CN108699164B

CN108699164B - 双重标靶药物载体

Info

Publication number: CN108699164B
Application number: CN201680083086.6A
Authority: CN
Inventors: 张正; 蓝耿立; 王信二; 张顺福; 李佳哲; 詹佩嘉
Original assignee: Fama Technology Consulting Co ltd
Current assignee: Fama Technology Consulting Co ltd
Priority date: 2016-03-02
Filing date: 2016-03-02
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2036-03-02
Also published as: CN108699164A; WO2017147820A1

Abstract

提供了一种双标靶药物载体,包括第一和第二标靶分子,其中标靶分子包括肽、抗体或蛋白质。所述标靶分子可结合至特定的受体、特异性蛋白或糖蛋白等,还可与放疗物质等共轭结合,形成共轭物。

Description

双重标靶药物载体

技术领域

本发明涉及一种新颖的标靶药物载体，且特别涉及一种具有2种标靶分子的双重标靶药物载体。

背景技术

癌症是造成美国死亡的主要原因，癌症死亡率持续增加。癌症是细胞无法正常分裂，生长和分化。癌症最初的临床表现极不平均，在人体器官和组织上几乎可产生超过70种的癌症，且其中一些类似的癌症类型属于多个不相同的分子疾病。不幸的是，一些癌症可能无实际上的症状，直到在病程晚期，因此在治疗及预后上极为困难。

癌症治疗通常包括手术、化疗及/或放射治疗。目前所有的疗法都会发生严重的副作用，且降低生活质量。大多数的化疗药物会同时作用于正常和癌变组织。因此，在治疗癌性肿瘤的挑战之一是，给予癌细胞最大化的杀伤，同时尽量减少对健康组织的伤害。根据给药途径的药物(例如，静脉内)和性质(例如，它的物理和药物动力学性质)，通常只有一小部分的投与量到达目标细胞，其余则作用于其他组织或迅速消失。

为了提高传送效率，降低毒性非癌细胞，已有使药物递送至人体内特异性位点的各种方式。例如，使用单株抗体治疗癌症。抗体提供目标选择性，但仍然存在昂贵以及与非目标细胞相互作用的问题。

近年来，致力于寻找肿瘤新生血管系统的特定目标物以发展新型的标靶治疗药物。肿瘤新生血管内皮细胞会大量表现多种特异性膜蛋白，包括αvβ3、αvβ5、整合素(integrin)、血管相关生长因子等。此外，过去研究发现短链胜肽(RGD、NGR)对于肿瘤血管新生内皮细胞具有极高的辨识度。

然而，肿瘤细胞具有高度不稳定性及变异性，且治疗过程中会对药物产生的抗药性。目前各种药物及诊断试剂对于改善癌症患者的存活仍缓慢且效果不彰。

发明内容

有鉴于上述先前技术所存在的问题，本发明提供一种可用于诊断及治疗癌症的新颖载体。本发明的双重标靶药物载体为一种融合蛋白平台，能有效降低制药技术门坎与成本。

本发明提供一种双重标靶药物载体，包括第一标靶分子以及第二标靶分子。

在本发明的实施例中，其中所述第一或第二标靶分子专一性地结合至肿瘤细胞或/和肿瘤微环境中的血管内皮细胞

在本发明的实施例中，其中所述第一及第二标靶分子包括，但不限于，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)、环状NGR(环状天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)、内化RGD(iRGD，内化-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、胱氨酸-甘氨酸-天门冬酰氨酸-赖氨酸-精氨酸-苏氨酸-精氨酸-甘氨酸-丙氨酸(CGNKRTRGA)、胃泌素(gastrin)、蛙皮素(bombesin)、奥曲肽(octreotide)或其衍生物。大分子胜肽(peptide)包括，但不限于，表皮生长因子(EGF)、抗-EGFR(epidermal growth factor receptor，上表皮生长因子受体)抗体、血管内皮生长因子(VEGF)、抗-VEGFR(Vascular Endothelial Growth FactorReceptor，血管内皮细胞生长因子受体)抗体、抗-HER2(第二型人类表皮生长因子接受体，human epidermal growth factor receptor 2)抗体、肝细胞生长因子受体(HGFR)、抗-HGFR抗体、肿瘤坏死因子(TNF)或抗-TNF抗体。

