CN108699522B - 血管细胞外基质水凝胶 - Google Patents

Abstract

本文提供了由血管组织制备ECM凝胶的方法。本文还提供了由血管组织制备的ECM组合物，以及这些组合物的使用方法，例如用于治疗动脉瘤，以及用于血管生成或血管再生。

Description

血管细胞外基质水凝胶

关于联邦资助的说明

本发明是在国立卫生研究院授予的批准号HL127214和HL109132的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年1月13日递交的美国临时专利申请第62/278,065号的权益，其整体通过引用并入本文。

本文提供了制备血管ECM材料如凝胶的方法、血管ECM材料以及该血管ECM材料的使用方法，例如用于治疗动脉瘤和用于血管形成或血管再生。

升主动脉的自由破裂或剥离是在全世界范围内每年多达250万患者中发生的引人关注的临床问题。这样的主动脉病变通常是致命的，可以在毫无征兆的情况下发生，而唯一的治疗选择是紧急的主动脉置换。主动脉壁的生物力学减弱通常是由胸主动脉瘤(TAA)的形成引起的。TAA涉及血管中间基质退变，但动脉瘤形成的诱发机制尚基本上未知。此外，目前还没有已知的对策使主动脉壁缺损的组织再生。血管滋养管的重塑、外膜中的微血管网络以及血管生成信号靶标的表达降低与TAA相关。

细胞外基质(ECM)生物支架是具有内在生物活性和天然结构特征的组织特异性生物材料。这些性质使他们适合作为用于细胞机制生物发现的三维体外细胞培养基底或作为疾病模型。某些脱细胞组织在多种应用中显示出治疗性组织再生的前景。脱细胞天然组织的发展导致了组织工程支架的产生，该支架保留基底膜蛋白如IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白以提高细胞的黏附性并激活影响细胞分化和再生潜力的信号传导。灭菌后ECM生物支架内的生长因子保持它们的生物活性形式，这些生长因子包括转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。此外，ECM生物支架的降解释放激活生物活性的隐窝防御肽(matricryptic peptide)。ECM生物支架通过生长因子的保留和独特的基质依从性来指导干细胞分化，这两者共同构成有利于再生的组织特异性微环境。

发明内容

因此本文提供了由溶解的脉管系统衍生的细胞外基质(ECM)组合物制备水凝胶的方法，该组合物可用作体外细胞培养基底或心血管应用中的组织修复的体内生物材料。血管的细胞外基质(ECM)为包括细胞表型的维持、分化、干细胞的自我更新在内的组织特异性细胞行为提供必要的信号传导并调节整体组织稳态和功能。本发明涉及一种方法，其中来自血管(例如，在一个方面为猪或人的主动脉外膜)的脱细胞ECM被配制成水凝胶并且可以用作体外细胞培养和体内组织再生的基底。

本文所述的组合物和方法解决了生物材料不足以促进血管生成的问题。在一个方面，本文提供了主动脉壁及其相关的微脉管系统中用于生物学发现的天然生物基底。本文所提供的组合物和方法的益处在于，其比研究市场上的现有产品(例如Matrigel)更能呈现天然的生理机能。所述组合物和方法有助于提供发现生物学的研究产品和作为治疗心血管疾病的治疗性生物材料的临床转化潜力。

本文提供的组合物和方法利用血管的细胞外基质(ECM)作为水凝胶的初始材料，并且在一方面，不包含合成的聚合物组分或细胞。独特的优势在于，其可从猪、羊、牛来源获得。如下所述，血管ECM如主动脉外膜组织需要独特的来源和配制方法以产生水凝胶。

附图说明

图1提供了实施例1的外膜ECM(AdvECM)凝胶制剂的弹性蛋白和I型胶原蛋白的蛋白质印迹分析照片。

图2：人内皮细胞的增殖。在存在或不存在50μg/mL、100μg/mL和250μg/mL猪外膜ECM消化物的情况下培养细胞12小时。使用基于MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)的测定法来测定细胞增殖。*表示与仅在基础培养基条件下培养的细胞(0μg/mL pAdvECM)相比具有显著性，p<0.05。

图3：微血管重塑或管腔直径和血管壁厚度的病理性增加与人主动脉中的动脉瘤相关。胸主动脉瘤(TAA，B)与非动脉瘤(NA，A、C)中的管腔直径增加的组织学证据和壁厚度增加(D-F)的组织学证据。比例尺为100μm。

图4：主动脉ECM。A)脱细胞猪主动脉。B)主动脉横截面，显示完整弹性层(C，自发荧光，绿色)中细胞核(DAPI，蓝色)的完全去除。D)冻干粉末ECM。E)显示纤维状微结构的10mg/mL外膜水凝胶膜的扫描电子显微照片，比例尺为1μm。F)ECM凝胶光密度(O.D.)随时间的变化。G)猪和人血管ECM的凝胶化速率与其他ECM(猪小肠黏膜下层(SIS))相当。曲线将O.D.读数表示成凝胶形成随时间的度量并归一化。

图5：人内皮细胞的增殖。在存在或不存在5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和250μg/mL pAdvECM的情况下培养细胞18小时。使用基于MTT的测定法来测定细胞增殖。*表示与仅在基础培养基条件下培养的细胞(0μg/mL pAdvECM)相比具有显著性，p<0.02。所示结果表示2种不同批次pAdvECM的3次独立实验。

图6：内皮细胞的迁移。A)相较于基础生长培养基中培养的未处理细胞，在pAdvECM存在下培养的受损细胞单层在18小时内显示出增加的伤口闭合。B)图(A)中的曲线下面积(AUC)。

图7：内皮细胞的体外分支化。将人内皮细胞(12.5×10⁴)接种在掺入pAdvECM的生长因子减少的Matrigel基底上并培养最长18小时。仅在Matrigel中培养的细胞形成长度相对短的管状结构(A)，而掺入pAdvECM的Matrigel则增加了管状结构的长度(B，D)。在经pAdvECM处理的和未处理的Matrigel基底上培养的细胞中，管状结构数目没有变化。*p<0.03，n＝3。

图8：如实施例4所述的两种本文所述水凝胶材料沉积方法的照片和显微照片。

图9：pAdvECM生物支架的制备和表征。A)作为冻干研磨粉末的pAdvECM生物支架。B)pH中和的胃蛋白酶消化的pAdvECM生物支架在37℃下1小时后形成水凝胶。C)使用含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳定性分析来自1.2mg总组织重量的DNA提取物。相较于天然主动脉组织，pAdvECM生物支架和SIS组显示出DNA含量明显降低。

图10：猪和人外膜ECM水凝胶的扫描电子显微镜检查。将脱细胞组织和ECM水凝胶固定在2.5％戊二醛中并进行处理用于扫描电子显微镜检查。显示5000X(A，C，E)和10000X(B，D，F)放大倍数下的脱细胞人外膜(Adv)(A-B)、人外膜水凝胶(C-D)、猪外膜水凝胶(E-F)和猪小肠黏膜下层(SIS)水凝胶(G-H)的代表性显微照片。所有比例尺为1μm。

图11：ECM水凝胶的浊度法凝胶化动力学。使用405nm下的光密度(O.D.)读数在37℃下监测pH中和的ECM消化物的凝胶化90分钟。A)猪外膜(Adv)(4mg/mL、8mg/mL和16mg/mL)。B)猪SIS(8mg/mL)、人Adv(16mg/mL)和猪Adv(16mg/mL)的归一化的浊度法凝胶化动力学。

图12：FGF2介导的ECM对原代内皮细胞增殖的刺激。在10μg/mL的猪外膜(pAdv，实心柱)或猪小肠黏膜下层(pSIS，灰色柱)ECM存在下培养原代人外膜衍生的内皮细胞。基础培养基中的细胞、单独加入FGF2抑制剂(在DMSO中的100nM PD173074于)的细胞或等体积DMSO和消化缓冲液(在0.01N HCl中的1mg/mL胃蛋白酶)中的细胞作为对照(空心柱)。在暴露于上述条件下72小时后，使用商业测定法进行MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑]转化的定量，结果表示为未处理细胞的百分比变化。显示了三个独立实验的一个代表性实验。柱表示四次重复测定的平均值±标准偏差。*表示相较于未处理条件p<0.05，**表示p<0.02，以及#表示p<0.005。

图13A至图13C：ECM生物支架对体外管状结构网络形成的影响。图13A，在生长因子减少的Matrigel基底上培养人外膜衍生的内皮细胞：(A)DMSO，0.05％(v/v)，(B)消化缓冲液(在0.1N HCl中的1％(w/v)胃蛋白酶)，(C)pAdv ECM，以及(D)pSIS ECM。向经上述处理的细胞培养基中加入FGF2抑制剂PD173074(100nM)，在平行孔(E-H)中示出。A-H:显示了一个代表性的10X视野，其选自两个独立实验的三个重复中的一个。(A-H)的所有比例尺为50μm。在不存在和存在PD173074的情况下，针对无ECM补充的基底(空心柱)、补充有pAdv的基底(实心柱)和补充有pSIS的基底(灰色柱)，对在10X下捕捉的5×5拼接视野中管状结构的数量(图13B)和总长度(图13C)进行定量。柱表示三次重复测定的平均值±标准偏差。图像和图表表示来自两个独立实验中的一个的数据。*表示与胃蛋白酶HCL相比具有显著性，p<0.02；#表示与不存在PD173074情况下的经pAdv ECM处理的细胞相比具有显著性，p<0.03。

图14A至图14D：ECM生物支架对体内血管生成的影响。图14A)支架在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上孵育之前(时间0)和之后(72小时)的代表性明场图像。通过沿支架周边的辐轮图案揭示了含pSIS ECM和pAdv ECM的纤维蛋白支架(250μg/mL)的促血管生成反应。在载有消化缓冲液(在0.1N HCl中的1％(w/v)胃蛋白酶)或DMSO的支架周围没有检测到明显的血管生成反应。FGF2抑制剂PD173074(100nM)的加入消除了对pAdv ECM的血管生成反应。仅添加抑制剂载体(DMSO)不改变对pAdvECM的血管生成反应。图14A的所有比例尺为5mm。图14B)CAM测定支架的代表性组织学横截面。使用注射的番茄凝集素

650(红色)使CAM脉管系统可视化，并用Hoechst染料(蓝色)标记细胞核。白色虚线表示支架/CAM间界面。仅载有消化缓冲液的支架没有表现出血管侵袭。pSIS ECM(250/mL)刺激新的脉管系统(由箭头表示)向支架侵袭，如同pAdv ECM在浓度为50-250μg/mL下以剂量依赖方式进行刺激一样。pAdv ECM的最大测试剂量(500μg/mL)抑制血管向支架的侵袭。图14C)加入DMSO不改变pAdv ECM诱导的血管侵袭并且FGF2抑制剂PD173074阻断了载有pAdv ECM的支架的作用。图14B和图14C中所有比例尺为500μm。*表示包含凝集素阴性细胞的无血管区。图14D)代表性的组织学横截面，显示了无血管区(*)中凝集素阴性细胞的趋化作用，其相邻于载有pAdvECM的纤维蛋白支架(250μg/mL)中的侵袭性凝集素阳性细胞(箭头)(i)，并且抑制载有500μg/ml pAdv ECM的纤维蛋白支架中凝集素阳性细胞的侵袭(ii)。(*)表示包含凝集素阴性细胞的无血管区。图14D的所有比例尺为20μm。

图15：基于蛋白质阵列的血管生成相关蛋白谱。使用Human AngiogenesisProteome Profiler Array，一式两份评估冻干的ECM生物支架(300μg总蛋白)的55种血管生成相关蛋白的存在。图16提供了密度测定值。猪和人ECM印迹的图像分别反映了20分钟和10分钟的曝光时间。虚线框为阳性对照参考点。点线框为阴性对照参考点。

图16A和图16B：血管生成相关蛋白质阵列。分析了来自正常(n＝7名合并患者)和动脉瘤(n＝28名合并患者)的人主动脉脱细胞外膜、猪外膜和猪SIS的55种血管生成相关蛋白。数值代表曝光5分钟(人ECM)或14分钟(猪ECM)后检测到的化学发光的两次重复测定的平均像素密度±标准偏差(S.D.)。*表示相较于猪外膜p<0.05，#表示相较于正常人主动脉外膜样本p<0.05。

图17：支架在CAM上孵育前(时间0)和孵育后(72小时)的代表性明场图像。通过纤维蛋白支架周围血管的辐轮外观显示血管生成反应，该支架载有所有剂量的pAdv ECM(50μg/mL、100μg/mL和500μg/mL)。所有比例尺为5mm。

图18：照片(A)和显微照片(B)显示了实施例7中描述的结果。(A)显示了载有pAdvECM的纤维蛋白栓激发血管生成反应。(B)显示了代表性H&E染色的石蜡包埋切片，其揭示了相较于载有缓冲液的支架，载有pSIS ECM和pAdv ECM的纤维蛋白支架(由星号表示)中具有更多的细胞浸润，如实施例7所述。对于(B)，左图的比例尺为500μm，右图的比例尺为50μm。

