CN108659126B - 抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人载脂蛋白A1(ApoA1)鼠源单克隆抗体D11‑10，所述ApoA1单抗D11‑10的重链亚型为IgG_2b，轻链亚型为κ，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。相较于现有基于ApoA1多抗而建立的ApoA1检测方法，本发明基于该ApoA1单抗D11‑10建立的ApoA1检测方法，能够显著提高冠心病(CHD)的检出率，尤其对于HDL‑C在正常范围的CHD患者，检出率有显著提高。因此，本发明基于ApoA1单抗D11‑10建立的全新的检测方法，能更好体现ApoA1的检测值与心脑血管疾病的相关性，对于心脑血管疾病的诊断、预防和管理具有重要的临床意义。

Description

抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种抗人载脂蛋白A1(ApoA1)鼠源单克隆抗体D11-10及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及利用该单克隆抗体在临床检测人外周血中ApoA1蛋白的含量以预测发生心脑血管疾病的风险及其对该疾病的诊断。

背景技术

载脂蛋白A1(ApoA1)是高密度脂蛋白(HDL)的主要结构蛋白，其生理作用在于能帮助HDL捕获游离胆固醇。此外，ApoA1还有稳定环前列腺素，促进血管舒张并抑制血小板凝聚，抵抗血管斑块形成等作用。

传统上，临床使用HDL-C和ApoA1蛋白的检测来反映体内HDL代谢的水平。血清/血浆中ApoA1和HDL-C水平的降低，提示心脑血管疾病(CHD、脑卒中等)的危险性增加，是心脑血管疾病危险性评价的灵敏指标之一。

然而目前有研究显示，在超过13万CHD患者中，逾4成患者的HDL-C水平处于正常范围，所以HDL-C并不能完全有效地反映疾病风险。贝特类、烟酸和胆甾醇酯转运蛋白(CETP)阻滞剂等提升HDL-C水平的药物都不能减少终点事件(全因或CHD引起的死亡率)，且无法降低卒中风险率，进一步提示HDL-C不能真实反应体内HDL的代谢情况。HDL由新生到成熟，再到被肝脏回收降解是一系列复杂的动态过程。通过超速离心和双向电泳的方法可以将体内代谢过程中的HDL分为不同的亚型，临床相关性研究显示HDL的亚型变化较HDL-C更能反应与心脑血管疾病的相关性。因此，监测体内特定的与疾病相关的功能性HDL亚型显得尤为重要。

目前实验室采用的HDL亚型分离和鉴定方法操作难度大、技术要求高、实验时间长，难于满足临床快速、高通量的检测要求，不适合临床应用。虽然检测血清中HDL的主要蛋白成分ApoA1，在一定程度能够反映体内HDL的代谢状态。但是，检测方法大多是基于ApoA1多克隆抗体的免疫学法，不能检测到HDL亚型的变化。因此，开发一种全新的、既能满足临床快速和高通量要求，又能检测与心脑血管疾病相关的HDL亚型的方法，对于心脑血管疾病的预防和管理具有重要的临床意义。

发明内容

本发明制备了一种ApoA1单克隆抗体D11-10，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链亚型为IgG_2b，轻链亚型为κ，由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10所分泌，所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号CGMCC No.13807。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供了一种ApoA1单克隆抗体D11-10，所述ApoA1单克隆抗体D11-10能够识别ApoA1蛋白特异抗原表位，并能据此甄别与心脑血管疾病相关的HDL特定亚型(D11-10亚型)。

本发明中，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；编码所述重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述ApoA1单抗D11-10能与重组的人ApoA1发生特异性的反应，所述ApoA1单抗D11-10与重组的人ApoA1结合力为1.73×10^-10M，其不与相同表达系统中得到的重组蛋白血清淀粉样蛋白A1(SAA1)和β₂微球蛋白(β₂M)发生反应，也不与市售天然的牛血清白蛋白(BSA)发生反应。

本发明中，所述ApoA1单抗D11-10的制备过程包括：利用杂交瘤细胞系在小鼠腹腔制备含D11-10单抗的腹水，经Protein A/G柱亲和层析纯化获得单抗。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体的亚型和亲和力。

本发明中，所述ApoA1单抗D11-10能够甄别特定构象HDL颗粒中的ApoA1，所述能被该单抗甄别的特定HDL构象被称为HDL D11-10亚型。

本发明发现了HDL D11-10亚型与CHD的高度相关性，提出了ApoA1单抗D11-10在制备用于诊断心脑血管疾病的产品中的应用。其中，所述心脑血管疾病体外诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。

