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CN108699570A - 从酒糟水提取油的工艺 - Google Patents

从酒糟水提取油的工艺 Download PDF

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CN108699570A
CN108699570A CN201680074974.1A CN201680074974A CN108699570A CN 108699570 A CN108699570 A CN 108699570A CN 201680074974 A CN201680074974 A CN 201680074974A CN 108699570 A CN108699570 A CN 108699570A
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CN
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phospholipase
ala
ser
thr
seq
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Application number
CN201680074974.1A
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M.J.阿克曼
M.C.胡斯
N.E.克里尔
沈心妤
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Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
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Publication date
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Abstract

一种回收油的工艺，该工艺包括(a)用α‑淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的该糖发酵为发酵产物；(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。磷脂酶在发酵产物生产工艺中用于增加从酒糟水和/或浆料的油回收产率的用途。

Description

从酒糟水提取油的工艺
技术领域
本发明涉及在基于含淀粉材料的发酵产物生产工艺的后端从酒糟水和/或浆料中提取/回收油的工艺。
背景技术
发酵产物(例如乙醇)典型地是通过以下过程产生的：首先在干磨或湿磨工艺中研磨含淀粉材料，然后使用酶将该材料降解为可发酵糖，并且最终使用发酵有机体将这些糖直接地或间接地转化为希望的发酵产物。例如通过从其他液体和/或固体分离希望的发酵产物的蒸馏，从发酵醪(通常被称为“啤酒麦芽浆”)中回收液体发酵产物。剩余部分被称为“全酒糟”。例如通过离心将全酒糟脱水并且分离为固相和液相。固相被称为“湿饼”(或“湿谷粒”)并且液相(上清液)被称为“酒糟水”。湿饼和酒糟水分别含有约35％和7％的固体。将脱水湿饼干燥以提供“干酒糟(Distillers Dried Grains)”(DDG)，用作动物饲料中的营养素。典型地将酒糟水蒸发以提供冷凝物和浆料，或者可以作为“逆流”而可替代地被直接再循环至浆料槽。冷凝物可以在排放前送往甲烷转化器或者可以被再循环至浆料槽。可以将浆料共混入DDG或在干燥前添加至湿饼中，以产生DDGS(含可溶物的干酒糟)。越来越多的乙醇工厂从作为副产物的酒糟水和/或浆料/蒸发的分离液(centrate)提取油用于在生物柴油生产或其他生物可再生产品中使用。
从发酵产物生产工艺进行油回收/提取中的大量工作集中在改进来自酒糟水的油的可提取性。通常通过己烷提取来完成油的有效去除。然而，由于需要高资本投资，所以未见己烷提取的利用被广泛应用。因此，已经开发了改进从发酵产物生产工艺进行油提取的其他工艺。
WO 2011/126897(诺维信公司(Novozymes))披露了通过以下过程回收油的工艺：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用产碳水化合物源的酶进行糖化以形成糖；使用发酵有机体来发酵这些糖；其中发酵培养基包括半纤维素酶；将发酵产物蒸馏以形成全酒糟；将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；并且从酒糟水回收油。发酵培养基可以进一步包括蛋白酶。
WO 2014/209789(诺维信公司)披露了通过将热稳定性蛋白酶添加至全酒糟、酒糟水和/或浆料，在液化之后和/或从来自发酵产物生产工艺的酒糟水和/或浆料/蒸发的分离液回收油的工艺。
本发明的一个目标是提供用于增加来自发酵产物生产工艺的可回收油的量的工艺。
发明内容
本发明的目标是提供在发酵产物生产工艺(尤其例如是乙醇生产工艺)的后端提取或回收油的改进的工艺。
因此，在第一方面，本发明涉及回收油的工艺，这些工艺包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收发酵产物以形成全酒糟；
(e)将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将酒糟水浓缩为浆料；
(f)从酒糟水和/或任选地浆料中回收油，
其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
在一个优选实施例中，磷脂酶是磷脂酶C。
在一个实施例中，磷脂酶(特别是磷脂酶C)与蛋白酶组合。
在一个实施例中，在步骤(b)和/或步骤(c)期间存在和/或添加磷脂酶，特别是磷脂酶C。可以在高于初始糊化温度的温度下(例如在70℃-100℃之间、优选在80℃-90℃之间、例如在85℃左右)进行步骤(a)。
可以同时或相继地进行步骤(b)和(c)。在实施例中，可以同时或相继地进行步骤(a)、(b)和(c)。当同时进行步骤(a)、(b)和(c)或步骤(b)和(c)时，温度低于初始糊化温度，例如在20℃-60℃之间、优选在25℃-40℃之间、例如在32℃左右。
例如通过提取(如己烷提取)或通过使用本领域熟知的另一种油回收技术，可以根据本发明从酒糟水和/或浆料/蒸发的分离液回收油。
在一个实施例中，步骤(a)-(c)在低于初始糊化温度的温度下进行。在另一个实施例中，步骤(b)和/或(c)在低于初始糊化温度的温度下进行。
在优选实施例中，磷脂酶选自下组，该组源自Kionochaeata物种(例如SEQ ID NO:3)、埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)(例如SEQ ID NO:1)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(例如SEQ ID NO:2)。优选的是来自埃默森青霉菌(本文中SEQID NO:1)的磷脂酶C。
在另一个方面，本发明涉及磷脂酶(特别是磷脂酶C)在基于含淀粉材料的发酵产物生产工艺的后端从酒糟水和/或浆料中进行油回收的用途。
在一个实施例中，磷脂酶与表面活性剂组合。
附图说明
图1显示了相对于底物剂量的％油。
图2显示了相对于PLC/表面活性剂剂量的％油。
图3显示了PLC Pe、PLC Bt和对照的油产量。
图4显示了匹配产量所需的表面活性剂剂量。
具体实施方式
本发明的目标是提供在发酵产物生产工艺的后端，尤其例如是从来自乙醇生产工艺的酒糟水提取或回收油的工艺。
本发明涉及使用磷脂酶(特别是磷脂酶C)用于在发酵产物生产工艺的后端，特别是从来自乙醇生产工艺的酒糟水回收/提取油的用途。诸位发明人出人意料地发现，当使用单独的磷脂酶(特别是磷脂酶C)时，或与表面活性剂(特别是一种或多种非离子型表面活性剂)组合时，油回收产率增加。可替代地，一种或多种表面活性剂的量可以减少。
因此，在第一方面，本发明涉及回收油的工艺，这些工艺包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收发酵产物以形成全酒糟；
(e)将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将酒糟水浓缩为浆料；
(f)从酒糟水和/或任选地浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)(即，步骤(a)、(b)和(c)中的一个或多个)期间存在和/或添加磷脂酶。
在一个实施例中，在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
在一个优选实施例中，磷脂酶是磷脂酶C。
在一个实施例中，磷脂酶(特别是磷脂酶C)与蛋白酶组合。
在一个实施例中，存在和/或添加一种或多种表面活性剂、优选非离子型表面活性剂。在一个优选实施例中，在步骤(b)和/或步骤(c)中添加和/或存在一种或多种表面活性剂。一种或多种表面活性剂优选是非离子型表面活性剂，具体地是选自以下各项的组：聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(例如，TWEENTM 80)和脱水山梨醇单油酸酯(例如，SPANTM 80)、或其混合物(例如其50:50(％)混合物)。
在一个实施例中，在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)期间添加蛋白酶。
在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶的实例包括具有本文中SEQ ID NO:3的氨基酸序列(例如来自Kionochaeta的菌株)；本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列(例如来自青霉菌属(Penicillium)的菌株)；以及本文中SEQ ID NO:2的氨基酸序列(例如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株)的那些磷脂酶。优选的是具有本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列的磷脂酶，例如源自埃默森青霉菌的菌株。
在一个优选实施例中，磷脂酶源自例如青霉菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:1的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
在一个另外的实施例中，磷脂酶可以源自例如芽孢杆菌属，例如显示于本文中SEQID NO:2的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
在一个实施例中，磷脂酶可以源自例如Kionochaeta，例如显示于本文中SEQ IDNO:3的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
在一个实施例中，本发明的回收油的工艺包括：
(a)在高于初始糊化温度的温度下，用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收发酵产物以形成全酒糟；
(e)将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将酒糟水浓缩为浆料；