具体实施方式

除非另有明确说明，否则在本申请中指定的各种范围内使用的数值表示为近似值，如同所述范围内的最大值和最小值都加以前缀“约”。以这种方式，在所述范围上下的微小浮动可以用于实现与上述范围内的数值基本相同的结果。而且，除非另有说明，否则这些范围的公开旨在作为包括最大值和最小值之间的每一个值的连续范围。对于本文提供的定义，这些定义是指这些词或短语的词形、同源词和语法变体。如本文所用，要素前没有数量词修饰是指“一个或多于一个”。

如本文所用，术语“患者”或“对象”指动物界成员，包括但不限于人类，“哺乳动物”指所有哺乳动物，包括但不限于人类。

如本文所用，伤口或缺陷的“治疗”或“处理”是指通过组合物、装置或结构的任何合适的给药方案、程序和/或给药途径施用于患者，以实现期望的临床/医疗最终目的，包括吸引祖细胞、治愈伤口、纠正缺陷等。

如本文所用，术语“包含”、“包括”或“含有”及其变体是开放式的且不排除未确定的其他元素的存在。于此相反，术语“由…组成”及其变体意为封闭式的并且排除了除痕量之外任何其他形式的元素。

如本文所用，术语“细胞外基质”和“ECM”指用于细胞生长的天然支架。ECM是结构性和非结构性生物分子的复杂混合物，包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、抗微生物剂、化学引诱物、细胞因子和生长因子。在哺乳动物中，ECM通常包含约90％的各种形式的胶原蛋白。ECM的组成和结构根据组织来源而改变。例如，小肠黏膜下层(SIS)、膀胱基质(UBM)、肝基质ECM和真皮ECM各自的总体结构和组成由于每个组织所需要的独特细胞巢(niche)而不同。

本文所述的ECM材料保持其结构性和非结构性生物分子的至少一部分的活性，包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、抗微生物剂、化学引诱物、细胞因子和/或生长因子，例如但不限于如以下实例中所述的外膜ECM产物。可以通过化学或机械方法，例如，通过交联和/或透析ECM而除去ECM内生物分子的活性。在一个方面，本文所述的ECM材料基本上未经交联和/或透析，如本文所述，这意味着ECM未经受透析和/或交联过程或除脱细胞化过程或在溶解之前作为ECM储存和处理的一部分而发生的过程以外的条件。因此，在一个方面，ECM材料不以除不重要方式之外的任何方式交联和/或透析，该不重要方式基本上不影响ECM材料在本文所述用途中的凝胶化和功能特征。

在使用前，ECM通过组织脱细胞化和/或组织失活来制备。在一个方面，进行脱细胞化以防止促炎性反应。因此，在一个方面，脱细胞或失活的ECM产物是指被脱细胞化至一定程度的ECM材料，即促炎性反应和由此导致的纤维化组织的生长不会被激发至有利于构建性重塑的任何实质性程度。

“生物相容性”是指装置、支架、组合物等本质上、实际上(用于其预期用途)和/或基本上对将会接触到装置、支架、组合物等的细胞、组织、器官和/或器官系统无毒、无损伤或无抑制。

如本文所用，术语“衍生”及其任何其他词形或同源词，例如但不限于“衍生的”、“衍生自”，是指通过任何有用的方法从任何所述来源获得的一种或多种组分。例如但不限于，ECM衍生的凝胶一般是指由通过本领域已知的用于分离ECM的任何数量的方法从任何组织获得的ECM组分构成的凝胶。在另一个实例中，哺乳动物组织衍生的ECM是指由通过任何有用的方法从哺乳动物获得的特定哺乳动物组织的组分构成的ECM。

本文所述方法涉及ECM或ECM凝胶的制备。ECM凝胶是逆向凝胶化的，或者可以说表现出逆向热凝胶化，因为它在温度升高时形成凝胶。当温度在逆向凝胶中升高到某一温度以上时，形成水凝胶。聚合物的逆向凝胶化的一般概念和例如其与最低临界共溶温度(LCST)的关系在化学领域是众所周知的。例如，如下文所述，本文所述的ECM组合物由脱细胞或失活的完整ECM制备。ECM凝胶通过以下步骤制备：用酸性蛋白酶消化ECM材料，中和该材料以形成预凝胶，然后将预凝胶的温度升高到凝胶化温度例如预凝胶的LCST以上，以使预凝胶变为凝胶。如本文所用，术语“凝胶”包括水凝胶。酸性蛋白酶消化的从溶液到凝胶的转变温度通常在10℃至40℃的范围内和其间的任何增量或范围内，例如20℃至35℃。例如，可以将预凝胶升温至37℃以形成水凝胶。

可以以任何有用的方式收获用于制备如本文所述的ECM、ECM衍生的预凝胶溶液和凝胶的组织。根据各个方面，本文所述的ECM材料由血管外膜如动脉外膜或主动脉外膜制备。例如但不限于，在一个方面，ECM材料由收获的猪主动脉制备，在另一方面，由人主动脉制备。从收获的组织剥离外膜并任选地冷冻。主动脉组织通过任何合适的方法获得，例如通过手动与周围组织分离而获得。在一个方面，主动脉组织不是从动脉瘤组织获得的。

脱细胞或失活的ECM可以是干燥的、冻干的(冷冻干燥的)或风干的。在某一时刻，例如在ECM凝胶制备中的酸性蛋白酶消化之前，例如在干燥之前或之后任选地将ECM组合物粉碎。还可以通过一些方法将粉碎的ECM进一步加工成粉末形式，这些方法例如但不限于，在冷冻或冷冻干燥状态下研磨或碾磨。如本文所用，术语“粉碎”及其任何其他词形或同源词是指将较大颗粒如干燥的ECM减小成较小颗粒的过程，包括但不限于撕裂、研磨、混合、切碎、切片、碾磨、切割、剪切和磨碎。任何形式的ECM可以被粉碎，包括但不限于水合形式、冷冻、风干、冻干、粉末、片状形式。

为了制备溶解的ECM组织，在酸性溶液中用酸性蛋白酶消化ECM，例如粉碎的ECM，以形成消化溶液。如本文所用，术语“酸性蛋白酶”是指切割肽键的酶，其中该酶在酸性pH下具有增加的切割肽键的活性。例如但不限于，酸性蛋白酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶及其混合物。

例如，将ECM的消化溶液在室温下保持恒定搅拌一定量的时间。在一个方面，在如本文所述的脱细胞主动脉外膜组织的酸性蛋白酶消化期间，将pH值维持在低于pH4.0或pH2.0±0.3。ECM消化物可以立即使用，或者也可以保存在-20℃下或冷冻在例如但不限于-20℃或-80℃下。在某些方面，ECM消化物在液氮中快速冷冻。为了形成“预凝胶”溶液，将消化溶液的pH提高至6.8至7.8。可以通过添加一种或多于一种碱性或等渗缓冲溶液，例如但不限于pH7.4的NaOH或PBS来提高pH。该方法任选地不包括凝胶化之前的透析步骤，从而产生更完整的ECM样基质，该基质在37℃下的凝胶化通常比可比的胶原蛋白或透析的ECM制备更慢。由于许多天然可溶因子，例如但不限于细胞因子的保留，所述凝胶因此保留了更多的天然ECM的性质。这些因子有助于细胞的趋化作用和损伤部位组织的适当重排，而不是有助于导致不希望的瘢痕形成的纤维化反应。在其他实施方案中，ECM在凝胶化之前被透析以除去某些可溶性组分。

如本文所用，术语“等渗缓冲溶液”是指被缓冲至pH为6.8至7.8，例如pH7.4，并且具有平衡的盐浓度以促进等渗环境的溶液。如本文所用，术语“碱”是指pH大于7的任何化合物或化合物的溶液。例如但不限于，碱是碱性氢氧化物或碱性氢氧化物的水溶液。在某些实施方案中，碱是NaOH或在PBS中的NaOH。在PH升高的时刻，该“预凝胶”溶液可以在适当温暖的温度，例如但不限于，在约37℃下被孵育成凝胶。

在制备ECM凝胶的方法中，可以用酸性蛋白酶如胃蛋白酶部分或完全消化ECM。然后将消化的ECM中和至pH 6.8-7.8，例如7.2-7.6或7.4，该中和且消化的ECM材料通过在使材料凝胶化的温度下孵育，例如在20℃、25℃、30℃或35℃以上如37°的温度下孵育而被凝胶化。消化程度可以通过对凝胶进行比较，或通过确定透明质酸的降解程度，例如通过众所周知的蛋白质印迹法(抗透明质酸抗体可以从多种来源商购获得)或层析法来确定。例如在部分消化中，透明质酸被消化少于50％、40％、30％、25％、20％或10％。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种ECM组合物，其包含pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织。在一个方面，失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织未经透析或化学交联，这意味着在将完整组织处理成失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织期间的任何阶段没有通过如在某些失活的ECM材料生产中所常见的添加化学交联剂来透析或交联所述材料。

主动脉外膜ECM组合物的独特特征描述如下。在一个方面，主动脉外膜ECM凝胶相较于对比ECM凝胶是更多孔的。例如，在图10中示出了主动脉外膜ECM凝胶(组C至F)相较于通过可比方法制备的SIS ECM凝胶(组G和H)具有增加的纤维长度和线性。图15和图16示出了主动脉外膜ECM凝胶组合物与类似制备的SIS ECM凝胶组合物相比的独特组成，其中FGF-1和FGF-2的量显著降低(降低至少50％)，HB-EGF的量增加(肝素结合EGF样生长因子，3％)，且各种其他蛋白质的量减少，例如(pAdv:pSIS的比率)：血管生成素2，0.95；内皮抑素，0.96；IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)，0.9；PTX3(Pentraxin 3)，0.91；催乳素，0.96；丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5，0.87；和TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)，0.92。

在一个方面，该组合物是无细胞的，这意味着该组合物不包含活细胞，并因此是无菌的，并且对该组合物任选地进行灭菌或消毒。该组合物可以在最终进行灭菌，例如通过例如但不限于暴露于环氧乙烷(EtO)气体、γ辐射或电子束辐射以进行灭菌，并且在一个方面，当处于干燥或冻干状态时进行灭菌(参见例如WO2015/143310，其关于对ECM凝胶进行最终灭菌的方法的技术公开通过引用并入本文)。如本文所述，通常用过乙酸对组合物进行消毒。

在使用中，ECM凝胶可以注射、喷涂、涂抹、倾倒或以其他方式应用于组织表面，例如任何血管，即整个血管网络，例如但不限于：患者的腹主动脉或降主动脉；升主动脉；主动脉弓；髂动脉或静脉，如常见的内部或外部的髂动脉或静脉；颈动脉；颈静脉；锁骨下动脉或静脉；头臂动脉或静脉(头臂干动脉或头臂干静脉)；下腔静脉；上腔静脉；和/或外周血管。根据产品的最终用途，组合物可以以各种方式应用或施用，例如干燥物如冻干粉、溶液、凝胶、泡沫等。

所述组合物可以单独施用，或与装置或组合物一起施用。例如，所述组合物可以吸附到细胞生长支架之中、之上，混合到细胞生长支架中或以其他方式与细胞生长支架共同施用，该细胞生长支架例如为合成聚合物和/或天然聚合物的各向同性或各向异性的纤维团，例如电沉积、湿法或干法纺纱、3D印刷、模塑或以其他方式形成的由再生医学领域中广为人知的生物相容性聚合物材料制备的聚合结构，该生物相容性聚合物材料例如为胶原蛋白、聚酯(PE)、聚氨酯(PU)、聚酯型氨酯脲(PEUU)、聚醚酯氨酯脲(PEEUU)、聚酯碳酸酯氨酯脲(PECUU)和聚碳酸酯氨酯脲(PCUU)共聚物，以及其他合适的聚合物材料，例如但不限于在美国专利第8,535,719号、第8,673,295号、第8,889,791号、第8,974,542号和第9,023,972号中所公开的聚合物材料。

用于本文所述组合物中的有用的聚合物组合物的其他非限制性实例包括：聚烯烃、聚碳酸酯、聚酐、聚醚、聚脲、聚氨酯、聚酮和含氟聚合物。在一个方面，聚合物组合物是可生物侵蚀的。生物相容性的、可生物侵蚀的、弹性的(共)聚合物组合物的非限制性实例包括PEUU、PEEUU、PECUU和PCUU。其他有用的(共)聚合物包括但不限于：包含α-羟基酸单体的聚合物；聚交酯，例如聚(丙交酯-co-乙交酯)、聚(L-丙交酯-co-己内酯)、聚乙醇酸、聚(DL-丙交酯-co-乙交酯)、聚(L-丙交酯-co-DL-丙交酯)；其他聚酯，包括聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚对二氧环己酮和polyglactin；聚内酯，包括聚己内酯；聚葡糖酸酯、聚(乙交酯-co-三亚甲基碳酸酯)、聚(乙交酯-co-三亚甲基碳酸酯-co-对二氧环己酮)。

本文所述的组合物还可在聚合纤维沉积或结构形成之前或与之一起混合到聚合组合物中。或者，在ECM产物未形成凝胶的情况下，ECM凝胶和/或合成聚合物可以吸附到ECM产物之中、之上或以其他方式与ECM产物组合。在一个方面，如本文所述的组合物应用于ECM材料并从ECM材料递送，例如任何商业ECM材料，例如本文所述的那些。