本发明还提供了一种心脑血管疾病的诊断产品，包括如上所述的ApoA1单抗D11-10；其中，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体等免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。

本发明还提供了一种预测待测对象发生心脑血管疾病的风险的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的ApoA1蛋白含量，对待测对象发生心脑血管疾病的风险进行预测，当待测对象的ApoA1蛋白含量低于正常人群的参考值时，预测发生心脑血管疾病的风险较高。

本发明还提供了一种诊断心脑血管疾病的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的ApoA1蛋白的含量，对心脑血管疾病进行诊断。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括如上所述的ApoA1单抗D11-10。

本发明还提供了所述心脑血管疾病的诊断产品的应用，所述心脑血管疾病的诊断产品可通过ApoA1单抗D11-10识别、定量特定的ApoA1抗原表位，来反映外周血中HDL D11-10亚型的水平，以监测心脑血管疾病风险及用于心脑血管疾病的诊断。

本发明中，所述心脑血管疾病的诊断产品可以用于全血、血清或血浆中以及组织提取物中的ApoA1的检测。

本发明中，所述心脑血管疾病主要包括由血管斑块形成导致的疾病。

本发明中，所述心脑血管疾病为CHD、脑卒中或动脉粥样硬化。

本发明的有益效果在于，本发明所述ApoA1单抗D11-10能够通过识别特定ApoA1抗原表位来甄别HDL D11-10亚型，该单抗与重组人ApoA1蛋白的结合力为1.73×10^-10M，具有较高的亲和力和特异性；并且在本发明所测定的蛋白中，该单抗只与重组的以及血中天然的ApoA1发生特异性反应，不与如SAA1、β2M和BSA等无关蛋白反应。所述ApoA1单抗D11-10对群体不同样本的测试结果呈离散型分布，提示其能够反映样本间的HDL异质性，即能够通过对ApoA1的检测，来反映样本中HDL D11-10亚型的水平。相较于现有HDL-C检测技术和ApoA1免疫比浊试剂盒(以ApoA1多抗为基础)的检测结果，本发明HDL D11-10亚型与CHD疾病更具相关性，能够更显著区分CHD和对照组，尤其提高了HDL-C在正常参考范围内的经冠状动脉造影术确诊(临床诊断金标准)的CHD病患的一致率。因此，利用ApoA1单抗D11-10发展的检测方法可以改善现有技术的灵敏度，提高对心脑血管疾病的检出率。采用本发明的ApoA1单抗D11-10，发展适用于临床高通量免疫比浊自动化检测的试剂盒，可实现对心脑血管疾病的风险预测和临床监测，同时又进一步地为阐明疾病的发生发展机制打下了基础。

附图说明

图1为ApoA1单抗D11-10的结合力检测。用重组人ApoA1蛋白包被板，系列稀释ApoA1单抗D11-10，采用直接ELISA方法检测，ApoA1单抗D11-10与重组人ApoA1蛋白的结合力为1.73×10^-10M。

图2为ApoA1单抗D11-10的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，及编码其重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。

图3为ApoA1单抗D11-10和多抗对临床样本的检测结果及比较。A：分别利用ApoA1单抗D11-10和ApoA1免疫比浊试剂盒测定的对照组和冠心病组样本中ApoA1的含量；B：分别利用ApoA1单抗D11-10和ApoA1免疫比浊试剂盒测定的对照组和冠心病组HDL-C≥1mM的样本中ApoA1的含量。

为1.37g/L(ApoA1单抗测定的对照组90％置信区间作为cut-off值)；

为1.00g/L(《临床检验规程》记载的用于ApoA1检测的cut-off值)。

图4用ApoA1单抗D11-10的检测CHD及对照组中的ApoA1三分位比较。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：ApoA1单克隆抗体D11-10的制备和纯化

1.材料：融合蛋白6×His-ApoA1，8周龄雌性BALB/c小鼠

2.方法和结果

2.1抗原制备

2.1.1人ApoA1重组蛋白表达质粒的构建

在GenBank查询获得ApoA1的基因序列(Gene ID:335)，根据序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物。以人源cDNA为模板扩增出人ApoA1基因的DNA片段，PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收相应片段，PCR扩增的ApoA1基因片段大小为875bp。PCR产物连接入表达载体pCold^TMII(该载体含有的6×His标签用于纯化)，转化至TaKaRaDH5α宿主菌，挑取单克隆进行质粒提取并测序验证，测序结果与GenBank检索序列一致。

