法 - Google Patents
基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3d培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法包括：(1)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行分离；(2)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行3D培养，形成类器官；(3)小鼠小肠类器官传代；(4)小鼠小肠类器官冻存；(5)小鼠小肠类器官复苏；(6)小鼠小肠类器官冰冻切片制备；(7)小鼠小肠类器官冰冻切片免疫荧光标记及鉴定。相比于现有技术，本发明以含有干细胞的小肠隐窝为基础，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。此方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。
背景技术
小肠作为人体最大的营养物质消化和吸收器官，由于其在代谢紊乱疾病如肥胖及糖尿病的重要作用，人们对肠道营养物质吸收、转运、感受和激素释放的兴趣日益增长。目前用于小肠营养物感受、转运、吸收及局部激素调节功能研究的体外模型主要分为两类：一类是以肠道组织为基础的模型，包括环法、外翻肠囊、尤斯灌流室和离体肠灌注，上述模型可以用于正常生理条件下微生物、上皮细胞、免疫细胞、神经细胞及其他细胞在组织中的相互作用；一类是以肿瘤细胞系为基础的模型，包括各种转化的肠道上皮细胞系，如Caco-2，HT29，NCI-H716，STC-1等，上述Caco-2细胞模型结合跨膜分析技术(Transwell)可以产生极化上皮层，用于体外上皮细胞反应研究。
但是，上述肠道功能体外研究模型均存在一定缺陷：肠道组织基础上的模型，因为上述模型需要获取离体组织，实验对象数量有限情况下将无法获得足够质量及数量的组织，而且离体组织具有时间有效性，因此只有有限的功能测试时间，实验的重复性及稳定性差。同时为了获取足够数据，动物使用量高。细胞基础上的模型，细胞组成单一，无法真正再现肠道细胞与细胞之间，细胞与细胞基质之间的相互作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法区别于现有技术，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含了完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定等方法。进一步地，此培养方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，包括以下几个步骤：
步骤一、收集一只8-10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2-3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3-5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10-15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10-15次进行清洗；
步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；
步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；
步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；
步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150-250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；
步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2-3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官；
步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中速溶，待小肠类器官重悬液完全融化后，转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中，加入预冷基础培养基至5毫升，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入100微升复合凝胶液，得到小肠类器官复苏重悬液；将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中；将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到复苏小肠类器官。
进一步地，步骤四、五和七中所述复合凝胶液提取自小鼠肉瘤，由粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、转化生长因子-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子和组织纤溶酶原激活剂组成。
步骤四、五和七中所述完全培养基由R-spondin条件培养基、Noggin条件培养基、DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素、链霉素、表皮生长因子、神经元细胞培养补充剂N2和B27、Rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂Y27632组成。
步骤七中所述基础培养基由DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素和链霉素组成。
步骤六中所述冻存液由DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素、链霉素、胎牛血清和二甲基亚砜组成。
本发明还提供了基于小鼠不同区段小肠的体外类器官鉴定方法，包括以下几个步骤：
步骤一、选择初代、传代和复苏小肠类器官中的任一小肠类器官作为鉴定对象，培养6天后去除培养基，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液4；将复合凝胶悬液4转移至15毫升离心管10中，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入提前冰上预冷的溶度为4％的多聚甲醛，在温度20-25℃条件下固定15分钟；固定完毕后，将离心管10中在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入2毫升溶度为0.01％的亚甲基蓝溶液，在温度20-25℃条件下孵育20分钟；孵育完成后，将离心管10在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入1毫升溶度为20％的蔗糖溶液，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得到含有小肠类器官蔗糖溶液的离心管10；
