CN108699537A

CN108699537A - 能够产生支链化合物的经修饰硫解酶及其用途

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Publication number: CN108699537A
Application number: CN201680077426.4A
Authority: CN
Inventors: 维森特·贝尔纳尔桑切斯; 帕梅拉·托雷斯萨拉斯; 安东尼奥·莫雷亚莱德莱昂; 维克托·巴雷拉比尔戈斯; 马里亚·代尔·马尔·冈萨雷斯巴罗索; 费尔南多·洛佩斯加莱戈; 费代里科·加戈巴德纳斯; 佩德罗·亚历杭德罗·桑切斯穆尔西亚
Original assignee: Repsol YPF SA
Current assignee: Repsol SA
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2018-10-23
Also published as: WO2017114897A1; MX2018008206A; EP3397758B1; ES2846907T3; EP3397758A1; US20200270653A1

Abstract

本发明涉及能够产生被认为在工业上特别令人关注的支链化合物的突变硫解酶。本发明还涉及获得所述支链产物的方法。

Description

能够产生支链化合物的经修饰硫解酶及其用途

技术领域

本发明涉及生物工程领域，并且特别地涉及能够产生用于工业用途的2-支化衍生物化合物的前体的具有硫解酶活性的酶。

背景技术

硫解酶是通过克莱森缩合反应(Claisen condensation reaction)催化非氨基酸酰基(例如乙酰基)转移以形成碳-碳键的酶超家族。存在于其活性中心的半胱氨酸残基的硫酯在所有情况下干扰反应机理。这些酶参与许多代谢途径，包括真核生物和原核生物中的生物合成(合成代谢)和降解(分解代谢)途径。

硫解酶超家族根据功能分为三个家族：(a)β-酮脂酰：酰基-载体-蛋白合酶(β-ketoacyl：acyl-carrier-protein synthase，KAS)，(b)聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)，以及(c)合成性和降解性硫解酶家族。前两组分别参与脂肪酸和复合物聚酮代谢。这两组蛋白质主要依赖于酰基载体蛋白质并参与用于底物激活的羧化过程。

第三组分为两个家族：生物合成性硫解酶(EC 2.3.1.9)和降解性硫解酶(EC2.3.1.16)，但是这两组酶在特定条件下均能够催化正向反应和反向反应二者。

尽管它们的底物特异性不同，但硫解酶超家族保留了一种相同类型的硫解酶折叠，其中每个单体由具有夹心型βαβαβαββ基序的两个相似半部形成。就其四级结构而言，它们通常在生物介质中组织成二聚体或二聚体的二聚体。在后者中，它们是通过四个β6/β7环相互作用的二聚体的二聚体，每个单体一个，并且其中相互作用主要是疏水型相互作用。

属于硫解酶家族的酶具有约400个残基，具有连接N末端和C末端两个相似结构域并具有βαβαβαββ折叠的约20个残基的广泛环。正是这个区域从活性中心向外折叠，形成配体相互作用位点的很大一部分。这些酶中催化相关的残基位于各自N-和C-末端结构域的所谓α-3螺旋的连续环中(一个组氨酸和两个半胱氨酸)。

硫解酶所接受的反应的一般生物合成机理由其中产生共价酰基半胱氨酸(Cys(Ac))中间体的两个连续步骤组成(方案1)。因此，在第一步中，将酰基(如果底物1是乙酰-CoA的话为乙酰基)转移至催化性半胱氨酸(受体)。在第二步中，在该催化性半胱氨酸与新的底物2之间发生克莱森缩合步骤以获得在2位乙酰化的该底物2。

(i)酰基转移

(ii)克莱森缩合

方案1.-通过硫解酶催化的反应的机理。

硫解酶的活性中心由两个含氧阴离子(oxyanion)孔(I和II)形成，其中产生的负电荷在整个催化循环过程中是稳定化的。

与直链产物相比，支链产物作为用于获得工业上令人关注的新化合物家族的基础。特别地，与直链对应物相比，支链产物表现出作为生物燃料的优点。然而，大多数硫解酶不能合成支链产物。

因此，有必要提供能够合成支链产物以产生工业上令人关注的衍生物的硫解酶。

发明简述

第一方面，本发明涉及突变硫解酶，其能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物的缩合形成式(I)化合物，

其中R₁和R₂独立地选自直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₂-C₆烯基、直链或支链C₂-C₆炔基、芳基、芳基-烷基和苄基，并且S-CoA是辅酶A，

所述突变硫解酶至少具有在对应于SEQ ID NO：1的多肽中的第293位的位置处的突变，其中所述硫解酶显示出与选自SEQ ID NO：1、2、3或4的硫解酶至少75％的序列同一性，前提是所述硫解酶不是由序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8组成的硫解酶。

第二方面，本发明涉及编码根据本发明第一方面的硫解酶的核酸。

第三方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的核酸的载体。

第四方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的核酸或根据本发明第三方面的载体的宿主细胞。

第五方面，本发明涉及用于产生式(I)化合物的方法，其包括在能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物的缩合形成式(I)化合物的突变硫解酶的存在下使式(II)化合物与式(III)化合物接触

所述突变硫解酶至少具有相对于天然硫解酶的突变，其中所述突变位于对应于SEQ IDNO：1的多肽中第293位的位置处；并且其中所述接触在足以使式(II)和(III)化合物缩合成式(I)化合物的条件下进行。

第六方面，本发明涉及用于产生式(IV)化合物的方法，其包括使式(I)化合物与能够催化由式(I)化合物形成式(IV)化合物的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触，

其中R₁、R₂和S-CoA如本发明第一方面中所限定。

附图简述

图1.来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(SEQ ID NO：1，Erg10)、黄杆菌属杆菌科(Flavobacterium bacteriaceae)(SEQ ID NO：5，FbThl)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(SEQ ID NO：4，TtTlhl)、真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(SEQ ID NO：2，BktB)和大肠杆菌(Escherichia coli)(SEQ ID NO：3，AtoB)的硫解酶的氨基酸序列的比对。高度保守的区域标有星号；冒号表示具有强相似性质的组之间的保守性；句号表示具有弱相似性质的组之间的保守性。在催化循环中具有关键作用的氨基酸加有框。

图2.(A)分别作为PpFadB2(SEQ ID NO：6)浓度的函数的乙酰乙酰-CoA和3-酮-2-乙基丁酰-CoA至3-羟基丁酰-CoA(3HB-CoA)和3-羟基-2-乙基丁酰-CoA(3H2EB-CoA)的还原反应的产率。(B)PpFadB2浓度对还原反应的立体选择性(以[峰2]/[峰1]比值表示)以及对主“峰2”3-羟基-2-乙基丁酰-CoA异构体的产生(以[峰2]/([峰1]+[峰2])·100表示)的影响。在测定的最低蛋白质浓度(0.0001mg/mL)下，仅检测到峰2异构体。

图3.3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的¹H-NMR谱。

图4.来自真氧产碱杆菌(BktB)的硫解酶的乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合能力的分析。(a)标准混合物、(b)野生型BktB和(c)BktB_Var10的总离子色谱(Total IonChromatogram，TIC)。峰标识：1：3H2EB-CoA峰1；2：3H2EB-CoA峰2；3：3HHB-CoA。

图5.来自酿酒酵母(Erg10)、黄杆菌属杆菌科(FbThl)、嗜热栖热菌(TtTlhl)、真氧产碱杆菌(BktB)、大肠杆菌(AtoB)和它们相应的Var10(三重突变体)的硫解酶的3HB-CoA产生产率的比较。使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和FadB2在37℃下在100mMMES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。1小时之后分析产物形成并通过HPLC-MS进行定量。A)3-羟基-2-乙基丁酰-CoA产率，B)3-羟基己酰-CoA产率，C)3-羟基丁酰-CoA产率。D)乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合测定中硫解酶变体的产物选择性。

图6.来自酿酒酵母的Erg10硫解酶变体的比较。(SEQ ID NO：1)使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和PpFadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。1小时的反应孵育之后，分析产物形成并通过HPLC-MS进行定量。

图7.在位置F293处修饰的来自酿酒酵母的硫解酶(SEQ ID NO：1，Erg10)的产物产率。使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和PpFadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。1小时的反应孵育之后，分析产物形成并通过HPLC-MS进行定量。(A)3-羟基-2-乙基丁酰-CoA(插图示出选定突变体的产物选择性)，(B)3-羟基丁酰-CoA，(C)3-羟基己酰-CoA。

图8.使用(a)Erg10_F293D和(b)Erg10_F293A作为生物催化剂的产物形成的时间过程。使用浓度分别为0.1和0.15mg/ml的纯化硫解酶和PpFadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。通过HPLC-MS对产物形成进行定量。

图9.A)标准3-羟基-戊酰-CoA(上)、无酶对照(中)和Erg10-F293A反应样品(下)的LC-MS分析。B)峰2和峰3的MS分析。

图10.无酶对照(上)和Erg10-F293D反应样品(下)的LC-MS分析。在插图中，峰4的MS分析。

图11.在位置F293处修饰的来自酿酒酵母的Erg10硫解酶变体的乙酰-CoA/乙酰-CoA缩合产物产物产率。使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和PpFadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。1小时的反应孵育之后，分析产物形成并通过HPLC-MS进行定量。通过与野生型Erg10的产物产率进行比较来对3-羟基丁酰-CoA产物产率进行归一化。

