CN108676801A - 一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以及该斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA的制备方法，本发明还公开了上述斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还进一步公开了一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针及其制备方法，以及该斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针在特异性标记卵母细胞以及鉴定卵母细胞类型中的应用。

Description

一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用。

背景技术

真核生物中只有小部分mRNA经过磷酸化，且带有poly(A)尾巴；而大部分的mRNA属于复制依赖性mRNA，不经过磷酸化，没有poly(A)尾巴，但是这类mRNA的3′端非编码区包含一个高度保守的茎环结构。该结构与一种特异结合在RNA上的蛋白质相互作用，这种蛋白质被称为茎环结合蛋白(SLBP或HBP)。前人的研究表明，茎环结合蛋白参与mRNA前体的合成、胚胎发育、细胞增殖等多种重要过程。SLBP一般有两种亚型，目前研究比较多的是2型，即SLBP2，编码SLBP2的基因就是slbp2。

石斑鱼属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)。石斑鱼肉质鲜美，营养丰富，经济价值高，是我国南方沿海主要的海水经济养殖鱼类。石斑鱼是雌雄同体鱼类，其个体发育过程中先雌后雄，存在性逆转现象。这一现象导致在人工繁殖过程中经常会出现雄鱼数量不足的问题，严重制约了石斑鱼人工繁殖技术的规模化生产和增养殖事业的发展。因此，探索石斑鱼性逆转的具体机制是很有必要的，信号特异、明显、可信的性别标记基因是研究过程中一项十分有效的工具，石斑鱼标记基因的开发对后续的实验研究十分重要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其制备方法和编码蛋白。

本发明的目的还在于提供一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针及其制备方法和应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

上述斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取斜带石斑鱼性腺总RNA；

(2)将提取的总RNA用SMART^TM PCR cDNA合成试剂盒逆转录出用于RACE的模板；

(3)设计两对特异的上下游引物，通过RACE扩增，获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA。

步骤(3)中所述的两对特异性的上下游引物，其中一对特异性的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示，另一对特异性的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

上述斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取斜带石斑鱼性腺总RNA；

(2)将提取的总RNA用SMART^TM PCR cDNA合成试剂盒逆转录出用于RACE的模板；

(3)设计两对特异的上下游引物，通过RACE扩增，获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA；

(4)选取slbp2的cDNA中比较保守的片段，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得产物进行电泳，回收目的产物，将目的片段进行重组质粒构建，筛选阳性克隆，提取质粒，用限制性核酸内切酶(ApaI,PstI)切割质粒，琼脂糖凝胶电泳后获取目的片段,然后将切得胶条进行回收，胶回收的产物用DIG探针试剂盒制备获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针。

步骤(4)中所述上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：9所示。

上述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针在特异性标记卵母细胞以及鉴定卵母细胞类型中的应用。

本发明中的探针可以特异性标记卵母细胞，定义卵母细胞所处的发育时期，同时可以在研究性逆转分子机制中鉴定细胞的类型。

本发明具有以下优点：

(1)本发明利用石斑鱼基因组数据库结合分子生物学方法设计了特异性引物，RACE扩增克隆得到slbp2基因的全长序列；

(2)本发明在ORF序列中选取特定的片段，逆转录用于原位杂交的探针，经检验，slbp2基因只在斜带石斑鱼雌性生殖细胞中表达，并且在不同发育阶段的卵母细胞中的表达量和表达部位不同，整个表达的过程中清晰的反映了巴氏小体的形成以及降解的过程；

(3)本发明为研究斜带石斑鱼性逆转机制提供了卵母细胞的特异性标记基因，为后续的实验研究奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中斜带石斑鱼slbp2在16个组织中的表达情况，其中，M为DS2000DNA Marker，1-16分别代表嗅球、端脑、间脑、小脑、延脑、下丘、垂体、心脏、头肾、胃、鳃、性腺、肾脏、肝脏、脾脏、肠16个组织；

图2是实施例1中斜带石斑鱼SLBP2与其他物种SLBP之间的同源性分析情况；

图3是实施例2中斜带石斑鱼slbp2探针的电泳图，M为DS 2000DNAMarker，P是slbp2探针；

图4是实施例3中斜带石斑鱼slbp2在卵母细胞不同发育阶段的表达情况，a代表卵原细胞期性腺，b代表含有大量初级生长阶段卵母细胞(PO)的性腺，c代表大量卵母细胞含有大量皮质小泡(PVO)时期的性腺，d卵黄生成阶段(VO)的性腺；