在本发明的实施例中，其中所述第一标靶分子以连接符与所述第二标靶分子连结。

在本发明的实施例中，其中所述连接符为具有5至20个氨基酸的胜肽。

在本发明的实施例中，其中所述连接符包括，但不限于，GG、PGGGG或GGGGSGGGGS，其中G系代表甘胺酸、P代表脯胺酸、S代表丝胺酸。

在本发明的实施例中，更包括放射线同位素。

本发明更提供一种医药组成物，包括上述双重标靶药物载体以及药学上可接受的载体。

在本发明的实施例中，更包括微脂体。

在本发明的实施例中，更包括纳米微粒。

具体实施方式

图1A为纯化VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF、EGF、RGD-EGF、RGD4C-EGF蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图1B为marker、VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF的SDS-PAGE电泳图，其中M为marker、1为VEGF(15.3Da)、2为RGD-VEGF(15.6Da)以及3为RGD4C-VEGF(16.3Da)。

图2A-2F为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与αvβ3、VEGFR1、VEGFR2的结合曲线/柱状图。RGD-EGF及RGD4C-EGF可分别与αvβ3及EGFR结合。图2A为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与αvβ3的结合曲线图。图2B为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与αvβ3结合后以RGDfV多肽竞争之柱状图。图2C为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与VEGFR1的结合曲线图。图2D为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与VEGFR2的结合曲线图。

图2E为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与VEGFR2结合后以VEGFR2抗体竞争之柱状图。图2F为RGD-EGF及RGD4C-EGF与αvβ3的结合曲线图。

图3A为U87MG(表现αvβ3及EGFR)细胞与RGD-VEGF及RGD4C-VEGF的结合曲图。RGD-VEGF及RGD4C-VEGF可分别与表现αvβ3及EGFR结合。

图3B为U87MG(表现αvβ3及EGFR)细胞与RGD-VEGF及RGD4C-VEGF的结合柱状图。

图3C为HUVEC(表现VEGFR1、VEGFR2与αvβ3)细胞与RGD-VEGF、RGD4C-VEGF及NGR-VEGF的结合曲线图。RGD-VEGF、RGD4C-VEGF及NGR-VEGF可结合至表现VEGFR1、VEGFR2与αvβ3的细胞。

图3D为HUVEC(表现VEGFR1、VEGFR2与ααvβ3)细胞与RGD-VEGF、RGD4C-VEGF及NGR-VEGF的结合柱状图。

图4A-4D为细胞黏附试验。RGD-VEGF及RGD4C-VEGF涂覆于细胞盘后，可增加U87MG细胞及HUVEC细胞贴附于培养盘上的数量，若加入大量RGD胜肽链竞争，可减少细胞的吸附。其中图4A为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF涂覆于细胞盘后，可增加U87MG细胞贴附于培养盘上的数量，而图4B为添加RGDfV多肽后，细胞贴附于培养盘上的数量即受到抑制，图4C-4D为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与HUVEC细胞结合后，再分别以RGDfV多肽或VEGFR2重组蛋白竞争，分别以吸光值及百分比表示。

图5A-5B显示RGD-EGF及RGD4C-EGF或RGD-VEGF及RGD4C-VEGF分别可活化EGFR或VEGFR下游的讯息传递途径。本发明双重标靶药物载体的EGF或VEGF仍保有其原本的生物特性。其中5A图的M为Marker、C为控制组(无加入蛋白)、E为EGF(25nM)、R-E为RGD-EGF(25nM)以及R4C-E为RGD4C-EGF(25nM)，而图5B的C为控制组(无加入蛋白)、R-V为RGD-VEGF、R4-VRGD4C-VEGF。

图6为放射性标志融合蛋白于缓冲溶液(HEPES，4℃)及血清(37℃)的稳定度试验。将放射性标志融合蛋白保存于Hepes缓冲液(4℃)及胎牛血清(37℃)的环境下，经24小时后放射化学纯度皆仍高于90％，显示经放射性In-111标志的融合蛋白的血清稳定度极佳。