步骤二、将离心管10中的小肠类器官蔗糖溶液转移至1.5毫升离心管11中，在转速4000rpm条件下离心30-60秒后加入50-100微升冰冻切片包埋剂，轻轻悬浮后，在温度20-25℃条件下静止20-30分钟；待小肠类器官沉降于1.5毫升离心管11后，将离心管11置于干冰上速冻1-3分钟；将成块小肠类器官从离心管11中取出，含小肠类器官的那一面向下，置于含冰冻切片包埋剂的包埋盒中二次包埋，用干冰速冻1-3分钟，得到小肠类器官包埋物；速冻完成后，采用冰冻切片机对小肠类器官包埋物以8-10微米的厚度进行切片，得小肠类器官包埋切片1；将小肠类器官包埋切片1置于烘片机上，在42℃温度下烘30分钟后，制得烘干后的小肠类器官包埋切片2，将小肠类器官包埋切片2放入切片盒中，在-80℃冰箱中保存备用；
步骤三、将步骤二中得到的小肠类器官包埋切片2从-80℃冰箱取出，置于烘片机上，在42℃温度下烘20分钟；随后，将小肠类器官包埋切片2放于孵育盒中，用磷酸盐缓冲溶液清洗10分钟；随后，去除磷酸盐缓冲溶液，加入抗原封闭液，温度20-25℃条件下孵育30-45分钟，得小肠类器官包埋切片3；在小肠类器官包埋切片3中加入一抗，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得小肠类器官包埋切片4；
步骤四、将步骤三中得到的小肠类器官包埋切片4用磷酸盐缓冲溶液重复清洗3次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片5；在小肠类器官包埋切片5中加入与步骤三中一抗相对应的二抗，温度20-25℃条件下孵育30分钟，得小肠类器官包埋切片6；将小肠类器官包埋切片6用磷酸盐缓冲溶液重复清洗4次，每次5分钟；随后，加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐溶液，温度20-25℃条件下孵育5分钟；用超纯水以清洗1-2次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片7；最后用封片剂对小肠类器官包埋切片7进行封片，得到小肠类器官封片；
步骤五，采用激光共聚焦显微镜对步骤四中得到的小肠类器官封片进行观察，获取免疫荧光图像及鉴定。
本发明具有以下优点及有益效果：
相比于现有的技术方法，本发明提供的方法具有以下几个显著的优点和进步：
1、本发明的技术方法，优化了小鼠小肠不同位段的选取位置，对提取流程进行了优化，能够保证小肠类器官体外培养顺利完成。
2、本发明的技术方法，对小鼠小肠类器官体外培养体系采用的培养体系、复合凝胶液、完全培养基和基础培养基等培养关键性生化试剂进行了突破性优化，进而保证小肠类器官能够在体外实现正常培养、反复传代、冻存和反复复苏，且具有传代稳定性。
3、本发明的技术方法，除了提供完整的体外培养方法，还提供了完整的体外传代、冻存和复苏方法，保证了小肠类器官在体外的循环使用性。
4、本发明的技术方法，优化了小肠类器官的体外鉴定方法，能够明确小肠类器官的可靠性。
附图说明
图1是小肠分段收集示意图。
图2是小肠类器官的体外培养生长图。
图3是小肠类器官的体外传代12次培养生长图。
图4是小肠类器官的免疫荧光鉴定图。
具体实施例
本发明公开了一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
为更好地阐述本发明，下面通过实施例来说明。
实施例1：
步骤一、将一只9周大的雄性C57BL/6小鼠用二氧化碳进行安乐死后将颈椎脱臼；采用70％浓度的乙醇溶液润湿小鼠腹部，用解剖剪切开小鼠腹腔至颅外生殖器，切割双侧腹部肌肉组织将切口延伸至肋骨，将十二指肠从幽门括约肌处切开，将小肠从腹腔内拉出后在回肠盲肠部将小肠切断；将收集好的小肠放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；图1是小肠分段收集示意图。其中1是幽门括约肌切断位置，2是回肠盲肠部切断位置，3是十二指肠段，4是空肠段，5是回肠段。
将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成4毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以45rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以45rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒15次进行清洗。
步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集。
步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上。
步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；
图2是小肠类器官体外培养第一天和第四天时的组织形态图。图2的A是原代分离十二指肠隐窝形态代表性图像，A1是十二指肠隐窝经过4天培养后形成类器官代表性图像；B是原代分离空肠隐窝形态代表性图像，B1是空肠隐窝经过4天培养后形成类器官代表性图像；C是原代分离回肠隐窝形态代表性图像，C1是回肠隐窝经过4天培养后形成类器官代表性图像。
从图2中可以看到，小肠类器官在体外具有稳定的组织生长性。
步骤五、在步骤四接种后6天，在步骤四中的24孔培养板1的每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入175微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到一次传代小肠类器官。
步骤六、重复步骤五的步骤11次，可以得到传代十三次的小肠类器官，图3是传代12次的小肠类器官体外培养第一天和第四天时的组织形态图。
图3的D是传代12代后十二指肠类器官解离后隐窝类似结构代表性图像，D1是传代培养4天后类器官代表性图像；E是传代12代后空肠类器官解离后隐窝类似结构代表性图像，D1是传代培养4天后类器官代表性图像；F是传代12代后回肠类器官解离后隐窝类似结构代表性图像，D1是传代培养4天后类器官代表性图像。
从图3中可以看到，小肠类器官在体外传代12次之后，仍然能够具有稳定的组织生长性。
步骤七、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官。
步骤八、将步骤七种存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中速溶，待小肠类器官重悬液完全融化后，转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中，加入预冷基础培养基至5毫升，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入100微升复合凝胶液，得到小肠类器官复苏重悬液；将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中；将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到复苏小肠类器官。