图5是实施例3中斜带石斑鱼slbp2mRNA在卵母细胞不同发育阶段的定位情况，A代表卵原细胞期性腺，B代表含有大量初级生长阶段卵母细胞(PO)的性腺，C代表大量卵母细胞含有大量皮质小泡(PVO)时期的性腺，D卵黄生成阶段(VO)的性腺，a-d分别代表slbp2探针阴性图，作为阴性对照；

图6是实施例3中斜带石斑鱼slbp2在不同发育阶段的卵母细胞中的表达模式图；

图7是实施例3中斜带石斑鱼slbp2mRNA在人工诱导性逆转过程中的表达情况，a、c、e分别代表性逆转早期、中期、末期的性腺，g是天然雄性性腺，b、d、g、h分别是a、c、e、g对应的DAPI(细胞核专用染料)染核图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特殊说明，本发明采用的设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1斜带石斑鱼slbp2的基因克隆

1、斜带石斑鱼16个组织总RNA的提取

取斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)，体长30～40cm，体重1～1.5kg，以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，分离出嗅球、端脑、间脑、小脑、延脑、下丘、垂体、心脏、头肾、胃、鳃、性腺、肾脏、肝脏、脾脏、肠16个组织，于液氮中速冻后，存放于-80℃冰箱备用。采用Trizol试剂法提取斜带石斑鱼16个组织的总RNA，其OD_260/280＝1.90。

2、斜带石斑鱼slbp2在16个组织中的分布情况

将步骤1中的斜带石斑鱼16个组织的RNA反转录为cDNA，PCR检测各个组织中slbp2的表达情况。经检测，性腺中表达量最高，肾脏中有少量表达，其他组织中均无表达(图1)。

3、斜带石斑鱼slbp2基因cDNA全序列的克隆

cDNA文库的构建

利用SMART^TM PCR cDNA扩增试剂盒(Clontech)构建cDNA文库，依照说明书进行实验操作，所有使用的离心管、枪头都是经过无酶处理的。用试剂盒相应的步骤合成模板，并根据终产物的浓度加入相应的缓冲液，-20℃保存三个月。

斜带石斑鱼slbp2基因cDNA全序列的克隆

根据NCBI数据库中其他物种的slbp2基因片段，设计特异的两对上下游引物SEQID NO：3(CGGCGACAGAAACAGATA)，SEQ ID NO：4(GTACAGTCGTCGCTCTTG)，SEQ ID NO：5(ACACCACCACCTTCTTCC)，SEQ ID NO：6(TCTCATCATCTTCCACCTG)，PCR扩增所用DNA聚合酶是高保真的Taq DNA聚合酶，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物进行第一轮PCR反应完成之后把第一轮的PCR反应产物稀释100倍作为第二轮的PCR反应的模板，用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行第二轮的PCR扩增。第二轮的PCR反应产物上样进行2％琼脂糖凝胶电泳，若有目的条带则切胶回收。

将切下的凝胶纯化回收以得到目的产物，然后将目的产物连接至pGEM-easy载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆送公司测序。Blast同源比对分析表明，得到slbp2基因3＇、5＇端非编码序列，通过软件拼接重合部分，即可得到slbp2基因的cDNA全序列。ATG位于27-30核苷酸，终止密码子位于795-798核苷酸，开放读码框为798个核苷酸，推测编码一个225个氨基酸的蛋白。5’UTR为27bp，3’UTR为798bp，3’UTR存在典型的加尾信号AATAAA。RACE扩增得到slbp2基因cDNA的全序列SEQ ID NO：1，并预测出相应的氨基酸序列SEQID NO:2，黑色粗体区域即为实施例2中的探针序列(SEQ ID NO:7)。

4、斜带石斑鱼SLBP2与其他物种的同源性分析

利用MEGA 6.06软件将斜带石斑鱼预测的氨基酸序列与其他物种的SLBP进行同源性比对，比对结果如图2。结果表明，斜带石斑鱼SLBP2与爪蟾聚到一支，可能二者的SLBP2在进化距离上较近。

实施例2斜带石斑鱼slbp2基因特异性探针的制备

cDNA第一链的合成

取10μg斜带石斑鱼性腺总RNA样品进行DNAase I处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT混合，进行反转录PCR，所得的产物置于-20℃保存备用。

斜带石斑鱼slbp2基因探针序列的克隆

根据实例1中的slbp2全长序列，选取slbp2基因序列中比较保守的一段SEQID NO：7，分别在该片段的3＇、5＇端设计引物SEQ ID NO：8(CAGCAACAAACCTCGAAGGC)，SEQ ID NO：9(CGGAGCCAGTCAGTCATGTT)，进行PCR扩增，所得PCR产物上样进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pGEM-easy载体转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源比对分析表明，目的产物为slbp2探针，序列如SEQ ID NO：7所示。