(f)从酒糟水和/或任选地浆料回收油，其中在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
当在高的温度下(即高于初始糊化温度，例如在70℃-100℃之间、优选在80℃-90℃之间、例如在85℃左右的温度下)，将步骤(a)作为液化步骤进行时，α-淀粉酶优选是细菌α-淀粉酶。
在一个优选实施例中，当步骤(a)中的温度高于初始糊化温度时，步骤(a)中使用的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。
特别优选的是源自芽孢杆菌属(例如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株)的细菌α-淀粉酶，具体地是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(例如显示于WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4的α-淀粉酶)的变体，具体地是被截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，优选是从485至495个氨基酸长，例如在491个左右氨基酸长。
在一个优选实施例中，细菌α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些α-淀粉酶变体与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4所列出的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比包含在位置R179、G180、I181和/或G182中的任一位置处的一个或两个氨基酸的缺失，优选地在WO 96/23873-参见例如第20页第1-10行(通过引用特此结合)中披露的双缺失，优选地对应于位置I181+G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。
在一个实施例中，细菌α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些α-淀粉酶变体具有以下突变组之一：
-I181*+G182*；
-I181*+G182*+N193F；
优选地
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59AQ89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQID NO:4进行编号)。
亲本嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是显示于本文中SEQ ID NO:4的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或可以是与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的α-淀粉酶。
嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体可以是显示于SEQ ID NO:4的α-淀粉酶变体，或可以是与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的序列一致性的α-淀粉酶变体。
在一个实施例中，与亲本α-淀粉酶(尤其是显示于SEQ ID NO:4的亲本α-淀粉酶)相比，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体具有从1个至12个突变，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、或12个突变。
在一个实施例中，步骤(a)中的pH是从4-7，优选4.5-6。
步骤(a)之后是步骤(b)中的糊精的糖化。然而，本发明的工艺可以进一步包括预糖化步骤，即在步骤(a)之后，但在糖化步骤(b)之前，在30℃-65℃之间的温度下进行40-90分钟。
当在高于初始糊化温度的温度下进行步骤(a)时，可以在步骤(a)之前进行喷射蒸煮步骤。喷射蒸煮可以在95℃-140℃之间的温度下进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是在约5分钟左右。
在一个优选实施例中，在步骤(a)之前，本发明的工艺进一步包括以下步骤：
i)优选地通过干磨来减小含淀粉材料的粒度；
ii)形成包括含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施例中，本发明的回收油的工艺包括
(a)在低于初始糊化温度的温度下，用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收发酵产物以形成全酒糟；
(e)将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将酒糟水浓缩为浆料；
(f)从酒糟水和/或任选地浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
在一个优选实施例中，糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时进行(优选在低于初始糊化温度的温度下)、或相继地进行。
在一个实施例中，同时进行步骤(a)、(b)和(c)。这是典型地在低于初始糊化温度的温度下完成的，即粗淀粉水解工艺(RSH)。然而，步骤(a)、(b)和(c)也可以在低于初始糊化温度(例如在20℃-60℃之间、优选在25℃-40℃之间、例如在32℃左右)的温度下相继地进行。
术语“初始糊化温度”意指淀粉糊化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃与75℃之间开始糊化；糊化的确切温度依赖于具体的淀粉，并且能够由技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物种类、根据植物种类的具体品种、以及随着生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Starke[淀粉]，第44卷第12期第461-466页(1992)所描述的方法使得5％的淀粉颗粒的双折射丧失的温度。
根据本发明，可以在从20℃至75℃、优选从40℃至70℃、例如在60℃左右的温度下，并且在4与5之间的pH下进行糖化步骤(b)。
在一个优选实施例中，发酵步骤(c)或同时的糖化发酵(SSF)(即，组合的步骤(b)和(c))在20℃-60℃之间、优选在25℃-40℃之间、例如在32℃左右的温度下进行。在一个实施例中，发酵步骤(c)或同时的糖化发酵(SSF)(即，组合的步骤(b)和(c))持续6至120小时(具体地是24至96小时)。在一个实施例中，同时或相继地进行含淀粉材料转化步骤(a)、糖化步骤(b)和发酵步骤(c)。
在一个实施例中，含淀粉材料转化步骤(a)在低于初始糊化温度、优选从20℃-60℃、优选在25℃-40℃之间、例如在28℃-36℃左右、例如在32℃左右的温度下进行。在一个实施例中，在低于含淀粉材料的初始糊化温度，通过用α-淀粉酶和产碳水化合物源的酶(特别是葡糖淀粉酶)处理含淀粉材料，将含淀粉材料转化为糊精并且将糊精糖化为糖。在一个实施例中，含淀粉材料转化为糊精、糊精糖化为糖、以及糖的发酵是按单个步骤(即，粗淀粉水解步骤)进行的。
当作为粗淀粉水解工艺(即，单步骤工艺或非蒸煮工艺)进行本发明的工艺时，葡糖淀粉酶可以优选地源自栓菌属(Trametes)的菌株(例如瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株)、或阿太菌属(Althelia)的菌株(例如罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株)。用于粗淀粉水解工艺的优选α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)的菌株(例如微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株)的α-淀粉酶，例如具有淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，例如具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。通常，粗淀粉水解工艺(即，非蒸煮工艺)中的含淀粉材料是颗粒状淀粉。优选可以通过研磨，将所述颗粒状淀粉的粒径减小至从0.05mm至3.0mm，优选0.1mm-0.5mm。
而且，糖水平(例如葡萄糖水平)可以保持低于6wt.-％，优选地低于约3wt.-％，优选地低于约2wt.-％，更优选地低于约1wt.-％，甚至更优选地低于约0.5％、或甚至更优选的0.25％wt.-％，如低于约0.1wt.-％。当按单个步骤进行含淀粉材料转化为糊精、糊精糖化为糖、以及糖的发酵时，pH可以是从4-7，优选4.5-6.0。如果作为常规工艺进行本发明的工艺(即，将步骤(a)在高于糊化温度的温度下作为液化步骤进行)，则在步骤(b)中使用的产碳水化合物源的酶优选是源自以下各项的葡糖淀粉酶：曲霉属(Aspergillus)，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属(Pycnoporus)的菌株；或褐褶菌属(Gloephyllum)的菌株。
其他适合的葡糖淀粉酶的实例可以在下面的“葡糖淀粉酶”部分中找到。
通常，步骤(a)中的含淀粉材料(包括颗粒状淀粉)包含20-55wt.-％干固体，优选25-40wt.-％干固体，更优选30-35wt.-％干固体。
可以通过离心(优选沉降式离心机)、过滤(优选使用压滤机、螺旋压榨机、板框压滤机、重力浓缩机或脱水机)或本领域已知的任何其他分离技术进行步骤(e)中的分离(即脱水)。
在一个实施例中，(希望的)发酵产物可以选自下组，该组由以下各项组成：醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施例中，(希望的)发酵产物是乙醇。根据本发明，可以通过蒸馏来回收希望的发酵产物。根据本发明，可以例如通过提取(如己烷提取)从酒糟水和/或浆料/蒸发的分离液回收油。
在步骤(e)中，将全酒糟分离(脱水)为酒糟水和湿饼
在步骤(e)中，将全酒糟分离为酒糟水和湿饼，以去除很大一部分的液体/水，可以使用任何适合的分离技术(包括离心、压榨和过滤)来实现。在一个优选实施例中，通过离心进行分离/脱水。在工业中，优选的离心机是沉降式离心机，优选高速沉降式离心机。适合的离心机的一个实例是来自阿法拉伐公司(Alfa Laval)的NX 400陡锥系列，它是高性能沉降器。在另一个优选实施例中，使用其他常规分离设备(如板/框压滤机、带压滤机、螺旋压榨机、重力浓缩机和脱水机)或类似设备来进行分离。
湿饼的干燥
在已经从酒糟水分离(例如，脱水)含有约30-35wt-％干固体的湿饼之后，可以在转鼓式干燥机、喷雾干燥机、环式干燥机、流化床干燥机等上将其干燥，以便产生“干酒糟”(DDG)。DDG是有用饲料成分，用于家畜、家禽和鱼。优选以小于约10-12wt.-％湿度的含量提供DDG，以避免发霉和微生物分解并且增加保质期。另外，高含湿量还使得运输DDG更昂贵。优选在不变性湿饼中的蛋白质的条件下干燥湿饼。湿饼可以与分离自酒糟水的浆料共混，并且被干燥为含可溶物的干酒糟(DDGS)。
