CN108611327B

CN108611327B - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法

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Publication number: CN108611327B
Application number: CN201810712312.3A
Authority: CN
Inventors: 吕红; 周峻岗; 段进坤; 杨德强
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2038-07-03
Also published as: CN108611327A

Abstract

为解决猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化中的步骤复杂、工艺繁琐、生产成本高、纯化效率低等问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，包括如下步骤：步骤S1，收集重组酵母细胞并进行破碎，获得含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞裂解液；步骤S2，对细胞裂解液进行澄清获得病毒样颗粒初提液；步骤S3，对病毒样颗粒初提液进行离子交换层析获得病毒样颗粒粗纯液；步骤S4，对病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩获得病毒样颗粒浓缩液；步骤S5，对病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒，其中，步骤S3的离子交换层析中，吸附过程及洗脱过程中所采用的缓冲液均含有预定浓度的表面活性剂。

Description

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒样颗粒的分离纯化方法，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是属于圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)的DNA病毒，其核酸分子为单股、首尾闭合的环状结构，无囊膜。PCV2本身不致死猪，但可造成免疫抑制。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，当与其它病原混合感染时，可加重病猪的死亡，给养殖业带来巨大的损失。PCV2已成为危害养猪业的主要疫病之一，在猪群中感染率较高，疫苗是防控PCV2的有效工具，免疫接种可以减少PCV2对免疫猪的危害程度及其组织病毒载量，也为猪场进行PCV2的净化提供了基础条件。目前市场上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种：全病毒灭活苗方面，由于病毒自身特点和生产工艺的弊端，经常出现病毒滴度难以提高等技术问题，且其有效抗原纯度较低，免疫接种后经常出现不同程度的不良反应。

猪圆环病毒亚单位疫苗主要是使用真核或原核表达系统高效表达Cap蛋白，Cap蛋白经自组装形成病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)，经纯化后可制备病毒样颗粒疫苗。VLP的形态结构与天然病毒高度相似，免疫原性良好，且不含有病毒基因，因此是一种理想的疫苗形式。目前，大多数商用PCV2亚单位疫苗使用昆虫杆状病毒表达系统表达重组Cap蛋白，但该系统表达时间长且成本昂贵；而大肠杆菌等原核表达系统不能对重组蛋白进行翻译后修饰，且需要考虑内毒素的去除。酵母细胞是比原核生物更好的表达系统，不仅能解决原核系统的内毒素问题，还可对表达的蛋白进行糖基化修饰，表达水平高，易于放大，且相较于其他真核表达系统成本更为低廉。

基于上述原因，本发明的发明人构建了重组表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒(即PCV2VLPs)的马克斯克鲁维酵母，并针对重组获得的菌株申请了发明专利(即CN201610806538.0)。然而，发明人在进行该重组酵母的提取纯化研究时发现，现有技术中病毒样颗粒的纯化方法常采用沉淀法、梯度离心、阴离子交换层析和分子排阻层析等，存在步骤复杂、工艺繁琐、生产成本高、纯化效率低等诸多问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的发明人首先进行了PCV2Cap蛋白的序列分析，发现在PCV2Cap蛋白的234个氨基酸中，有强碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸的残基数达41个，而强酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的残基数仅16个，PCV2cap蛋白的理论等电点约为10.8，因此在常规的纯化缓冲体系(pH6-8)中PCV2VLPs表面极有可能是带正电荷。因此，采用阳离子交换层析可以较好地分离出PCV2VLPs。

此外，酵母细胞在高压破碎的过程中，细胞内的多糖类等带负电的物质大量释放，可能与PCV2VLPs通过离子作用结合到一起，中和了PCV2VLP表面的正电荷，影响阳离子交换层析分离纯化PCV2VLP的效率，因此，在进行阳离子交换层析过程中，通过补加特定的表面活性剂，同时增强缓冲体系中的离子强度，就能够显著提高PCV2VLP的纯化效率。