斜带石斑鱼slbp2重组质粒的构建

将获取的目的片段进行重组质粒构建，筛选阳性克隆，提取质粒，用限制性核酸内切酶(ApaI,PstI)切割质粒获取目的片段(666bp)后胶回收，回收到的DNA片段用DIG探针试剂盒制备探针。整个过程保证无RNA酶的污染，冰上操作。纯化后的探针在RNA专区，用2％琼脂糖凝胶低电压电泳分离RNA片段，出现目的大小片段并且条带单一清晰，则探针可用(图3)。探针放在-80℃保存，稀释后的可放于-20℃留用。

实施例3斜带石斑鱼slbp2探针与不同时期性腺组织原位杂交

斜带石斑鱼性腺组织的处理

取新鲜的性腺组织块1cm³左右立即放入4％多聚甲醛中，4℃过夜。30％蔗糖浸泡样品，4℃摇床过夜。30％蔗糖和OCT包埋剂(樱花)按照1:1的比例处理样品2～4小时后，在干冰上用OCT包埋剂包埋样品，凝固后样品放入-80℃保存。

斜带石斑鱼性腺组织冰冻切片

冷冻切片机(Lecia)事先预冷到-20℃，包埋好的组织块先放入冷冻切片机(Lecia)腔体内平衡30～60分钟，然后进行切片。未成熟的卵巢组织切片厚度为7μm，卵母细胞含有大量卵黄颗粒的性腺组织切片厚度为8-10μm。切片放入-80℃保存。

原位杂交

取不同时期卵巢性腺切片42℃烘45分钟，随后即可开展为期两天的原位杂交。探针的浓度为0.5-1ng/μL，杂交温度为55～65℃，具体条件需要根据实际情况作出调整。整个过程保证无RNA酶的污染。

第一天流程：1×PBS(DEPC水配置)下复水30分钟，预杂交液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，0.5mg/ml鲑鱼精RNA，1×Denhard＇s，5％硫酸葡聚糖)65℃孵育1h，然后用加入探针的预杂交液65℃过夜。

第一天流程：50％甲酰胺：2×SSCT＝1:1洗脱30min，洗2次；2×SSCT洗脱15min；0.2×SSCT洗脱30min，洗2次。洗脱过程都是在65℃的烘箱中进行的。室温封闭1h之后，用Anti-DIG-AP孵育2h，最后用NBT/BCIP Stock Solution显色。

图4是斜带石斑鱼slbp2在卵母细胞不同发育阶段的表达情况，a代表卵原细胞期性腺，b代表含有大量初级生长阶段卵母细胞(PO)的性腺，c代表大量卵母细胞含有大量皮质小泡(PVO)时期的性腺，d卵黄生成阶段(VO)的性腺。结果显示斜带石斑鱼slbp2在卵原细胞中表达量极低，在初级生长阶段卵母细胞中大量积累，随后slbp2表达量逐渐降低。

图5是斜带石斑鱼slbp2在卵母细胞不同发育阶段的定位情况，A代表卵原细胞期性腺，B代表含有大量初级生长阶段卵母细胞(PO)的性腺，C代表大量卵母细胞含有大量皮质小泡(PVO)时期的性腺，D卵黄生成阶段(VO)的性腺。

图5原位杂交结果显示，当卵母细胞处于初级生长阶段的早期，slbp2mRNA汇聚在细胞核周的巴氏小体中，形成一个致密的球体。当卵母细胞处于初级生长阶段的中期，这个致密体逐渐远离细胞核，迁移到细胞质；当卵母细胞处于初级生长阶段的末期，巴氏小体消失，slbp2mRNA分散在细胞质中。在皮质小泡期卵母细胞中，slbp2mRNA在细胞质中的信号大大减弱，主要汇聚在细胞的一侧边缘；在卵黄生成期的卵母细胞中，slbp2mRNA在细胞质中几乎没有检测不到信号，或是仅在细胞的一侧边缘有少量信号。

图6是斜带石斑鱼slbp2在不同发育阶段的卵母细胞中的表达模式图。

图7斜带石斑鱼slbp2mRNA在人工诱导性逆转过程中的表达情况。结果显示，slbp2在卵母细胞中的表达定位情况与图5一致，并且slbp2在雄性生殖细胞中并无表达，再次证明slbp2是卵母细胞特异的标记基因。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中山大学

海南晨海水产有限公司

阳江职业技术学院

<120> 一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1866

<212> DNA

<213> 茎环结合蛋白 (stem loop binding protein)