步骤九、以步骤四的初代小肠类器官作为鉴定对象，以标记肠道上皮细胞标志蛋白钙粘蛋白(E-cadherin)、吸收细胞标志蛋白绒毛蛋白(Villin)、潘氏细胞标志蛋白溶菌酶(Lysozyme)、杯状细胞标志蛋白粘蛋白(Mucin2)、内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白(Chromogranin A)和L型细胞标志蛋白胰高血糖素样肽(GLP-1)蛋白为标记蛋白，培养6天后去除培养基，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液4；将复合凝胶悬液4转移至15毫升离心管10中，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入提前冰上预冷的溶度为4％的多聚甲醛，在温度20℃条件下固定15分钟；固定完毕后，将离心管10中在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入溶度1毫升溶度为0.01％的亚甲基蓝溶液，在温度20℃条件下孵育20分钟；孵育完成后，将离心管10中在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入1毫升溶度为20％的蔗糖溶液，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得到含有小肠类器官蔗糖溶液的离心管10。
步骤十、将离心管10中的小肠类器官蔗糖溶液转移至1.5毫升离心管11中，在转速4000rpm条件下离心45秒后加入50-100微升冰冻切片包埋剂，轻轻悬浮后，在温度20℃条件下静止25分钟；待小肠类器官沉降于1.5毫升离心管11后，用干冰速冻2分钟；将成块小肠类器官从离心管11中取出，含小肠类器官的那一面向下，置于含冰冻切片包埋剂的包埋盒中二次包埋，用干冰速冻30秒，得到小肠类器官包埋物；速冻完成后，采用冰冻切片机对小肠类器官包埋物以9微米的厚度进行切片，得小肠类器官包埋切片1；将小肠类器官包埋切片1置于烘片机上，在42℃温度下烘30分钟后，制得烘干后的小肠类器官包埋切片2，将小肠类器官包埋切片2放入切片盒中，在-80℃冰箱中保存备用。
步骤十一、将步骤十中得到的小肠类器官包埋切片2从-80℃冰箱取出，置于烘片机上，在42℃温度下烘20分钟；随后，将小肠类器官包埋切片2放于孵育盒中，用磷酸盐缓冲溶液清洗10分钟；随后，去除磷酸盐缓冲溶液，加入抗原封闭液，温度20℃条件下孵育40分钟，得小肠类器官包埋切片3；在小肠类器官包埋切片3中加入一抗，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得小肠类器官包埋切片4。
步骤十二、将步骤十一中得到的小肠类器官包埋切片4用磷酸盐缓冲溶液重复清洗3次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片5；在小肠类器官包埋切片5中加入与步骤十一中一抗相对应的二抗，温度20℃条件下孵育30分钟，得小肠类器官包埋切片6；将小肠类器官包埋切片6用磷酸盐缓冲溶液重复清洗4次，每次5分钟；随后，加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐溶液，温度20℃条件下孵育5分钟；用超纯水以清洗2次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片7；最后用封片剂对小肠类器官包埋切片7进行封片，得到小肠类器官封片。
步骤十三，采用激光共聚焦显微镜对步骤十二中得到的小肠类器官封片进行观察，获取免疫荧光图像及鉴定。
图4是小肠类器官的鉴定结果图。
图4的G、H、I、P、Q、R分别是肠道上皮细胞标志蛋白钙粘蛋白(E-cadherin)、吸收细胞标志蛋白绒毛蛋白(Villin)、潘氏细胞标志蛋白溶菌酶(Lysozyme)、杯状细胞标志蛋白粘蛋白(Mucin2)、内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白(Chromogranin A)和L型细胞标志蛋白胰高血糖素样肽(GLP-1)标记的肠道不同类型细胞在十二指肠类器官中表达的免疫荧光代表性图像；G0、H0、I0、P0、Q0、R0分别是上述标志蛋白标记的不同类型肠道细胞在小鼠十二指肠组织中表达的免疫荧光代表性图像；
图4的J、K、L、S、T、U分别是肠道上皮细胞标志蛋白钙粘蛋白(E-cadherin)、吸收细胞标志蛋白绒毛蛋白(Villin)、潘氏细胞标志蛋白溶菌酶(Lysozyme)、杯状细胞标志蛋白粘蛋白(Mucin2)、内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白(Chromogranin A)和L型细胞标志蛋白胰高血糖素样肽(GLP-1)标记的肠道不同类型细胞在空肠类器官中表达的免疫荧光代表性图像；J0、K0、L0、S0、T0、U0分别是上述标志蛋白标记的不同类型肠道细胞在小鼠空肠组织中表达的免疫荧光代表性图像。
图4的M、N、O、V、W、X分别是肠道上皮细胞标志蛋白钙粘蛋白(E-cadherin)、吸收细胞标志蛋白绒毛蛋白(Villin)、潘氏细胞标志蛋白溶菌酶(Lysozyme)、杯状细胞标志蛋白粘蛋白(Mucin2)、内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白(Chromogranin A)和L型细胞标志蛋白胰高血糖素样肽(GLP-1)标记的肠道不同类型细胞在回肠类器官中表达的免疫荧光代表性图像；M0、N0、O0、V0、W0、X0分别是上述标志蛋白标记的不同类型肠道细胞在小鼠空肠组织中表达的免疫荧光代表性图像。
从图4中可以看到，与小鼠体内小肠绒毛相同，体外小肠类器官也由单层上皮细胞组成；而且与体内小肠绒毛中细胞组成结构相同，分化多种不同类型肠道上皮细胞，包括肠道吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞和L型细胞。
因此，从上述步骤和结果可以看出，本发明提供的基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法是稳定，可靠，有效的。
以上所述仅是本发明的特定实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，其特征在于包括以下几个步骤：
步骤一、收集一只8-10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2-3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3-5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10-15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10-15次进行清洗；