发酵有机体
用于将发酵培养基中的糖发酵为希望的发酵产物的用于步骤c)中的发酵有机体的实例包括真菌有机体，尤其例如是酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。
在一个实施例中，将发酵有机体添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基中的存活发酵有机体(如酵母)计数在从105至1012个的范围内，优选地从107至1010个，尤其是约5 x 107个。
可商购的酵母包括例如RED STARTM和ETHANOL RED酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱施曼酵母公司(Fleischmann’sYeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(EthanolTechnology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品公司(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)、以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。
含淀粉材料
根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适合在本发明的工艺中使用的含淀粉材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆类、或甜薯、或其混合物、或者由其衍生的淀粉、或谷类。还考虑了糯型和非糯型(waxy and non-waxy types)的玉米和大麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵有机体进行的发酵步骤在内的工艺生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施例中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。使用的优选发酵工艺包括醇发酵工艺。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)可以用作可以与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况中，其还可以用作可饮用的乙醇。
回收
继发酵之后，可以例如通过蒸馏从发酵培养基分离发酵产物(如乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物。
蛋白酶和磷脂酶用于改进油提取的用途
在一个方面，本发明涉及磷脂酶(特别是磷脂酶C)(例如上文描述的磷脂酶(例如，SEQ ID NO:1、2和/或3中的任一者))用于在发酵产物生产工艺中提高来自酒糟水和/或浆料的油回收产率的用途。
酶
可以根据本发明使用以下酶活性中的一种或多种。
α-淀粉酶
可以使用适合的α-淀粉酶进行本发明的工艺，该工艺包括步骤(a)。优选地，在一个实施例中，可以使用细菌α-淀粉酶和/或真菌α-淀粉酶。
当在高温下(即高于初始糊化温度)将步骤(a)作为液化步骤进行时，α-淀粉酶可以是细菌的。
当在低于初始糊化温度的温度下进行步骤(a)时，例如当如上所述步骤(a)、(b)和(c)作为粗淀粉水解(单步骤工艺或非蒸煮工艺)进行时，α-淀粉酶可以是真菌的。
细菌α-淀粉酶
适合的细菌α-淀粉酶的实例包括下面提及的。用于步骤i)的优选细菌α-淀粉酶可以源自芽孢杆菌属(有时称为土芽孢杆菌属)的菌株，包括地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的菌株。其他细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属物种的菌株NCIB 12289、NCIB12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶，所有的这些在WO 95/26397中进行了详细描述；以及由Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research Communications[生物化学和生物物理研究通讯]，151(1988)，第25-31页(通过引用特此结合)中描述的α-淀粉酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO00/60059、以及WO 02/10355(所有文件都通过引用结合在此)。具体地，考虑的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576中(通过引用特此结合)，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，这些变体与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4中列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有在位置R179至G182的一至两个氨基酸的缺失，优选WO 1996/023873-参见例如第20页第1-10行(通过引用特此结合)中披露的双缺失，优选对应于Δ(181-182)，或者使用WO 99/19467(该参考文件通过引用特此结合)中的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4进行编号的氨基酸R179+G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，对应于Δ(181-182)的双缺失，并且任选地进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
在一个实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是披露在WO 2011/082425中的α-淀粉酶，例如选自以下各项的组的α-淀粉酶：
-I181*+G182*；
-I181*+G182*+N193F；
优选地
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文中SEQ ID NO:4进行编号)。
在一个实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有以下突变：181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(SEQ ID NO:4)。
截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶典型地被自然截短至约491个氨基酸长，例如从485个至495个氨基酸长。
具体考虑的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(在WO 99/19467的SEQ ID NO:4中示出)的445个C末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(在WO 99/19467的SEQ ID NO:5中示出)的37个N末端氨基酸残基，该杂合α-淀粉酶具有以下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467中的SEQ ID NO:4进行编号)。尤其优选的是具有突变H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S中的一个或多个和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失(优选E178和G179的缺失)(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行编号)的变体。
可商购的细菌α-淀粉酶产品和含α-淀粉酶的产品包括TERMAMYLTM SC、LIQUOZYMETM SC、LIQUOZYMETM LpH、AVANTECTM、AVANTECTM AMP、BAN(诺维信公司，丹麦)DEX-LOTM、SPEZYMETM XTRA、SPEZYMETM AA、SPEZYME FRED-L、SPEZYMETM ALPHA、GC358、SPEZYMERSL、SPEZYME HPA和SPEZYMETM DELTA AA(来自杜邦公司(DuPont)，美国)、FUELZYMETM(范恩尼姆公司(Verenium)，美国)。
在步骤(a)中，细菌α-淀粉酶可以按本领域熟知的量添加。当以KNU为单位度量(描述于以下“材料与方法”部分中)时，α-淀粉酶活性优选地以0.5-5,000NU/g DS的量、以1-500NU/g DS的量、或更优选地以5-1,000NU/g DS、如10-100NU/g DS的量存在。
真菌α-淀粉酶
优选地，真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)是丝状真菌来源的。真菌α-淀粉酶可以是真菌酸性α-淀粉酶。
真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属的菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。
优选真菌α-淀粉酶是Fungamyl样α-淀粉酶，该α-淀粉酶优选地源自米曲霉的菌株。在本披露中，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”表示与WO 96/23874中的SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列的成熟部分表现出高度一致性(即大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或甚至100％的一致性)的α-淀粉酶。
另一种优选的酸性α-淀粉酶源自于黑曲霉的菌株。在一个优选实施例中，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主登陆号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”的黑曲霉的并且在WO 89/01969(实例3)中进行更详细描述的α-淀粉酶。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在WO 2004/080923(诺维信公司)中示出为SEQ ID NO:1，将其通过引用特此结合。还考虑了与WO 2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70％一致性、例如至少80％或甚至至少90％一致性、例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。适合的可商购的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可获自诺维信公司，丹麦)。
真菌酸性α-淀粉酶还可以是野生型酶，其包含碳水化合物结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化结构域(即，非杂合)，或其变体。在一个实施例中，野生型酸性真菌α-淀粉酶源自白曲霉(Aspergillus kawachii)的菌株。