经过以上分析，为达到建立高效的PCV2VLPs纯化工艺的目的，发明人在本发明中提出了基于阳离子交换层析并在阳离子交换层析中补加特定的表面活性剂的分离纯化方法。具体地，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，用于从重组酵母细胞裂解液中分离纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，收集表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的重组酵母细胞并进行破碎，获得含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞裂解液；步骤S2，对细胞裂解液进行澄清，获得病毒样颗粒初提液；步骤S3，对病毒样颗粒初提液进行离子交换层析，获得病毒样颗粒粗纯液；步骤S4，对病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩3～5倍，获得病毒样颗粒浓缩液；步骤S5，对病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒，其中，步骤S3的离子交换层析中，吸附过程及洗脱过程中所采用的缓冲液均含有预定浓度的表面活性剂。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S3中，吸附过程所采用的缓冲液为含50～150mM NaCl、0.01％Tween 80的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱过程中所采用的缓冲液为含1M NaCl、0.01％Tween 80的50mM磷酸盐缓冲液。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S1中，破碎采用机械碾磨破碎、超声波破碎或高压均质破碎中的任意一种或多种联用。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S2中，澄清采用全量过滤、错六过滤或高速离心的任意一种或多种联用。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，澄清采用高速离心，其条件为10000g离心30min。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S3中，离子交换层析的介质采用强阳离子交换介质，强阳离子交换介质为Capto SP ImpRes、Capto S ImpAct、SP Bestarose FF和POROS HS中的任意一种或多种的混合。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，强阳离子交换介质为Capto SP ImpRes。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S4中，超滤浓缩采用截留分子量为30kDa的超滤管离心浓缩。

本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S5种，凝胶过滤层析的介质采用Sephacryl S-500HR或Sephacryl S-300HR。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，采用如上任一项的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法从重组酵母细胞裂解液中分离纯化得到。

发明作用与效果

根据本实施例提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，由于采用了离子交换层析对细胞裂解液进行纯化，并在离子交换层析的过程中采用添加了预定浓度表面活性剂的缓冲液，对于细胞样颗粒来说，离子交换层析具有更大的吸附量和更高的选择性，因此能够从细胞裂解液中吸附病毒样颗粒并在洗脱过程中释放，达到从细胞裂解液中富集病毒样颗粒的目的。与常规的沉淀法或梯度离心法相比，这一富集过程选择性更好，中间过程的产物杂质含量相对较低，因此更有利于后续纯化过程的进行。

本实施例中，由于采用了凝胶过滤层析的填料对病毒样颗粒进行进一步的纯化，因此能够使病毒样颗粒的纯度在离子交换层析后再经过一次层析就可达到95％以上，满足实际应用中的需求。另外，凝胶过滤层析前还设有超滤浓缩的步骤，因此还能够减小体积，提高凝胶层析的效率。

附图说明

图1是本发明实施例中的不同离子强度的上样液流经Capto SP ImpRes离子交换层析柱纯化的SDS-PAGE电泳检测结果；

图2是本发明实施例中的上样液流经Capto SP ImpRes离子交换层析柱纯化的280nm检测图谱；

图3为本发明实施例中抗原粗纯液Sephacryl S-500HR凝胶过滤层析柱时的280nm检测图谱；

图4为本发明实施例中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒离子交换纯化前后样品的SDS-PAGE电泳检测结果；

图5为本发明实施例中凝胶过滤层析纯化病毒样颗粒SDS-PAGE电泳检测结果；

图6为利用本发明方法纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒HPLC检测结果；

图7为利用本发明方法纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的电子显微镜图。

具体实施方式

本发明所采用的猪圆环病毒2型病毒样颗粒(以下称病毒样颗粒)的分离纯化方法主要包括以下步骤：

步骤S1，收集表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的重组酵母细胞并进行破碎，获得含病毒样颗粒的细胞裂解液；

步骤S2，对细胞裂解液进行澄清，获得病毒样颗粒初提液；

步骤S3，对病毒样颗粒初提液进行离子交换层析，获得病毒样颗粒粗纯液；

步骤S4，对病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩3～5倍，获得病毒样颗粒浓缩液；

步骤S5，对病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒。

以下结合附图以及实施例来说明本发明的具体实施方式。下述各实施例中所采用的试剂如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商建议的条件。

实施例1.猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞破碎、澄清和Capto SP Impres离子交换层析