图7为荧光摄影图。RGD-VEGF与RGD4C-VEGF标志重组蛋白可结合至细胞。

图8为放射性标志重组蛋白的单光子及计算机断层扫瞄(SPECT/CT)造影。荷U87MG皮下肿瘤小鼠经尾静脉注射¹¹¹In-DTPA(二乙基三胺五乙酸，Diethylene triaminepentacetate aci)-EGF、¹¹¹In-DTPA-RGD-EGF及¹¹¹In-DTPA-RGD4C-EGF后1、4、8及24小时，进行小动物单光子及计算机断层扫瞄(SPECT/CT)造影。影像显示施打In-111标志重组蛋白后，三者于肿瘤的专一性积聚(以肿瘤/肌肉积聚比值表示)皆随时间而提高，皆于药物注射后8小时达高峰，此时¹¹¹In-DTPA-RGD4C-EGF的肿瘤/肌肉积聚比为4.4，略高于¹¹¹In-DTPA-RGD-EGF的3.6，而远高于¹¹¹In-DTPA-EGF的1.7。

具体实施方式

本发明所述的标靶分子为胜肽、抗体或蛋白质。本发明的标靶分子可经化学性修饰以增加稳定性。化学修饰胜肽或胜肽类似物包括任何可in vivo(体内)或in vitro(体外)增加稳定性及/或效力的化学功能性等同物。胜肽类似物是指任何胜肽的氨基酸衍生物。胜肽类似物包括，但不限于，在合成时修饰支链、合并未饱和氨基酸及/或其衍生物、交联与其它可增加胜肽象约束的方法。例如，支链修饰包括胺基的修饰。

标靶分子可in vivo及in vitro结合至病灶组织，特别为肿瘤、癌症组织/细胞及肿瘤微环境的血管内皮细胞。因此，当标靶胜肽与报导分子(生物成像的荧光分子或放射线)共轭时，肿瘤标靶胜肽可直接显示肿瘤位置，有助于癌症的诊断。本发明所述的“共轭”是指2个有助于治疗/诊断肿瘤的分子(如肿瘤标靶胜肽与报导分子)通过足够的亲合力结合。共轭可以共价、非共价键或其它形式的结合方式完成，例如，包覆。

本发明的标靶分子可为小分子胜肽及/或大分子胜肽。小分子胜肽包括，但不限于，氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)、环状NGR、内化RGD(iRGD)、胱氨酸-甘氨酸-天门冬酰氨酸-赖氨酸-精氨酸-苏氨酸-精氨酸-甘氨酸-丙氨酸(CGNKRTRGA)、胃泌素(gastrin)、蛙皮素(bombesin)、奥曲肽(octreotide)或其衍生物。大分子胜肽包括，但不限于，表皮生长因子(EGF)、抗-EGFR抗体、血管内皮生长因子(VEGF)、抗-VEGFR抗体、抗-HER2抗体、肝细胞生长因子受体(HGFR)、抗-HGFR抗体、肿瘤坏死因子(TNF)或抗-TNF抗体。

在实施例中，标靶分子可与成像物质或放疗物质(放射性药物或同位素)，形成共轭物。

放射性成像物质包括，但不限于，¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸F、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、²¹¹At、²²⁵Ac、¹⁷⁷Lu、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁷Cu、²¹³Bi、²¹²Bi、²¹²Pb与⁶⁷Ga。

放射性药物包括，但不限于，¹¹¹In羟基喹啉、¹³¹I碘化钠、^99mTc苯溴氨乙酸、^99mTc红血球、¹²³I碘化钠、^99mTc Exametazime、^99mTc大颗粒聚合白蛋白、^99mTc亚甲膦酸盐、^99mTcMertiatide、^99mTc羟亚甲基二膦酸盐、^99mTc三胺五乙酸、^99mTc Pertechnetate、^99mTcSestamibi、^99mTc硫胶体、^99mTc Tetrofosmin、²⁰¹T1与¹³³Xe。

放射线同位素包括，但不限于，⁵²Fe、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁹⁹mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹⁴⁹Pm、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu与¹⁹⁸Au。

本发明中所述的肿瘤标靶胜肽或其共轭物可经非肠胃、局部、直肠、鼻、阴道、植入、或喷雾吸入等方式给予。本发明中所述对的“非肠胃”包括皮下、皮内、静脉、肌内、关节、动脉、滑膜、病灶或颅内注射。