图12.1小时的反应之后乙酰-CoA∶丁酰-CoA比例对作为生物催化剂的Erg10_F293D变体的产物谱的影响。使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和PpFadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。通过HPLC-MS对产物形成进行定量。

图13.来自真氧产碱杆菌的BktB硫解酶变体(SEQ ID NO：2)的比较。使用浓度分别为0.19和0.15mg/ml的纯化硫解酶和FadB2在37℃下在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中进行反应。1小时的反应孵育之后，分析产物形成并通过HPLC-MS进行定量。

发明详述

本发明的发明人已鉴定了硫解酶中的突变，这些突变改善了它们的生物合成活性，并且更特别地，能够产生支链产物。

基于这些发现，发明人已经开发了在其现在将详细描述的不同实施方案中的本发明方法。

本发明的突变硫解酶

本文中使用的术语“硫解酶”是指能够使包含乙酰-CoA(AcCoA)的2个分子缩合以产生包含乙酰乙酰-CoA的分子的多肽。该术语包括天然地催化例如2个乙酰-CoA分子的缩合的硫解酶(生物合成性硫解酶，也称为乙酰乙酰-CoA硫解酶或乙酰-CoA乙酰转移酶，EC编号2.3.1.9)和天然地催化由乙酰乙酰-CoA和辅酶A形成乙酰-CoA的硫解酶(降解性硫解酶，也称为3-酮脂酰-CoA硫解酶或3-氧酰-CoA硫解酶，EC编号2.3.1.16)这二者，但是在合适的条件下，其可催化正反应和逆反应二者。根据本发明的优选硫解酶包括但不限于酿酒酵母乙酰乙酰-CoA硫解酶(Erg10，SEQ ID NO：1)、真氧产碱杆菌乙酰-CoA乙酰转移酶(BktB，SEQID NO：2)、大肠杆菌乙酰乙酰-CoA硫解酶(AtoB，SEQ ID NO：3)和嗜热栖热菌乙酰乙酰-CoA硫解酶(TtThl，SEQ ID NO：4)。

本文中使用的术语“突变体”是指如上所定义的硫解酶的任何变体，其能够使包含乙酰辅酶A(AcCoA)和丁酰辅酶A(BuCoA)的两个分子缩合以形成3-酮-2-乙基丁酰-CoA，由于存在一个或更多个氨基酸的添加、替换或缺失，其不同于乙酰乙酰-CoA硫解酶，并且相对于如SEQ ID NO：1至4定义的任何序列，其显示出与天然硫解酶至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性。在一个优选的实施方案中，在序列的整个长度上测定序列同一性。本领域技术人员认识到存在许多可用于比对两个序列的已建立的算法。用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性检索算法，通过这些算法的计算机化执行(例如，GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等，编辑，Greene PublishingAssociates，Inc.and John Wiley and Sons，Inc.，(1995增刊))进行。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215：403-410和Altschul等，1977，Nucleic Acids Res.3389-3402中；以及BLASTP算法(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，J.，1990，Mol.Biol.215：403-410)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站(National Center for Biotechnology Information website)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字来鉴定高得分序列对(high scoring sequence pair，HSP)，其当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阈值评分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的相邻字命中行为作为用于启动搜索的种子，以找到包含它们的更长的HSP。然后沿着每个序列在两个方向上延伸字命中，只要累积比对得分可提高即可。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止字命中在每个方向的延伸：累计比对得分从其达到的最大值下降量X；由于一个或更多个负评分残基比对的积累，累积得分变为零或低于零；或者达到序列的任一端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)，10的期望值(E)，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长(W)，10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc Natl Acad Sci USA 89：10915)。序列比对和百分比序列同一性的示例性测定可使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys，Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用所提供的默认参数或多重比对程序(可获自Swiss Institute of Bioinformatics，Lausanne，Switzerland)，在一些实施方案中，使用下面的参数。

为了本公开内容的目的，在一些实施方案中，氨基酸序列的百分比同一性程度可通过多重比对分析获得，计算比对中相同匹配的数目并且将这样的相同匹配数目除以参考序列的长度，并使用以下默认参数来实现缓慢/准确的成对最优比对输出格式：聚类w/o数字；处理输入序列：否；MBED样聚类指导树：是；组合迭代次数：默认(0)；最大指导树迭代：默认；最大HMM迭代：默认；顺序：对齐。

本领域技术人员将理解，根据本发明的显示硫解酶活性的突变体(例如乙酰-辅酶A(AcCoA)与丁酰-辅酶A(BuCoA)缩合)可具有相对于天然序列降低的乙酰-CoA缩合活性，使得根据本发明的突变体可具有相对于天然硫解酶活性为99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或更低的乙酰-CoA缩合的硫解酶活性。

当使用式(II)化合物(优选丁酰-辅酶A(BuCoA))和式(III)化合物(优选乙酰-CoA)作为底物时，根据本发明的硫解酶突变体具有使式(II)和(III)化合物缩合的特定硫解酶活性，其为至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.5、至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100mU/mg。

本文中使用的术语“C₁-C₆烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和非环状烃。代表性的直链C₁-C₆烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基；而支链C₁-C₆烷基包括但不限于异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。包括在本发明中的烷基可任选地用一个或更多个取代基进行修饰。

本文中使用的术语“C₂-C₆烷基”是指具有2至6个碳原子的直链或支链饱和非环状烃。代表性的直链C₂-C₆烷基包括但不限于乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基；而支链C₂-C₆烷基包括但不限于异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。包括在本发明中的烷基可任选地用一个或更多个取代基进行修饰。

本文中使用的术语“C₂-C₆烯基”是指具有2至6个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链无环烃。代表性的直链和支链C₂-C₆烯基包括但不限于乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基等。烯基可任选地被一个或更多个取代基修饰。

本文中使用的术语“C₂-C₆炔基”是指具有2至6个碳原子和至少一个碳-碳三键的直链或支链无环烃。代表性的直链和支链C₂-C₆炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。

“芳基”是指芳香族烃基，例如苯基、萘基或蒽基。芳基可任选地被一个或更多个基团(例如羟基、巯基、卤素、烷基、苯基、烷氧基、卤代烷基、硝基、氰基、羧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基、酰基和烷氧基羰基)取代。

本文中使用的“芳基-烷基”定义为与如上定义的芳基缔合的如上定义的烷基。

本文中使用的“苄基”定义为-CH₂-苯基，其中苯基可被取代或未被取代。

在本发明的一个特别且优选的实施方案中，R₁是乙基。在本发明的另一个特别且优选的实施方案中，R₂是甲基。

本文中使用的表述“对应于多肽Y中的第X位的位置”是指在包含突变硫解酶序列、多肽Y序列和可变数目的序列的多序列比对中，当所述硫解酶序列与多肽Y重叠时，硫解酶序列中与第X位一致的位置。在一个优选的实施方案中，多序列比对由上述硫解酶序列(具有SEQ ID NO：1至4的序列)形成。在一个优选的实施方案中，使用至少10个硫解酶序列、至少15个序列、至少20个序列、至少25个序列或更多来进行多序列比对。多序列比对可通过使用如上所述的用于该目的的任何标准方法来获得，并且如本专利申请的实施例1中所示。在一个优选实施方案中，通过CLUSTALW2程序(Larkin等，Bioinformatics，2007，23：2947-2948)中实施的算法，使用标准参数(比对类型：慢；矩阵：Gonnet；缺口开放：10；缺口延伸：0.1；KTUP：1；窗口长度：5；得分类型：百分比；Top Diags：5，以及配对缺口：3)进行多序列比对。在另一个优选的实施方案中，通过CLUSTAL OMEGA程序(Sievers F.等，Biology7Article number：539doi：10.1038/msb.2011.75)中实施的算法，使用标准参数(HHalign算法，具有默认参数，且默认转换矩阵是Gonnet，其空位开放罚分为6位，且空位延伸为1位)进行多序列比对。

根据本发明，突变硫解酶具有至少一个相对于天然硫解酶的突变，其中所述突变位于对应于SEQ ID NO：1的多肽中的第293位的位置处，前提是所述硫解酶不是由序列SEQID NO：7或SEQ ID NO：8组成的硫解酶。

在本发明的一个特别的实施方案中，所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识(signature)的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少35％的同一性，所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少50％的同一性，和/或其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少25％的同一性。

表述“所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号X的硫解酶标识的序列”是指在包含本发明的突变硫解酶序列(即，包含序列SEQ ID NO：1-4的硫解酶)和在Prosite数据库中具有登录号X的标识的序列比对中，本发明硫解酶的与Prosite数据库的标识X一致的序列。序列同一性可通过使用可用于比对前述两个序列的任何适合算法来确定。