可商购的含真菌α-淀粉酶的组合物包括FUNGAMYLTM和在商品名SP288下销售的酸性真菌α-淀粉酶(可获自诺维信公司，丹麦)。
在一个实施例中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括通过引用特此结合的WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(诺维信公司)或美国专利申请号60/638,614(诺维信公司)中披露的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)(例如淀粉结合域)以及任选的接头。
考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括披露于共同未决的美国专利申请号60/638,614中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA1 18和罗尔夫阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO:100)、具有罗尔夫阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其在美国申请号11/316,535中的表5中披露为氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)以及具有罗尔夫阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO:102)。其他具体考虑的杂合α-淀粉酶是列于美国申请号11/316,535或WO2006/069290(通过引用特此结合)中的实例4中的表3、4、5和6中的任何α-淀粉酶。考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括披露于美国专利公开号2005/0054071中的那些，包括披露于第15页表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是WO 2013/006756中披露的α-淀粉酶，该α-淀粉酶包括以下变体：具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，其进一步包含以下取代中的至少一种或以下取代的组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO2013/006756中的SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:5进行编号)(全部通过引用结合在此)。
根据本发明，可以按以下量添加酸性α-淀粉酶：0.1至10AFAU/g DS、优选0.10至5AFAU/g DS、尤其是0.3至2AFAU/g DS。
可以按熟知的有效量，优选在从0.001-1mg酶蛋白/g DS、优选0.01-0.5mg酶蛋白/g DS的范围内，将真菌α-淀粉酶添加至步骤(a)。
产碳水化合物源的酶
根据本发明，产碳水化合物源的酶(优选葡糖淀粉酶)在步骤(b)中存在，并且可以在步骤(a)、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)或同时的糖化步骤(b)和发酵步骤(c)(SSF)期间存在和/或添加。
术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵有机体用作能量源，例如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的工艺中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。
具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。
在一个优选实施例中，产碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶
可以使用任何适合的葡糖淀粉酶进行本发明的工艺，包括步骤(b)和/或(c)。优选地，在一个实施例中，葡糖淀粉酶具有细菌的或真菌的来源。
考虑的葡糖淀粉酶包括选自下组的那些，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]，3(5)，第1097-1102页)、或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信公司，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业、生物学与化学](1991)，3(5)，第941-949页)、或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.[蛋白质工程]9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Eng.[蛋白质工程]8:575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.[生物化学杂志]301:275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry[生物化学]35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(Li等人(1997)，Prot.Eng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自阿太菌属的菌株，优选是源自罗尔夫阿太菌(以前命名为罗尔夫革菌)的菌株的葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)，“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylasesfrom Corticium rolfsii”[“来自罗尔夫革菌的降解粗淀粉的葡糖淀粉酶的纯化和特性”]，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330，篮状菌属葡糖淀粉酶，具体地源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。还考虑的是在WO 2006/060062中披露为SEQ ID NO:4的里氏木霉葡糖淀粉酶，和与其具有至少80％或至少90％一致性的葡糖淀粉酶，以及在US 10/992,187(通过引用特此结合)中披露为SEQ ID NO:3的源自灰腐质霉(Humicola grisea)的另外的葡糖淀粉酶或与其具有至少80％或至少90％一致性的序列。
在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌。
在一个实施例中，在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)期间存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自密孔菌属的菌株、或褐褶菌属的菌株。在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是在WO 2011/066576中描述的血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，如在WO 2011/066576中显示为SEQ ID NO:4的菌株。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌(Gloeophyllumsepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)的菌株，特别是如在WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶是在WO 2011/068803中显示为SEQ ID NO:2的篱边粘褶菌。
其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自栓菌属的菌株，优选是披露于WO 2006/069289(将其通过引用而结合在此)中的瓣环栓菌的菌株的葡糖淀粉酶。根据本发明还考虑了杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例披露于WO 2005/045018中。具体实例包括实例1的表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此结合)。
考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
包含葡糖淀粉酶的可商购的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETM FUEL、SPIRIZYMETM ULTRA、SPIRIZYMETM EXCEL、SPIRIZYMETM ACHIEVE、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300(来自杰能科国际公司(Genencor Int.))；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自杰能科公司)。
在一个实施例中，可以按0.02-20AGU/g DS、优选0.05-5AGU/g DS(在全酒糟中)、尤其是在0.1-2AGU/g DS之间的量添加葡糖淀粉酶。
可以按有效量、优选在从0.001-1mg酶蛋白/g DS、优选0.01-0.5mg酶蛋白/g干固体(DS)的范围添加葡糖淀粉酶。
磷脂酶
磷脂酶起着将磷脂水解成其组成脂肪酸和亲脂性部分的作用。优选的磷脂酶类型是磷脂酶C。用于在本发明使用的适合的磷脂酶源自有机体，优选来自细菌或真菌。优选的磷脂酶源自埃默森青霉菌(例如本文中SEQ ID NO:1)、苏云金芽孢杆菌(例如本文中SEQ IDNO:2)和Kionochaeata物种(例如本文中SEQ ID NO:3)，其中来自埃默森青霉菌的磷脂酶C(本文中SEQ ID NO:1)是优选的。
在以下各段落中进一步总结本发明：
1.一种回收油的工艺，该工艺包括
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收发酵产物以形成全酒糟；
(e)将全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将酒糟水浓缩为浆料；
(f)从酒糟水和/或任选地浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
2.如段落1所述的工艺，其中优选在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加该磷脂酶。
3.如段落1或2所述的工艺，其中在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加一种或多种表面活性剂、优选非离子型表面活性剂。