同样地，本文所述的组合物可以通过任何合适的方法应用于或掺入非织造材料，例如绷带、缝合线、植入物，例如陶瓷植入物、金属植入物或聚合植入物，例如假体、人造血管或以其他方式改进的血管、瓣膜、人工晶状体、组织移植物或植入物。

如本文所用，术语“涂覆”和相关的同源词是指包括用本文所述的组合物覆盖有机的、无机的或活的结构或其组合的过程。例如但不限于，用ECM衍生的凝胶涂覆无机结构的方法可以包括如倾倒、嵌入、分层、浸渍、喷涂的方法。超声波处理可用于帮助用ECM衍生的凝胶涂覆无机结构。如本文所用，术语“超声波处理”是指通常以高于15kHz且低于400kHz的频率暴露于超声波的过程。有机结构包括天然的聚合物组合物，包括失活组织、蛋白质组合物如胶原蛋白，以及包括合成的聚合物组合物，如上述的PEUU、PEEUU、PCUU和PECUU。活组织可以是任何活组织，无论其是否位于患者内的原位或是否剥离。例如，本文所述的组合物和材料可以(原位)应用于现有的血管，例如患者腹部或胸腔内原位的降主动脉。在一个方面，在进行旁路移植手术中用以恢复血液流通的再植入之前，用所述的组合物，例如浸泡的，喷涂的和/或包裹的组合物处理活体的剥离的血管。在一个实例中，旁路移植手术是心脏旁路手术且所述组合物应用于例如但不限于静脉，例如隐静脉。

在另一方面，所述组合物与其他组合物组合以形成复合结构。其他组合物可以是另一种生物相容性聚合物组合物，其中本文所述外膜ECM凝胶含有另一种生物相容性聚合物的颗粒，或者外膜ECM凝胶均匀地或非均匀地(例如，作为微粒或纳米颗粒)分散在其它聚合物中。在一个方面，另一种生物相容性聚合物是纤维蛋白栓，其具有分散于各处的所述外膜ECM的凝胶颗粒。在另一个方面，另一种生物相容性聚合物是其中均匀地或非均匀地混合了所述外膜ECM凝胶的不同的ECM凝胶。其他生物相容性颗粒包括天然聚合物组合物，例如但不限于纤维蛋白或如上所述的合成聚合物。

在另一方面，组合物涂覆于生物相容性结构材料上，例如金属，无机钙化合物如氢氧化钙、磷酸钙或碳酸钙，或陶瓷组合物。合适金属的非限制性实例是钴铬合金、不锈钢合金、钛合金、钽合金、钛-钽合金，其可以包括非金属和金属组分，例如钼、钽、铌、锆、铁、锰、铬、钴、镍、铝和镧，包括但不限于，各种等级的CP Ti(工业纯钛)、或Ti 6Al 4V(90重量％Ti，6重量％Al和4重量％V)、不锈钢316、镍钛诺(镍钛合金)、涂覆有羟基磷灰石的钛合金。金属因其高强度、柔韧性和生物相容性而有用。金属也可以形成复杂的形状且许多金属可以抵抗生物环境中的腐蚀，减少磨损，并且不会损伤组织。在一个非限制性实例中，金属作为用于髋部修复的股骨或髋臼部件。在另一个实例中，金属是用于将假体永久附接到患者的纤维或其他隆凸。包括陶瓷、钙化合物，例如但不限于霰石的其他组合物可以是优选的，例如但不限于，在骨骼或牙齿结构的修复或重塑中。金属、陶瓷和/或其他材料的组合也可以证明是有用的。例如，髋关节置换的金属股骨部件可以包括陶瓷球和/或可以包括球表面上的塑料涂覆层，髋臼部件也可如此。

在某些方面，所述组合物用于在患者体内释放一种或多于一种治疗剂和/或掺入了一种或多于一种治疗剂。例如，在至少一种治疗剂被植入患者中或以其他方式施用于患者之前，将其添加到本文所述的组合物中，例如，在所述聚电解质对组合时加入治疗剂。通常，治疗剂包括可以涂覆、嵌入、吸附、或以其他方式附着或掺入本文所述的组合物或材料之中或之上或掺入到将会对患者提供治疗益处的药物产品中的任何物质。这些治疗剂的非限制性实例包括抗微生物剂、生长因子、润肤剂、类视黄醇和外用类固醇。每种治疗剂可以单独使用或与其他治疗剂组合使用。例如但不限于，包含神经营养剂或表达神经营养剂的细胞的组合物可以应用于靠近中枢神经系统的关键区域如脊柱的伤口。

在某些非限制性方面，治疗剂是生长因子，例如神经营养因子或血管生成因子，其任选地可以使用重组技术制备。生长因子的非限制性实例包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、基质衍生因子1α(SDF-1α)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5、多效生长因子(神经突生长促进因子1)、中期因子蛋白(神经突生长促进因子2)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白细胞介素-8(IL-8)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素和干扰素。包括神经营养因子和血管生成因子在内的各种生长因子的商业制剂可从获自：R&D Systems,Minneapolis,Minnesota；Biovision,Inc,Mountain View,California；ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,Rehovot,Israel；和Cell

Canton,Massachusetts。

在某些非限制性方面，治疗剂是抗微生物剂，例如但不限于，异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氯法齐明、利福布汀、氟喹诺酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、强力霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、喷他脒、阿托伐醌、巴龙霉素、diclazaril、阿昔洛韦、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、依他康唑、咪康唑、吡啶硫酮锌和银盐如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐。

在某些非限制性方面，治疗剂是抗炎剂，例如但不限于非甾体抗炎药(NSAID)，例如水杨酸、吲哚美辛、吲哚美辛钠三水合物、水杨酰胺、萘普生、秋水仙碱、非诺洛芬、舒林酸、二氟尼柳、双氯芬酸、吲哚布洛芬、水杨酰胺钠；抗炎细胞因子；抗炎蛋白；甾体抗炎药；或抗凝血剂，例如肝素。还可包括可以促进伤口愈合和/或组织再生的其他药物。

在某些非限制性实施方案中，将细胞添加到组合物中。有用细胞的非限制性实例包括：干细胞、祖细胞和分化细胞；重组细胞；肌肉细胞及其前体；神经细胞及其前体；间充质祖细胞或干细胞；骨细胞或其前体，如骨祖细胞、前脂肪细胞等。

任何有用的细胞因子、化学引诱物、药物或细胞可以混合到本文所述的任何组合物中，与本文所述的任何组合物混合、共同施用或以其他方式组合。例如但不限于，有用的组分包括生长因子、干扰素、白细胞介素、趋化因子、单核因子、激素、血管生成因子、药物和抗生素。细胞可以混合到组合物中，或者可以包含在与组合物组合的基底如生物支架之上或之内。在任一种情况下，当细胞接种于基底时，细胞可以生长和/或适应通过在生物反应器或培养箱中以适合的培养基孵育一段适合的时间以最佳地/有利地制备用于植入患者的组合物所产生的巢。细胞可以接种于基底以促进细胞的向内生长、分化和/或适应。例如但不限于，细胞相对于患者可以是自体的或同种异体的，以接受包含凝胶的组合物/装置。细胞可以是干细胞或其他祖细胞、或分化的细胞。

如本文所用，术语“药物”是指具有预防或治疗作用的任何组合物，包括但不限于抗生素、多肽、激素、有机分子、维生素、补充剂、因子、蛋白质和化学引诱物。

如本文所用，术语“细胞”是指来自任何动物的任何类型的细胞，例如但不限于大鼠、小鼠、猴和人的细胞。例如但不限于，细胞可以是祖细胞如干细胞，或分化的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞。在某些实施方案中，用于医疗程序的细胞可以获自该患者用于自体程序或者获自其他供体用于同种异体程序。

在另一方面，提供了包含本文所述组合物的商业试剂盒。试剂盒包括适合的包装材料和组合物。在一个非限制性实施方案中，试剂盒包括在容器中的液体的、凝胶的或干燥的ECM，该ECM可以是包装材料，或者可以包含在包装材料内。容器可以是小瓶、注射器、管或适于在试剂盒的商业流通途径中用于存储和转移的任何其他容器。同样地，可以适当地包装产品，例如装置、凝胶、支架、缝合线、假体、网状物、泡沫等，以用于商业流通，该产品包括本文所述的可溶性或结构性组合物中的一种或两种。

根据本发明的一个方面，提供了一种产生主动脉ECM的方法。该方法使用两性离子洗涤剂，例如CHAPS或甜菜碱(任何具有正电荷和负电荷的中性化合物)，并且包括作为一类的洗涤剂/表面活性剂，例如1-十二烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙磺酸盐；3-(N,N-二甲基烷基铵)丙磺酸盐，其中烷基通常是直链的脂肪族烃，例如直链C_6-22饱和烃；3-(1-吡啶基)-1-丙磺酸盐；表面活性素肽和其他，如可广泛地从商业来源获得，例如从Sigma-Aldrich获得的洗涤剂/表面活性剂。阴离子洗涤剂是任何有用的洗涤剂，其包含负电荷，例如但不限于烷基苯磺酸盐、胆汁酸如脱氧胆酸和有机硫酸盐如SDS。胰蛋白酶-EDTA的替代物是已知的，并且可商购获得的其他用于细胞分离和组织解离的酶，例如胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、XIV型蛋白酶可以单独或任选地与例如来自Sigma-Aldrich的胰蛋白酶(例如，

)以及任选地与除EDTA外的螯合剂组合以达到相同效果。

作为第一步，获得新鲜的主动脉组织并去除脂肪和结缔组织。使用任何方法，例如如下所述地通过使用镊子或剪刀、或通过任何自动化机械过程，将外膜层与中间层剥离以得到主动脉外膜。然后将主动脉外膜冷冻和解冻。接下来，将材料在两性离子洗涤剂中孵育并进行常规洗涤。通常使用PBS和/或水或其他溶剂进行洗涤，例如醇是合适的。然后在胰蛋白酶-EDTA或等效物中孵育该材料以解离细胞和组织，通常随后进行洗涤。接下来，在阴离子洗涤剂中孵育该材料，通常随后进行洗涤。随后对材料进行消毒，例如通过用过乙酸处理，然后洗涤。然后将材料干燥，例如通过冻干，并将其粉碎。在其干燥状态下，任选地对材料进行灭菌。将干燥的粉碎的材料在酸中再水化，该酸例如为HCl，pH<4.0，pH 1至4，例如pH1至2，例如2.0±0.3，并用酸性蛋白酶如胃蛋白酶消化，从而保持溶液的pH在蛋白酶的活性范围内，例如，pH<4.0，pH 1至4，pH 1至2，例如2.0±0.3。消化可以是部分的或完全的。部分消化可以通过缩短酸性蛋白酶消化时间、在反应中使用较低量的酸性蛋白酶、和/或通过在高于酸性蛋白酶的最佳pH下进行消化来实现。完全消化通常在酸性蛋白酶的最佳pH下实现，例如pH为2.5或更低，例如2.0±0.3。为了形成凝胶，将酸性溶液中和至例如pH为6.8至7.8，以形成预凝胶溶液，并将该溶液在较高温度下孵育，如室温(20℃至25℃)或37℃(例如，20°至50℃、30°至45℃、35°至42℃、或37℃±5℃、37℃±4℃、37℃±3℃、37℃±2℃或37℃±1℃)以形成凝胶。在胶凝化之前、期间或之后，可以将预凝胶溶液喷涂、涂覆、混合、分层、倾倒、注射或以其他方式沉积在基底之上或之中，例如聚合物、陶瓷、金属、组织(离体或体内)、不同的失活组织产品(例如SIS ECM片、非织造材料、缝合线或任何其他医学上有用的材料)。在一个方面，酸性蛋白酶消化是不完全的，但足以产生凝胶，从而在所得凝胶内留下未消化的ECM材料的小颗粒，这些小颗粒将在组合物的使用期间被原位消化，从而导致其治疗性组合物的延迟释放。

根据另一方面，提供了一种治疗患者动脉瘤的方法，包括向具有动脉瘤的血管表面施用pH为6.8至7.8、例如根据本文所述方法制备的失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织，例如主动脉外膜组织。在一个方面，血管是患者的降主动脉、腹主动脉或升主动脉或主动脉弓。

根据另一方面，提供了在患者中诱导血管形成或血管再生的方法。该方法包括向体内或离体(例如，在移植的情况下)的活组织施用酸性蛋白酶消化的血管外膜，例如根据本文提供的任何方面或实施方案的主动脉外膜ECM预凝胶或凝胶组合物，从而导致该活组织的血管形成，例如血管再生。在一个方面，组织是患者的伤口，例如皮肤伤口，例如但不限于糖尿病性溃疡，例如糖尿病足溃疡。在另一方面，组织是骨组织，例如受损的骨组织或表现出骨质疏松症的骨组织。在另一方面，组织是患者的心肌和/或其脉管系统，例如患者心肌中的伤口或梗塞。