2.1.2人ApoA1重组蛋白的表达与纯化

将表达人ApoA1蛋白的pCold^TMII重组质粒转化大肠杆菌BL21。用IPTG诱导表达，经Qiagen镍亲和层析柱纯化后(根据说明书操作规程)，得到人ApoA1重组蛋白6×His-ApoA1(6×His-ApoA1融合蛋白)。

2.2小鼠免疫

根据《Current Protocols in Immunology》中操作流程，使用人ApoA1重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，然后用弗氏不完全佐剂乳化，共免疫四次，每次免疫注射量为200μg蛋白。

2.3杂交瘤细胞的制备、筛选和单克隆化

分离免疫的BALB/c小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。通过ELISA方法，对杂交瘤细胞进行检测。测定6×His-ApoA1结果为阳性，且测定His-SAA结果为阴性的克隆被保留。通过有限稀释培养，直至获得稳定的杂交瘤单克隆细胞。含有抗体的培养上清，用Protein A亲和层析柱进行纯化后，用于后续检测。

2.4ApoA1单克隆抗体D11-10亚型、特异性和亲和力检测

2.4.1ApoA1单克隆抗体D11-10亚型鉴定

使用Southern Biotech公司SBA Clonotyping^TM System/HRP单克隆抗体轻链和重链分型试剂盒，按照厂商说明书，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定本发明所述ApoA1单抗D11-10的重链亚型为IgG_2b，轻链亚型为κ。

2.4.2ApoA1单克隆抗体D11-10的特异性和亲和力检测

使用直接ELISA检测ApoA1单抗D11-10的特异性，分别在固相介质上包被市售天然的ApoA1蛋白和BSA或带有6×His标签的不同重组蛋白如：ApoA1、SAA1和β₂M，检测单抗对其的识别情况。结果显示ApoA1单抗D11-10只与重组的以及天然的人ApoA1蛋白发生特异性反应，不与相同表达系统中得到的重组蛋白SAA1和β₂M发生反应，也不与市售的天然BSA发生反应，显示出良好的特异性。

采用直接ELISA方法检测该单抗对其抗原的亲和力(结合力)。将96孔ELISA板包被ApoA1蛋白，包被液为50mM pH8.5的Tris.HCl。放置于湿盒中，4℃过夜，PBST洗涤4次后，2％的BSA 37℃封闭2h，洗涤2次。加入浓度为系列稀释的ApoA1单抗D11-10，37℃孵育1小时；PBST洗涤4次。对辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠抗体进行1∶2000稀释，每孔加50μL，室温孵育1.5小时；PBST洗涤4次。然后每孔加入50μL HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温避光孵育约0.5小时，然后每孔加入50μL 2N H₂SO₄，测A_450nm值。吸收值大于阴性对照孔两倍以上判断为阳性。通过浓度梯度稀释阳性孔的吸光值计算ApoA1单抗D11-10的结合力，结果显示ApoA1单抗D11-10与ApoA1蛋白发生浓度梯度依赖的特异性反应(图1)，计算得到该抗体与人ApoA1蛋白的结合力为1.73×10^-10M。

综上所述，ApoA1单抗D11-10为IgG_2b亚类，抗体的结合力为1.73×10^-10M，只与人ApoA1天然蛋白和重组蛋白发生特异性反应，而与无关蛋白SAA1、β₂M和BSA不发生反应(表1)。

表1ApoA1单克隆抗体D11-10的特征

+：发生反应；－：不发生反应。

实施例2：ApoA1单抗D11-10的可变区序列的测定

1.材料：Trizol(Invitrogen)，引物由生工生物工程公司合成，反转录和PCR试剂均采购自TaKaRa公司。

2.方法和结果：

2.1总RNA提取和cDNA的第一链合成

收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，根据Trizol说明书操作流程提取总RNA。使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对总RNA定性定量鉴定。

根据TaKaRa公司PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明合成cDNA。

2.2ApoA1单抗D11-10重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因片段扩增和测序

根据TaKaRa公司Taq酶说明书，采用50μLPCR的反应体系。

根据Wang等发表的文章Universal PCR amplification of mouseimmunoglobulin gene variable regions:the design of degenerate primers and anassessment of the effect of DNA polymerase 3’to 5’exonuclease activity，由生工生物工程公司合成引物。

扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒；57℃退火30秒；72℃延伸30秒，共35个循环，72℃10分钟。

PCR产物使用Axygen公司胶回收剂盒(操作根据厂商说明书)，简述如下：将ApoA1单抗D11-10重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带切胶回收后，进行定量测定和电泳分析。将目的片段连接入T-A克隆载体，经转化、筛选后，挑取阳性克隆交由生工生物工程公司测序。将测序得到的DNA序列通过在线软件IMGT/V-QUEST分析，编码其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNo.2，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(图2)。

实施例3：基于ApoA1单抗D11-10建立的检测方法在心脑血管疾病的风险预测及诊断的临床应用

1.材料：

ApoA1单抗D11-10；健康体检人群(无冠心病史)和冠心病(CHD)患者的血清样本。

2.方法和结果：

2.1制备混合血清校准品及赋值

使用20例健康体检人群的血清样本，每例取等体积血清至离心管中(各100μL)，置于4℃充分混匀后200μL/管分装，冻存于-80℃冰箱。第二天取出一支，置于4℃解冻，平衡至室温后，使用德赛公司的ApoA1免疫比浊试剂盒对混合血清样本赋值。混合血清样本ApoA1的浓度为1.66g/L，并以此作为后续建立ELISA检测方法的校准品。

2.2临床样本的检测和心脑血管疾病相关性分析

2.2.1临床样本和相关临床信息的收集：

分别收集对照组血清样本38例和冠心病(CHD)组血清样本52例。对照组为体检健康人群，甘油三酯、胆固醇、高密度和低密度脂蛋白均处于正常生理值范围，且无炎症反应、无冠心病和肝肾疾病史；冠心病组为冠脉造影确诊的冠心病人群。

2.2.2双抗体夹心ELISA对临床样本进行检测及结果分析

2.2.2.1标准曲线的绘制和临床样本的检测

包被兔抗ApoA1抗体至96孔ELISA板，浓度为1μg/mL，包被液为50mM pH8.5的Tris.HCl。将ELISA板放置于湿盒中，4℃过夜。第二天用清洗液(2％BSA的PBS溶液)洗涤4次后，每孔加200μL 2％BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。用清洗液洗涤4次，分别在板中加入校准品及临床血清样本。将步骤2.1制备的混合血清以1/20，1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280比例进行稀释，并分别加入板中，50μL/孔，作为校准品，稀释液为含有2％BSA的PBS溶液。以加稀释液的孔作为空白对照。收集到的临床血清样本分别用稀释液进行1/80倍的稀释，以保证样本浓度位于绘制的校准曲线浓度范围内。每个临床样本使用两个复孔进行测试。ELISA板中加入样本后在37℃孵育1小时，清洗液洗涤4次。使用稀释液将ApoA单抗D11-10稀释至1μg/mL，每孔加50μL，室温孵育1.5小时后，洗涤4次。使用稀释液以1∶2000比例稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠二抗，每孔加50μL，37℃孵育1小时后，清洗液洗涤4次。然后每孔加入50μLHRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育约0.5小时，最后每孔加入50μL 2N H₂SO₄，测A_450nm值。根据不同浓度混合血清的ApoA1理论蛋白浓度值和实测A_450nm值拟合出校准曲线。每个临床样本可根据其A_450nm值，在校准曲线中计算出ApoA1的测定浓度值。

2.2.2.2ApoA1单抗D11-10检测结果的分析及与多抗检测结果的比较

根据临床诊断信息将样本分为对照组和CHD组(经冠状动脉造影术确诊，即临床诊断金标准诊断的CHD病患组)，将每个样本利用本发明所述ApoA1单抗D11-10的实测值和ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)的测定值用GraphPad Prism 6进行分析，作出点分布图(图3A)：每个点的纵坐标代表所测该样本的ApoA1含量，横坐标代表所属分组。

图3A显示了对照组和CHD组各样本通过ApoA1单抗D11-10和ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)的检测结果。单抗测得CHD组中ApoA1的分布较对照组的总体要低；多抗也在图3A中显示出类似的结果，但是非常明显的差异在于多抗测试结果分布非常集中，不能体现出个体异质性。反观单抗的测试结果，由于ApoA1单抗有甄别特定构象HDL(D11-10亚型)颗粒中的ApoA1表位的能力，所以ApoA1含量分布呈离散型，提示D11-10亚型的HDL在不同个体的分布不同。