本发明所述的“连接符”是指2-50个合成氨基酸的序列，较佳5-20个合成氨基酸的序列，其连接二个胜肽序列，例如，连接2个胜肽结构。本发明的连接符可透过胜肽键连接2个氨基酸序列。本发明的连接符胜肽为直链序列，连接第一部分与第二部分。在实施例中，可置换连接符可为(GGGGS)n、(G)n、(EAAAK)n、(XP)n或(PAPAP)n，例如，GG、GGSG、GGGS、GGGGS、GGSGG、GGGSGG、GGGSGGG、GGGSGGGS、GGGSGGGGS、ASGG、GGGSASGG、SGCGS、GGGGSGGGG、GGSHG、SGGCGGS及AACAA，其中所述G表示甘氨酸；所述S表示

氨酸；所述E表示谷氨酸；所述A表示丙氨酸；所述K表示赖氨酸；所述P表示脯胺酸；所述H表示组氨酸；所述C表示胱氨酸。

综上所述，本发明双重标靶药物载体可携带肿瘤治疗药物或其它物质(如治疗性放射核种)，以成为肿瘤标靶药物载体。此外，也可携带可进行分子造影的药物，作为肿瘤诊断地分子影像探针。本发明双重标靶显影剂载体并具肿瘤诊断的效果。

实施例1

1.融合蛋白质体的制备

将EGF、RGD-EGF、RGD4C-EGF、VEGF、RGD-VEGF及RGD4C-VEGF基因以Nco I及Xho I限制酶切位建构于pET28a(+)的表达载体。RGD、RGD4C的C端(即碳端)与EGF或VEGF的N端(即氮端)相接，且EGF或VEGF的C端有His₆标志。His₆标志有利于后续的纯化及分析，其中RGD-EGF、RGD4C-EGF、RGD-VEGF及RGD4C-VEGF的基因序列包含连接符GG。将建构完成的pET28a(+)EGF、RGD-EGF、RGD4C-EGF、VEGF、RGD-VEGF及RGD4C-VEGF表现载体转染至E.coli.DH5α，以生产及保存载体DNA。经DNA定序确认序列正确。

2.标靶融合蛋白的表现及纯化

将实施例1的载体以热休克的方式送入E.coli BL21(DE3)，以卡纳霉素(50μg/mL)筛选及确认。将带有蛋白表现载体的E.coli BL21(DE3)菌株，以1mM IPTG在37℃诱导16小时。将菌液经由法国压破菌仪(French press)以30PSI压力破菌，13000g离心30分钟，分别收取上清液及沉淀物(pellet)的样本进行SDS-PAGE电泳分析，由SDS-PAGE可观察到标靶融合蛋白的表现。若是以不可溶的包含体(inclusion body)形式存在菌体中，后续蛋白生产收取破菌后的沉淀物进行蛋白纯化。溶解后的标靶融合蛋白以0.45μm滤膜过滤后，接着将标靶融合蛋白以1∶50比例的复性(refolding)缓冲液(20mM Tris，0.1Mm GSSG，1mM GSH，1mM EDTA pH 8.0)进行复性稀释(dilution refolding)。将标靶蛋白样本缓慢地加入复性缓冲液中，且标靶融合蛋白稀释后的浓度不超过0.2mg/ml，于4℃进行复性12小时，再以0.45μm滤膜过滤，并去除沉淀的标靶蛋白。

将蛋白复性液以5mL/min流速通过镍管柱(nickel column)。先以缓冲液A(20mMTris(pH8.0)，500mM NaCl，20mM咪唑，0.5mM PMSF)清洗管柱，接着进行洗堤，利用缓冲液A与缓冲液B(20mM Tris(pH8.0)，500mM NaCl，500mM咪唑，0.5mM PMSF)的比例调整溶液的咪唑浓度，以洗涤出标靶融合蛋白。由于收集的标靶融合蛋白仍有其它杂质蛋白，因此利用凝胶管柱(HiPrap 26/60S-100)分离出融合蛋白。以

浓缩离心管(Millipore)浓缩蛋白样本，将蛋白浓度调整至约0.5～3mg/mL，并分装至微量离心管，贮存于-80℃。以SDS-PAGE分析确认蛋白纯度，如图1所示。