4.如段落3所述的工艺，其中该非离子型表面活性剂选自以下各项的组：聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(例如TWEENTM 80)和脱水山梨醇单油酸酯(例如SPANTM 80)、或其混合物(例如50:50(％)混合物)。
5.如段落1-4中任一段所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶是磷脂酶C。
6.如段落1-5中任一段所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1(例如青霉菌PLC)；或本文中SEQ IDNO:2(例如芽孢杆菌属)、或本文中SEQ ID NO:3(例如Kionochaeta PLC)的氨基酸序列，优选地其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
7.如段落1-6中任一段所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶源自青霉菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:1中的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
8.如段落1-6中任一段所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶源自芽孢杆菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:2的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
9.如段落1-6中任一段所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的磷脂酶源自Kionochaeta，例如显示于本文中SEQ ID NO:3的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
10.如段落1-9中任一段所述的回收油的工艺，该工艺包括
(a)在高于初始糊化温度的温度下，用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；
(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；
(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
11.如段落10所述的工艺，其中步骤(a)中的该温度是高于该初始糊化温度，例如在80℃-90℃之间的温度下、例如在85℃左右。
12.如段落10或11所述的工艺，其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时进行。
13.如段落10-12中任一段所述的工艺，其中该细菌α-淀粉酶源自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，具体地是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如显示于WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4中的α-淀粉酶变体，具体地该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶被截短，优选地为具有从485-495个氨基酸、例如在491个左右的氨基酸。
14.如段落1-9中任一段所述的回收油的工艺，该工艺包括
(a)在低于初始糊化温度的温度下，用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物；
(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；
(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；
(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
15.如段落14所述的工艺，其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时进行(优选地在低于该初始糊化温度的温度下)，或相继地进行。
16.如段落14或15所述的工艺，其中步骤(a)、(b)和(c)在低于该初始糊化温度的温度下同时或相继地进行。
17.磷脂酶在发酵产物生产工艺中用于增加从酒糟水和/或浆料的油回收产率的用途。
18.如段落17所述的用途，其中该磷脂酶是磷脂酶C。
19.如段落17-18中任一段所述的用途，其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1；本文中SEQ ID NO:2；或本文中SEQ ID NO:3的氨基酸序列，优选地其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
20.如段落17-19中任一段所述的用途，其中该磷脂酶源自青霉菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:1的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
21.如段落17-20中任一段所述的用途，其中该磷脂酶源自芽孢杆菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:2的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
22.如段落17-21中任一段所述的用途，其中该磷脂酶源自Kionochaeta，例如显示于本文中SEQ ID NO:3的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
23.如段落17-22中任一段所述的用途，其中该磷脂酶与一种或多种表面活性剂、优选非离子型表面活性剂组合。
24.如段落23所述的用途，其中该非离子型表面活性剂选自以下各项的组：聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(例如TWEENTM 80)和脱水山梨醇单油酸酯(例如SPANTM 80)、或其混合物(例如50:50(％)混合物)。
本文中所描述和要求保护的本发明并不局限于本文中所披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。本文引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
材料与方法
α-淀粉酶369(“AA369”)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V截短至在491个左右的氨基酸长(本文中SEQ ID NO:4)。
葡糖淀粉酶SA(“GSA”)包含一种共混物，该共混物包含WO 99/28448中所披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、和具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的披露为本文中SEQ ID NO:5的具有以下突变的微小根毛霉α-淀粉酶：G128D+D143N(活性比AGU:AGU:FAU(F)：约30:7:1)。
PLC Pe：本文SEQ ID NO:1中示出的埃默森青霉菌
PLC Bt：本文SEQ ID NO:2中示出的苏云金芽孢杆菌
TweenTM 80是非离子型表面活性剂(聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯)，购自飞世尔科技公司(Fisher Scientific)的飞世尔化学(Fisher Chemical)产品，CAS：9005-65-6，目录号T164-500。
SPANTM 80是非离子型表面活性剂(脱水山梨醇单油酸酯)，购自飞世尔科技公司(Fisher Scientific)的西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich)产品，CAS：1338-43-8，目录号NC0765791。
α-淀粉酶活性的确定
1.PhadebasTM测定
通过采用片剂作为底物的方法确定α-淀粉酶活性。Phadebas片剂(淀粉酶测试物(Amylase Test)，由法玛西亚诊断公司(PharmaciaDiagnostic)提供)包含交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，它已与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。
对于每一单次测量，将一个片剂悬浮于包含5ml 50mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(50mM乙酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mMCaCl2，用NaOH调节pH至感兴趣的值)的管中。于感兴趣的温度下在水浴中进行该测试。在x ml的50mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液中稀释待测试的α-淀粉酶。将1ml此α-淀粉酶溶液添加至5ml 50mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液中。通过α-淀粉酶水解淀粉，从而给出可溶性蓝色片段。在620nm处用分光光度计测量所得到的蓝色溶液的吸光度，其是α-淀粉活性的函数。
重要的是在10或15分钟的孵育((测试时间)后测量的620nm吸光度要在0.2-2.0的吸光度单位的范围内。在此吸光度范围内，在活性和吸光度之间存在线性关系(朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律)。因此，必须调节酶的稀释以适合该标准。在一组指定的条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶将水解某一量的底物并将产生蓝色。在给定组的条件下，所测量的吸光度与α-淀粉酶的比活性(纯的α-淀粉酶蛋白的每毫克活性)成正比。
2.替代方法
α-淀粉酶活性可替代地通过采用PNP-G7底物的方法来确定。PNP-G7是对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷的缩写，它是可以由内切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶消化底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄色并且因而可以通过可见分光光度法在波长λ＝405nm(400nm-420nm)下测量。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由勃林格-曼海姆公司(Bohringer-Mannheim)制造(目录号1054635)。
为了制备底物，将一瓶底物(BM 1442309)添加至5ml缓冲液(BM1442309)中。为了制备α-葡糖苷酶，将一瓶α-葡糖苷酶(BM 1462309)添加至45ml缓冲液(BM1442309)中。通过将5mlα-葡糖苷酶溶液与0.5ml底物混合来制成工作溶液。