由于单抗只识别一个HDL颗粒上暴露的ApoA1蛋白抗原决定簇而多抗可以识别多个抗原决定簇的差异，造成基于多抗的ApoA1免疫比浊试剂盒的正常参考范围不适用于基于D11-10单抗发展的检测方法。因此，单抗D11-10测定结果的判定需要建立独立的参考范围。由于检测结果汇总后呈非正态分布，故采用中位数(25％百分位数，75％百分位数)方式表述：ApoA1单抗D11-10测定的对照组ApoA1含量为4.05(2.43，6.00)g/L，对照组ApoA1单抗D11-10测定结果90％的置信区间的cut-off值为1.37g/L(图3中

线)；而ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)的正常参考范围cut-off值为1.00g/L(图3中

线)(《临床检验规程》)。单抗测得CHD组ApoA1的含量为1.64(0.77，3.14)g/L，统计单抗检测CHD组中测定值小于cut-off值的人数和所占比例分别为22例和42％(22/52)。多抗测得CHD组ApoA1含量为1.18(0.99，1.32)g/L。统计多抗检测CHD组中测定值小于cut-off值的人数和所占比例分别为13例和25％(13/52)。说明单抗可以检测出的更多CHD病例，与临床CHD诊断金标准更吻合，说明基于单抗发展的ApoA1检测方法的灵敏度高于现有的ApoA1免疫比浊试剂盒。

进一步对CHD患者的HDL-C的水平进行分析发现，38例对照组中的HDL-C均处于正常参考区间范围(HDL-C≥1mM)，但是在收集的52例CHD患者也有32例HDL-C处于正常参考区间范围(HDL-C≥1mM)，再次说明仅仅检测HDL-C无法完全反映体内HDL的异质性及与疾病的相关性，因此HDL-C作为CHD风险因子具有很大局限性。进一步对32例HDL-C≥1mM的CHD病人亚组和38例对照组用GraphPad Prism 6进行分析，作出点分布图(图3B)。同样的单抗检测结果仍呈离散分布，单抗测定CHD组中ApoA1含量为1.63(0.86，2.91)g/L，且在cut-off值下方有13个样本(13/32，41％)；反观多抗的测试结果，分布仍然集中，提示不能区分个体间HDL的异质性。多抗测定CHD组中ApoA1含量1.27(1.19，1.40)g/L，全部在正常值范围内，即在多抗测定结果的cut-off值以下没有样本分布(0/32)(图3B，表2)，即在32例HDL-C≥1mM的CHD患者中，单抗相较于现有的ApoA1免疫比浊试剂盒可增加41％的检出率。提示单抗测试可以改善多抗检测及HDL-C检测中的不足，说明利用本发明的ApoA1单抗D11-10发展的检测方法可以提高ApoA1及HDL-C在预测CHD患病风险的准确性和灵敏度。

综上，相较于现有的ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)，利用本发明ApoA1单抗D11-10建立的检测方法与临床诊断结果具有更高的一致性，特别是在HDL-C≥1mM的CHD人群中，多抗检测结果与临床诊断结果无一相符，而单抗的检出率为41％，大大提高了ApoA1及HDL-C在预测CHD患病风险的准确性和灵敏度。

