CN108676075A - 一种引导蛋白分子进入植物细胞核的方法 - Google Patents
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Abstract
一种引导蛋白分子进入植物细胞核的方法，目的是寻求一段特定的氨基酸序列，该序列能够被转运蛋白复合体识别和结合，从而将携带该序列的蛋白质分子转运至细胞核内；本发明采用一段特定的氨基酸序列引导蛋白质分子进入植物细胞核，从而使蛋白质分子发挥其在细胞核的相应功能；该氨基酸序列的单字母代码为：qanrkvslqryrekrkdr；其三字母代码为：GlnAlaAsnAArgLysValSerLeuGlnArgTyrArgGluLysArgLysAspArg；由于三联体密码子的简并性，上述氨基酸序列可对应无数条核苷酸序列，例如其中一条如下所示：CAGGCGAACAGAAAGGTATCTTTGCAAAGATATCGTGAAAAGCGGAAAGACAGA；与该氨基酸序列相对应的所有核酸序列都具有相同功能。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种引导蛋白分子进入植物细胞核的方法。
背景技术
一个细胞含有多种细胞器和多种蛋白质分子，特定分子实现其功能需要到达细胞中特定的位置，特别是进入特定的细胞器。比如，转录因子需要在进入细胞核中才能结合到基因组特定基因的转录调控区域从而启动基因的转录表达。在生物学的研究中有时需要将特定的蛋白质分子送入细胞核中研究其功能，或在基因工程技术的应用中，特定的蛋白质分子必须进入细胞核才能实现该蛋白质分子的功能。为了实现此目的，一种方法是让蛋白质分子携带一个引导入核的信号或序列，只要这个序列存在，细胞内的入核转运机制就能识别，并由转运蛋白复合体将该蛋白分子从细胞质运送到细胞核。这个序列可以在蛋白质分子的N端或C端或中间。细胞中存在多种引导入核的蛋白序列，本发明判定了一种新的序列，能够使蛋白质分子引导入植物细胞核中。
发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种引导蛋白分子进入植物细胞的细胞核的方法，该方法寻求一段特定的氨基酸序列，该序列能够被转运蛋白复合体识别和结合，从而将携带该序列的蛋白质分子转运至细胞核内。
本发明采用一段特定的氨基酸序列引导蛋白质分子进入植物细胞核，从而使蛋白质分子发挥其在细胞核的相应功能；确定了这样一个信号或序列，可以以融合的方式放在蛋白质分子的N端或C端或中间。该氨基酸序列的单字母代码为：qanrkvslqryrekrkdr，其三字母代码为：GlnAlaAsnAArgLysValSerLeuGlnArgTyrArgGluLysArgLysAspArg，由18个氨基酸组成。与此相对应的核苷酸该序列由54个组成，容易与目的基因序列连接制成带有入核信号的融合蛋白。目的基因可以是编码DNA的结合蛋白或编码DNA内切酶等。由于三联体密码子的简并性，上述氨基酸序列可对应无数条核苷酸序列，例如其中一条如下所示：CAGGCGAACAGAAAGGTATCTTTGCAAAGATATCGTGAAAAGCGGAAAGACAGA；与该氨基酸序列相对应的所有核酸序列都具有相同功能。
该序列在蛋白质分子序列的N端或C端或序列的中间都具有将整个分子引入植物细胞的细胞核的功能。携带该特定序列的蛋白质分子进入植物细胞核，从而使蛋白质分子发挥其在细胞核的相应功能，主要包括与基因组DNA相结合从而激活或抑制基因的表达，或特异剪切基因组DNA从而完成基因组编辑等。将该序列与编码绿色荧光蛋白的核酸序列结合，克隆到CaMV35S启动子和NOS终止子的中间，形成携带入核信号的绿色荧光蛋白表达单元，当基因在植物细胞中表达后，由于入核信号的存在，绿色荧光蛋白积聚于细胞核中，如图1、2、3所示，而未携带入核信号的绿色荧光蛋白分子没有在植物细胞核中积聚，如图4、5、6所示。
本发明主要适用于植物基因工程，其特点是发明了一种引导蛋白质分子进入植物细胞核的新序列。该序列能够被转运蛋白复合体识别和结合，从而将携带该序列的蛋白质分子转运至细胞核内。
附图说明
图1是用核酸染料DAPI染色后细胞核的位置显示图；
图2是相同视野下被转化的细胞中绿色荧光蛋白分子在细胞核中积聚显示图；
图3是相同视野的白光下的洋葱表皮细胞显示图；
图4是用核酸染料DAPI染色后细胞核的位置显示图；
图5是相同视野下被转化的细胞中绿色荧光蛋白分子分布在细胞中的状况显示图；
图6是相同视野的白光下的洋葱表皮细胞显示图。
具体实施方式
图1、2和3显示，本发明中的入核引导序列与编码绿色荧光蛋白的核酸序列融合后在CaMV35S启动子的驱动下表达，融合蛋白在细胞核中聚集状况。用基因枪将含有表达单元的质粒转入洋葱的表皮细胞，5天后在200X的显微镜下观察并照相记录。
作为对照，图4、5和6显示，本发明中没有携带入核序列的绿色荧光蛋白表达的状况，在CaMV35S启动子的驱动下，表达的绿色荧光蛋白质分子没有在细胞核中聚集。用基因枪将含有表达单元的质粒转入洋葱的表皮细胞，5天后在200X的显微镜下观察并照相记录。
将本发明中的入核信号的核酸序列与任何一个需要导引入核的蛋白质分子的核酸序列融合，其融合方式可通过基因合成、用DNA连接酶连接不同的DNA片段或overlap-PCR扩增等方法完成，融合部位可在蛋白质分子的N端或C端或中间的任何部位。当将该序列置于蛋白质分子中间时，要注意保持蛋白分子功能的完整性，以免由于蛋白质结构发生改变而导致功能受到影响或破坏。融合的分子在植物细胞中表达为蛋白质时，由于携带了入核的信号或序列，将会被运送到细胞核内。例如在基因组编辑技术中，被称为分子剪刀的特异性核酸内切酶必须进入细胞核才能剪切基因组DNA，将编码特异性核酸内切酶的序列与本发明中的序列融合，融合后的核酸序列被构建在表达单元中，即构建在合适的启动子和终止子的中间。当此表达单元序列被引入植物受体的细胞核内或基因组中后，融合的基因被转录，之后在核糖体内翻译成蛋白质。由于该蛋白质分子带有入核的引导序列或入核的信号序列，该分子就会进入细胞核实现其设定的功能。
Claims (4)
1.一种引导蛋白分子进入植物细胞核的方法，其特征是采用一段特定的氨基酸序列引导蛋白质分子进入植物细胞核，从而使蛋白质分子发挥其在细胞核的相应功能；该氨基酸序列的单字母代码为：qanrkvslqryrekrkdr，其三字母代码为：
GlnAlaAsnAArgLysValSerLeuGlnArgTyrArgGluLysArgLysAspArg。
2.如权利要求1所述的引导蛋白分子进入植物细胞核的方法，其特征是由于三联体密码子的简并性，上述氨基酸序列可对应无数条核苷酸序列，例如其中一条如下所示：CAGGCGAACAGAAAGGTATCTTTGCAAAGATATCGTGAAAAGCGGAAAGACAGA；与该氨基酸序列相对应的所有核酸序列都具有相同功能。
3.如权利要求1或2所述的引导蛋白分子进入植物细胞核的方法，其特征是该序列在蛋白质分子序列的N端或C端或序列的中间都具有将整个分子引入植物细胞的细胞核的功能。