通过将20微升酶溶液转移至96孔微量滴定板中并且在25℃下孵育进行该测定。在25℃下添加200微升工作溶液。将溶液混合并且预孵育1分钟并且在OD 405nm下在3分钟内每15秒测量吸收。
在给定组的条件下，时间相关吸收曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。
酸性淀粉分解活性(FAU)的确定
一个真菌α-淀粉酶单位(1FAU)被定义为基于下列标准条件，按照用于确定α-淀粉酶的诺维信标准方法，每小时分解5.26g淀粉(Merck可溶性淀粉(Merck Amylum solubile)Erg.B.6，批号9947275)的酶量：
底物 可溶性淀粉
温度 37℃
pH 4.7
反应时间 7-20分钟
用于确定KNU和FAU的诺维信方法的详细描述可作为标准方法EB-SM-0009.02/01索取获得。酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的确定
以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。
使用的标准是AMG 300L(由诺维信公司销售的野生型黑曲霉G1 AMG)。这种AMG中的中性α-淀粉酶在储存于室温3周后从约1FAU/mL下降至0.05FAU/mL以下。
根据AF 9 1/3(用于确定真菌α-淀粉酶的诺维信方法)来确定这种AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉形成蓝色复合物，但不与其降解产物形成蓝色复合物。颜色的强度因此与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法在指定分析条件下确定淀粉酶活性为淀粉浓度的减少。
标准条件/反应条件：(每分钟)
进一步细节可以发现于可从诺维信公司索取得到的标准方法文件EB-SM-0259.02/01中，通过引用将该文件结合在此。
FAU-F的测定
相对于强度已知的酶标准品确定FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)。
更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物测定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
一千Novoα淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003MCa2+；和pH 5.6)下将5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉糊精化的酶量。
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括。
葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，使用光度计在340nm测定该NADH作为起始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液：乙酸盐 0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括。
蛋白酶活性(AU)的确定
用蛋白水解酶将二甲基酪蛋白(DMC)水解为小肽。在此工艺中形成的伯氨基团与三硝基苯磺酸(TNBS)反应，从而形成有色复合物。在原位监测此颜色发展，所以可以计算每时间单位的吸收改变。此图是反应速率的量度，并且因此也是对酶活性的量度。
DMC反应的反应条件
温度： 50℃
pH： 8.3
波长： 405nm
反应时间： 8分钟
测量时间: 2分钟
酶浓度范围： 0.072-0.216mAU/ml。
相对于酶标准品确定活性。
在可从丹麦的诺维信公司索取获得的标准方法文件EB-SM-0218.02/02中进一步描述了该测定。
实例
实例1
使用磷脂酶和表面活性剂提取游离油
这个实验的目的是测量通过使用两种PLC酶中的一种(即埃默森青霉菌PLC(PLCPe)或苏云金芽孢杆菌PLC(PLC Bt))实现的游离玉米油产量增加以及在用或不用PLC的情况下由50％80和50％80组成表面活性剂共混物的剂量响应。
方法
发酵：用α-淀粉酶369液化的工业醪被冷冻储存。在开始该研究之前，将一升醪解冻约2小时。在Mettler-Toledo水分平衡仪上测量醪的干燥固体含量，结果值为33.70％DS。分别使用200g/L尿素和1g/L青霉素的溶液将醪制备为1000ppm尿素和3mg/L青霉素，并且使用40％v/v H2SO4调节至pH 5。将大约27g的每种制备的醪用移液管移至45个已经在顶部中钻孔的预先称重的每一个50mL离心管中。
使用的PLC是埃默森青霉菌(PLC Pe)和苏云金芽孢杆菌PLC(PLC Bt)。基于Wang等人(Fang,L、Wang,T.和Lamsal,B.(2015))报道的表面活性剂优化，使用的表面活性剂是由50％w/w TWEENTM 80和50％w/w SPANTM 80组成的共混物。表面活性剂和二氧化硅纳米粒子从浓缩玉米酒糟可溶物(CCDS)回收油的协同作用。Industrial Crops&Products[工业作物和产品]，553.doi:10.1016/j.indcrop.2015.09.031)。
使RED STARTM酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))再水合，其中将2.75g酵母放置在50mL的32℃自来水中持续30分钟。
表：测试的处理
表：酶
经由以下等式或类似方法计算酶剂量：
表：酶剂量
将水添加至每个样品中，这样使得酶和水的总添加体积是621μL/27g样品。将所有样品添加250μL再水合酵母溶液并涡旋。当所有样品都被添加时，称量每个样品。将样品放置在设置在32℃的振摇培养箱中持续64小时。
游离油测定：然后在经过验证的测定中处理样品管以测量游离可提取油。该测定包括给试管添加表面活性剂，在65℃孵育10分钟，并在3000×g下离心10分钟。然后小心地用己烷冲洗试管多次以从顶面(游离)油层提取己烷。己烷洗涤由五次冲洗组成：10mL、5mL、5mL、2.5mL、2.5mL。然后在步琪平行蒸发仪(Buchi Multivapor)上蒸发针对每个管收集的己烷/油混合物以分离玉米油。然后取玉米油的重量并归一化至起始材料。
结果如图1-3中所示。使用拟合模型平台在JMP 12.0.1中进行的统计分析显示，添加表面活性剂线性增加对照和两种PLC处理的油产率。在该模型中，埃默森青霉菌PLC相较于对照也显著提高了油产率，使游离油增加9.1％。
值得注意的一点是，对于两种PLC和对照而言，相对于表面活性剂的油产率的斜率是相同的。
如前所述(图2)，发现由于添加埃默森青霉菌PLC导致相对于对照的油产率显著增加。
在不使用任何表面活性剂的情况下，通过应用埃默森青霉菌PLC，相对于对照，游离油产率增加了9.1％(参见图3)。
可替代地，通过添加埃默森青霉菌PLC，保持最高测量产率(无PLC的情况下)所需的表面活性剂剂量可以减少36％(图4)。
结论
使用PLC可以使游离油产率增加9.1％，或将必需的表面活性剂剂量减少36％。
序列表
<110> 诺维信公司
Akerman, Michael J
Hooss, Melissa
Kreel, Nathaniel Edward
Shen, Xinyu
<120> 从酒糟水提取油的工艺
<130> 14159-WO-PCT
<160> 5
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 610
<212> PRT
<213> 埃默森青霉菌（Penicillium emersonii）
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(16)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (17)..(610)
<400> 1
Met Arg Val Leu Ala Leu Ile Ala Ala Leu Ala Thr Val Ala Thr Ala
-15 -10 -5 -1
Ser Ala Pro Tyr Asp Lys Arg Asp Leu Ala Gln Glu Ile Trp Asp Asp
1 5 10 15
Ile Lys Asn Ala Val Asp Cys Ala Gly Cys Gln Val Val Leu Thr Ala
20 25 30
Leu Lys Gly Val Ala Asp Leu Gly Thr Thr Ala Leu Val Asp Val Leu
35 40 45
Thr Glu Val Cys Asn Ile Ser Gly Lys Glu Asp Ser Asp Val Cys Ser
50 55 60
Gly Ile Ile Ser Arg Glu Gly Pro Val Leu Asp Tyr Val Leu Gln His
65 70 75 80
Leu Asp Ile Gly Ser His Thr Ser Gln Val Ile Cys Ala Ser Ala Phe
85 90 95
Gly Leu Cys Gln Tyr Pro Glu Val Arg Pro Tyr Asn Leu Thr Phe Pro
100 105 110
Lys Pro Lys Pro Asn Thr Thr Arg Pro Glu Pro Ser Gly Glu Ser Pro
115 120 125
Ile Gln Val Val His Phe Ser Asp Thr His Val Asp Leu Ser Tyr Glu
130 135 140
Thr Gly Ser Asn Tyr Asn Cys Thr Lys Pro Ile Cys Cys Arg Pro Tyr
145 150 155 160
Thr Ala Glu Asp Ala Pro Gly Asn Thr Thr Thr Pro Cys Gly Pro Tyr
165 170 175
Gly Asn Thr Lys Cys Asp Ala Pro Leu Ser Leu Glu Glu Ser Met Phe
180 185 190
Ala Ala Ile Lys Ala Leu Asn Pro Gln Pro Ala Phe Ser Ile Tyr Thr
195 200 205
Gly Asp Val Val Ala His Asp Ile Trp Leu Val Asp Gln Asn Glu Val
210 215 220
Ile Glu Asp Leu Asn Ala Thr Tyr Asp Arg Met Ala Gly Leu Gly Leu
225 230 235 240
Val Tyr Ala Ala Ile Gly Asn His Asp Thr Ala Pro Val Asn Asp Leu
245 250 255
Pro Thr Ser Asn Ile Pro Ser Glu Tyr Ser Ala Asn Trp Thr Tyr Glu
260 265 270
Ala Leu Ser Tyr Asp Phe Thr Met Leu Thr Gln Ser Ala Ser Ala Gln
275 280 285