实施例

升主动脉的自由破裂或剥离是在全世界范围内每年多达250万患者中发生的引人关注的临床问题。这样的主动脉病变通常是致命的，可以在毫无征兆的情况下发生，而唯一的治疗选择是紧急的主动脉置换。通过以主动脉衍生的细胞外基质水凝胶作为有主动脉破裂风险患者的预防性和微创性治疗选择，提供了该问题的解决方案。这一目标得到了积极假设驱动的研究的支持，该研究定义了在人类主动脉疾病的情况下导致内皮功能障碍的机制，以及基质驱动的信号传导如何通过外膜(主动脉壁外层)中的局部祖细胞影响血管生成。这种新认识推动了再生医学方法的发展，以引起主动脉壁本身的重塑，从而通过相关微血管网络的再生从外向内基本上修复主动脉。

实施例1-外膜水凝胶的制备

为了研究外膜细胞外基质(ECM)对营养血管功能的影响，由脱细胞的人和猪主动脉外膜开发出水凝胶。从商业来源获得猪主动脉样本，而人主动脉则在开放主动脉置换手术期间经IRB批准并获得患者同意时收获。将外膜与中间层剥离，并在两性离子洗涤剂(8mMCHAPS，1M NaCl和25mM EDTA)中于37℃孵育24小时，然后在PBS中洗涤，接着在去离子水中洗涤2小时。然后将外膜浸入阴离子洗涤剂(0.5％SDS，1M NaCl和25mM EDTA)中24小时，在去离子水中浸泡2小时，然后冷冻干燥，暴露于70％乙醇并用去离子水和PBS漂洗至ECM再水化。通过石蜡包埋切片中无DAPI染色来确认主动脉组织的完全脱细胞化。在冷冻干燥和研磨后，将ECM粉末在0.01N HCL和胃蛋白酶中消化24小时。蛋白质印迹分析显示，ECM消化物含有弹性蛋白和I型胶原蛋白(参见图1)。水凝胶膜由中和的ECM消化物形成。凝胶化动力学分析表明，在37℃干热培养箱中孵育90分钟内达到峰值凝胶化。扫描电子显微镜显示，水凝胶膜表现出天然的ECM纤维状微结构。主动脉ECM水凝胶可用作细胞培养基底，以研究动脉瘤环境下基质衍生的微血管功能障碍机制。这项工作的临床转化是主动脉ECM水凝胶可能作为心血管应用中组织再生的天然生物材料而发挥作用。

如上所述，将猪主动脉外膜脱细胞化并消化。将人内皮细胞(P16)以5×10³个细胞/cm²的密度接种，并在0-250μg/mL猪外膜ECM消化物(pAdvECM)存在下以37℃在湿润的培养箱中培养12小时。根据制造商的说明书使用MTT转化测定法(Cell Titer，Promega)测定细胞的增殖。如图2所示，与仅在基础生长培养基(内皮生长培养基，Cell Applications)中培养的内皮细胞相比，50μg/mL pAdvECM消化物增加了人内皮细胞的增殖(p<0.05)。然而，更高剂量的pAdvECM消化物(250μg/mL)降低了细胞的增殖(p<0.05)。较高剂量的ECM消化物引起的显著的细胞增殖减少可能与培养基的酸性pH有关，这可以通过添加含酚红的培养基的显著颜色变化来证明(数据未显示)。这些数据提供了初步证据证明，脱细胞的pAdvECM消化物表现出促有丝分裂的生物活性并且可以引起内皮细胞增殖，这是血管生成的必要机制。

实施例2-主动脉中的微血管重塑与胸主动脉疾病相关

研究揭示了升胸主动脉中与动脉瘤相关的微血管重塑。注意到动脉瘤主动脉样本中微血管的缺乏伴随着现有血管腔面积的增加和血管壁增厚(图3)。此外，人主动脉外膜是祖细胞巢的所在地，包括内皮细胞和周细胞祖细胞，也就是微脉管网络的前体。这一新认识激发了以再生医学方法作为有主动脉破裂风险患者的微创治疗策略，其通过利用局部祖细胞用于治疗性微血管再生。提出了本文所述的脱细胞的主动脉细胞外基质(ECM)用作治疗性微血管再生的刺激物。

本文所述的血管ECM水凝胶在方法和组合物中都是独特的(图4)。在哺乳动物血管ECM脱细胞化后(图4(A-C))，冻干且粉碎的ECM的消化(图4(D))基本上不同于Freytes,D.O.等人((2008),“Preparation and rheological characterization of a gel form ofthe porcine urinary bladder matrix.”Biomaterials 29(11):1630-1637)的方法，该方法中密切监测并严格控制pH为2.0±0.3。来自猪和人主动脉的细胞友好型ECM已针对水凝胶形成进行了优化，其纤维微结构类似于天然ECM(图4(E))。初步实验表明，血管ECM水凝胶在37℃的干热培养箱中孵育90分钟内达到峰值凝胶化(图4(F))，其中猪和人主动脉ECM的凝胶化速率与猪下肠黏膜下层(SIS)(图4(G))和膀胱基质(Freytes等人，2008)相似。

实施例3-血管ECM生物活性的评估

证明血管衍生的细胞外基质(ECM)的治疗潜力涉及评估其作为1)细胞增殖2)细胞迁移和3)内皮细胞分支化的调节剂的生物活性。进行了一系列实验以证明上述三种功能。

外膜衍生的ECM是促有丝分裂的。如上所述将猪主动脉外膜脱细胞化并消化以获得细胞外基质(pAdvECM)。将人内皮细胞(P16-18)以5×10³个细胞/cm²的密度接种，并在0-25μg/mL猪外膜ECM消化物(pAdvECM)存在下以37℃在湿润的培养箱中培养2-18小时。根据制造商的说明书使用MTT转化测定法(Cell Titer，Promega)测定细胞的增殖。根据图5中显示的数据，与仅在基础生长培养基(内皮生长培养基，Cell Applications)中培养的内皮细胞相比，5-10μg/mL pAdvECM消化物增加了人内皮细胞增殖(p<0.02)。这些数据提供了初步证据证明，脱细胞的pAdvECM消化物表现出促有丝分裂的生物活性，并且可以引起内皮细胞增殖，这是血管生成的重要机制。

外膜衍生的ECM刺激内皮细胞迁移。使用体外伤口愈合或“划痕试验”测定法评估pAdvECM消化物对内皮细胞迁移的影响。简而言之，在汇合的人内皮细胞的单层培养物中使用P20移液管尖端制造划痕“伤口”，然后在存在或不存在25μg/mL pAdvECM的情况下培养至18小时。将细胞放置在可置于载物台上的孵育室(stage-top incubation chamber)内并保持在37℃、5％CO₂和潮湿的环境下。每10分钟在倒置TE-2000显微镜(Nikon)上使用相差光学显微镜获取图像。通过使用图像分析软件(NIS Elements 4.2，Nikon)创建二元阈值，根据图像计算随时间的伤口闭合百分比。我们从图6中显示的数据得出结论，与基础培养基中的细胞(阴性对照)相比，用pAdvECM处理内皮细胞增加了细胞迁移的速率，该结论通过增加的伤口闭合百分比得以证明。

外膜衍生的ECM增强内皮细胞分支化。在体外评估pAdvECM对内皮细胞分支化的影响。简而言之，将0μg/mL、250μg/mL、500μg/mL或1000μg/mL的pAdvECM与生长因子减少的Matrigel^TM(Corning)组合，并用来涂覆48孔组织培养板中孔的表面。使pAdvECM/Matrigel混合物(150μL)在37℃下固化1小时，然后以12.5×10⁴个细胞/孔接种于内皮生长培养基中。我们从图7中显示的数据得出结论，与单独的Matrigel相比，pAdvECM增强了Matrigel基底上的内皮细胞分支化(p<0.03)。虽然在用pAdvECM处理的情况下管状结构的数量没有变化，但它们的长度相较于单独在Matrigel基底上培养的未处理细胞有所增加。

实施例4-临床转化

将使用该喷涂装置在小型(小鼠：皮下血管生成)和大型(兔和猪：动脉瘤)动物的临床前模型中测试水凝胶的治疗功效。可以将水凝胶雾化以进行微创递送。可以将ECM水凝胶喷涂或涂抹到基于聚氨酯的管状支架上。发现喷涂的ECM水凝胶分散在管状支架壁内，或者通过简单地将凝胶“涂抹”到管状支架的外表面上以作为外部护套，如同在有和没有偏振光的情况下使用天狼星红染色检测胶原蛋白一样进行检测(图8)。这项工作是该领域的一次垂直飞跃，通过向主动脉递送生物材料以利用能够进行治疗性血管生成的局部血管周围祖细胞，从而将焦点转移至微创治疗方法，以使用雾化生物水凝胶引发动脉瘤环境中的主动脉再生。

实施例5-主动脉ECM衍生的水凝胶制备

以下是用于制备主动脉ECM衍生的水凝胶的示例性和非限制性方案。

溶液。两性离子洗涤剂：5.895g CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)(8mM)；70.08g NaCl(1M)；8.76g EDTA(25mM)；和1200mL PBS。胰蛋白酶-EDTA：1.2g胰蛋白酶(0.1％)；0.456g EDTA(1x)；和1200mL PBS。阴离子洗涤剂：70.08g NaCl(1M)；8.76gEDTA(25mM)；6.228g SDS(18mM)；和1200mL PBS。过乙酸：7.98mL过乙酸原液(PAA，0.1％)；1152mL蒸馏水(dH2O，96％)；和48mL 100％乙醇(4％)。0.01N盐酸：50μL12N HCl原液；和9.95mL dH₂O。5N盐酸：4.167mL 12N HCl溶液；和5.833mL dH₂O。

步骤1：新鲜主动脉组织的清洁和外膜层的分离。使用钝钳和剪刀，从新鲜或冷冻的猪或人主动脉去除所有无关的脂肪和结缔组织。用dH2O偶尔对组织进行保湿以使组织不会变干。使用钝钳将外膜层与主动脉样本的中间层剥离以产生主动脉外膜片。将剥离的主动脉外膜切成约2.5×2.5英寸的方块以进行脱细胞化。从新鲜主动脉的新鲜(未脱细胞的)切片的中间和角落取1个方块，将两个方块快速冷冻；1个用于组织学分析，另1个用于将来的研究。为了测量主动脉外膜方块的总湿重，轻轻地擦干组织并在精确天平上称重。以下方案是针对约30g的外膜片方块(湿重)进行的优化。新鲜分离的组织必须在-80℃下冷冻至少过夜并在处理前解冻。

步骤2：脱细胞化。将外膜组织置于1L烧瓶中并填充以800mL去离子水。将含有外膜的1L烧瓶置于定轨摇床上并以300rpm运行30分钟。去除去离子水并更换新鲜的去离子水(800mL用于外膜)。重复三次(总共漂洗4次，摇床上持续2小时)。当组织在摇床上时开始制备两性离子洗涤剂。在组织摇动完成前30分钟，将两性离子洗涤剂置于37℃水浴中(确保溶液处于适当温度下以进行下一步骤)。完成摇动后取出并弃去离子水。将每种组织类型转移到独立的1L烧瓶中。向含外膜的烧瓶填充400mL温热的两性离子洗涤剂(每约30g组织400mL)。将烧瓶置于37℃摇动水浴中。将烧瓶在振动浴中放置12小时。在水浴中12小时后更换两性离子洗涤剂。更换时遵循与初始两性离子洗涤剂制备相同的步骤。更换两性离子洗涤剂后，在温热的水浴中更换烧瓶，再孵育12小时(总共24小时的两性离子孵育)。孵育完成前30分钟，使2400mL 1X PBS达到37℃。孵育完成后，从摇动水浴中取出烧瓶并适当地弃去两性离子洗涤剂。用37℃的1X PBS在振动水浴中漂洗组织15分钟(400mL用于外膜)。更换1XPBS并在振动水浴中再漂洗15分钟(总共30分钟)。将组织在蒸馏dH₂O中4℃下储存过夜。将组织转移至装有400mL dH₂O的干净烧瓶中。使用定轨摇床(300rpm)摇动组织1小时。更换dH₂O并再摇动一小时(总共2小时)。在dH₂O摇动结束前30分钟，制备胰蛋白酶-EDTA溶液并使其达到37℃。清空并弃去用过的dH₂O。替换为400mL胰蛋白酶-EDTA溶液。将组织在摇动水浴中以37℃孵育30分钟。用第二批溶液替换胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37℃摇动水浴中再孵育30分钟(总共1小时)。处理掉胰蛋白酶-EDTA溶液。清洁或使用新的1L烧瓶。将组织转移到新的烧瓶中。向烧瓶填充400mL dH₂O。在定轨摇床上以300rpm摇动烧瓶1小时。更换dH₂O并再摇动一小时(总共2小时)。在dH₂O漂洗完成前30分钟，开始制备阴离子洗涤剂。温热阴离子洗涤剂至37℃。弃去用过的dH₂O并更换400mL阴离子洗涤剂。将烧瓶置于37℃摇动水浴中12小时。重复进行阴离子洗涤剂孵育。妥善处理阴离子洗涤剂。清洁或获得新的1L烧瓶。向烧瓶填充400mL 1X PBS。在定轨摇床上以300rpm摇动组织和PBS溶液15分钟。弃去用过的PBS。重复PBS洗涤。将组织在蒸馏dH₂O中4℃下储存过夜。将组织转移至装有400mL dH₂O的干净烧瓶中。使用定轨摇床(300rpm)摇动组织7小时。更换dH₂O并再摇动7小时(总共14小时)。清空dH₂O并用制备好的过乙酸溶液(400mL)填充烧瓶。在定轨摇床上以300rpm摇动烧瓶2小时。妥善处理过乙酸。清洁或获得新的1L烧瓶。向烧瓶填充1X PBS(400mL)。在定轨摇床(300rpm)上摇动组织15分钟。弃去用过的PBS并用dH₂O(400mL)填充烧瓶。在定轨摇床上以300rpm摇动组织和dH₂O 15分钟。更换dH₂O并再摇动15分钟(总共30分钟)。弃去dH₂O并填充以PBS(400mL)。57.在定轨摇床上以300rpm摇动15分钟。在铝箔上展开样品。从3个完整脱细胞方形切片的中间和角落取两个0.5×0.5cm²的切片，用于质量控制以确认脱细胞化。对于每个脱细胞方形样品，快速冷冻1个切片用于组织切片，另1个储存在微量离心管中用于将来分析。用铝箔包裹样品并卷起边缘。在-80℃下冷冻过夜。将冷冻样品转移至冷冻干燥器，并开始抽真空。处理2天后检查样品：完全冻干的样品会变脆，几乎没有弹性。如果经过2天的处理没有变“脆”，则再冻干一天并在24小时后进行跟踪检查，以查看是否获得“脆”组织。一旦观察到组织变脆，通过将方块打碎成0.5-0.75×0.5-0.75cm²的块来制备脱细胞化的、冻干的、脆性样品以促进组织研磨。