具有登录号PS00098的标识是具有以下共有序列模式的保守硫解酶标识：[LIVM]-[NST]-{T}-x-C-[SAGLI]-[ST]-[SAG]-[LIVMFYNS]-x-[STAG]-[LIVM]-x(6)-[LIVM]。对应于在Prosite数据库中具有PS00098登录号的标识的序列见于SEQ ID NO：1的多肽的第87至105位处，并对应于子序列

VNKVCASAMKAIILGAQSI

具有登录号PS00737的标识是具有以下共有序列模式的保守硫解酶标识：N-x(2)-G-G-x-[LIVM]-[SA]-x-G-H-P-x-[GAS]-x-[ST]-G。对应于在Prosite数据库中具有PS00737登录号的标识的序列见于SEQ ID NO：1的多肽的第344至360位处，并对应于子序列

NVYGGAVALGHPLGCSG

具有登录号PS00099的标识是具有以下共有序列模式的保守硫解酶标识：[AG]-[LIVMA]-[STAGCLIVM]-[STAG]-[LIVMA]-C-{Q}-[AG]-x-[AG]-x-[AG]-x-[SAG]。对应于在Prosite数据库中具有PS00099登录号的标识的序列见于SEQ ID NO：1的多肽的第379至392位处，并对应于子序列

GVAAICNGGGGASS

因此，根据该实施方案，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少35％的同一性。在一个更特别的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少40％的同一性。在另一个特别的实施方案中，所述同一性为至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少100％。在一个优选的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约37％的同一性。在另一个优选的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约47％的同一性。在一个优选的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ IDNO：1的所述硫解酶标识的序列具有约58％的同一性。在一个优选的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1所述硫解酶标识的序列具有约63％的同一性。

作为替代或补充，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少50％的同一性。具有登录号PS00737的所述标识是具有以下共有序列模式的保守硫解酶标识：NN-x(2)-G-G-x-[LIVM]-[SA]-x-G-H-P-x-[GAS]-x-[ST]-G。在一个更特别的实施方案中，对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少55％的同一性。在另一个特别的实施方案中，所述同一性为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少100％。在一个优选的实施方案中，对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约55％的同一性。在另一个优选的实施方案中，对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约76％的同一性。在另一个优选的实施方案中，对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约82％的同一性。在另一个优选的实施方案中，对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约86％的同一性。

作为替代或补充，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少25％的同一性。所述标识是具有以下共有序列模式的保守硫解酶标识：[AG]-[LIVMA]-[STAGCLIVM]-[STAG]-[LIVMA]-C-{Q}-[AG]-x-[AG]-x-[AG]-x-[SAG]。在一个更特别的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有至少30％的同一性。在另一个特别的实施方案中，所述同一性为至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少100％。在一个优选的实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约35％的同一性。在另一个优选实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约42％的同一性。在一个优选实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约82％的同一性。在一个优选实施方案中，本发明硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的所述序列与对应于SEQ ID NO：1的所述硫解酶标识的序列具有约92％的同一性。

在一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Phe293处；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met290处，

(iii)SEQ ID NO：3的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met289处，以及

(iv)SEQ ID NO：4的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met294处。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽，其中第293位处的残基不是Phe；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽，其中第290位处的残基不是Met，

(iii)SEQ ID NO：3的多肽，其中第289位处的残基不是Met，以及

(iv)SEQ ID NO：4的多肽，其中第294位处的残基不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是SEQ ID NO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的所述至少一个突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是SEQ ID NO：2的多肽，其中在位置Met290处的所述至少一个突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是SEQ ID NO：3的多肽，其中位于位置Met289处的至少一个突变选自Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是SEQ ID NO：4的多肽，其中位于位置Met294处的所述至少一个突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu。

在另一个实施方案中，根据本发明的硫解酶还包含在选自对应于SEQ ID NO：1的多肽中的第90和383位的残基的位置处的至少一个另外的突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90和Phe293处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Phe293和Ile382处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90、Phe293和Ile383处包含突变的SEQ ID NO：1的多肽。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90和Phe293处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中所述突变使得第90位处的氨基酸不是Val，并且第293位处的氨基酸不是Phe。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Phe293和Ile382处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中所述突变使得第293位处的氨基酸不是Phe，并且第382位处的氨基酸不是Ile。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90、Phe293和Ile382处包含突变的SEQ ID NO：1的多肽，其中所述突变使得第90位处的氨基酸不是Val，第293位处的氨基酸是不是Phe，并且第382位处的氨基酸不是Ile。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90和Phe293处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，和/或其中位于位置Val90处的突变是V90I突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Phe293和Ile382处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，和/或其中位于位置Ile382处的突变是I383V突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90、Phe293和Ile383处包含突变的SEQ ID NO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，其中位于位置Val90处的突变是V90I突变，和/或其中位于位置Ile382处的突变是I383V突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)包含V90I和F293A突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(ii)包含V90I和F293D突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iii)包含F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iv)包含F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(v)包含V90I、F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，以及

(vi)包含V90I、F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89和Met290处包含突变的SEQ IDNO：2的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met290和Met379处包含突变的SEQ IDNO：2的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89、Met290和Met379处包含突变的SEQ ID NO：2的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89和Met290处包含突变的SEQ IDNO：2的硫解酶，其中所述突变使得第89位处的氨基酸不是Leu，和/或第290位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met 290和Met 379处包含突变的SEQID NO：2的硫解酶，其中所述突变使得第290位处的氨基酸不是Met，并且第379位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89、Met290和Met379处包含突变的SEQ ID NO：2的硫解酶，其中所述突变使得第89位处的氨基酸不是Leu，第290位处的氨基酸不是Met，和/或第379位处的氨基酸不是Met。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89和Met290处包含突变的SEQ IDNO：2的多肽，其中位于位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，和/或位置Leu89处的突变是L89I突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met290和Met379处包含突变的SEQ IDNO：2的多肽，其中位于位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，和/或位置Met379处的突变是Met379Val突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89、Met290和Met379处包含突变的SEQ ID NO：2的多肽，其中位于位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，位置Leu89处的突变是Leu89Ile突变，和/或位置Met379处的突变是Met379Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自

(i)包含L89I和M290A突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(ii)包含L89I和M290D突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iii)包含M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iv)包含M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(v)包含L89I、M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，以及

(vi)包含L89I、M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87和Met289处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met289和Leu378处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87、Met289和Leu378处包含突变的SEQ ID NO：3的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87和Met289处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中所述突变使得第87位处的氨基酸不是Val，和/或第289位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met289和Leu378处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中所述突变使得第289位处的氨基酸不是Met，并且第378位处的氨基酸不是Leu。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87、Met289和Met379处包含突变的SEQ ID NO：3的硫解酶，其中所述突变使得第87位处的氨基酸不是Val，第289位处的氨基酸不是Met，和/或第379位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87和Met289处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中第289位处的突变是Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu，和/或其中位置Val87处的突变是Val87Ile突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met289和Leu378处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中第289位处的突变是Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu，和/或其中Leu378位置处的突变是Leu378Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87、Met289和Leu378处包含突变的SEQ ID NO：3的硫解酶，其中第289位处的突变是Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu，其中位置Val87处的突变是Val87Ile突变，并且其中位置Leu378处的突变是Leu378Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自

(i)包含V87I、M289A和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽，以及

(ii)包含V87I、M289D和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88和Met294处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met294和Met385处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88，Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88和Met294处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶，其中所述突变使得第88位处的氨基酸不是Leu，和/或第294位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met294和Met385处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶，其中所述突变使得第294位处的氨基酸不是Met，并且第385位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88、Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶，其中所述突变使得第88位处的氨基酸不是Leu，第294位处的氨基酸不是Met，并且位置385处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88和Met294处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶，其中位于位置Met294处的突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu，和/或位于位置Leu88处的突变是Leu88Ile突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met294和Met385处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶，其中位于位置Met294处的突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu，和/或位于位置Met385处的突变是Met385Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88、Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶，其中位于位置Met294处的突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu，位于位置Leu88处的突变是Leu88Ile突变，和/或位于位置Met385处的突变是Met385Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自

(i)包含L88I、M294A和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽，

(ii)包含L88I、M294D和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽。

第二方面，本发明涉及编码根据本发明第一方面的硫解酶的核酸。本文中使用的术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则涵盖天然核苷酸和以与天然核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸类似物。术语“核苷酸”包括但不限于包含与糖(例如核糖、脱氧核糖或其合成类似物)连接的碱基(例如嘧啶、嘌呤或其合成类似物)或与氨基酸连接的碱基(如在肽核酸(peptidenucleicacid，PNA)中)。核苷酸是寡核苷酸或多核苷酸中的一个单体。“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸中的碱基序列。

