CN108611322B - 乳腺癌循环肿瘤细胞系ctc-3、培养基及ctc-3的建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC‑3、培养基及CTC‑3的建立方法和应用，涉及细胞技术领域，本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC‑3，其保藏编号为CCTCC NO：C201892。该细胞系性状稳定，可开展大规模基础研究与临床试验，从而进一步把握循环肿瘤细胞的特质、阐释肿瘤发展机制，为癌症患者临床分期、预后判断、个体化治疗提供依据。本发明提供的培养基，包括基础培养基和添加剂。该培养基可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞。本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC‑3的建立方法，操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞的扩增培养。

Description

乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3、培养基及CTC-3的建立方法和 应用

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3、培养基及CTC-3的建立方法和应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中。循环肿瘤细胞作为表征恶性肿瘤转移潜能的重要生物学标志，在血液中的存在及数量能够反映肿瘤恶性程度、肿瘤治疗的效果及预后。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。

目前CTC检测的主要方法包括依赖肿瘤相关标志物检测的免疫学检测技术和基于形态学富集的膜过滤技术(Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。前者是基于细胞表面表达不同抗原标志，将针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加磁场筛选富集CTCs。该技术的优势在于特异度较高，已有商品化的半自动检测设备(CellSearch)；但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异，利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉，分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准，该富集技术特异性相对较差。

因此，开发一种稳定的循环肿瘤细胞系及相应的操作简单的循环肿瘤细胞系的培养方法，用以基础研究和临床试验尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，该细胞系性状稳定，可多次稳定传代，可用于进行基础研究与临床试验。

本发明的第二个目的在于提供一种用于培养上述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基，该培养基能够有效促进单个循环肿瘤细胞的增殖，可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞。

本发明的第三个目的在于提供上述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的建立方法，以缓解现有技术中存在的富集循环肿瘤细胞易造成假阴性或特异性较差的技术问题。

本发明的第四个目的在于提供上述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3在建立循环肿瘤细胞分离培养体系中的应用。

本发明提供了一种乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，所述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的保藏编号为CCTCC NO：C201892。

本发明还提供了用于培养上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加剂；

所述基础培养基包括体积比为1:0.5-5的DMEM培养基和PRMI1640培养基；

所述添加剂包括1-5mM的L-谷氨酰胺；

优选地，所述培养基还包括胎牛血清；

优选地，所述培养基还包括双抗；

本发明还提供了上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的建立方法，所述建立方法包括：

利用上述的培养基培养外周血单个核细胞，得到细胞簇，将所述细胞簇进行传代，得到所述乳腺癌循环肿瘤细胞系。

进一步地，将外周血单个核细胞加入上述的培养基中培养2-3天后进行换液，去除悬浮细胞。

进一步地，于37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培养外周血单个核细胞。

进一步地，所述外周血单个核细胞采集于乳腺癌患者的外周血；

优选地，离心所述乳腺癌患者的外周血，得到全血细胞，将所述全血细胞经密度梯度离心，得到所述外周血单个核细胞；

优选地，所述密度梯度离心为聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心。

进一步地，离心后还包括裂解红细胞的步骤。

进一步地，所述建立方法还包括鉴定得到的所述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的步骤。

进一步地，利用免疫荧光技术鉴定所述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3；

优选地，所述免疫荧光技术鉴定的指标为CK(+)DAPI(+)CD45(-)。

另外，本发明还提供了上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3在建立循环肿瘤细胞分离培养体系中的应用。

本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，其保藏编号为CCTCC NO：C201892。该细胞系成克隆生长，性状稳定，可多次稳定传代，因此，可开展大规模基础研究与临床试验，在检测细胞表面标志物的同时进行基因水平上的探索，可以从分子生物学水平上进一步把握循环肿瘤细胞的特质、阐释肿瘤发展机制，为癌症患者临床分期、预后判断、个体化治疗提供依据。

本发明提供的用于培养上述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基，包括体积比为1:0.5-5的DMEM培养基和PRMI1640培养基以及1-5mM的L-谷氨酰胺。该培养基能够有效促进单个循环肿瘤细胞的增殖，可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞，能够大规模培养研究提供有力保障。

本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的建立方法，包括：利用本发明提供的培养基培养外周血单个核细胞，得到细胞簇，将细胞簇进行传代，得到乳腺癌循环肿瘤细胞系。该方法操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞的扩增培养。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的培养外周血单个核细胞培养至14天左右出现的细胞簇图；

图2为本发明实施例1提供的消化传代后细胞培养7天左右出现的细胞簇图；

图3为本发明实施例2提供的免疫荧光鉴定结果图；

图4为本发明实施例4提供的CTC-3体外培养生长曲线图；

图5为本发明实施例5提供的CTC-3体外成球能力的实验结果图；

图6为本发明实施例6提供的CTC-3体外成瘤能力的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，于2018年04月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201892。