步骤3：冻干外膜的研磨。组装具有60目筛的研磨机，以收集精细研磨的外膜粉末。将脱细胞化的、冻干的外膜块逐渐加入到研磨机上的料斗中，并用木钉推动组织通过。一旦所有组织被研磨，收集粉末并于室温下储存在带标签的气密密封容器中。

步骤4：外膜粉末的消化。使用精密天平称出0.5g冻干的研磨的外膜粉末。使用精密天平称出100mg胃蛋白酶(Sigma)。加入45μL 5N HCl。使用酸性pH试纸确认得到的pH为2，并与pH为2的红色色度相匹配。将胃蛋白酶缓慢加入搅拌的pH为2的0.01N HCl溶液中。5.一旦胃蛋白酶溶解在0.01HCl中，逐渐将所有外膜粉末加入搅拌的胃蛋白酶-HCl溶液中。在所有外膜粉末加入溶液后，记下消化的开始时间。在消化开始时检查并确认pH为2。继续以900RPM搅拌1.5小时。消化1.5小时后，在仍然以900RPM搅拌的同时检查“消化物”的pH。如果pH在2至3之间，则加入120μL的5N HCl。通过在pH试纸上匹配pH 2的颜色来确认pH值调节至2。继续每30分钟检查溶液的pH，持续1.5小时，如果观察到pH在2至3之间，则向溶液中加入20μL 5N HCl。继续以900RPM搅拌15小时。15小时后，将消化物的搅拌增加至1100RPM以抵消增加的黏度。确认pH仍然为2。继续搅拌24小时消化周期的剩余6小时。消化24小时后，将RPM降至200RPM搅拌10分钟以使泡沫从消化物上升到溶液表面。在200RPM下10分钟后，将ECM消化物以500μL等分样品储存在-20℃下或转移至冰上并以如下制备水凝胶。

步骤5：水凝胶的形成。在冰上保持或解冻先前冷冻的ECM消化物。将所有试剂保持在冰上：10X PBS、0.1N NaOH、1N NaOH、1N HCl。按以下顺序混合：1份10X PBS、1份0.1NNaOH和8份ECM消化物。旋涡混合。检查pH并调节至6.8至7.8。将水凝胶加入至组织培养孔、盖玻片或模具中，并在37℃干热培养箱中孵育60至90分钟，在潮湿的37℃培养箱中孵育过夜或在室温下孵育达到8小时。

实施例6-血管周围细胞外基质水凝胶模拟天然基质微结构并通过碱性成纤维细胞生长因子促进血管生成

已显示细胞外基质(ECM)衍生的生物支架通过保留生物活性信号引发组织修复。鉴于大血管的外膜是丰富血管化的微环境，我们假设血管周围ECM包含影响血管谱系细胞的生物活性信号。ECM生物支架衍生自脱细胞的人和猪主动脉外膜(分别为hAdv和pAdv)并进而显示具有最小的DNA含量且保留弹性蛋白和胶原蛋白。hAdv和pAdv ECM生物支架的水凝胶制剂显示出与衍生自猪小肠黏膜下层(pSIS)的ECM水凝胶类似的凝胶化动力学。hAdv和pAdv ECM水凝胶显示出更薄的、更少波动的和纤维状的微结构，使人想起天然外膜，并且与pSIS ECM水凝胶相比，可见的超微结构略有差异。胃蛋白酶消化的pAdv和pSIS ECM生物支架增加了人外膜衍生的内皮细胞的增殖并且这种作用部分地由碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)介导。当补充以pAdv ECM生物支架时，在Matrigel基底上培养的人内皮细胞形成更多和更长的管状结构，并且FGF2介导这种基质信号传导。衍生自pAdv的ECM生物支架在鸡胚绒毛尿囊膜模型中促进FGF2依赖的体内血管生成。使用专注血管生成的蛋白质阵列，我们检测了55种血管生成相关蛋白，包括hAdv ECM、pAdv ECM和pSIS ECM中的FGF2。有趣的是，与非动脉瘤(正常)样本相比，这些因子中的19种在衍生自人主动脉动脉瘤样本的ECM生物支架中富集的更少。该研究揭示，Adv ECM水凝胶重现天然外膜的基质纤维微结构，并保留血管生成相关因子和生物活性特性，例如能够影响血管生成重要过程的FGF2信号传导。这项工作支持Adv ECM生物支架用于发现生物学和向临床应用中微血管再生的临床转化。

ECM生物支架引发血管生成的潜能对再生医学应用特别重要。虽然ECM生物支架的血管生成和血管发生机制尚不完全清楚，但ECM降解过程中生长因子的逐渐释放是一种可能的作用机制。由于驻留细胞分泌的固定化生长因子强化ECM，因此血管ECM是用于引发血管生成和血管发生的可行的候选生物材料。血管外膜是在形式和功能上都异质的血管周围微环境。由于ECM的纤维蛋白编织网络的性质，外膜不仅为血管提供了大部分生物力学强度，而且还充当祖细胞巢。此外，血管外膜中细胞组成的多样性使得该ECM微环境成为实现对血管细胞群的多种期望的生物活性效应的主要候选者。了解外膜ECM在血管生理学中的作用将提供对心血管疾病的深刻见解，特别是通过探索衍生自人外膜的ECM生物支架。可以使用更易于获得的猪外膜ECM(pAdv)生物支架，以利用其内在的生物活性来开发潜在的再生疗法。

该研究检验了血管周围ECM包含影响血管谱系细胞的生物活性信号的假设。对由人和猪脱细胞主动脉外膜制成的ECM水凝胶生物材料的组成和凝胶化动力学进行表征，并利用原代外膜衍生的人内皮细胞培养模型、管形成体外分析和体内血管生成模型评估了血管生成相关过程中的猪ECM生物支架的信号传导活性。选择猪小肠黏膜下层(pSIS)作为对照ECM，因为其先前进行了全面表征并且目前被用作临床相关的生物支架。以下研究结果揭示了血管周围ECM的几种仿生特征，这些特征可能使这些天然生物材料可用于发现生物学并为再生医学应用带来希望。

材料和方法

组织收集。在升主动脉置换手术或心脏移植期间，在获得患者同意和机构审查委员会批准的情况下或通过Center for Organ Recovery and Education从器官捐献者收集人升胸主动脉样本(n＝40例患者)。所有人样本的采集符合1983年修订的1975年赫尔辛基宣言。切除后，将组织样本置于冰上的盐水中并运送至实验室。样本从年龄为17至82岁的22名男性和18名女性中收集。从商业来源(Tissue Source，Lafayette，IN)获得猪升主动脉样本并在湿冰上运输。从当地屠宰场(Thoma Meat Market，Saxonburg，PA)获得猪SIS样本并如前所述进行制备。在实验室中采集后，所有样本立即储存在-80℃直至使用。

主动脉外膜的脱细胞化。由来自39名患者和2头猪的脱细胞主动脉组织样本制备外膜ECM生物支架。使用先前建立的方法(Reing JE等人，The effects of processingmethods upon mechanical and biologic properties of porcine dermalextracellular matrix scaffolds,Biomaterials,2010；31:8626-33)将外膜层与血管中层剥离，并脱细胞化。简而言之，将外膜样本在8mM CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)、1M NaCl(Thermo FisherScientific)和25mM EDTA(乙二胺四乙酸，Thermo Fisher Scientific)的溶液中在37℃下孵育24小时，随后在1x PBS(磷酸盐缓冲盐水，Thermo Fisher Scientific)中洗涤，然后在去离子水(dH₂O)中洗涤。然后将组织置于含有0.1％胰蛋白酶(Amresco，LLC，Solon，OH)和0.04％EDTA的溶液中并在摇床上放置1小时，在dH₂O中漂洗，然后在0.5％SDS(十二烷基硫酸钠，Thermo Fisher Scientific)、1M NaCl和25mM EDTA的溶液中摇动24小时，然后在1xPBS和dH₂O中洗涤。然后将组织置于0.1％过乙酸(Rochester Midland Corporation，Rochester，NY)和4％乙醇的溶液中并放置在摇床上，然后用1x PBS和dH₂O漂洗，然后在-80℃下冷冻过夜并冷冻干燥。将来自人和猪主动脉的脱细胞主动脉外膜(此处指hAdv和pAdvECM生物支架)冷冻干燥并精细研磨以产生ECM生物支架粉末用于进一步的酶消化。如先前他处所述制备SIS ECM生物支架(Badylak SF等人，Small Intestinal Submucosa as aLarge Diameter Vascular Graft in the Dog.Journal of Surgical Research.1989；47:74-80)。SIS的粉末化和胶凝化使用了与本报告中描述的相同步骤。

DNA含量的定性和定量评估。根据制造商的说明书，使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen，Germantown，MD)从25mg来自猪(2头猪，合并的)和人主动脉(4例患者样本，合并的)的粉末状Adv ECM生物支架定量残留DNA含量。最终洗脱体积为50μL Buffer AE。使用Qubit 2.0(Thermo Fisher Scientific)来定量每种提取物中dsDNA的浓度。将来自1.2mg干组织重量的粉末状ECM生物支架的DNA提取物和来自1.2mg湿组织重量的天然主动脉的提取物在含有0.003％(v/v)溴化乙锭(Sigma Life Science,St.Louis,MO)的1％琼脂糖(Thermo Fisher Scientific)凝胶中进行电泳，并在UV光下于Chemidoc XRS生物成像平台(Bio-Rad，Hercules，CA)上进行可视化观察。

粉末状ECM生物支架的消化。通过在室温下以1600RPM在含有来自猪胃黏膜的1mg/mL胃蛋白酶(约2000-2300U/mg，Sigma)的0.01N盐酸溶液(pH 2，Thermo FisherScientific)中搅拌24小时，将Adv和pSIS ECM生物支架粉末以20mg/mL的浓度消化。24小时后，ECM消化物立即用于凝胶化动力学测定或储存于-20℃以备将来使用。

胶原蛋白和弹性蛋白含量的检测。使用在0.5M乙酸中的0.1mg/mL胃蛋白酶于4℃过夜消化，从天然外膜和外膜衍生的ECM生物支架粉末中提取胃蛋白酶可溶性胶原蛋白。在分离和浓缩步骤之后，根据制造商的说明书，使用Sircol Soluble Collagen Assay(Biocolor Ltd，UK)，如前所述在每个样品中测定胃蛋白酶可溶性胶原蛋白的量(Phillippi JA等人，Mechanism of aortic medial matrix remodeling is distinct inpatients with bicuspid aortic valve.J Thorac Cardiovasc Surg.2014；147:1056-64)[38]。将在每种提取物中测定的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白的量相对于湿组织的重量或Adv ECM生物支架粉末的重量进行归一化。

根据制造商的方案，使用Fastin Elastin Assay(Biocolor)，如前所述(Phillippi JA等人,J Thorac Cardiovasc Surg.2014；147:1056-64)检测α-弹性蛋白的量。通过在0.25M草酸中于100℃下对天然动脉外膜和Adv ECM生物支架粉末进行三次连续的弹性蛋白提取，每次一小时，将不溶性弹性蛋白转化为水溶性α-弹性蛋白。将每种提取物中测定的α-弹性蛋白的量相对于湿组织的重量或Adv ECM粉末的重量进行归一化。