术语多核苷酸是指至少10个核苷酸，优选至少16个核苷酸，优选至少20个核苷酸，优选至少25个核苷酸，优选至少100个核苷酸或更多酸的序列，包括多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸二者或其组合。术语“寡核苷酸”还指由通过常规磷酸二酯键结合的常规核苷酸形成的分子以及其变体，包括设计用于提高寡核苷酸的生物稳定性或用于使发夹形结构的物理稳定性稳定化的嘌呤或嘧啶残基中的修饰以及核糖或脱氧核糖残基中的修饰。可用于本发明的经修饰的核苷酸的实例包括但不限于在糖的2′位处具有选自以下的取代基的核苷酸：氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、甲基、乙基、丙基、丁基或官能化烷基(例如乙氨基、丙氨基和丁氨基)。或者，烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基或根据式的-O(CH₂)q-R的官能化烷氧基，其中q为2至4且R为氨基、甲氧基或乙氧基。合适的烷氧基烷基是甲氧基乙基和乙氧基乙基。其中不同核苷酸在2′位包含不同修饰的寡核苷酸也是本发明的一部分。作为替代或补充，本发明的寡核苷酸可包含经修饰的键，例如磷酸二酯-、磷酸三酯-、硫代磷酸酯-、二硫代磷酸酯-、硒代磷酸酯-、二硒代磷酸酯-、苯胺硫代磷酸酯-(phosphoroanilothioate-)、氨基磷酸酯-、甲基膦酸酯-、硼烷膦酸酯-型键及其组合，或者它们是肽核酸(PNA)，其中不同的核苷酸通过酰胺键结合。

第三方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的核酸的载体。本文中使用的术语“载体”是指能够将一种或更多种目的多核苷酸递送到宿主细胞中并优选地还表达所述一种或更多种目的多核苷酸递的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，例如生产细胞(producer cell)。该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或位点专一地整合到基因组DNA中。这样的靶向构建体优选地包含足够长度的DNA用于同源重组或异源整合。

第四方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的核酸或根据本发明第三方面的载体的宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可通过本领域普通技术人员公知的常规技术进行。当宿主是原核生物(例如大肠杆菌)时，可由指数生长期之后收获的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞，并随后使用本领域中公知的程序通过CaCl₂方法处理。或者，可使用MgCl₂或RbCl。如果期望的话，也可在形成宿主细胞的原生质体之后或通过电穿孔进行转化。

当宿主是真核生物时，可使用例如以下的转染DNA的方法：磷酸钙共沉淀、常规机械操作(例如显微注射)、电穿孔、包裹在脂质体中的质粒的插入或病毒载体。真核细胞也可用编码本发明突变硫解酶的多核苷酸序列和编码选择性表型的第二外源DNA分子(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转化。另一种方法是使用真核病毒载体(例如猿猴病毒40(simianvirus，SV40)或牛乳头瘤病毒来瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白质。参见Gluzman Y，编辑，“Eukaryotic Viral Vectors”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，US，1982)。

用于产生式(I)化合物的体外方法

在第五方面，本发明涉及用于产生式(I)化合物的方法，下文称为“本发明的第一方法”，其包括在存在能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物缩合形成式(I)化合物的突变硫解酶的情况下，使式(II)化合物与式(III)化合物接触，

其中R₁和R₂独立地选自：直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₂-C₆烯基、直链或支链C₂-C₆炔基、芳基、芳基-烷基和苄基，并且S-CoA是辅酶A，所述突变硫解酶至少具有相对于天然硫解酶的突变，其中所述突变位于对应于SEQ ID NO：1的多肽中第293位的位置；并且其中所述接触在足以使式(II)和(III)化合物缩合成式(I)化合物的条件下进行。

术语“突变体”、“硫解酶”、“式I化合物”、“式II化合物”和“式III化合物”及其细节已在本发明第一实施方案的上下文中定义。

在本发明的第一方法的一个特别的实施方案中，所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的序列与SEQ ID NO：1的硫解酶中对应于所述标识的序列具有至少35％的同一性，所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的序列与SEQ ID NO：1的硫解酶中对应于所述标识的序列具有至少50％的同一性，和/或所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的序列与SEQ ID NO：1的硫解酶中对应于所述标识的序列具有至少25％的同一性。

在一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Phe293；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met290，

(iii)SEQ ID NO：3的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met289，

以及

(iv)SEQ ID NO：4的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met294。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽，其中在第293位处的残基不是Phe；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽，其中在第290位处的残基不是Met，

(iii)SEQ ID NO：3的多肽，其中在第289位处的残基不是Met，以及

(iv)SEQ ID NO：4的多肽，其中在第294位处的残基不是Met。

在另一个实施方案中，根据本发明的硫解酶还在选自对应于SEQ ID NO：1的多肽中第90和383位的残基的位置处包含至少一个另外的突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90、Phe293和Ile382处包含突变的SEQ ID NO：1的多肽，其中所述突变使得第90位处的氨基酸不是Val，第293位处的氨基酸不是Phe，并且第382位处的氨基酸不是Ile。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90和Phe293处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，和/或其中位于位置Val90处的突变是Val90Ile突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Phe293和Ile382处包含突变的SEQ IDNO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，和/或其中位于位置Ile382处的突变是leI383Val突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val90、Phe293和Ile383处包含突变的SEQ ID NO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu，其中位于位置Val90处的突变是Val90Ile突变，和/或其中位于位置Ile382处的突变是Ile383Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)包含V90I和F293A突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(ii)包含V90I和F293D突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iii)包含F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iv)包含F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(v)包含V90I、F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，以及

(vi)包含V90I、F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met 290和Met 379处包含突变的SEQID NO：2的硫解酶，其中所述突变使得在第290位处的氨基酸不是Met，并且在第379位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89、Met290和Met379处包含突变的SEQ ID NO：2的硫解酶，其中所述突变使得在第89位处的氨基酸不是Leu，第290位处的氨基酸不是Met，和/或在第379位处的氨基酸不是Met。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89和Met290处包含突变的SEQ IDNO：2的多肽，其中位于在位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，和/或在位置Leu89处的突变是Leu89Ile突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met290和Met379处包含突变的SEQ IDNO：2的多肽，其中位于位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，和/或在位置Met379处的突变是Met379Val突变。

在一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu89、Met290和Met379处包含突变的SEQ ID NO：2的多肽，其中位于位置Met290处的突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu，在位置Leu89处的突变是Leu89Ile突变，和/或在位置Met379处的突变是Met379Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自

(i)包含L89I和M290A突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(ii)包含L89I和M290D突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iii)包含M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iv)包含M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(v)包含L89I、M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2多肽，以及

(vi)包含L89I、M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met289和Leu378处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中所述突变使得第289位处的氨基酸不是Met，且第378位处的氨基酸不是Leu。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Met289和Leu378处包含突变的SEQ IDNO：3的硫解酶，其中第289位处的突变是Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu，和/或其中第Leu378处的突变是Leu378Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Val87、Met289和Leu378处包含突变的SEQ ID NO：3的硫解酶，其中第289位处的突变是Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu，其中在位置Val87处的突变是Val87Ile突变，并且其中在位置Leu378处的突变是Leu378Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自

(i)包含V87I、M289A和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽，以及

(ii)包含V87I、M289D和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88、Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88和Met294处包含突变的SEQ IDNO：4的硫解酶，其中所述突变使得在第88位处的氨基酸不是Leu，和/或在第294位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88、Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶，其中所述突变使得在第88位处的氨基酸不是Leu，在第294位处的氨基酸不是Met，并且在第385位处的氨基酸不是Met。

在另一个实施方案中，突变硫解酶是在位置Leu88、Met294和Met385处包含突变的SEQ ID NO：4的硫解酶，其中位于位置Met294处的突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu，位于位置Leu88处的突变是L88I突变，和/或位于位置Met385处的突变是Met385Val突变。

在另一个实施方案中，突变硫解酶选自：

(i)包含L88I、M294A和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽，

(ii)包含L88I、M294D和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽。

本文中使用的表述“在存在硫解酶的情况下使式(II)化合物与式(III)化合物接触”是指将所述硫解酶与所述式(II)和(III)化合物孵育以用于使所述化合物与所述硫解酶之间相互作用；从而导致形成式(I)化合物。

硫解酶使式(II)化合物与式(III)化合物缩合产生式(I)化合物所需的条件包括硫解酶与底物之间在浓度方面的合适比例，以及合适的盐、辅因子、pH和温度条件，以及合适的反应时间。

用于实施根据本发明的第一方法的合适的盐条件包括但不限于通常已知的任何缓冲液，例如浓度为至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或更高的磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES)。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法在100mM MES缓冲液中进行。

用于实施根据本发明的第一方法的合适的pH值包括但不限于4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5的值。在一个优选的实施方案中，该方法在约6的pH下进行。

用于实施根据本发明的第一方法的合适温度条件包括但不限于约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃。在一个优选的实施方案中，该方法在37℃下进行。

用于实施根据本发明的方法的合适的反应时间包括但不限于至少1ms、至少1s、至少15s、至少30s、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时或更长时间。在一个优选的实施方案中，反应时间是1小时。

在根据本发明的第一方法中化合物(II)和(III)的浓度比例没有特别限制。因此，化合物(II)与化合物(III)的合适浓度比例为1000∶1、500∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶100、1∶500或1∶1000。在一个实施方案中，这两种化合物以等摩尔浓度使用。化合物(II)和(III)的合适浓度包括但不限于约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约100nM、约500nM、约1μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约100μM、约500μM、约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约100mM或更高。在一个优选的实施方案中，底物(I)和(II)的浓度为0.1至1mM。