该细胞系成克隆生长，性状稳定，可多次稳定传代，细胞恶性程度高，增值能力强，体外生长速度快，因此，可开展大规模基础研究与临床试验，在检测细胞表面标志物的同时进行基因水平上的探索，可以从分子生物学水平上进一步把握乳腺癌循环肿瘤细胞的特质、阐释乳腺癌肿瘤发展机制，为癌症患者临床分期、预后判断、个体化治疗提供依据。

本发明还提供了用于培养上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基，该培养基包括基础培养基和添加剂；

基础培养基包括体积比为1:0.5-5的DMEM培养基和PRMI1640培养基，DMEM培养基和PRMI1640培养基的体积比例如可以为，但不限于1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5；

添加剂包括1-5mM的L-谷氨酰胺，例如可以为，但不限于1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。

该培养基能够有效促进单个循环肿瘤细胞的增殖，可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞，能够大规模培养研究提供有力保障。

当用于培养上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基中的基础培养基和添加剂的用量在上述范围内时，对单个循环肿瘤细胞的增殖效果更好，能够更快速地培养出细胞克隆。

优选地，培养基还包括胎牛血清。

胎牛血清能够提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。并且，胎牛血清还是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源，此外，在培养基中也能够起到酸碱度缓冲液作用。在本发明提供的培养基中加入胎牛血清，能够进一步丰富本发明提供的培养基的营养，使其对单个循环肿瘤细胞的增殖效果更好，能够更快速地培养出细胞克隆。

优选地，培养基还包括双抗。

双抗为青链霉素混合液，在本发明的一个实施方式中，双抗包括0.1-2unit/mL青霉素和5-15μg/mL链霉素。其中青霉素例如可以为，但不限于0.1unit/mL、0.3unit/mL、0.5unit/mL、0.8unit/mL、1unit/mL、1.2unit/mL、1.5unit/mL、1.8unit/mL或2unit/mL；链霉素例如可以为，但不限于5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL或15μg/mL。在一个优选的实施方式中，双抗包括1unit/mL青霉素和10μg/mL链霉素。在本发明提供的培养基中加入双抗，能够起到抑制细菌生长、避免细胞污染的目的，有效提高细胞的质量和成活率。

本发明还提供了上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的建立方法，建立方法包括：

利用上述的培养基培养外周血单个核细胞，得到细胞簇，将上述细胞簇进行传代，得到所述乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3。

该方法操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞的扩增培养。

在一个优选的实施方式中，将外周血单个核细胞加入上述的培养基中培养2-3天后进行换液，去除悬浮细胞。

通过换液去除悬浮细胞，能够保证细胞培养的质量，避免后期检测时受到死亡细胞的干扰。同时，换液也能够补充细胞增殖所需要的养分，并弃掉代谢废物。

在一个优选的实施方式中，于37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培养外周血单个核细胞。

在一个优选的实施方式中，外周血单个核细胞采集于乳腺癌患者的外周血。

优选地，离心乳腺癌患者的外周血，得到全血细胞，将全血细胞经密度梯度离心，得到外周血单个核细胞。

密度梯度离心是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。应用密度梯度离心能够达到分离效果好，可一次获得较纯颗粒的效果。且适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒。并且，颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

优选地，密度梯度离心为聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心。

在一个优选的实施方式中，离心后还包括裂解红细胞的步骤。

若离心后分离得到的外周血单个核细胞含红细胞太多，则需进行裂解红细胞操作，从而保证收集到的细胞的高纯度、高质量。

对裂解红细胞的方法和试剂不做限定，现有技术中能够实现红细胞裂解的方法或试剂均可。

在一个优选的实施方式中，建立方法还包括鉴定得到的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的步骤。

通过鉴定，能够进一步保证得到的乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性，便于后续研究。

在一个优选的实施方式中，利用免疫荧光技术鉴定乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3。

优选地，免疫荧光技术鉴定的指标为CK(+)DAPI(+)CD45(-)。

另外，本发明还提供了上述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3在建立循环肿瘤细胞分离培养体系中的应用。对深入研究乳腺癌的发生发展机制，寻找新的治疗靶点，具有重要的临床应用和基础研究价值。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

如无特殊说明，本发明实施例中所用仪器或试剂均为市售的产品。

实施例1乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的获得

利用本发明提供的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的建立方法获得乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，包括如下步骤：

(a)抽取乳腺癌患者的静脉外周血6-8mL至10mL采血管中，离心获得血清和全血细胞，将全血细胞经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤3次，低速离心后获得外周血单个核细胞。

(b)将获取的外周血单个核细胞重悬于本发明提供的用于培养乳腺癌循环肿瘤细胞系的原代细胞的培养基中，细胞种于6孔板，于37℃，5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2-3天后进行换液，去掉悬浮细胞，之后隔2天换液一次，培养至14天左右出现细胞簇，结果如图1所示。