ECM生物支架水凝胶的形成。根据已建立的方法(Freytes DO等人，Preparationand rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladdermatrix.Biomaterials.2008；29:1630-7)从ECM生物支架消化物配制水凝胶，并且所有制备在冰上进行。简而言之，将消化物稀释至期望的最终浓度，并在10x PBS和0.1N NaOH(氢氧化钠，Thermo Fisher Scientific)的溶液中中和至pH为7.4±0.2。

水凝胶凝胶化动力学。如前所述(Freytes DO等人，2008；29:1630-7)检测猪和人Adv ECM生物支架衍生的水凝胶(4-16mg/mL)的浊度法水凝胶凝胶化动力学。使用分光光度计(TECAN，德国)，在405nm下每2分钟以一式三份获得来自100μL等分的中和ECM消化物的光密度读数，持续至2小时。通过以下等式确定归一化的吸光度(NA)：

其中'A'代表在特定时间点的吸光度读数，'A₀'代表初始吸光度，'A_最大'代表最大吸光度。测定的ECM凝胶化的其他指标包括：达到50％凝胶化所需的时间，定义为't_1/2'；滞后期't_滞后'，其通过归一化吸光度曲线的线性部分的外推来确定；以及凝胶化速度'S'，其以归一化吸光度曲线的生长区最大斜率计算。

水凝胶的形态学超微结构表征。在12mm圆形盖玻片(Thermo Fisher Scientific)上制备8mg/mL的hAdv、pAdv和pSIS ECM生物支架水凝胶，并在2.5％戊二醛(ElectronMicroscopy Sciences，Hatfield，PA)中固定1小时。将经固定的水凝胶在1x PBS中漂洗三次共15分钟，在四氧化锇中处理1小时，并在1x PBS中再漂洗三次共15分钟，然后在系列梯度乙醇中分别脱水15分钟(30％、50％、70％、90％、100％)。然后将脱水的样品用超临界CO₂(Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)进行临界点干燥，并在每次置换循环之前将处理过的水凝胶浸泡15分钟。在临界点干燥后，用金/钯(Cressington ScientificInstruments，Watford，England)将样品溅射涂覆至厚度为4.6nm。然后使用JSM 6335F扫描电子显微镜(Jeol USA，Inc.，Peabody，MA)以5000x和10000x总放大倍数检查hAdv、pAdv和pSIS ECM水凝胶的表面形态，并与脱细胞的天然人外膜的完整样本进行比较。

原代外膜衍生的人内皮细胞的分离和培养。从来自健康供体胸主动脉的人样本的外膜分离原代内皮细胞。在收获1-2小时之内在实验室进行样本采集后，立即将外膜与中间层剥离并在含1％(v/v)青霉素/链霉素和1％(v/v)的两性霉素B(Invitrogen)的冰冷1XPBS中漂洗两次。然后使用安全解剖刀将组织精细切碎并在1X PBS中漂洗。将组织和PBS置于70μm分子筛中。收集通过物并保持在37℃，同时在含有0.4％(w/v)IV型胶原酶(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)和350KU/mL DNA酶I(Sigma)的DMEM(Life Technologies)中于37℃、温和搅拌下消化剩余组织30分钟。使消化培养基和组织通过70μm筛，并在37℃温和搅拌下将组织返回到新鲜的消化培养基中再消化30分钟。在经由70μm筛的最终过滤并用1X PBS洗涤后，合并所有滤液并在4℃下以400g离心10分钟。使用内皮生长培养基(EGM，Cell Applications，San Diego，CA)将细胞铺在75cm²培养瓶中。加入庆大霉素(250μg/mL，Thermo Fisher Scientific)24至48小时。将细胞保持在37℃和5％CO₂的湿润培养室中并扩增1至2代。使用荧光激活细胞分选技术(FACS)从亲代培养物中分离原代内皮细胞。

对于基于FACS的内皮细胞分离，对扩增的外膜细胞进行沉淀(约1×10⁶至4×10⁶个细胞)，并在1μL纯净小鼠血清(Sigma)中在冰上孵育，避光，并用以下荧光染料缀合的单克隆小鼠抗人抗体进行标记(每种抗体2μL)：CD31-PE-Cy7(Biolegend，San Diego，CA，#303117)、CD45-APC-Cy7(BD Biosciences，San Jose，CA，#348805)、CD34-ECD(#BD2709U)和CD56-PE-Cy5(IM2654，均来自Beckman Coulter，Indianapolis，IN)。在分选之前将DAPI(200ng/mL)加入到未固定且未穿透的细胞悬浮液中以区分活细胞和死细胞/凋亡细胞。使用封闭在II级生物安全柜中的五激光MoFlo Astrios高速细胞分选仪(Beckman Coulter，University of Pittsburgh Cancer Institute Flow Cytometry Core Facility)中的三种激光分选细胞。基于成熟内皮细胞表面蛋白质组(CD56-/CD45-/CD34-/CD31+)，如前所述(Zimmerlin L等人，Stromal vascular progenitors in adult human adiposetissue.Cytometry A.2010；77:22-30)将细胞分选至含有庆大霉素和EGM的6孔板中，扩增1至2代且每两天补充培养基直至冷冻保存。

内皮细胞分支化的测定。通过用生长因子减少(GFR)的Matrigel(Corning)涂覆48孔培养板中的孔表面来制备细胞培养基底，该Matrigel在存在或不存在新鲜消化的pAdv或pSIS ECM生物支架(250μg/mL)的情况下制备。在湿润的37℃培养箱中凝胶化1小时。将原代人外膜衍生的内皮细胞在EGM中以1.5×10⁴个细胞/cm²的密度一式三份地接种于基于凝胶的基底上。在相邻孔中进行仅有消化缓冲液(在0.1N HCl中的1mg/ml胃蛋白酶)和仅有DMSO的对照。其中指出用100nM PD173074处理细胞。为了评估管状结构的内皮细胞分支化形成，使用配备有成像阵列CoolSNAP ES2单色相机和NIS Elements软件的Nikon EclipseTE2000-E显微镜(Nikon Inc.,Melville,NY)在细胞接种后7小时捕获大帧图像。使用NISElements软件对管状结构的总数和长度进行定量。

体内血管生成的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型。根据我们建立的方案修改CAM测定法(Smith JD等人，The use of quantum dots for analysis of chick CAMvasculature.Microvasc Res.2007；73:75-83和Smith JD等人，Improved growth factordirected vascularization into fibrin constructs through inclusion ofadditional extracellular molecules.Microvasc Res.2007；73:84-94)。白色来航鸡蛋购自当地农场并在37℃和70％湿度下孵育(G.Q.F.Manufacturing Co.,Savannah,GA)。在孵育的第3天，将鸡蛋破碎放至无菌培养皿中并孵育10天。用与先前描述类似的方法制备放置在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上的纤维蛋白支架(Smith JD等人，Improved growth factordirected vascularization into fibrin constructs through inclusion ofadditional extracellular molecules.Microvasc Res.2007；73:84-94；Smith JD等人，The use of quantum dots for analysis of chick CAM vasculature.MicrovascRes.2007；73:75-83；和Jadlowiec J等人，Endocrinology.2005；146:3765-72)。简而言之，将终浓度为5mg/mL的牛纤维蛋白原、1U/mL抑肽酶(均来自Enzyme Research Labs，SouthBend，IN)缓冲在pH 7.4的1X PBS中。将向纤维蛋白支架中添加消化缓冲液(在0.1N HCl中的1mg/mL胃蛋白酶)作为血管生成反应的阴性对照。在存在或不存在FGF2抑制剂PD173074(100nM，在DMSO中)或载体对照(0.05％(v/v)DMSO)的情况下，pAdv ECM生物支架在纤维蛋白凝胶中的最终浓度在50μg/mL至500μg/mL之间变化。混合支架组分并在37℃下孵育30分钟。加入人凝血酶(Enzyme Research laboratory，South Bend，IN)至1U/mL以启动纤维蛋白聚合，并在48孔板(Corning，NY)中于37℃孵育60分钟。将补充以测试材料的纤维蛋白支架置于CAM上并在37℃、70％湿度下孵育。

在CAM上孵育72小时后，使用安装在立体显微镜(AmScope，Irvine，CA)上的3MP彩色照相机以7.5X的放大倍数捕获由血管生成反应导致的支架和周围脉管系统的明场图像。通过微量注射的

650标记的番茄凝集素(Vector labs，Burlingame，CA)来标记鸡胚脉管系统的内皮细胞，并在剥离支架和周围CAM之前孵育15分钟。将收获的组织在10％中性缓冲的福尔马林(Sigma，St.Louis，MO)中固定48小时，在1X PBS中洗涤三次并在30％蔗糖溶液中冷冻保护72小时，然后处理以进行组织学评估。将支架切成两半，包埋在Tissue-Tek OCT(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)中，并使用Microm HM500OM低温恒冷切片机(Thermo Fisher Scientific)切割为60μm厚的切片。将切片用Hoechst33342溶液(Thermo Fisher Scientific)染色，并使用Zeiss LSM880共聚焦显微镜的10X物镜成像。进行瓦片扫描并使用ZEN Black显微镜和成像软件(Carl Zeiss Microscopy，Thornwood，NY)拼接图像。

蛋白质阵列。根据制造商的说明书，使用Protein Profiler^TM Array HumanAngiogenesis Kit(R&D Systems，Minneapolis，MN)分析来自正常(n＝7名患者)和动脉瘤(n＝28名患者)主动脉样本的脱细胞人外膜、猪外膜和SIS的血管生成相关蛋白的存在。简而言之，将冻干的ECM在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中重悬并使用杜恩斯匀浆器进行匀浆化。使用二喹啉甲酸测定法(Thermo Scientific)评估总蛋白质浓度并将300μg总蛋白质用作阵列的输入。使用ImageJ软件(National Institutes of Health，USA)根据每种蛋白质的重复点进行密度测量。

统计分析。所有实验重复至少两次。使用未配对双尾学生T检验在处理组和对照组之间进行定量测量的成对比较。结果部分中提供的定量数据代表平均值±标准偏差。p值小于0.05被认为在统计学上是显著的。

结果

Adv生物支架的表征。将与猪和人主动脉血管中层剥离的外膜脱细胞化、冻干并研磨成精细粉末(图9(A))。pH中和的胃蛋白酶消化的ECM生物支架在37℃下形成水凝胶(图9(B))。使用凝胶电泳对DNA含量进行定性评估揭示，与天然样本相比，hAdv和pAdv生物支架中的DNA含量较低(图9(C))。发现hAdv和pAdv生物支架的总DNA含量<40ng/mg组织且<350ng/mg干组织重量，对于pSIS生物支架，总DNA含量分别<80ng/mg。这些pAdv和hAdv生物支架还保留了可评估的胶原蛋白和α-弹性蛋白(表1)。

表1：来自猪和人主动脉的天然外膜和外膜衍生的ECM消化物中的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白和α-弹性蛋白含量。数据显示为平均值(标准偏差)。

Adv生物支架水凝胶表现出类似于天然外膜的纤维状微结构。在ECM生物支架制备的研磨和冻干步骤之前，对脱细胞人外膜的基质超微结构进行研究(图10(A，B))。通过对这些样本的扫描电子显微照片进行观察显示出非细胞纤维微结构(图10(A，B))。在由消化的hAdv(图10(C，D))和pAdv(图10(E，F))生物支架产生的水凝胶中也观察到类似的微结构，其表现出更薄和更直的形态。相比之下，由消化的pSIS生物支架产生的水凝胶显示出更粗、更起伏的纤维，并且额外的球状ECM明显粘附到纤维上(图10G，H)。在用于产生ECM生物支架水凝胶的脱细胞化、冻干、研磨、消化和凝胶化过程之后，外膜的天然样纤维基质微结构得以重现。

ECM生物支架水凝胶的凝胶化动力学。ECM水凝胶的光学密度随时间的变化显示为37℃下的凝胶化期间的对数曲线。如所预期的，对于更高浓度的pAdv ECM生物支架，观察到了水凝胶光学密度的增加(图11(A))。在60分钟内发生90％的凝胶化，并在90分钟内达到峰值凝胶化(图11(A))。凝胶化过程中pAdv、hAdv和pSIS ECM生物支架的归一化吸光度图显示了所有被测生物材料具有相似的凝胶化速率(图11(B))。如根据ECM水凝胶制剂的光密度读数所计算的凝胶化速度(S)、t_滞后和t_1/2在pSIS组和pAdv组的8mg/mL浓度下是相似的(表2)。表2：猪生物支架胶凝化动力学的浊度分析。显示了来自三个独立批次的胃蛋白酶消化的生物支架之一的代表性计算。数据显示为平均值(标准偏差)。S、t_1/2和t_滞后分别表示凝胶化速度、达到50％凝胶化所需的时间和滞后期。O.D.为光密度。