<400> 1

acatggggtg aaactcaaac tgcaatcatg tcaaccagca gagtggaaac agccgctcac 60

agcccgctgc tctcctccag cttgtgtttc agcccgtggt catgcgtctg tgtgaagggc 120

tggtcagccg ccatgtggaa cggcctcccc gacccgctgc tgactgctgc caactcctcc 180

agatgctccg cccccgagcc atggctcctc cccggctgca gctccgtctt cgacagcctg 240

gtcagtaaca cgtctccgac cccatctcct cctgctgcca gcggcctgag aggacgagag 300

cgagctgtca gcaacaaacc tcgaaggccg tccatcctgg agcgatgtat cctcaaagtg 360

tccaccagca gtgtcgctgt ggggacagaa gatctggaca acaagcggcc ccctatcggc 420

cgctgctacc cccgcctccc ggacccggcc aacaccgaga ccaacggtgc ggttctgaag 480

cggcggcaga aacagatcca gtacggtaaa aacaccagcg gctaccagaa ctacctgcag 540

caagtcccca aacatatgag ggacgccaaa ctccacccgt ccacccccaa caagtacagg 600

aagtacagcc ggcgctcctg ggacatgcag gtgcgtctgt ggaggcgagc gctgcacctt 660

tgggaccctc catctgagag ccagccggac gccaccgaca cacatgaccc agtggagcaa 720

ctgcagagcc agctggcgaa gatgacctcc gacctgtgtg aggacggaga agacaagcag 780

agagagaagg agactccaga agcctctaaa gcctcctctg tgtctcctct gtcggctgtg 840

atgtcgctgg agctgcctgg atcctggaac gtcccgctgt caccggaggc tgagatgaac 900

ctcaggacac tgcgctctcc tccaggcctc agccagctga ccaacgacaa caacaacatg 960

actgactggc tccgccttct gctggaggct gacaacgacc aagatttcgg ctccgatgac 1020

cagcaggttc ctgtgttttc tgaccagctc ttttggaacc cgtactgaat gtcagcagat 1080

ctccactgac ctgaaacaaa cgacgttcag ccgtctgtca acatcataaa ctcctcgatc 1140

atcatcaagg agacgtcgtt ggtcctgaag gtgtcagagt aaagtttgtg tgtttccagt 1200

acgtttgact ttttaagatg gttgaaaatt tactataacg acagcaggga tgtgattggt 1260

ccttgatcta ccccccccac cctccacgag gaggaactac cctccgctcc tgcaggggtg 1320

ttgaggtttc ccagctgctc ttgaaagtgt cctctggtcg gacagctgga cactttgacc 1380

tgagcatggt actgtagttt gcacgttgta tatttctgtt gacctgcgtc agatggagca 1440

cttctcacct gcatcatgtt ttagttttag gaatcctgca ctgatggaaa gctgctaatt 1500

tattttattt gaagtcacaa atttatttaa caaacccatg tggtgtcact tcatggcctc 1560

tctgcaggct gttgtctttg gtccaccatc accgtcatgc tctgccgtct gtctgtctgt 1620

ctgtctgtct gtccggatca ggctccagct cctcctctct acctcatgtt ttttctaaaa 1680

aacagaaacc ctgattgtcg gagggaaaca gctgtcactt tgtgttgtcg gttttctttt 1740

actttttctc aatttgtcat tttgcgctgc tcgaatatcg agaccaaagc tgaaagatgt 1800

gattaataaa gatgtaaata aagtgttata aattcacaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaa 1866

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 茎环结合蛋白 (stem loop binding protein)

<400> 2

Met Ser Thr Ser Arg Val Glu Thr Ala Ala His Ser Pro Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ser Ser Leu Cys Phe Ser Pro Trp Ser Cys Val Cys Val Lys Gly Trp

20 25 30

Ser Ala Ala Met Trp Asn Gly Leu Pro Asp Pro Leu Leu Thr Ala Ala

35 40 45

Asn Ser Ser Arg Cys Ser Ala Pro Glu Pro Trp Leu Leu Pro Gly Cys

50 55 60

Ser Ser Val Phe Asp Ser Leu Val Ser Asn Thr Ser Pro Thr Pro Ser

65 70 75 80

Pro Pro Ala Ala Ser Gly Leu Arg Gly Arg Glu Arg Ala Val Ser Asn

85 90 95

Lys Pro Arg Arg Pro Ser Ile Leu Glu Arg Cys Ile Leu Lys Val Ser

100 105 110

Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Thr Glu Asp Leu Asp Asn Lys Arg Pro