(c)将步骤(b)培养得到的细胞簇经0.25％的胰酶在37℃下消化5-10min，培养基终止消化，1000g离心5min，沉淀细胞用本发明提供的用于培养乳腺癌循环肿瘤细胞系的原代细胞的培养基重悬后种于6孔板中，于37℃，5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，隔2天换液一次，培养一周后得到乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，结果如图2所示。

实施例2乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的检测

将本发明实施例1得到的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3继续培养一周后，待细胞长满孔底70％左右后用0.25％胰酶室温消化2-3min后用于细胞爬片，鉴定；预先将盖玻片于生物安全柜中用75％的酒精浸泡48h，将消化得到的P2代具有高度增殖分化的克隆细胞用本发明提供的用于培养乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3的原代细胞的培养基重悬后种于预先铺好盖玻片的6孔板中，于37℃，5％CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，2-3天待细胞爬片稳定后利用免疫荧光染色法进行鉴定。

爬片后的细胞进行免疫荧光染色，包括如下步骤：

(A)先将6孔板中培养基去掉，PBS洗涤3次后，加4％的多聚甲醛固定20min；

(B)除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞2-3次；封闭5min后加anti-CD45孵育20min，之后操作都需避光操作；

(C)除去抗体稀释液，PBS洗涤一次，加入anti-Rbb-Cy3孵育20min；0.5％TritonX-100通透5min后，除去通透液，加入anti CK-FITC孵育50min；

(D)PBS洗涤一次加入DAPI后，将盖玻片取出，将有细胞贴壁那面盖于滴有封片剂的载玻片上，暗室采用荧光显微镜观察染色情况。

检测结果如图3所示，从图3的结果中可以看出核染色为阳性并表达上皮细胞标志细胞角蛋白(CK)，但缺乏白细胞共同抗原CD45，即CK(+)DAPI(+)CD45(-)，说明该细胞系具有上皮细胞表型的一类肿瘤细胞。

实施例3乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3STR鉴定

本实施例利用细胞系鉴定试剂盒采用10-STR扩增方案扩增，在ABI3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。

方法包括如下步骤：

1.DNA提取；

2.多重PCR利用细胞系鉴定试剂盒对细胞系DNA进行扩增；

3.毛细管电泳分型；

4将得到的等位基因类型与DSMZ进行比对。

检测样品包括：CTC-3，MCF-7，乳腺癌患者外周血中的PBMCs。

STR鉴定结果如下表所示：

鉴定结果显示标准位点比对中CTC-3和MCF-7的相似性小于20％，而来源于乳腺癌患者外周血中的CTC-3和PBMCs的相似性大于90％，表明CTC-3可能是一种来源于人外周血中新的乳腺癌循环肿瘤细胞系。

实施例4乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3生长曲线测定

将实施例1中获得的CTC-3细胞与MCF-7细胞经胰酶消化后重悬于培养基中，梯度稀释细胞，将细胞按5500cells/孔种于24孔板种，于第三天、第五天、第七天随机取三个孔胰酶消化计数，制作CTC-3生长曲线。

结果如图4所示，从结果图中可以看出，CTC-3细胞在第五天后细胞生长速度明显快于MCF-7，说明该细胞系在体外具有肿瘤细胞增殖速度快的特性。

实施例5乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3体外成球实验

将实施例1中获得的CTC-3细胞与MCF-7细胞经胰酶消化后重悬于培养基中，以低密度(1000-2000cells/mL)接种于超低贴附培养皿中。培养基为DMEM/F12，加入重组人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、B27、Knock-Out^TM血清替代物生长因子和添加物，隔天补充2mL新鲜培养基，10-14天细胞成球后倒置显微镜下观察细胞成球形态。

结果如图5所示，从图5中可以看出，CTC-3的成球能力强于MCF-7，说明CTC-3细胞的干性能力强。

实施例6乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3体外成瘤能力实验

取雌性裸鼠12只，随机分成2组，每组6只。将实施例1中获得的CTC-3重悬于生理盐水，计数，梯度稀释，皮下接种至裸鼠腹部两侧，以乳腺癌细胞系MCF-7为阳性对照组。2组老鼠接种细胞数量10⁶/只。每周监测肿瘤生长，游标卡尺检测肿瘤大小，其计算公式为：长×宽²。

结果如图6所示，从图6中可以看出，CTC-3在体外具有具有较强成瘤能力，与乳腺癌细胞系MCF-7体外成瘤能力相当。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (2)

1.一种乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3，其特征在于，所述乳腺癌循环肿瘤细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C201892。

2.如权利要求1所述的乳腺癌循环肿瘤细胞系CTC-3在建立循环肿瘤细胞分离培养体系中的应用。

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