3.受体结合试验

3.1标靶融合蛋白与Integrin的结合

以ELISA cell binding(ELISA细胞结合)试验分析EGF、RGD-EGF、NGR-EGF、RGD4C-EGF、VEGF、RGD-VEGF、NGR-VEGF、及RGD4C-VEGF标靶融合蛋白与细胞的结合。将25μg/well溶于PBS(含钙、镁离子)的integrin(αvβ3)受体置于96well ELISA微量盘，于4℃培养12小时后，以3％BSA于25℃反应1小时。加入系列稀释的标靶融合蛋白于25℃培养2小时，经PBS缓冲液(含钙、镁离子)清洗后，以小鼠抗-His-HRP抗体侦测蛋白结合到受体的情形，测量波长450nm的吸光值以量化结合于受体上的蛋白量。所得数据利用prism软件作非线性曲线拟合(curve fitting)可得蛋白结合的解离常数K_d值，进而可作为蛋白对不同受体结合能力的比较。

3.2标靶融合蛋白与EGFR、VEGFR的结合

将25μg/well溶于PBS缓冲液(含钙、镁离子)的抗-IgG抗体置于96well ELISA微量盘，于4℃培养12小时后，以3％BSA于25℃反应1小时。加入25ng/well EGFR或VEGFR，于25℃反应2小时。经PBS缓冲液(含钙、镁离子)清洗后，加入系列稀释的标靶融合蛋白于25℃培养2小时。经由PBS缓冲液(含钙、镁离子)清洗后，以小鼠抗-His-HRP抗体侦测蛋白结合到受体的情形，测量波长450nm的吸光值以量化结合于受体上的蛋白量。所得数据利用prism软件作非线性曲线拟合(curve fitting)可得蛋白结合的解离常数Kd值，进而可作为蛋白对不同受体结合能力的比较。

EGF、RGD-EGF、RGD4C-EGF与EGFR的解离常数K_d值分别为2.38、20.35及14.33nM。VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF与Integrin的解离常数K_d值分别为0、5.0及1.0。VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF与VEGFR1的解离常数K_d值分别为15.3、11.3及11.4。VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF与VEGFR2的解离常数K_d值分别为22.2、12.1及13.9。

参照图2A-2F，各类双重标靶融合蛋白可与两种以上的受体进行结合，具有双重标靶的能力。RGD-EGF及RGD4C-EGF可分别与Integrin(αvβ3)及EGFR结合，RGD-VEGF及RGD4C-VEGF可分别与Integrin(αvβ3)、VEGFR1及VEGFR2结合。

4.细胞结合试验

本实施例使用MDA-MB468(高度表现EGFR)、MDA-MB231(中度表现EGFR)、MCF-7(低度表现)、HT1080(表现APN)、U87MG(表现ααvβ3)与HUVEC(表现VEGFR与αvβ3)细胞株，以分析双重标靶融合蛋白与不同受体的专一性结合。

将MDA-MB468、MDA-MB231、MCF-7、HT1080、U87MG与HUVEC细胞，分别以20，000cells/well的量接种于96孔微量盘，于37℃培养12小时。待细胞贴附后，以4℃预冷的4％三聚甲醛(para-formadehyde)固定后，于室温培养15分钟。固定后的细胞与3％FBS于25℃培养1小时后，加入连续稀释的标靶融合蛋白，于25℃培养1小时。经PBS缓冲液(含1mmol/L CaCl₂及0.5mmol/L MgCl₂)清洗后，以老鼠抗-His-HRP抗体侦测蛋白结合到细胞的情形，再利用HRP的受质TMB呈色，测量波长450nm的吸光值，以量化结合于细胞上的蛋白量。所得数据利用prism软件作非线性曲线拟合(curve fitting)可得蛋白结合的解离常数K_d值。

EGF、RGD-EGF、RGD4C-EGF与MDA MB 468细胞上的EGFR的解离常数K_d值分别为16.38、26.97及22.22nM。VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF、NGR-VEGF与U87MG细胞上的intergrin的解离常数K_d值分别为1.74、1.83、1.9及1.9μM。VEGF、RGD-VEGF、RGD4C-VEGF、NGR-VEGF与HUVEC细胞上的VEGFR及intergrin的解离常数K_d值分别为12.7、11.9、6.4及9.4nM。