用于实施根据本发明的第一方法的硫解酶的合适浓度包括但不限于约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约5μg/mL、约8μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约50μg/mL、约75μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约500μg/mL、约750μg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约5mg/mL、约7.5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、约75mg/mL、约100mg/mL。在一个优选的实施方案中，硫解酶的浓度为0.05至1mg/mL。

在本发明的一个特别的且优选的实施方案中，本发明的第一方法还包括使式(I)化合物与具有能够催化由式(I)化合物形成式(IV)化合物的β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触，

并且其中R₁和R₂独立地选自：直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₂-C₆烯基、直链或支链C₂-C₆炔基、芳基、芳基-烷基和苄基，并且S-CoA是辅酶A。

本文中使用的术语“具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽”是指催化支链醛或酮向其各自醇的NADP(H)转化的多肽，其中术语NAD(P)H是指作为辅因子的NADH或NADPH。用于本发明的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽是生物催化剂；因此用于本发明的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽是酶。

β-酮脂酰-CoA还原酶活性可通过本领域中已知的任何适于确定NAD(P)H-依赖的醛还原酶活性之活性的方法(例如与质谱联用的液相色谱)确定或通过监测240nm处NAD(P)H的氧化通过分光光度法确定。

当使用3-酮-2-乙基-丁酰-CoA作为底物时，用于本发明的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽包括比活性在以下范围内的多肽：至少0.001、至少0.01、至少0.1、至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100mU/mg、至少200mU/mg、至少400mU/mg、至少800mU/mg、至少1000mU/mg或更高。

根据本发明，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的序列与SEQ ID NO：6的序列具有至少45％的同一性，其中SEQ ID NO：6对应于来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的β-酮脂酰-CoA还原酶的氨基酸序列。

在一个特别的实施方案中，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的序列与SEQ IDNO：6的序列具有至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更高的同一性。在一个优选的实施方案中，在被比较的多肽的全长上确定上述同一性值。上文中已详细描述了术语“同一性”以及用于确定两个序列之间的同一性百分比的合适算法。

在本发明的一个特别的且优选的实施方案中，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽由来自恶臭假单胞菌的β-酮脂酰-CoA还原酶蛋白的氨基酸序列组成，并且其在SEQ IDNO：6中示出。

本领域技术人员将理解，该特别的实施方案包括用于实施从化合物(I)获得化合物(IV)的反应的合适条件。所述条件包括具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽与底物之间在浓度方面的合适比例，以及合适的盐、辅因子、pH和温度条件，以及合适的反应时间。

上文中详细描述了合适的盐、pH、温度条件，辅因子和化合物(I)二者的合适浓度，以及合适的反应时间。

具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的合适浓度包括但不限于约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约5μg/mL、约8μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约50μg/mL、约75μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约500μg/mL、约750mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约5mg/mL、约7.5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、约75mg/mL、约100mg/mL。在一个优选的实施方案中，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的浓度为0.05至1mg/mL。

在本发明第一方法的一个特别的且优选的实施方案中，R₁是乙基。在本发明第一方法的另一个特别的且优选的实施方案中，R₂是甲基。

用于产生式(IV)化合物的体外方法

在第七方面，本发明涉及用于产生式(IV)化合物的方法，在下文中称为“本发明的第三方法”，其包括使式(I)化合物与能够催化由式(I)化合物形成式(IV)化合物的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触，

其中R₁和R₂独立地选自直链或支链C₂-C₆烷基、直链或支链C₂-C₆烯基、直链或支链C₂-C₆炔基、芳基、芳基-烷基和苄基，并且S-CoA是辅酶A。

术语“具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽”、“式I化合物”、“式IV化合物”、“C₁-C₆烷基”、“C₂-C₆烷基”、“C₂-C₆烯基”、“C₂-C₆炔基”、“芳基”、“芳基-烷基”、“苄基”以及其细节在前面已经定义并且在本文中以相同的含义使用。

本文中使用的表述“使式(I)化合物与具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触”是指将所述多肽与所述式(I)化合物孵育以用于使所述化合物与所述多肽相互作用；从而导致形成式(IV)化合物。

本领域技术人员将理解，该方法在由化合物(I)获得化合物(IV)的合适条件下进行。所述条件包括具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽与底物(即式I化合物)之间在浓度方面的合适比例，以及合适的盐、辅因子、pH和温度条件，以及合适的反应时间。

用于实施根据本发明的第三方法的合适的盐条件包括但不限于通常已知的任何缓冲液，例如浓度为至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或更高的磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES)。在一个优选的实施方案中，根据本发明的第三方法在100mM MES缓冲液中进行。

用于实施根据本发明的第三方法的合适的pH值包括但不限于4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5的值。在一个优选的实施方案中，该方法在约6的pH下进行。

用于实施根据本发明的第三方法的合适温度条件包括但不限于约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃。在一个优选的实施方案中，本发明的第三方法在37℃下进行。

用于实施根据本发明的第三方法的合适反应时间包括但不限于至少1ms、至少1s、至少15s、至少30s、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时或更多。在一个优选的实施方案中，反应时间是1小时。

用于实施根据本发明的第三方法的化合物(I)的合适浓度包括但不限于约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约100nM、约500nM、约1μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约100μM、约500μM、约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约100mM或更多。在一个优选的实施方案中，式(I)化合物的浓度为0.1至0.5mM。

具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的合适浓度包括但不限于约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约5μg/mL、约8μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约50μg/mL、约75μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约500μg/mL、约750μg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约5mg/mL、约7.5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、约75mg/mL、约100mg/mL。在一个优选的实施方案中，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽的浓度为0.05至1mg/mL。

本文中使用的术语“辅因子”是指蛋白质的生物学活性所需的非蛋白质化合物。在一个实施方案中，在用于获得上述定义的式(IV)化合物的方法中，分子NADPH充当辅因子。在另一个实施方案中，在用于获得上述定义的式(IV)化合物的方法中，分子NADH充当辅因子。NADH充当还原剂，其供给由羰基(＝O)形成羟基(-OH)所必需的电子。因此，NADH被转化为其氧化形式NAD⁺。用于实施根据本发明的第一方法的NADPH或NADH辅因子的合适浓度包括但不限于约10nM、约50nM、约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约5mM、约10mM或更高。在一个优选的实施方案中，辅因子浓度为1mM。

在本发明的第三方法的一个特别的且优选的实施方案中，R₁是乙基。在本发明的第三方法的另一个特别的且优选的实施方案中，R₂是甲基。

根据本发明使用的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的合适多肽已在本发明的第一方法的上下文中详细描述，并且可等同地用于本发明的第三方法的上下文中。在本发明的第三方法的一个特别的且优选的实施方案中，具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽由来自恶臭假单胞菌的β-酮脂酰-CoA还原酶蛋白的氨基酸序列组成，并且其在SEQ ID NO：6中示出。

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实施例

实施例1.硫解酶序列的比对和保守残基的鉴定。

在本研究中分析的硫解酶在表1中示出。

表1.所选硫解酶的列表

*是指BktB序列。

为了表示所选残基的保守程度，在目的序列(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4)之间进行多重比对。采用默认参数使用来自欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsInstitute，EBI)的Clustal Omega万维网服务器(web server)进行比对。比对在图1中示出。

实施例2.硫解酶的表达和纯化

将编码天然硫解酶或突变硫解酶的质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)-T1^R中，如下所述进行表达和纯化。然后将纯化的重组酶用作用于合成3-羟基-2-乙基-丁酰-CoA(3H2EB-CoA)的生物催化剂。

将在37℃的LB培养基中的过夜培养物接种至0.1的OD_600nm，到50ml的NZY自动诱导(Auto-Induction)LB培养基(NZYTech，Portugal)中。NZY培养基补充有100μg/mL Kan或Amp(根据相应的质粒-表1)。使培养物在37℃下有氧培养7小时，并在25℃下有氧培养直至24小时。此后，通过在4500g下离心10分钟收集细胞并保持在-20℃直至进一步纯化。

沉淀(50ml)用50mM磷酸盐pH 7.5(10ml)匀浆并置于冰浴中进行超声处理。使用脉冲模式(5秒开/关)和20％振幅进行超声处理10分钟。将裂解物在4℃，10,000g下离心30分钟。使用空的PD-10柱通过His-亲和色谱纯化包含融合蛋白的上清液。将上清液与1ml树脂在4℃下孵育30分钟。蛋白质用1ml洗脱缓冲液(300mM咪唑，50mM磷酸盐，pH7.5)洗脱、定量并用于酶反应。

实施例3.硫解酶的高通量表达和纯化

将编码天然硫解酶或突变硫解酶的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)-T1^R中，如下所述进行表达和纯化。然后将纯化的重组酶用作用于合成3H2EB-CoA的生物催化剂。