表2冠心病组ApoA1单抗D11-10和多抗检测的ApoA1含量比较

^§单抗测试结果cut-off值为1.37g/L(参考对照组单抗测试结果的90％置信区间)。

^※多抗测试结果cut-off值为1.00g/L(参考临床检验操作规程)。

ApoA1含量表示方式为：中位数(25％百分位数，75％百分位数)。

由于单抗识别了人群中HDL D11-10亚型，在人群中呈离散分布，且在对照组和CHD间的分布有差异，即CHD组较多的分布于cut-off值下方。以CHD组ApoA1单抗D11-10测定结果的三分位数将对照组及CHD组进行分组分析(图4)。如图4A及4C所示，在ApoA1最低分位t1(0.10～0.90g/L)组内，对照组中仅有2例落于该组(2/38，5.3％)，既对照组大部分不在低于cut-off值，与CHD组正相反。而在中分位组t2(0.91～2.80g/L)组中，对照组有11例(11/38，28.9％)，其中仅2例低于cut-off值；在高分位组t3(>2.90g/L)中，66％的对照组样本(25/38)均位于此。因此对照组在该三分位组中所占比例分别从5.3％，28.9％上升至66％，卡方检验其具有显著性差异(p<0.01)；进一步对该三分位组数据进行相关性分析发现，ApoA1单抗测定的结果与疾病呈负相关(r＝－0.377，p<0.01)；由于在CHD病人中，有相当一部分患者的HDL并没有降低，仍在正常范围内，因此，对于该部分HDL在正常范围内的亚群(HDL≥1mM)同样按照上述三分位数进行分组分析，如图4B及4D所示，对照组所占比例分别为7.9％(3/38)、15.8％(6/38)、76.3％(29/38)，大于3/4的对照组人群在高分位组，卡方检验显示具有显著性差异(p<0.01)；进一步的相关性分析发现，在该HDL≥1mM的亚群中，ApoA1单抗D11-10测定的结果与疾病相关性更高(从r＝-0.377升高至r＝－0.435p<0.01)；说明利用ApoA1单抗D11-10发展的检测方法比现有的HDL-C和ApoA1免疫比浊方法更加灵敏和准确，特别是与HDL-C处于正常参考区间内的CHD病患人群的相关性有显著提高。

综上所述，本发明ApoA1单抗D11-10及其发展的检测方法和试剂盒可以甄别与CHD负相关的特定HDL亚型，即HDL D11-10亚型。该亚型的分布在CHD病人及其对照组都呈离散型，提示群体的HDL异质性。在CHD中，单抗的检测结果不均一并且总体比较低，提示HDLD11-10亚型可能随着CHD病程而减少，可能与疾病的严重程度相关；而对照组中的该亚型相对较多，提示该亚型可能有抗斑块形成的功能。在对临床CHD患者的检测中，依赖ApoA1单抗D11-10的检测方法能够显著提高CHD的检出率，尤其在HDL-C正常(HDL-C≥1mM)的CHD患者中，在现有的ApoA1免疫比浊试剂完全阴性的情况下，依然能有41％的检出率，大大提高了与临床冠脉造影诊断(临床诊断金标准)的一致性。因此本发明的ApoA1单抗D11-10即基于该单抗发展的检测方法和试剂盒可以改善现有ApoA1检测试剂盒和方法的缺陷，对心脑血管疾病的临床监测具有重要意义。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

<110> 德赛诊断系统（上海）有限公司

<120> 抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 4

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CAGGTCCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTTACAAGCTACTGGATGCATTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGTGGTTATACTGAATACAGTCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACAATGACTGCTGACAAATATTCCACAACAGCCTACATACAACTAAGCAGTGTGACATCTACGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCATCCTATGGTAACTACAAATTTGTTTACTGGGGCCAAGGGAGTCTGGTCACGGTCTCTGCAA

<210> 2

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GATATTGTGATCACACAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAACAATTATTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACGTCCAGATTACAGTCAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCATCATTACCAACCTGGAGCAAGAAGATTTCGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATACGCTTCCAATCACGTTCGGCTCGGGGACAAATTTGGAAATAAAGC

<210> 3

<211> 117

<212> 氨基酸

<213> 人工序列

<400> 3

QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYSFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTEYSQKFKDKATMTADKYSTTAYIQLSSVTSTDSAVYYCASYGNYKFVYWGQGSLVTVSA

<210> 4

<211> 107

<212> 氨基酸

<213> 人工序列

<400> 4

DIVITQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLHWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLIITNLEQEDFATYFCQQGDTLPITFGSGTNLEIK

Claims (10)

1.一种ApoA1单克隆抗体D11-10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-10能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位；

所述ApoA1单克隆抗体D11-10由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10分泌，所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号为CGMCC No.13807。

2.如权利要求1所述的ApoA1单克隆抗体D11-10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链亚型为IgG_2b，轻链亚型为κ，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；编码所述重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-10在制备用于诊断心脑血管疾病产品中的应用。

4.一种心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-10。

5.如权利要求4所述的心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。

6.如权利要求4或5所述的心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，所述心脑血管疾病的诊断产品用于检测人体中ApoA1的水平，或用于区分识别HDL-C亚型，或用于监测心脑血管疾病风险及用于心脑血管疾病的诊断。

7.如权利要求6所述的心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，所述心脑血管疾病包括由血管斑块形成导致的疾病。

8.如权利要求7所述的心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，所述心脑血管疾病为冠心病、脑卒中或动脉粥样硬化。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-10。

10.一种BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10，其特征在于，所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号CGMCC No.13807。

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