4.如权利要求1或2所述的引导蛋白分子进入植物细胞核的方法，其特征是携带该特定序列的蛋白质分子进入植物细胞核，从而使蛋白质分子发挥其在细胞核的相应功能，主要包括与基因组DNA相结合从而激活或抑制基因的表达，或特异剪切基因组DNA从而完成基因组编辑。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003008536A2 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Ahram Biosystems Inc. | A system for intracellular process monitoring and in vivo drug screening |
| US20030084482A1 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-01 | Gerald Hall | Production of proteins in plants |
| WO2008003666A1 (en) * | 2006-07-07 | 2008-01-10 | Bayer Bioscience N.V. | Transplastomic plants expressing lumen-targeted protein |
| CN102260679A (zh) * | 2010-05-27 | 2011-11-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调控果实和种子发育的蛋白及其应用 |
| CN102584975A (zh) * | 2012-02-08 | 2012-07-18 | 清华大学深圳研究生院 | 一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用 |
| KR20120125709A (ko) * | 2011-05-09 | 2012-11-19 | 경상대학교산학협력단 | ＡｔＰＰ５ 변이 유전자 컨스트럭트를 지닌 열 완충성이 증진된 형질전환 아라비돕시스 식물체 |
| CN103254293A (zh) * | 2012-02-15 | 2013-08-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种液泡膜定位序列及其应用 |
| WO2016071830A2 (en) * | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Agresearch Limited | Methods for plant improvement |
| CN107105627A (zh) * | 2014-11-04 | 2017-08-29 | 农牧研究公司 | 用于单子叶植物改良的方法 |
-
2018
- 2018-06-01 CN CN201810554472.XA patent/CN108676075B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030084482A1 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-01 | Gerald Hall | Production of proteins in plants |
| WO2003008536A2 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Ahram Biosystems Inc. | A system for intracellular process monitoring and in vivo drug screening |
| WO2008003666A1 (en) * | 2006-07-07 | 2008-01-10 | Bayer Bioscience N.V. | Transplastomic plants expressing lumen-targeted protein |
| CN102260679A (zh) * | 2010-05-27 | 2011-11-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调控果实和种子发育的蛋白及其应用 |
| KR20120125709A (ko) * | 2011-05-09 | 2012-11-19 | 경상대학교산학협력단 | ＡｔＰＰ５ 변이 유전자 컨스트럭트를 지닌 열 완충성이 증진된 형질전환 아라비돕시스 식물체 |
| CN102584975A (zh) * | 2012-02-08 | 2012-07-18 | 清华大学深圳研究生院 | 一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用 |
| CN103254293A (zh) * | 2012-02-15 | 2013-08-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种液泡膜定位序列及其应用 |
| WO2016071830A2 (en) * | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Agresearch Limited | Methods for plant improvement |
| CN107105627A (zh) * | 2014-11-04 | 2017-08-29 | 农牧研究公司 | 用于单子叶植物改良的方法 |
| CN107205355A (zh) * | 2014-11-04 | 2017-09-26 | 农牧研究公司 | 用于植物改良的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| DEREK等: "PEAPOD regulates lamina size and curvature in Arabidopsis.", 《PNAS》 * |
| GABRIELA LACATUS等: "The Arabidopsis PEAPOD2 transcription factor interacts with geminivirus AL2 protein and the coat protein promoter.", 《VIROLOGY》 * |
| GLENN R.HICKS ET AL: "Protein import into the nucleus: An integrated View.", 《ANNUAL REVIEW OF CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 * |
| MARY CHRISTIE等: "Structural Biology and regulation of protein import into the nucleus.", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 * |
| 杨万年等: "植物体内核定位信号介导的蛋白质核转运", 《湖北民族学院学报（自然科学版）》 * |
| 陈曦: "蛋白质的入核运送和它在基因表达中的调节作用", 《生物化学与生物物理进展》 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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