将LB培养基中的37℃下过夜培养物接种至0.1的OD_600nm，到5ml NZY自动诱导LB培养基(NZYTech，Portugal)中。NZY培养基补充有100μg/mL卡那霉素或氨苄青霉素(根据相应的质粒-表1)。使培养物在37℃下有氧培养7小时并在25℃下有氧培养直至24小时。此后，将细胞等分到96孔深孔板中并在4500g下离心10分钟。将沉淀保持在-20℃直至进一步纯化。

将96孔深孔板中的沉淀用250μl裂解缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5，10μg/ml DNase I，20mM MgSO₄)重悬以进行细胞裂解。细胞裂解进行20分钟。将裂解物在室温，10,000g下离心30分钟。将包含融合蛋白的上清液进行IMAC纯化。将上清液与100μl对脂孵育15分钟。将蛋白质用50μl洗脱缓冲液(300mM咪唑，50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5)洗脱、定量并用于酶反应。

实施例4.通过硫解酶测定脂酰-CoA缩合。

a)乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合测定

通过体外偶联酶测定法在合成方向上评价硫解酶变体的乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合活性并通过HPLC-MS进行产物特征分析(profiling)。由于通过硫解酶催化的缩合反应是吸能的，所以将其与来自恶臭假单胞菌的3-羟基-2-甲基丁酰-CoA脱氢酶(SEQ ID NO：6，PpFadB2)偶联以驱动正向反应(Th1/PpFadB偶联测定)。可能有三种反应产物：3-羟基丁酰-CoA(3HB-CoA)(2个乙酰-CoA分子缩合的野生型产物)、3-羟基己酰-CoA(3HH-CoA)(乙酰-CoA/丁酰-CoA直链缩合产物)和3-羟基-2-乙基丁酰-CoA(3H2EB-CoA)(乙酰-CoA/丁酰-CoA支链缩合产物)。所有三种产物均通过HPLC-MS进行分析(参见下文)。

在2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)缓冲液(pH 6.0)、100μM乙酰-CoA、100μM丁酰-CoA、1mM NADH、0.15mg/mL PpFadB2(SEQ ID NO：6)和0.19mg/ml的硫解酶变体中进行反应。在200μL体积的96孔微量板中制备反应混合物，并在搅拌下(在Thermomixer中300rpm)在37℃下孵育1小时。一旦完成，通过10kDa截止滤板(Millipore)过滤除去酶。将样品储存在-20℃直到进一步分析。

b)乙酰-CoA/乙酰-CoA缩合测定

在具有200μM乙酰-CoA、1mM NADH、0.15mg/mL PpFadB2和0.19mg/mL硫解酶变体的2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)缓冲液(pH 6)中进行反应。如先前部分所述处理反应。

实施例5.来自恶臭假单胞菌的3-羟基-2-甲基丁酰-CoA-脱氢酶(SEQ ID NO：6，PpFadB2)的表达和纯化

将LB培养基中的37℃下过夜培养物接种至0.1的OD_600nm，到500ml的NZY自动诱导LB培养基(NZYTech，Portugal)中。NZY培养基补充有100μg/mL氨苄青霉素。培养物在37℃下有氧培养7小时，并在25℃下有氧培养直至24小时。此后将细胞等分成50ml，并通过在4500g下离心10分钟收集并保存在-20℃直至进一步纯化。

沉淀(50ml)用50mM磷酸盐pH 7.5(20ml)匀浆并置于冰浴中进行超声处理。使用脉冲模式(5秒开/关)和20％振幅进行超声处理10分钟。将裂解物在4℃，10000g下离心30分钟。使用空的PD-10柱通过His亲和色谱纯化包含融合蛋白的上清液。将上清液与3ml树脂在4℃下孵育30分钟。用3ml洗脱缓冲液(300mM咪唑，50mM磷酸盐，pH 7.5)洗脱蛋白质。将洗脱的溶液透析并通过10,000MWCO超滤膜(Amicon)浓缩至约0.5ml的最终体积。然后将纯化的蛋白质定量并保持在4℃下直至用于酶反应。

实施例6.PpFadB2蛋白对3-酮-2-乙基丁酰-CoA的脱氢酶活性的表征。

来自恶臭假单胞菌的FadB2蛋白(PpFadB2；登录号：WP_064492895.1)表现出对3-酮-2-乙基丁酰-CoA的高活性。为了进一步确认该酶的生物催化潜力，使用1mM NADH和100μM 3-酮-2-乙基丁酰-CoA进行体外转化测定。将纯化的PpFadB2添加到测定中至0.0001-1mg/mL的终浓度。在所有的蛋白质浓度下，3-酮-2-乙基丁酰-CoA的消耗是总计，并且通过HPLC评估产品产率为76-95％(图2)。

3-酮-2-乙基丁酰-CoA中的酮基的还原在分子中产生新的手性碳。脱氢酶是高度立体选择性的，并且预期优先合成一种异构体。

3-羟基-2-乙基-丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA的LC-MS、LC-MS/MS和NMR分析

3-羟基-2-乙基丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA购自Sigma-Aldrich并通过LC-MS进行分析。化学合成的3-羟基-2-乙基丁酰-CoA洗脱为两个峰，m/z比为882.2。化学合成的3-羟基己酰-CoA洗脱为单峰，m/z比为882.2。所有三个峰均能很好地进行色谱分离。

来自3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的两个峰的MS/MS谱是不可区分的，并且与3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的单峰的MS/MS谱显著不同(表2)。

表2.3-羟基-2-乙基丁酰-CoA(洗脱为峰1和峰2)和3-羟基己酰-CoA(洗脱为单峰)的MS/MS谱。以负模式记录MS/MS谱。

¹Abund：峰面积积分的绝对值。²Norm：峰面积积分的相对值，相对于MS/MS谱中所有峰积分面积的总和进行归一化。

通过¹H-NMR进一步分析化学合成的3-羟基-2-乙基丁酰-CoA，其进一步证实存在两种异构体(图3)。LC-MS和1H-NMR二者均证实化学合成的3-羟基-2-乙基丁酰-CoA中峰1和峰2异构体以7∶3的比例存在。

因此，得出结论：化学合成的3-羟基-2-乙基丁酰-CoA由7∶3比例的两种非对映异构体的混合物组成。

PpFadB2的立体选择性的实验评估

在体外测定中，酶的立体选择性受其浓度高度影响。在1mg/mL PpFadB2下，将3-酮-2-乙基-丁酰-CoA还原为3-羟基-2-乙基丁酰-CoA产生两种非对映异构体的混合物，其通过HPLC拆分。在较低的酶浓度下，异构体的比例随着峰2异构体产率提高而改变(图2)。

实施例7.硫解酶变体的乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合活性。

构建了BktB_L89I_M290A_M379L(Var10)变体，将其表达并纯化以用作3H2EB-CoA合成中的生物催化剂。

该蛋白质变体能够催化所期望化合物的合成(参见图4中的色谱图)。

一旦Var10被鉴定为能够进行3H2EB-CoA合成的生物催化剂，我们决定研究这些突变对其他所研究硫解酶的作用(表3)。所选硫解酶显示序列同一性低于50％(表3)。

表3.与BktB Var10突变体同源的硫解酶变体的列表。

硫解酶	名称
		BktB_L89I_M290A_M379V	BktB_Var10
AtoB_V87I_M289_L378V	AtoB_Var10
		Erg10_V90I_F293A_I383V	Erg10_Var10
TtThl_L88I_M294A_M385V	TtThl_Var10

构建了四种经修饰硫解酶，将其纯化并用作用于体外乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合的生物催化剂。图5示出产物A)3H2EB-CoA、B)3HHB-CoA、C)3HB-CoA的产率，以及D)野生型硫解酶及其三重突变体的产物选择性。

关于乙酰-CoA缩合活性，与其野生型酶相比，BktB_Var10、AtoB_Var10和Erg10_Var10对3HB-CoA合成显示出更差的活性(图5)。

明显地，AtoB_Var10和Erg10_Var10提高了乙酰-CoA/丁酰-CoA支链缩合产物产率，表现出比BtkB_Var10高4倍的相当的活性(约0.6％产物产率)。而且，Erg10_Var10显示出对合成支链化合物(3HB-CoA/3H2EB-CoA 60：40)的明显选择性。

在合成3HH-CoA的情况下，BktB及其Var10性能最佳，具有相当的合成活性。AtoB_Var10也能够催化该反应，但导致较低的产率。TtTh1的突变杀伤了直链缩合活性。有趣的是，Erg10_Var10产生接近检出限的痕量直链产物(在野生型酶中未观察到活性)。相比较而言，Erg10_Var10和AtoB_Var10显示出支链化合物比直链化合物分别高43倍和3倍的产率。

因此，Erg10_Var10是最好的变体，因为它在克莱森缩合反应的第二步中接受乙酰-CoA以外的底物，同时对支链化合物的合成具有选择性。

实施例8.Erg10硫解酶的单突变体和双突变体的分析。

我们在这三个位置产生了所有可能的变化组合。对三种单变体(Erg10_V90I、Erg10_F293A和Erg10_I383V)和三种双变体(Erg10_V90I_F293A、Erg10_V90I_I383V和Erg10_F293A_I383V)进行用于3H2EB-CoA合成的评价。