步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；
步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；
步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；
步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150-250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；
步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2-3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官；
步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中速溶，待小肠类器官重悬液完全融化后，转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中，加入预冷基础培养基至5毫升，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入100微升复合凝胶液，得到小肠类器官复苏重悬液；将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中；将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到复苏小肠类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤四、五和七中所述复合凝胶液提取自小鼠肉瘤，由粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、转化生长因子-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子和组织纤溶酶原激活剂组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤四、五和七中所述完全培养基由R-spondin条件培养基、Noggin条件培养基、DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素、链霉素、表皮生长因子、神经元细胞培养补充剂N2和B27、Rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂Y27632组成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤七中所述基础培养基由DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素和链霉素组成。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤六中所述冻存液由DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、青霉素、链霉素、胎牛血清和二甲基亚砜组成。
6.一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官鉴定方法，其特征在于包括以下几个步骤：
步骤一、选择初代、传代和复苏小肠类器官中的任一小肠类器官作为鉴定对象，培养6天后去除培养基，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液4；将复合凝胶悬液4转移至15毫升离心管10中，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入提前冰上预冷的溶度为4％的多聚甲醛，在温度20-25℃条件下固定15分钟；固定完毕后，将离心管10中在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入2毫升溶度为0.01％的亚甲基蓝溶液，在温度20-25℃条件下孵育20分钟；孵育完成后，将离心管10在转速200g条件下离心10分钟，去除上清液；在离心管10中加入无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，在转速200g条件下离心5分钟后去除上清液，重复3次；随后向离心管10中的沉淀中加入1毫升溶度为20％的蔗糖溶液，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得到含有小肠类器官蔗糖溶液的离心管10；
步骤二、将离心管10中的小肠类器官蔗糖溶液转移至1.5毫升离心管11中，在转速4000rpm条件下离心30-60秒后加入50-100微升冰冻切片包埋剂，轻轻悬浮后，在温度20-25℃条件下静止20-30分钟；待小肠类器官沉降于1.5毫升离心管11后，将离心管11置于干冰上速冻1-3分钟；将成块小肠类器官从离心管11中取出，含小肠类器官的那一面向下，置于含冰冻切片包埋剂的包埋盒中二次包埋，用干冰速冻1-3分钟，得到小肠类器官包埋物；速冻完成后，采用冰冻切片机对小肠类器官包埋物以8-10微米的厚度进行切片，得小肠类器官包埋切片1；将小肠类器官包埋切片1置于烘片机上，在42℃温度下烘30分钟后，制得烘干后的小肠类器官包埋切片2，将小肠类器官包埋切片2放入切片盒中，在-80℃冰箱中保存备用；
步骤三、将步骤二中得到的小肠类器官包埋切片2从-80℃冰箱取出，置于烘片机上，在42℃温度下烘20分钟；随后，将小肠类器官包埋切片2放于孵育盒中，用磷酸盐缓冲溶液清洗10分钟；随后，去除磷酸盐缓冲溶液，加入抗原封闭液，温度20-25℃条件下孵育30-45分钟，得小肠类器官包埋切片3；在小肠类器官包埋切片3中加入一抗，在温度4℃条件下过夜放置12小时，得小肠类器官包埋切片4；
步骤四、将步骤三中得到的小肠类器官包埋切片4用磷酸盐缓冲溶液重复清洗3次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片5；在小肠类器官包埋切片5中加入与步骤三中一抗相对应的二抗，温度20-25℃条件下孵育30分钟，得小肠类器官包埋切片6；将小肠类器官包埋切片6用磷酸盐缓冲溶液重复清洗4次，每次5分钟；随后，加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐溶液，温度20-25℃条件下孵育5分钟；用超纯水以清洗1-2次，每次5分钟，得小肠类器官包埋切片7；最后用封片剂对小肠类器官包埋切片7进行封片，得到小肠类器官封片；
步骤五，采用激光共聚焦显微镜对步骤四中得到的小肠类器官封片进行观察，获取免疫荧光图像。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20181102 |