Adv生物支架的促有丝分裂活性是FGF2介导的。经pAdv ECM生物支架处理的从主动脉外膜分离的原代人内皮细胞与在其基础生长培养基中的细胞相比表现出增加的细胞增殖(46.1±2.5％与0.0±7.5％，p＝0.0005)(图12)。相较于对照细胞，经pSIS ECM生物支架处理的内皮细胞增加了细胞数(34.0±5.8％与0.0±7.5％，p＝0.0005)。与等效剂量的pSIS ECM生物支架相比，发现pAdv ECM生物支架是更有效的有丝分裂原(46.1±2.5％与34.0±5.8％，p＝0.018)。此外，两种ECM的作用部分由FGF2介导，因为用PD173074抑制FGF2信号通路阻止了由pAdv ECM生物支架(25.9±4.6％与46.1±2.5％，p＝0.001)和pSIS ECM生物支架(18.7±10.4％与34.0±5.8％，p＝0.05)引起的细胞数增加。即使存在FGF2抑制剂，pAdv ECM生物支架(25.9±4.6％与0.0±7.5％，p＝0.002)和pSIS ECM生物支架(18.7±10.4％与0.0±7.5％，p＝0.03)仍然维持了细胞增殖的升高。

Adv生物支架通过FGF2促进体外管状结构形成。在单独GFR-Matrigel基底(图13(A))上或补充有胃蛋白酶-HCl的基底(图13(B))上由人外膜衍生的内皮细胞形成的管状结构最少。相较于培养在单独Matrigel(图13(A))和仅补充胃蛋白酶-HCl消化缓冲液的基底(图13(B))上的细胞，向GFR-Matrigel基底添加pAdv ECM(图13(C))和pSIS ECM(图13(D))生物支架增强了由内皮细胞形成管状结构。添加FGF2抑制剂PD173074不影响单独Matrigel(图13(E))上或补充有胃蛋白酶-HCl的基底(图13(F))上管状结构形成。相反，相较于培养在不存在FGF2抑制剂、补充有ECM生物支架的基底上的细胞(分别为图13(C，D))，PD173074减少了补充有pAdv ECM生物支架(图13(G))和pSIS ECM生物支架的基底(图13(H))上的管状结构形成。

管状结构的数量(图13B)和总长度(图13C)的定量结果与我们的定性观察结果一致，且经处理细胞的所有数值与胃蛋白酶-HCl对照进行比较。我们注意到在存在DMSO或培养基中添加有PD173074的单独Matrigel上，内皮细胞分支化程度最低。相较于胃蛋白酶-HCl对照，我们观察到在含有pAdv ECM生物支架的基底上管状结构的数量和总长度均增加(分别为151.7±33.01个管与54.7±23.80个管，p＝0.017和分别为27.8±4.34mm与9.5±4.15mm，p＝0.006)。相较于不存在抑制剂的pAdv ECM生物支架，FGF2抑制剂的存在减少了管状结构的数量和长度(67.0±39.89个管与151.7±33.01个管，p＝0.049和10.4±6.20mm与27.8±4.34mm，p＝0.020)。相较于胃蛋白酶-HCl对照，注意到培养在补充有pSIS ECM的基底上的细胞有类似的趋势，观察结果未达到统计学显著性(分别为110.7±36.95个管与54.7±23.80个管，p＝0.104和分别为17.9±6.23mm与9.5±4.15mm，p＝0.135)。相较于胃蛋白酶-HCl对照，在管数量和管总长度方面，FGF2抑制对补充有pSIS ECM的基底上管状结构形成的影响与pAdv ECM相似，但未达到95％置信度(分别为44.0±18.08个管与110.7±36.95个管，p＝0.069和分别为6.7±2.42mm与17.9±6.23mm，p＝0.075)。

pAdv生物支架的体内血管生成活性。为了评估pAdv ECM生物支架的体内血管生成潜力，我们使用鸡胚CAM模型进行血管生成。72小时后对pSIS ECM生物支架和加载有pAdvECM生物支架的纤维蛋白支架的定性检查显示了大致相同水平的血管生成活性，这通过支架周边的鸡胚脉管系统的“辐轮”图案予以证明(图14A)。加载有消化缓冲液的支架在72小时后未引起任何血管生成反应。随着pAdv ECM生物支架浓度增加至250μg/mL，血管向支架的侵袭以剂量依赖性方式发生(图14B，箭头)。尽管50-500μg/mL pAdv ECM生物支架均导致了支架周围的辐轮图案(图14A和图17)，但组织学检查显示在最高剂量的pAdv ECM(500μg/mL)时血管侵袭前端消失(图14B)。加入FGF2抑制剂PD173074完全抑制了pAdv ECM生物支架(250μg/mL)诱导的血管生成，并且单独包含药物载体DMSO对pAdv ECM生物支架的促血管生成作用没有影响(图14C)。我们注意到侵袭载有pSIS ECM和pAdv ECM的支架的凝集素阴性细胞(图14B，星号)的趋化作用领先于凝聚素阳性细胞的血管前端迁移(图14B，箭头)。对于载有pAdv ECM的支架，该现象的代表性更高放大倍数图像显示在图14D中。我们在迁移性凝集素阳性细胞侵入支架之前(图14D(i)，箭头)，在载有pAdv ECM(250μg/mL)的支架(图14D(i)，星号)内观察到凝集素阴性细胞的无血管区。在更高浓度的pAdv ECM(500μg/mL)条件下，凝集素阴性细胞侵袭支架而凝集素阳性细胞毗邻且不穿过支架/CAM界面(图14D(ii))。

ECM生物支架中血管生成相关蛋白的检测。我们在pAdv和pSIS ECM生物支架样本以及从正常和动脉瘤患者分离的hAdv生物支架样本中利用血管生成相关商业蛋白阵列检测出所有55种蛋白质的存在(图15)。所有被检测阵列蛋白的完整列表和密度值显示在图16中。阵列印迹的定性检查显示在所有ECM生物支架中检测到FGF2(图15，B19、B20)。相较于pAdv ECM生物支架，FGF1和FGF2(图15，分别为B17、B18、B19、B20)在pSIS ECM生物支架中更为丰富(分别为122.0±4.43像素密度与43.3±0.7像素密度(任意单位)，p＝0.022和100.2±0.56像素密度与43.5±0.46像素密度)。其他8种血管生成相关因子在pSIS ECM中比在pAdv ECM生物支架中更为丰富(图16)。有趣的是，相较于非动脉瘤主动脉(≤34mm)样本，在由动脉瘤人主动脉(最大正交直径>42mm)制备的hAdv ECM生物支架中发现包括FGF2在内的19种蛋白质的水平更低(图16)。值得注意的是，血小板反应蛋白1(TSP1)是所有其他蛋白质平均量的约3倍(60.0±1.91与19.9±1.34)。相较于正常样本，在动脉瘤样本中没有发现检测到的血管生成相关因子的升高。

在该研究中，我们使用脱细胞的人和猪主动脉外膜样本制备了来自血管周围微环境的新型基于ECM生物支架的水凝胶生物材料。我们在体外和体内血管生成模型中对这些ECM生物支架的基质蛋白组成、微结构以及其对原代人内皮细胞的信号传导活性进行了表征。

我们证明，ECM水凝胶在pH、离子强度和温度的生理条件下由胃蛋白酶消化的脱细胞外膜组织自组装，从而类似于天然外膜ECM结构。来自hAdv和pAdv ECM生物支架的水凝胶重现了纤维基质微结构，其与天然人外膜的微结构具有惊人的相似性。这些Adv ECM水凝胶显示出似乎比衍生自pSIS ECM生物支架的水凝胶的纤维更直、起伏更小的纤维形态。这些水凝胶的基质纤维超微结构的显著差异可能取决于组织特异性蛋白质环境，而组织特异性蛋白质环境由该组织的独特生物力学需求协调地决定。例如，主动脉是可复原的高弹性组织，其承受连续的循环荷载并且在没有动脉瘤疾病的情况下不会明显扩张或破裂。相反，肠道更加可渗透以促进营养吸收，这可以解释ECM生物支架凝胶化后观察到的纤维密度降低和非起伏的纤维形态。虽然进一步测试将最终确定外膜衍生的ECM水凝胶的生物力学性质，但含胶原蛋白和弹性蛋白的ECM生物支架水凝胶在凝胶化后表现出天然外膜的微结构模拟。对Adv ECM生物支架水凝胶的凝胶化动力学分析显示出类似于其他组织来源如相似浓度的pSIS的凝胶化速率曲线。出乎意料地观察到pSIS和Adv ECM生物支架水凝胶之间凝胶化动力学的相似性，这是由于假设了SIS和外膜微环境的蛋白质组成存在差异。由于水凝胶形成涉及自组装基质蛋白如胶原蛋白之间的相互作用并且该过程可以通过层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖进行调节，因此凝胶化活性的解释是复杂的。在pSIS ECM和Adv ECM凝胶化动力学之间观察到的相似性表明，独特的组织即使经过不同的脱细胞化步骤处理也可以通过ECM生物支架凝胶化的过程而最终得到调和，该凝胶化过程以类似的方式将这些独特的ECM转化为水凝胶形式。可以通过调节ECM生物支架的浓度进一步定制各种独特组织来源的ECM水凝胶。我们感兴趣的是了解pAdv ECM水凝胶的特异性蛋白质组分和功能，并且目前的工作进一步集中于猪ECM的固有生物活性特性及其对人外膜衍生的内皮细胞的体外行为和体内血管生成的影响。

我们评估了胃蛋白酶消化的猪ECM生物支架中的内源性FGF2对血管生成关键活性的影响。pAdv和pSIS ECM生物支架诱导的内皮细胞增殖是FGF2介导的。在存在FGF2抑制剂的情况下，Adv和pSIS ECM生物支架的促有丝分裂活性仍然高于未处理的对照，从而表明ECM生物支架的指导细胞增殖的信号传导是非FGF2依赖性的，这与在猪膀胱和真皮ECM中的发现一致。FGF2还通过人外膜衍生的内皮细胞介导ECM诱导的管状结构网络形成。

虽然相对于Adv ECM生物支架，pSIS ECM生物支架中FGF1和FGF2的丰度增加，但pAdv ECM生物支架显示出比pSIS ECM生物支架更高的促有丝分裂潜力。针对该观察结果可以做出两种解释。首先，外膜的组织特异性环境有利于衍生自该部位的内皮细胞，这可能是通过保留其他组织特异性生长因子依赖性的和非依赖性的促有丝分裂信号来实现。除此解释之外或作为其替代，推测pSIS和pAdv ECM生物支架制剂之间的生物活性能力不同。此外，我们检测了通过该研究中制备的所有ECM中的阵列所探测的每种蛋白质，该阵列的人类特异性使我们无法直接比较人ECM与猪ECM中的蛋白质丰度。重要的是，ECM支架中生长因子如生物活性FGF2的存在，也可能有助于维持外膜中的驻留祖细胞巢。人动脉瘤中几种血管生成相关因子的丰度降低引发了许多与疾病机制相关的问题，并且提供了利用血管周围ECM生物支架设计人类疾病体外模型以及评估体内异种ECM代替物的治疗潜力的机会。

使用鸡胚CAM体内血管生成模型，我们证明了pAdv ECM的体内血管生成潜力。随着pAdv ECM生物支架浓度的增加显示出的血管侵袭可归因于支架中较高的FGF2和其他血管生成因子的浓度。我们推测在响应于载有pAdv ECM和pSIS ECM的支架的血管生成期间领先于凝集素阳性内皮细胞的迁移性凝集素阴性细胞为巨噬细胞。我们以两种方式之一解释了在500μg/mL pAdv ECM生物支架的最高剂量下血管侵袭受到抑制的有趣观察结果。CAM中的现有抗血管生成因子如TSP1干扰促血管生成信号或负反馈机制受到高浓度促血管生成因子的影响。在FGF2抑制剂存在下pAdv ECM生物支架的体内血管生成潜力被完全消除强烈表明，FGF2是外膜ECM中的主要促血管生成信号和有效的再生因子。虽然其他基质信号传导如机械转导和整合素介导的信号传导有助于增加细胞增殖，但Morin和Tranquillo对体外血管发生和血管生成模型的综述肯定了大多数报告所指出的，即当不使用ECM生物支架时，需要添加外源性生长因子以实现血管发生和/或血管生成，该过程需要内皮细胞和周细胞的组合(Morin KT，Tranquillo RT.In vitro models of angiogenesis andvasculogenesis in fibrin gel.Experimental Cell Research.2013；319:2409-17)。最近发现pSIS生物支架水凝胶的体内血管生成潜力与FGF2和VEGF的基质降解依赖性释放相关(Wang W等人，Preparation and characterization of pro-angiogenic gel derivedfrom small intestinal submucosa.Acta Biomaterialia.2016；29:135-48)。同样地，AdvECM生物支架衍生的水凝胶用作信号如FGF2的贮库，该信号影响对血管形成重要的细胞行为。

对于临床应用，在理想情况下，将会开发一些精选的ECM生物支架衍生的水凝胶以在大多数患病器官中引发再生。另外，组织特异性ECM水凝胶可以用作天然生物支架，从而可用于发现疾病机制的生物学。虽然来自各种组织来源的ECM水凝胶显示出固有的生物活性，但是有关它们对血管生成影响的研究直至最近才出现。这些研究提供了证据证明，ECM生物支架影响血管细胞并与其相互作用。已经使用与组织衍生的血管生成生长因子的独特组合相缀合的合成材料更好地研究了杂交支架的血管生成潜力，并且必须针对具有特定要求的生长因子含量和释放曲线的特定应用进行精确地设计。通过多因子结构和信号传导能力，ECM生物支架在其组织特异性模拟方面提供优于合成构造体的明显优势。此外，通过对组织来源、密度和递送方法的选择，可以定制衍生自ECM生物支架的水凝胶以用于特定的组织再生应用。我们的研究结果共同证明了Adv ECM生物支架水凝胶是多用途的生物支架，其能够同时在微结构上和生长因子依赖性信号传导方面模拟天然外膜微环境，这对于针对血管谱系细胞功能的期望效果是重要的。