Thr Ala Ala Asn Tyr Gly Ser Tyr Ser Ala Ile Tyr Pro Gly Ser Tyr
290 295 300
Gly Thr Asp Leu Arg Val Ile Ser Tyr Asn Ser Ile Phe Tyr Tyr Val
305 310 315 320
Asp Asn Phe Trp Ala Tyr Gln Asp Pro Met Glu Phe Asp Pro Asp Gly
325 330 335
Gln Leu Ala Trp Leu Ile Asn Glu Leu Gln Glu Ala Glu Thr Ala Gly
340 345 350
Gln Arg Val Trp Ile Ile Ala His Val Pro Thr Gly Thr Ser Asp His
355 360 365
Phe His Asp Tyr Ser His Tyr Phe Asp Gln Ile Val Gln Arg Tyr Glu
370 375 380
Ala Thr Ile Ala Ala Leu Phe Tyr Gly His Thr His Ile Asp Gln Phe
385 390 395 400
Gln Ile Ser Tyr Ser Asn Tyr Ser Asn Arg Ala Phe Asp Thr Ala Thr
405 410 415
Ala Ile Gly Tyr Ile Met Pro Ser Leu Thr Pro Thr Ser Gly Pro Pro
420 425 430
Thr Phe Arg Val Tyr Asp Val Asp Pro Lys Thr Phe Ala Val Leu Asp
435 440 445
Phe Thr Asn Tyr Ile Ala Asn Ile Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ser Gly
450 455 460
Pro Ser Trp Gln Lys Tyr Tyr Ser Ala Lys Glu Thr Tyr Gly Ser Leu
465 470 475 480
Leu Ser Pro Pro Val Thr Asp Pro Thr Ala Glu Leu Thr Pro Ala Phe
485 490 495
Trp His Asn Val Thr Val Ala Phe Glu Gln Asp Asn Ala Thr Phe Gln
500 505 510
Glu Tyr Trp Ala Arg Gln Thr Arg Gly Tyr Asp Val Ser Ser Cys Thr
515 520 525
Gly Ser Cys Ile Thr Gln Ala Ile Cys Gly Leu Arg Ala Gly Asp Ala
530 535 540
Gln Tyr Asn Cys Val Thr Pro Thr Pro Gly Phe Asn Phe Ala Lys Arg
545 550 555 560
Asp Thr Ser Asn Pro Lys Gln Ala Leu Ser His Val Glu Lys Cys Glu
565 570 575
Gly Ser Gly Leu Leu Gly Leu Leu Arg Arg Met Val Ala Asp Ser Lys
580 585 590
Ser Ser
<210> 2
<211> 278
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(33)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (34)..(278)
<400> 2
Met Lys His His Arg Phe Arg Thr Asn Leu Leu Ser Ala Leu Ser Val
-30 -25 -20
Ser Ser Ile Val Ile Thr Ser Ile Ile Gly Ser Thr Gln Thr Thr Tyr
-15 -10 -5
Ala Trp Ser Ala Asp Ala Pro His Asp Pro Asn Gln Ser Thr His Leu
-1 1 5 10 15
Phe Ile Val Asn Gly Ala Val Asn Leu Val Ala Asn Asn Thr Asp Pro
20 25 30
Gln Ile Asn Lys Pro Thr Ala Leu Leu Gln Gln Trp Arg Ser Gln Trp
35 40 45
Glu Gln Gly Leu Tyr Asp Ala Asp His Leu Asn Pro Tyr Tyr Asp Ser
50 55 60
Gly Thr Phe Met Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Thr Gln Thr Asn Tyr
65 70 75
Ala Gly Leu Ser Tyr Pro Thr Ala Arg Gln Thr Gly Ala Lys Tyr Phe
80 85 90 95
Thr Ile Ala Ser Asn Asp Tyr Gln Ala Gly Asp Met Ser Asp Ala Phe
100 105 110
Tyr Asn Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Phe Thr Asp Val Thr Met Pro
115 120 125
Leu His Ala Gly Asn Ile Ser Asn Leu Asp His Glu Ala Pro Gly Tyr
130 135 140
His Ala Lys Leu Glu Ala Tyr Ala Glu Ser Ile Gln Asn Gln Val Thr
145 150 155
Pro Pro Thr Ala Gly Leu Tyr Asn Trp Val Ser Pro Asn Asp Pro Glu
160 165 170 175
Leu Trp Ile His Gln Ala Ala Val Gln Ala Lys Ser Val Leu Pro Gln
180 185 190
Val Trp Asn Ser Asp Ile Thr Ser Trp Phe Trp Glu Ala Ala Phe Ser
195 200 205
Asn Tyr Tyr Ser Gln Gln Trp His Asn Ala Val Thr Thr Pro Val Leu
210 215 220
Asn Gln Leu Ser Gln Ala Glu Ala Glu Thr Ala Gly Tyr Ile Asp Leu
225 230 235
Phe Phe Arg Val Asn Gly
240 245
<210> 3
<211> 640
<212> PRT
<213> Kionochaeata物种
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(18)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (19)..(640)
<400> 3
Met Arg Thr Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ser Val Ala
-15 -10 -5
Gln Ala Ala Val Ser Pro Ala Asp Val Leu Ala Val Val Glu Lys Arg
-1 1 5 10
Val Asp Pro Ala Ser Gly Leu Glu Ala Arg Ser Ile Trp Asp Thr Ile
15 20 25 30
Trp Asp Asp Ile Lys Ser Ala Ala Asp Cys Thr Ala Cys Glu Ala Val
35 40 45
Leu Thr Leu Leu Lys Gly Val Ala Ala Phe Gly Asp Ser Phe Phe Val
50 55 60
Glu Val Leu Thr Glu Ile Cys Asp Leu Ser Gly Ala Glu Asp Asp Asp
65 70 75
Val Cys Ser Gly Val Leu Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu Ala Asn Asp
80 85 90
Ile Arg Lys Met Ser Ile Gly Ser Lys Thr Ser Glu Leu Phe Cys Ile
95 100 105 110
Thr Phe Leu Gly Leu Cys Ser Tyr Pro Asp Val Asp Ala Tyr Lys Val
115 120 125
Pro Phe Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Arg Pro Val Ser Ser Gly
130 135 140
Lys Asp Pro Leu Tyr Val Val His Phe Ser Asp Ile His Ile Asp Pro
145 150 155
Phe Tyr Val Ala Gly Ser Ala Ser Asn Cys Thr Lys Pro Ile Cys Cys
160 165 170
Arg Asp Tyr Thr Ser Ala Ser Ser Pro Gly Asn Asn Asp Ser Pro Ala
175 180 185 190
Gly Pro Tyr Gly Asp His Asn Cys Asp Val Pro Tyr Ser Leu Glu Asp
195 200 205
Ser Met Tyr Ala Ala Ile Lys Glu Leu Val Pro Asn Ala Ala Phe Gly
210 215 220
Ile Phe Thr Gly Asp Ile Val Asp His Ala Val Trp Asn Thr Ser Glu
225 230 235
Ser Gln Asn Ile Ile Asp Met Asn Asp Ala Tyr Ser Arg Met Lys Ser
240 245 250
Ser Gly Met Leu Pro Ala Ile Phe Ala Thr Ala Gly Asn His Glu Ala
255 260 265 270
Ser Pro Val Asn Ala Phe Pro Pro Pro Ala Val Gly Lys Glu Ser Gln
275 280 285
Trp Val Tyr Asp Thr Leu Ala Ser Asp Trp Ser Gln Trp Ile Gly Ala
290 295 300
Ser Ala Ala Ser Ser Val Glu Ser Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Tyr
305 310 315
Gly Ser Thr Lys Leu Arg Ile Ile Ser Leu Asn Thr Asn Met Tyr Tyr
320 325 330
Ile Glu Asn Phe Tyr Leu Tyr Glu Pro Thr Met Glu Thr Asp Pro Ala
335 340 345 350
Gly Gln Phe Ala Trp Leu Val Ser Glu Leu Ser Ala Ala Glu Ala Ala