参照图3A-3D，RGD-EGF、RGD4C-EGF、RGD-VEGF及RGD4C-VEGF可与表达对应受体的细胞结合。

以RGD胜肽或VEGFR抗体与RGD-VEGF及RGD4C-VEGF于U87MG及HUVEC细胞中进行竞争性结合试验。竞争物的添加可有效降低RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与细胞的结合。结果证实，本发明的双重标靶分子可以专一性的结合至肿瘤的生物标记上。

5.细胞黏附试验

本实施例使用ECM细胞黏附分析系统来分析细胞的黏附特性。于96孔微量盘每孔涂覆不同浓度的标靶融合蛋白，于16℃培养12小时。待蛋白贴附后，加入3％BSA，于25℃培养1小时。将已饥饿(starvation)一小时的肿瘤细胞(U87MG，5x 10⁵cells/well)加至96孔微量盘，于37℃培养2小时后，以D-PBS清洗，去除未结合到蛋白的细胞。最后加入MTT，于37℃培养1小时，存活的细胞会将MTT药剂代谢成甲腊(formazan)蓝紫色结晶。以DMSO溶解甲腊，侦测波长570nm的吸光值。以下列公式计算细胞贴附特性。

细胞贴附(％)＝(试验组OD值/对照组OD值)×100％

参照图4A-D，将RGD-VEGF及RGD4C-VEGF涂覆于细胞盘后，可增加U87MG细胞及HUVEC细胞贴附于培养盘上的数量，若加入大量RGD胜肽链竞争，可减少细胞的吸附。图4A为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF涂覆于细胞盘后，可增加U87MG细胞贴附于培养盘上的数量，而图4B为添加RGDfV多肽后，细胞贴附于培养盘上的数量即受到抑制，图4C-4D为RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与HUVEC细胞结合后，再分别以RGDfV多肽或VEGFR2重组蛋白竞争，分别以吸光值及百分比表示。

6.细胞活化试验

以细胞实验测试，融合蛋白活化细胞受体及其下游讯息传递分子磷酸化反应。将各类人类肿瘤细胞与25nM标靶融合蛋白于37℃培养60分钟，收细胞内蛋白萃取物，以西方墨点法分析细胞受体及其下游讯号分子的磷酸化反应情形。

参照图5，将RGD-EGF及RGD4C-EGF与表达EGFR的MDA-MB468细胞共培养；或将RGD-VEGF及RGD4C-VEGF与表达VEGFR1和VEGFR2的HUVEC血管内皮细胞共培养。分析EGFR(图5A)或VEGFR(图5B)下游的讯息传递分子。RGD-EGF及RGD4C-EGF或RGD-VEGF及RGD4C-VEGF可分别活化EGFR或VEGFR下游的讯息传递途径。结果显示本发明双重标靶分子，不仅具有与相对生物标记分子结合的能力外，大胜肽分子，如EGF或VEGF，仍保有其原本的生物特性。

7.放射性标志标靶融合蛋白的制备

将2-(4-异硫氰酸苯)二乙三胺五乙酸(2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid，p-SCN-Bn-DTPA)溶于HEPES缓冲溶液中，加入RGD-EGF与RGD4C-EGF等标靶融合蛋白(融合蛋白：P-SCN-Bn-DTPA＝1∶5～20(摩尔比))于室温下反应1小时。利用以胶体层析法(Sephadax G25)去除未反应的小分子反应物，获得DTPA-RGD-EGF及DTPA-RGD4C-EGF等放射性标志前驱蛋白。加入适量的HEPES缓冲溶液及放射性(¹¹¹InCl₃、⁶⁷GaCl₃、⁹⁰YCl₃及¹⁷⁷LuCl₃等)至上述键结DTPA的融合蛋白溶液，于室温下反应1小时。加入过量的EDTA，螯合未结合于蛋白的放射性金属离子，并以薄膜过滤离心法及胶体层析法进行纯化，测量活性并以放射薄层分析法分析产物的放射化学纯度，并分析放射性标志融合蛋白于缓冲溶液(HEPES，4℃)及血清(37℃)的稳定度。参照图6，¹¹¹In-DTPA-RGD4C-EGF于Hepes缓冲液(4℃)及胎牛血清(37℃)的经时稳定度。将三者(原放射化学纯度皆大于95％)保存于Hepes缓冲液(4℃)及胎牛血清(37℃)中，经24小时后放射化学纯度仍高于90％。