结论

我们揭示，来自人和猪主动脉外膜的血管周围组织可以脱细胞化以衍生出ECM生物支架并制成水凝胶，该水凝胶重现了天然基质纤维微结构。pAdv ECM生物支架保留了生物活性信号，该信号引起FGF2介导的人内皮细胞增殖、体外管状结构网络的形成和体内血管生成。包括FGF2在内的几种血管生成相关蛋白存在于Adv ECM生物支架中，并且许多在由人动脉瘤样本制备的基质中丰度较小。这些发现为Adv ECM生物支架用于心血管疾病环境下正常生理学中血管发生和血管生成的进一步研究提供了支持，并且还提供了新的治疗机会。

实施例7-脱细胞猪主动脉外膜ECM的体内评估

方法：使用先前建立的皮下基质胶栓小鼠模型(subcutaneous matrigel-plugmouse model)的改进办法(Passaniti,A.等人(1992).A simple,quantitative methodfor assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstitutedbasement membrane,heparin,and fibroblast growth factor.Laboratoryinvestigation；a journal of technical methods and pathology,67(4),519-528)，在试验测定中评估猪主动脉外膜ECM的体内促血管生成特性。简而言之，将6-8周龄的C57BL6J小鼠(25-30g)麻醉并在其背侧制作四个水平切口(12mm)以产生用于支架植入的皮下袋。通过在标准48孔板中加入250μL 10mg/mL纤维蛋白(有或没有中和的猪外膜ECM生物支架)来制备支架。在植入后7天和14天，经由尾静脉注射

650-番茄凝集素以标记脉管系统。注射后15分钟，处死动物并收获支架连同周围组织，并在10％中性缓冲福尔马林中固定48小时。每个样本的一半用于进行苏木精和伊红(H&E)分析和马氏三色染色的石蜡包埋切片分析。在冷冻切片中，评估每个样本另一半的凝集素标记的脉管系统。

结果：初步结果显示，相较于未负载的纤维蛋白支架，载有pAdv ECM的纤维蛋白支架的促血管生成活性增加(图18(A))，这与我们在上述CAM模型中观察到的pSIS和pAdv ECM支架的血管生成结果一致。H&E染色的石蜡包埋切片的定性显微镜检查显示，相较于单独使用未负载的纤维蛋白或仅补充消化缓冲液的凝胶，植入载有pSIS ECM和pAdv ECM的纤维蛋白之后14天支架的细胞浸润(推测为巨噬细胞)更多(图18(B))。此外，载有pAdv ECM的支架似乎比载有SIS ECM的支架更加劣化并具有更多的浸润细胞。

以下条目提供了本文描述的本发明各个方面的实例。

1.一种制备细胞外基质(ECM)材料的方法，其包括：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织，其中所述血管外膜组织任选为牛、绵羊或猪的血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，任选地用过乙酸进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；和

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶。

2.根据条目1所述的方法，其中所述外膜组织是主动脉外膜。

3.根据条目1或2中任一项所述的方法，其还包括在所述ECM预凝胶凝胶化产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶胶凝化。

4.根据条目1至3中任一项所述的方法，其中所述脱细胞的ECM材料未被所述酸性蛋白酶完全消化，从而产生能够在37℃下凝胶化且包含未消化的脱细胞ECM颗粒的ECM预凝胶。

5.根据条目1至4中任一项所述的方法，其还包括在步骤e之前的一个或多于一个洗涤步骤。

6.根据条目5所述的方法，其中所述一个或多于一个洗涤步骤包括用磷酸盐缓冲盐水、盐水和/或水洗涤所述组织或材料。

7.根据条目1至6任一项所述的方法，其中所述ECM材料在没有透析步骤或交联步骤的情况下制备。

8.根据条目1至7中任一项所述的方法，其中所述两性离子洗涤剂是CHAPS。

9.根据条目1至8中任一项所述的方法，其中所述阴离子洗涤剂是SDS。

10.根据条目1至9中任一项所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。

11.根据条目1至10中任一项所述的方法，其中在pH为1至4、1至2或2.0±0.3的溶液中用酸性蛋白酶溶解所述脱细胞的ECM材料。

12.根据条目1至11中任一项所述的方法，其包括将所述ECM材料分散在天然的或合成的聚合物组合物中。

13.根据条目12所述的方法，其中所述天然的或合成的聚合物组合物是以下的一种或多于一种：第二ECM材料、纤维蛋白、胶原蛋白、聚酯(PE)、聚氨酯(PU)、聚酯型氨酯脲(PEUU)、聚醚酯氨酯脲(PEEUU)、聚酯碳酸酯氨酯脲(PECUU)、聚碳酸酯氨酯脲(PCUU)共聚物、聚烯烃、聚碳酸酯、聚酐、聚醚、聚脲、聚氨酯、聚酮和含氟聚合物。

14.根据条目12或13所述的方法，其中所述ECM材料在所述ECM材料凝胶化之前或期间与所述天然的或合成的聚合物组合物混合。

15.根据条目12所述的方法，其中所述预凝胶与纤维蛋白以及纤维蛋白原混合并凝胶化，而所述纤维蛋白与所述纤维蛋白原交联。

16.一种ECM组合物，其包含pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织。

17.根据条目16所述的ECM组合物，其中所述组合物是凝胶，并且相较于酸性蛋白酶消化的猪小肠黏膜下层，所述凝胶包含更长的纤维和降低至少50％的FGF-1和/或FGF-2含量，并且任选地具有增加的HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)含量和/或降低的血管生成素2、内皮抑素、IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、PTX3(穿透素3)、催乳素、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5和/或TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)中一种或多于一种的含量，并且任选地具有降低至少50％的FGF-1和/或FGF-2含量，增加的HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)含量和降低的血管生成素2、内皮抑素、IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、PTX3(穿透素3)、催乳素、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5和TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)的含量。

18.根据条目16或17所述的组合物，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织未进行透析或化学交联。

19.一种治疗患者动脉瘤的方法，其包括向具有动脉瘤的血管表面施用pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织，其中所述血管外膜组织任选为主动脉外膜组织。

20.根据条目19所述的方法，其中所述血管是所述患者的主动脉。

21.根据条目19或20所述的方法，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织通过以下步骤制备：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织，例如主动脉外膜组织，其中所述血管外膜组织任选为牛、绵羊或猪的血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，任选地用过乙酸进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞化的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶，和

i.任选地，在所述ECM预凝胶凝胶化以产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶凝胶化。

22.一种使患者的活组织血管化或再血管化的方法，其包括向离体或体内组织表面施用pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织，其中所述血管外膜组织任选为主动脉外膜组织。

23.根据条目19所述的方法，其中所述组织是活血管。

24.根据条目19所述的方法，其中所述组织是患者的伤口，任选为皮肤伤口、糖尿病性溃疡或糖尿病足溃疡，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于所述伤口。

25.根据条目19所述的方法，其中所述组织是患者的活骨组织，任选为受损的骨或表现出骨质疏松症的骨，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于所述骨。

26.根据条目19所述的方法，其中所述组织是患者的心肌和/或其脉管系统，任选为患者心肌中的伤口或梗塞，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于患者的心肌，并且任选地施用于患者心肌中的伤口或梗塞。

27.根据条目22至26中任一项所述的方法，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织通过以下步骤制备：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织，例如主动脉外膜组织，其中所述血管外膜组织任选为牛、绵羊或猪的血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，任选地用过乙酸进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶，和

i.任选地，在所述ECM预凝胶凝胶化以产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶凝胶化。

在已描述的本发明中，本领域普通技术人员将理解，在不影响本发明或其任何实施方案的范围的情况下，可以在条件、配方和其它参数的广泛和等效的范围内实施本发明。

Claims (36)

1.一种制备细胞外基质(ECM)材料的方法，其包括：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶；和

i.任选地，在所述ECM预凝胶凝胶化以产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶凝胶化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管外膜组织为牛、绵羊或猪的血管外膜组织。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管外膜组织为主动脉外膜。

4.根据权利要求1所述的方法，其中用过乙酸进行所述消毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞的ECM材料未被所述酸性蛋白酶完全消化，从而产生能够在37℃下凝胶化且包含未消化的脱细胞ECM颗粒的ECM预凝胶。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述ECM材料在没有透析步骤或交联步骤的情况下制备。

7.根据权利要求1所述的方法，其中：

a.所述两性离子洗涤剂是CHAPS；

b.所述阴离子洗涤剂是SDS；

c.所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶；和/或

d.在pH为1至4的溶液中用酸性蛋白酶溶解所述脱细胞的ECM材料。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶液的pH为1至2。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶液的pH为2.0±0.3。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其包括将所述ECM材料分散在天然的或合成的聚合物组合物中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述天然的或合成的聚合物组合物是以下的一种或多于一种：第二ECM材料、纤维蛋白、胶原蛋白、聚酯(PE)、聚氨酯(PU)、聚酯型氨酯脲(PEUU)、聚醚酯氨酯脲(PEEUU)、聚酯碳酸酯氨酯脲(PECUU)、聚碳酸酯氨酯脲(PCUU)共聚物、聚烯烃、聚碳酸酯、聚酐、聚醚、聚脲、聚酮和含氟聚合物。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述ECM材料在所述ECM材料凝胶化之前或期间与所述天然的或合成的聚合物组合物混合。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述预凝胶与纤维蛋白以及纤维蛋白原混合并凝胶化，而所述纤维蛋白与所述纤维蛋白原交联。

14.一种ECM组合物，其为pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是凝胶，并且相较于酸性蛋白酶消化的猪小肠黏膜下层，所述凝胶包含更长的纤维和降低至少50％的FGF-1和/或FGF-2含量，并且任选地具有增加的HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)含量和/或降低的血管生成素2、内皮抑素、IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、PTX3(穿透素3)、催乳素、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5和/或TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)中一种或多于一种的含量，并且任选地具有降低至少50％的FGF-1和/或FGF-2含量，增加的HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)含量和降低的血管生成素2、内皮抑素、IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、PTX3(穿透素3)、催乳素、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5和TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)的含量。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的主动脉外膜组织未进行透析或化学交联。

17.pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织在制备用于治疗患者动脉瘤的产品中的用途，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于患者的具有动脉瘤的血管表面。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述血管外膜组织为主动脉外膜组织。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述血管是所述患者的主动脉。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织通过以下步骤制备：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶，和

i.任选地，在所述ECM预凝胶凝胶化以产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶凝胶化。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述血管外膜组织为牛、绵羊或猪的血管外膜组织。

22.根据权利要求20所述的用途，其中所述血管外膜组织为主动脉外膜组织。

23.根据权利要求20所述的用途，其中用过乙酸进行所述消毒。

24.pH为6.8至7.8、失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织在制备用于使患者的活组织血管化或再血管化的产品中的用途，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于离体或体内组织的表面。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述活组织是活血管。

26.根据权利要求24所述的用途，其中所述血管外膜组织为主动脉外膜组织。

27.根据权利要求24所述的用途，其中所述活组织是患者的伤口，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于所述伤口。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述伤口是皮肤伤口、糖尿病性溃疡或糖尿病足溃疡。

29.根据权利要求24所述的用途，其中所述活组织是患者的活骨组织，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于所述骨。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述活骨组织是受损的骨或表现出骨质疏松症的骨。

31.根据权利要求24所述的用途，其中所述活组织是患者的心肌和/或其脉管系统，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于患者的心肌。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述心肌和/或其脉管系统是患者心肌中的伤口或梗塞，并且所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织被施用于所述患者心肌中的伤口或梗塞。

33.根据权利要求24所述的用途，其中所述失活的酸性蛋白酶消化的血管外膜组织通过以下步骤制备：

a.在两性离子洗涤剂中孵育血管外膜组织；

b.在胰蛋白酶-EDTA中孵育所述组织；

c.用阴离子洗涤剂孵育所述组织；

d.对所述组织进行消毒，从而产生脱细胞的ECM材料；

e.冷冻干燥所述脱细胞的ECM材料；

f.粉碎所述脱细胞的ECM材料；

g.用酸性蛋白酶部分或完全溶解所述脱细胞的ECM材料以产生溶解的ECM；

h.中和所述溶解的ECM以产生ECM预凝胶，和

i.任选地，在所述ECM预凝胶凝胶化以产生ECM凝胶的温度下使所述ECM预凝胶凝胶化。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述血管外膜组织为牛、绵羊或猪的血管外膜组织。

35.根据权利要求33所述的用途，其中所述血管外膜组织为主动脉外膜组织。

36.根据权利要求33所述的用途，其中用过乙酸进行所述消毒。

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