在其序列上具有突变F293A的双变体能够催化乙酰-CoA和丁酰-CoA的缩合，产生3H2EB-CoA(图6)。在具有活性的那些中，F293A_I383V显示出比V90I_F293A更高的性能。关于单突变体，只有F293A能够进行所期望的反应，与Erg10_Var10相比，其显示出3倍提高的活性。在单变体I383V的情况下，合成的支链化合物接近检出限。对于变体V90I，未发现乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合产物(图6)。

实施例9.Phe293处的Erg10硫解酶突变体的分析。

通过饱和诱变(将其改变成其余19种天然氨基酸)来探索Phe293残基对Erg10的硫解酶活性的作用。出人意料地，F293D突变体具有优于Erg10_Var1017倍和120倍的在BktB中观察到的初始活性(图7)。

当查看产物选择性时(图7A插图)，F293D成为用于产生3H2EB-CoA的最具活性和选择性的变体。明显地，该突变体分别比3HB-CoA(图7B)和3HH-CoA(图7C)产生高1.5倍和35倍的3H2EB-CoA。

实施例10.硫解酶变体的动力学分析。

对于最佳硫解酶变体的乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合活性的动力学分析，在测定中调节酶的浓度以确保捕获产物合成谱的线性阶段。对于每种蛋白质，测定两种不同酶浓度(对于Erg10_F293D为0.04和0.02mg/mL；对于Erg10_F293A为0.19和0.09mg/mL)。在24小时期间进行反应。计算反应的前20分钟的比活性。

测定一式三份地进行并且至少在两种蛋白质浓度下进行以确保所确定活性的可靠性。

通过经由10Da截止滤板过滤快速分离酶而停止反应。直至进一步分析之前将样品储存在-20℃。

测量Erg10_F293D的比活性并与Erg10_F293A的比活性比较。结果显示对于合成3H2EB-CoA，Erg_F293D的活性比Erg_F293A高12倍，分别示出具有700±140mU/g蛋白质和54±10mU/g蛋白质的比活性。

我们进行了3H2EB-CoA形成的时间过程。这两种酶都显示出典型的饱和曲线(图8)。24小时之后，我们观察到Erg10_F293D和Erg10_F293A分别有约3000nM和1800nM的最大产量(图8)。

实施例11：Erg10硫解酶变体的底物灵活性的表征

我们已经分析了Erg10变体在体外催化数种缩合反应的能力。如所述进行关于乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合反应的酶测定，但是用替代底物进行。

我们使用乙酰-CoA/丙酰-CoA和乙酰-CoA/己酰-CoA作为底物对进行交叉克莱森缩合反应。通过分别监测m/z为868.1或910.2的化合物的色谱图通过LC-MS来对反应进行分析。

乙酰-CoA/丙酰-CoA交叉克莱森缩合。

监测m/z为868.1的化合物的色谱图。在样品中检测到数个峰，其中两个(峰2和3)明显更强烈(与无酶对照相比，在具有Erg10_F293A的反应样品中高13倍和1.5倍；与无酶对照相比，在具有Erg10_F293D的反应样品中高122倍和5倍)(图9)。因此，这两个峰对应于由Erg10变体对底物的作用而产生的产物。

如在乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合的情况下，直链(3-羟基戊酰-CoA)和支链(3-羟基-2-甲基丁酰-CoA)缩合产物是可能的。峰2的保留时间不同于商业标准3-羟基戊酰-CoA(Sigma)的保留时间，这表明反应中产生的主要产物可能对应于支链缩合产物(3-羟基-2-甲基丁酰-CoA，峰2)，尽管也形成了直链缩合产物(3-羟基戊酰-CoA，峰3)(图9)。

乙酰-CoA/己酰-CoA交叉克莱森缩合

监测m/z为910.2的化合物的色谱图。在样品中检测到数个峰，与无酶对照相比，其中一个(保留时间12.5分钟)在反应样品中显著更强烈(与无酶对照相比，具有Erg10_F293D的反应样品高22倍)。因此，该峰对应于由Erg10变体对底物的作用而产生的产物(图10)。

直链(3-羟基辛酰-CoA)和支链(3-羟基-2-丁基丁酰-CoA)缩合产物是可能的，但由于缺乏商业标准，其身份不能被证实。

因此，乙酰-CoA/丙酰-CoA和乙酰-CoA/己酰-CoA交叉克莱森缩合反应的结果表明：

·Erg10_F293D变体在克莱森缩合的第二步中可接受广泛范围的脂酰-CoA作为底物。

·Erg10_F293D变体在克莱森缩合的第一步中对乙酰-CoA作为底物具有高度特异性。

·总之，这两个观察结果进一步支持Erg10_F293变体对合成支链缩合化合物的更高选择性。

实施例12：Erg10硫解酶变体的乙酰-CoA/乙酰-CoA缩合活性。

也用这些酶进行了野生型反应。Erg10_F293D和Erg10_F293A分别保留60％和30％的野生型酶的乙酰-CoA/乙酰-CoA缩合活性(图11)。

实施例13：在乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合测定中乙酰-CoA/丁酰-CoA比例对产物形成特征的影响。

测定不同比例的乙酰-CoA∶丁酰-CoA。我们评价了比例从1∶1至1∶10的乙酰-CoA∶丁酰-CoA。当提高丁酰-CoA浓度时，观察到3-羟基-2-乙基丁酰-CoA产物形成提高。相反，在相同反应条件下，3HB-CoA的产生显著降低(图12)。关于3HH-CoA，由于在所有情况下接近检出限的低浓度而没有观察到明显的趋势。

实施例14：BktB硫解酶(SEQ.ID NO.2)的单突变体和双突变体的分析

真氧产碱杆菌硫解酶(BktB，SEQ.ID.NO：2)能够缩合两个乙酰-CoA分子(产生乙酰乙酰-CoA)或一个乙酰-CoA和一个丁酰-CoA分子(产生3-酮己酰-CoA)。产生少量的3-酮-2-乙基丁酰-CoA。在PpFadB2存在下，这些化合物分别转化为3-羟基丁酰-CoA、3-羟基-2-乙基丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA。

构建了Leu89、Met290和Met379的单突变体、双突变体和三突变体。构建了七种蛋白质变体：BktB Leu89Ile、BktB Met290Ala、BktB Met290Asp、BktB Met379Val、BktBLeu89Ile Met290Ala、BktB Leu89Ile Met379Val、BktB Met290Ala Met379Val或BktBLeu89Ile Met290Ala Met379Val。如前面说明的，对所得蛋白质变体的乙酰-CoA和丁酰-CoA的混合物评估进行克莱森缩合活性的能力。

鉴定的反应产物是：3-羟基丁酰-CoA、3-羟基-2-乙基丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA。检测到3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的两种不同异构体，其在不同保留时间洗脱(图13)。

实施例15：AtoB硫解酶(SEQ.ID NO.3)的单突变体和三突变体的分析

大肠杆菌硫解酶(AtoB，SEQ.ID.NO：3)能够缩合两个乙酰-CoA分子(产生乙酰乙酰-CoA)或一个乙酰-CoA和一个丁酰-CoA分子(产生3-酮己酰-CoA)。在PpFadB2存在下，这些化合物分别转化为3-羟基丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA。

构建了Val87、Met289和Leu378的单突变体和三突变体。构建了三种蛋白质变体：AtoB Met289Ala、AtoB Met289Asp和AtoB Val87Ile Met289Ala Leu378Val(Var10)。如前面所说明的，对所得的蛋白质变体的乙酰-CoA和丁酰-CoA的混合物评估进行克莱森缩合活性的能力。

鉴定的反应产物是：3-羟基丁酰-CoA、3-羟基-2-乙基丁酰-CoA和3-羟基己酰-CoA。检测到在不同保留时间洗脱的3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的两种不同异构体(表4)。

表4.由AtoB硫解酶及其突变体催化的乙酰-CoA/丁酰-CoA缩合反应的产物(3-羟基丁酰-CoA、3-羟基-2-乙基丁酰-CoA和3-羟基-己酰-CoA)的浓度。以1∶1乙酰-CoA∶丁酰-CoA比例进行反应。

	3HB-CoA(μM)	3H2EB-CoA(nM)	3HHB-CoA(nM)
				AtoB	4.12	0	425
M289A	5.62	33.62	17.22
				M289D	12.51	2491.38	34.57
Var10	11.63	2166.47	30.92

实施例16.辅酶A硫酯的UPLC-MS分析。

在dH₂O中制备标准储备溶液。然后，在用100mM甲酸铵缓冲液稀释之后获得包含不同量各分析物的校准曲线样品。对于乙酰-CoA、丁酰-CoA和3-羟基丁酰-CoA的最终浓度为40、30、20、10、4、1、0.1mM，且对于3-羟基己酰-CoA和3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的终浓度为200、150、100、50、20、5、2、0.5μM。在校准曲线样品之前和之后也包括空白样品以控制不存在后续效应(carry-over effect)。