8.细胞荧光摄影实验

肿瘤细胞或血管细胞(2.5x10⁵cells/well)于12孔细胞培养盘培养中，在37℃下，CO₂培养箱中培养一天。去除培养盘中的培养基，以1mL PBS清洗细胞后，分别加入VEGF、RGD-VEGF与RGD4C-VEGF，于37℃下，CO₂培养箱中静置2小时。去除培养基后，并以0.5mL PBS清洗3次，于添加anti-His₆荧光标志抗体后，直接以荧光显微镜观察并拍摄影像。参照图7，荧光摄影显示RGD-VEGF与RGD4C-VEGF标志重组蛋白可结合至细胞。

9.放射性标志重组蛋白的单光子及计算机断层扫瞄(SPECT/CT)造影

肿瘤小鼠(肿瘤大小约50-100mm³)分别于尾静脉注射500μCi的放射性标志重组蛋白。于注射后1、2、4、8、24、48及72小时进行小动物SPECT/CT造影。在造影结束后以软件处理影像，由影像圈选ROI(region of interest)分析计算肿瘤与肌肉积聚比(tumor tomuscle ratio)，评估药物于动物活体内的动态积聚变化。参照图8。荷U87MG皮下肿瘤小鼠经尾静脉注射¹¹¹In-DTPA-EGF、¹¹¹In-DTPA-RGD-EGF及¹¹¹In-DTPA-RGD4C-EGF后1、4、8及24小时，进行小动物单光子及计算机断层扫瞄(SPECT/CT)造影。影像显示施打In-111标志重组蛋白后，三者于肿瘤的专一性积聚(以肿瘤/肌肉积聚比值表示)皆随时间而提高，皆于药物注射后8小时达高峰，此时¹¹¹In-DTPA-RGD4C-EGF的肿瘤/肌肉积聚比为4.4，略高于¹¹¹In-DTPA-RGD-EGF的3.6，而远高于¹¹¹In-DTPA-EGF的1.7。

肿瘤专一性积聚量化分析结果显示，RGD4C-EGF及RGD-EGF融合蛋白皆具双重标靶能力，于肿瘤的积聚明显高于仅具单一标靶能力的EGF重组蛋白；此外，具环状RGD序列的RGD4C-EGF融合蛋白因与integrin αvβ3有较佳的结合能力，使其在肿瘤的积聚略优于具线性RGD序列的RGD-EGF融合蛋白。

所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示的特点均是等同或相似特点的一般系列的实例。

由上述可知，熟习此技艺者能轻易地了解本发明的必要特征，在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。

Claims

1.一种双重标靶药物载体，其特征是，包括第一标靶分子以及第二标靶分子；

所述第一标靶分子选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）或RGD4C；

所述第二标靶分子选自表皮生长因子（EGF）或血管内皮生长因子（VEGF）。

2.如权利要求1所述的双重标靶药物载体，其特征是，所述第一或第二标靶分子专一性地结合至肿瘤细胞或/和肿瘤微环境中的血管内皮细胞。

3.如权利要求1所述的双重标靶药物载体，其特征是，所述第一标靶分子以连接符与所述第二标靶分子连结。

4.如权利要求3所述的双重标靶药物载体，其特征是，所述连接符为5至20个氨基酸的胜肽。

5.如权利要求4所述的双重标靶药物载体，其特征是，所述连接符选自PGGGG或GGGGSGGGGS。

6.一种放射性标靶标志蛋白，其特征是，所述放射性标靶标志蛋白由如权利要求1所述的双重标靶药物载体及放射性核种所组成。

7.如权利要求6所述的放射性标靶标志蛋白，其特征是，所述双重标靶药物载体是通过金属螯合剂与所述放射性核种连接。

8.如权利要求7所述的放射性标靶标志蛋白，其特征是，所述金属螯合剂选自DTPA (二乙烯三胺五乙酸，diethylene triamine pentaacetic acid)、NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷，1,4,7-triazacyclononane-N,N',N''-triacetic acid)或DOTA (1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸，1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraaceticacid)。