355 360 365
Gly Glu Arg Val Trp Ile Ile Gly His Met Pro Met Gly Leu Ser Asp
370 375 380
Ala Phe His Asn Pro Ser Asn Tyr Phe Asp Gln Ile Val Asn Arg Tyr
385 390 395
Gln Ala Thr Ile Ala Ala Leu Phe Phe Gly His Thr His Glu Asp His
400 405 410
Phe Gln Ile Ser Tyr Ser Asp Tyr Gly Ala Gln Thr Ala Ala Asn Ala
415 420 425 430
Arg Ala Ile Ser Tyr Ile Met Pro Ser Leu Thr Pro Thr Ser Gly His
435 440 445
Pro Thr Phe Arg Val Tyr Ala Val Asp Pro Glu Thr Phe Gly Val Leu
450 455 460
Asp Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Met Gly Leu Ala Ser Tyr Gln Thr
465 470 475
Ala Gly Pro Thr Trp Lys Pro Tyr Tyr Ser Ala Arg Asp Ala Tyr Gly
480 485 490
Gly Leu Val Asp Pro Pro Leu Pro Ala Gly Ala Glu Leu Thr Pro Ala
495 500 505 510
Phe Trp His Asn Val Thr Ala Ala Leu Ala Ala Asn Gln Thr Ser Phe
515 520 525
Asp Ala Tyr Tyr Ala Arg Lys Thr Arg Gly Trp Asp Val Ala Pro Cys
530 535 540
Thr Gly Ala Cys Ala Thr Ala Glu Ile Cys Ala Leu Arg Ala Ala Arg
545 550 555
Ala Gln Asn Asn Cys Val Val Pro Thr Pro Gly Val His Phe Ser Lys
560 565 570
Arg Ala Thr Asp Glu Ala Glu Gly Ala His His Arg Asp Glu Cys Gly
575 580 585 590
Ile Ser Val Ala Arg Asn Ser Leu Ser Ser Leu Val Ala Arg Arg Glu
595 600 605
Ala Leu Glu His Leu Glu Ser Arg Leu Val Glu Arg Arg Arg Ala Val
610 615 620
<210> 4
<211> 515
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(515)
<400> 4
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp Pro
515
<210> 5
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂合蛋白序列
<400> 5
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580

Claims (20)

1.一种回收油的工艺，该工艺包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的该糖发酵为发酵产物；
(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；
(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；
(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
2.如权利要求1所述的工艺，其中优选地在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加该磷脂酶。
3.如权利要求1或2所述的工艺，其中在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加一种或多种表面活性剂、优选非离子型表面活性剂。
4.如权利要求3所述的工艺，其中该非离子型表面活性剂选自以下各项的组：聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(例如TWEENTM80)和脱水山梨醇单油酸酯(例如SPANTM80)，或其混合物，例如50:50(％)混合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的该磷脂酶是磷脂酶C。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1(例如青霉菌属PLC)；或本文中SEQ ID NO:2(例如芽孢杆菌属)；或本文中SEQ ID NO:3(例如Kionochaeta PLC)的氨基酸序列，优选地其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的该磷脂酶源自青霉菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:1的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
8.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的该磷脂酶源自芽孢杆菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:2的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
9.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中在步骤(a)至(c)、优选地步骤(b)和/或(c)中存在和/或添加的该磷脂酶源自Kionochaeta，例如显示于本文中SEQ ID NO:3的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的回收油的工艺，该工艺包括
(a)在高于该初始糊化温度的温度下用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的该糖发酵为发酵产物；
(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；
(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；
(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(b)和/或(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
11.如权利要求10所述的工艺，其中步骤(a)中的该温度是高于该初始糊化温度、例如在80℃-90℃之间的温度下、例如在85℃左右。
12.如权利要求10或11所述的工艺，其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时地进行。
13.如权利要求10-12中任一项所述的工艺，其中该细菌α-淀粉酶源自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，具体地是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如显示于WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:4中的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，具体地该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶被截短，优选地为具有从485-495个氨基酸、例如在491个左右的氨基酸。
14.如权利要求1-9中任一项所述的回收油的工艺，该工艺包括
(a)在低于该初始糊化温度的温度下用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)使用产碳水化合物源的酶将这些糊精糖化以形成糖；
(c)使用发酵有机体将发酵培养基中的该糖发酵为发酵产物；
(d)回收该发酵产物以形成全酒糟；
(e)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；
(e')任选地将该酒糟水浓缩为浆料；
(f)从该酒糟水和/或任选地该浆料回收油，其中在步骤(a)至(c)期间存在和/或添加磷脂酶。
15.如权利要求14所述的工艺，其中：
(i)糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时地进行，优选地在低于该初始糊化温度的温度下，或相继地进行；或
(ii)步骤(a)、(b)和(c)在低于该初始糊化温度的温度下同时地或相继地进行。
16.磷脂酶在发酵产物生产工艺中用于增加从酒糟水和/或浆料的油回收产率的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中该磷脂酶是磷脂酶C。
18.如权利要求16-17中任一项所述的用途，其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1；本文中SEQ ID NO:2；或本文中SEQ ID NO:3的氨基酸序列，优选地其中该磷脂酶具有本文中SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
19.如权利要求16-18中任一项所述的用途，其中该磷脂酶是：
(i)源自青霉菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:1的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶；
(ii)源自芽孢杆菌属，例如显示于本文中SEQ ID NO:2的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶；或
(iii)源自Kionochaeta，例如显示于本文中SEQ ID NO:3的磷脂酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的磷脂酶。
20.如权利要求16-19中任一项所述的用途，其中该磷脂酶与一种或多种表面活性剂、优选非离子型表面活性剂组合，其中该非离子型表面活性剂选自以下各项的组：聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(例如TWEENTM80)和脱水山梨醇单油酸酯(例如SPANTM80)，或其混合物，例如50:50(％)混合物。
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