使用来自Waters(Milford，MA，USA)并配备有光电二极管阵列检测器(photodiodearray detector，PDA)的Acquity BEH C18柱(100×2.1mm，1.7μm)，在Acquity UPLC系统中进行色谱。梯度洗脱缓冲液是A(水和100mM的甲酸铵)和B(乙腈)。梯度法如下：在95％A下0至1分钟，1至14分钟至80％A，14至15分钟至10％A，在10％A下15至17分钟，17至17.5分钟至95％A，在95％A下17.5至20分钟。UV检测器波长设定为254nm，且注射体积为10μL。总运行时间为20分钟，且流量设置为300μLmin-1。

使用来自Waters(Milford，MA，USA)的以正/V模式工作的具有电喷雾电离源的飞行时间质谱仪(ESI-TOF)LCT Premier XE进行质谱检测。获得的MS范围为m/z 100-1000。毛细管电压和锥电压(cone voltage)分别设定在3000和100V。对于其他参数，脱溶剂气体温度为220℃，并且源温度为120℃。脱溶剂气流设定为600L·h^-1，锥气流(cone gas flow)设定为50L·h^-1。

使用Masslynx v4.1软件分析色谱图和谱(Waters，Milford，MA，USA)。所有分析物都通过质谱鉴定(表5)。通过ESI-TOF MS进行3-羟基己酰-CoA和3-羟基-2-乙基丁酰-CoA的定量。另一方面，为了避免信号饱和，通过在254nm处的UV吸光度进行乙酰-CoA、丁酰-CoA和3-羟基丁酰-CoA的定量。

表5.分析物、保留时间、加合物和检出的离子。

Claims

1.突变硫解酶，其能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物的缩合形成式(I)化合物，

2.根据权利要求1所述的硫解酶，其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的多肽中的所述标识的序列具有至少35％的同一性，其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的多肽中的所述标识的序列具有至少50％的同一性，和/或其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的多肽中的所述标识的序列具有至少25％的同一性。

3.根据权利要求2所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Phe293处，

4.根据权利要求3所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的所述至少一个突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu。

5.根据权利要求3所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：2的多肽，其中在位置Met290处的所述至少一个突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu。

6.根据权利要求5所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：2的多肽，其中在位置Met290处的所述至少一个突变选自Met290Asp和Met290Ala。

7.根据权利要求3所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：3的多肽，其中位于位置Met289处的至少一个突变选自Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu。

8.根据权利要求7所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：3的多肽，其中位于位置Met289处的至少一个突变选自Met289Asp和Met289Ala。

9.根据权利要求3所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：4的多肽，其中位于位置Met294处的所述至少一个突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的硫解酶，其还包含在选自对应于SEQ ID NO：1的多肽中的第90和383位的残基的位置处的至少一个另外的突变。

11.根据权利要求10所述的硫解酶，其中所述至少一个另外的突变选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽中位于位置Val90和/或Ile383处的突变；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽中位于位置Leu89和/或Met379处的突变；

(iii)SEQ ID NO：3的多肽中位于位置Val87和/或Leu378处的突变；以及

(iv)SEQ ID NO：4的多肽中位于位置Leu88和/或Met385处的突变。

12.根据权利要求11所述的硫解酶，其中：

(i)SEQ D NO：1的多肽中位于位置Val90处的突变是V90I突变和/或位于位置I383处的突变是I383V突变，

(ii)SEQ ID NO：2的多肽中位于位置Leu89处的突变是L89I突变和/或在位置Met379处的突变是M379V突变，

(iii)SEQ ID NO：3的多肽中位于位置Val87处的突变是V87I突变和/或在位置Leu378处的突变是L378V突变，并且

(iv)SEQ ID NO：4的多肽中位于位置Leu88处的突变是L88I突变和/或在位置Met385处的突变是M385V突变。

13.根据权利要求12所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶选自：

(i)包含V90I和F293A突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(ii)包含V90I和F293D突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iii)包含F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(iv)包含F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(v)包含V90I、F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，以及

(vi)包含V90I、F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽。

14.根据权利要求12所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶选自

(i)包含L89I和M290A突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(ii)包含L89I和M290D突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iii)包含M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iv)包含M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(v)包含L89I、M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，以及

(vi)包含L89I、M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽。

15.根据权利要求12所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶选自

(i)包含V87I、M289A和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽，以及

(ii)包含V87I、M289D和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽。

16.根据权利要求12所述的硫解酶，其中所述突变硫解酶选自

(i)包含L88I、M294A和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽，

(ii)包含L88I、M294D和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的硫解酶，其中R₁是乙基和/或R₂是甲基。

18.核酸，其编码根据权利要求1至17中任一项所述的硫解酶。

19.载体，其包含根据权利要求18所述的核酸。

20.宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的核酸或根据权利要求19所述的载体。

21.用于产生式(I)化合物的方法，其包括在能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物的缩合形成式(I)化合物的突变硫解酶的存在下使式(II)化合物与式(III)化合物接触

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述突变硫解酶显示出与选自SEQ ID NO：1、2、3或4的硫解酶至少75％的序列同一性。

23.根据权利要求21或22中任一项的方法，其中所述硫解酶不是由序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8组成的硫解酶。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00098的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少35％的同一性，其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00737的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少50％的同一性，和/或其中所述硫解酶中对应于在Prosite数据库中具有登录号PS00099的硫解酶标识的序列与对应于SEQ ID NO：1的硫解酶中的所述标识的序列具有至少25％的同一性。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述突变硫解酶选自：

(ii)SEQ ID NO：2的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met290处；

(iii)SEQ ID NO：3的多肽，其中所述至少一个突变位于位置Met289处；以及

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：1的多肽，其中位于位置Phe293处的所述至少一个突变选自Phe293Asp、Phe293Ala、Phe293Ser、Phe293Gly和Phe293Glu。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：2的多肽，其中在位置Met290处的所述至少一个突变选自Met290Asp、Met290Ala、Met290Ser、Met290Gly和Met290Glu。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：2的多肽，其中在位置Met290处的所述至少一个突变选自Met290Asp和Met290Ala。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：3的多肽，其中位于位置Met289处的至少一个突变选自Met289Asp、Met289Ala、Met289Ser、Met289Gly和Met289Glu。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：3的多肽，其中位于位置Met289处的至少一个突变选自Met289Asp和Met289Ala。

31.根据权利要求25所述的方法，其中所述突变硫解酶是SEQ ID NO：4的多肽，其中位于位置Met294处的所述至少一个突变选自Met294Asp、Met294Ala、Met294Ser、Met294Gly和Met294Glu。

32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述硫解酶还包含在选自对应于SEQ ID NO：1的多肽中的第90和383位的残基的位置处的至少一个另外的突变。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少一个另外的突变选自：

(i)SEQ ID NO：1的多肽中位于位置Val90和/或Ile383处的突变；

(ii)SEQ ID NO：2的多肽中位于位置Leu89和/或Met379处的突变；

(iv)SEQ ID NO：4的多肽中位于位置Leu88和/或Met385处的突变。

34.根据权利要求33所述的方法，其中

(i)SEQ ID NO：1的多肽中位于位置Val90处的突变是V90I突变和/或位于位置I383处的突变是I383V突变，

35.根据权利要求34所述的方法，其中突变硫解酶选自：

(vii)包含V90I和F293A突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(viii)包含V90I和F293D突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(ix)包含F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(x)包含F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，

(xi)包含V90I、F293D和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽，以及

(xii)包含V90I、F293A和I383V突变的SEQ ID NO：1的多肽。

36.根据权利要求34所述的方法，其中突变硫解酶选自

(i)包含L89I和M290A突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(ii)包含L89I和M290D突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iii)包含M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(iv)包含M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，

(v)包含L89I、M290A和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽，以及

(vi)包含L89I、M290D和M379V突变的SEQ ID NO：2的多肽。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述突变硫解酶选自

(i)包含V87I、M289D的SEQ ID NO：3的多肽，以及

(ii)L378V突变或包含V87I、M289A和L378V突变的SEQ ID NO：3的多肽。

38.根据权利要求34所述的方法，其中突变硫解酶选自

(i)包含L88I、M294A和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽，

(ii)包含L88I、M294D和M385V突变的SEQ ID NO：4的多肽。

39.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中R₁是乙基。

40.根据权利要求21至39中任一项所述的方法，其中R₂是甲基。

41.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其还包括使式(I)化合物与能够催化由式(I)化合物形成式(IV)化合物的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触，

其中R₁、R₂和S-CoA如权利要求1中所限定。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽由SEQID NO：6的序列组成。

43.用于产生式(IV)化合物的方法，其包括使式(I)化合物与能够催化由式(I)化合物形成式(IV)化合物的具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽接触，

其中R₁、R₂和S-CoA如权利要求1中所限定。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述具有β-酮脂酰-CoA还原酶活性的多肽由SEQID NO：6的序列组成。

45.根据权利要求43或44中任一项的方法，其中R₁是乙基。

46.根据权利要求43至45中任一项的方法，其中R₂是甲基。