115 120 125

Pro Ile Gly Arg Cys Tyr Pro Arg Leu Pro Asp Pro Ala Asn Thr Glu

130 135 140

Thr Asn Gly Ala Val Leu Lys Arg Arg Gln Lys Gln Ile Gln Tyr Gly

145 150 155 160

Lys Asn Thr Ser Gly Tyr Gln Asn Tyr Leu Gln Gln Val Pro Lys His

165 170 175

Met Arg Asp Ala Lys Leu His Pro Ser Thr Pro Asn Lys Tyr Arg Lys

180 185 190

Tyr Ser Arg Arg Ser Trp Asp Met Gln Val Arg Leu Trp Arg Arg Ala

195 200 205

Leu His Leu Trp Asp Pro Pro Ser Glu Ser Gln Pro Asp Ala Thr Asp

210 215 220

Thr His Asp Pro Val Glu Gln Leu Gln Ser Gln Leu Ala Lys Met Thr

225 230 235 240

Ser Asp Leu Cys Glu Asp Gly Glu Asp Lys Gln Arg Glu Lys Glu Thr

245 250 255

Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Val Ser Pro Leu Ser Ala Val Met

260 265 270

Ser Leu Glu Leu Pro Gly Ser Trp Asn Val Pro Leu Ser Pro Glu Ala

275 280 285

Glu Met Asn Leu Arg Thr Leu Arg Ser Pro Pro Gly Leu Ser Gln Leu

290 295 300

Thr Asn Asp Asn Asn Asn Met Thr Asp Trp Leu Arg Leu Leu Leu Glu

305 310 315 320

Ala Asp Asn Asp Gln Asp Phe Gly Ser Asp Asp Gln Gln Val Pro Val

325 330 335

Phe Ser Asp Gln Leu Phe Trp Asn Pro Tyr

340 345

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggcgacaga aacagata 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacagtcgt cgctcttg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaccaccac cttcttcc 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcatcatc ttccacctg 19

<210> 7

<211> 666

<212> DNA

<213> 茎环结合蛋白 (stem loop binding protein)

<400> 7

cagcaacaaa cctcgaaggc cgtccatcct ggagcgatgt atcctcaaag tgtccaccag 60

cagtgtcgct gtggggacag aagatctgga caacaagcgg ccccctatcg gccgctgcta 120

cccccgcctc ccggacccgg ccaacaccga gaccaacggt gcggttctga agcggcggca 180

gaaacagatc cagtacggta aaaacaccag cggctaccag aactacctgc agcaagtccc 240

caaacatatg agggacgcca aactccaccc gtccaccccc aacaagtaca ggaagtacag 300

ccggcgctcc tgggacatgc aggtgcgtct gtggaggcga gcgctgcacc tttgggaccc 360

tccatctgag agccagccgg acgccaccga cacacatgac ccagtggagc aactgcagag 420

ccagctggcg aagatgacct ccgacctgtg tgaggacgga gaagacaagc agagagagaa 480

ggagacacca gaagcctcta aagcctcctc tgtgtctcct ctgtcggctg tgatgtcgct 540

ggagctgcct ggatcctgga acgtcccgct gtcaccggag gctgagatga acctcaggac 600

tctgcgctct cctccaggcc taagccagct gaccaacgac aacaacaaca tgactgactg 660

gctccg 666

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcaacaaa cctcgaaggc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggagccagt cagtcatgtt 20

Claims (8)

1.一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的编码蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)提取斜带石斑鱼性腺总RNA；

(2)将提取的总RNA用SMART^TM PCR cDNA合成试剂盒逆转录出用于RACE的模板；

(3)设计两对特异的上下游引物，通过RACE扩增，获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA。

4.根据权利要求3所述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA的制备方法，其特征是：步骤(3)中所述的两对特异性的上下游引物，其中一对特异性的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示，另一对特异性的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6。

5.一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

6.权利要求5所述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)提取斜带石斑鱼性腺总RNA；

(2)将提取的总RNA用SMART^TM PCR cDNA合成试剂盒逆转录出用于RACE的模板；

(3)设计两对特异的上下游引物，通过RACE扩增，获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA；

(4)选取slbp2的cDNA中比较保守的片段，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得产物进行电泳，回收目的产物，将目的片段进行重组质粒构建，筛选阳性克隆，提取质粒，用内切酶切割质粒获取目的片段后胶回收，胶回收的片段用DIG探针试剂盒制备获得斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针。

7.权利要求6所述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针的制备方法，其特征是：步骤(4)中所述上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：9所示。

8.权利要求5所述的斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的特异性探针在特异性标记卵母细胞以及鉴定卵母细胞类型中的应用。