本实施例的主要步骤为：以马克斯克鲁维酵母重组表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞为初始样品，进行破碎、澄清和离子交换层析纯化。其中，经过多次筛选，发明人发现以强阳离子交换介质作为层析介质具有良好的分离效果；进一步，采用强阳离子介质中的Capto SP ImpRes介质具有最好的分离效果，因此本实施例中采用该介质进行实验。

具体实验过程如下：

1)溶液配制

本实施例中所用的各缓冲液的配方如下：

破菌缓冲液：50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

稀释缓冲液1：50mM NaH₂PO₄，0.01％Tween80，pH6.80

稀释缓冲液2：50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

稀释缓冲液3：50mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

平衡缓冲液1：50mM NaH₂PO₄，50mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

平衡缓冲液2：50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

平衡缓冲液3：50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

洗脱缓冲液：50mM NaH₂PO₄，1M NaCl，0.01％Tween80，pH6.80

2)样品的制备

取发酵菌液50mL，10000g离心5min去除培养基上清，沉淀加入去离子水至50mL，混合均匀后再次10000g离心5min，弃掉上清，沉淀即为表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的马克斯克鲁维酵母菌体细胞。

将上述过程收集得到的菌体细胞用破菌缓冲液重悬至200mL，高压均质机1300bar破碎2次，10000g、4℃离心30min收集上清，再加入等体积稀释缓冲液进行稀释，即得细胞裂解液。

3)装柱

取沉降后的Capto SP Impres12mL加入到玻璃层析柱中，并组装至AKTA蛋白纯化系统，用50mL去离子水冲洗至平衡。

4)离子交换层析平衡

取60mL平衡缓冲液以2.0mL/min流速平衡柱子，A₂₈₀基线平稳后，标定此时A₂₈₀值为零点。

5)病毒样颗粒纯化

将细胞裂解液混匀，取200mL混匀后作为上样液，以2.0mL/min流速上样，当A₂₈₀吸光值上升后收集流穿液。上样结束后，用60mL平衡缓冲液以2.0mL/min流速冲洗柱子，待A₂₈₀基线平稳后停止冲洗，目的是洗去非特异性结合的杂蛋白。

6)病毒样颗粒洗脱

用50mL洗脱液以2.0mL/min流速进行洗脱，当A280值出现上升后开始收集洗脱液，待A280值回归零点后停止收集。

7)离子交换层析清洗

上述层析过程结束后，可对离子交换层析填料进行清洗和再生，以恢复填料使用时的最佳性能。清洗再生的具体过程如下：

用50mL Milli-Q水以2.0mL/min流速清洗柱子，然后用50mL 0.5M NaOH以1.0mL/min流速进行清洗，再次用50mL Milli-Q水以2.0mL/min流速清洗柱子，最后用50mL 20％乙醇以2.0mL/min流速清洗柱子。

本实施例中，为考察不同离子强度对上样及洗脱的影响进行了A、B、C三组阳离子交换层析的实验。三组实验所用的洗脱缓冲液均相同，但稀释缓冲液和平衡缓冲液有所不同，分别如下：

实验组A：稀释缓冲液1、平衡缓冲液1；

实验组B：稀释缓冲液2、平衡缓冲液2；

实验组C：稀释缓冲液3、平衡缓冲液3。

可以看出，由于破菌缓冲液中含有50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.01％Tween80，并且稀释缓冲液按等体积加入了破菌后的上清液，因此得到的各实验组的细胞裂解液中，离子强度(NaCl浓度)与对应的平衡缓冲液是完全相同的。也就是说，每个实验组的上样离子强度与对应的平衡离子强度是一致的。

图1是本发明实施例中的不同离子强度的上样液流经Capto SP ImpRes离子交换层析柱纯化的SDS-PAGE电泳检测结果。图1中，各个泳道的样品为：泳道1、2：实验组A流穿液；泳道3：实验组A洗脱液；泳道4、5：实验组B流穿液；泳道6：实验组B洗脱液；泳道7、8：实验组C流穿液；泳道9：实验组C洗脱液。

如图1所示，当上样及平衡过程中采用含50～150mM NaCl、0.01％Tween 80的缓冲液时，流穿液中的病毒样颗粒蛋白含量较少，说明该离子强度范围有利于层析介质对病毒样颗粒的吸附。另外，洗脱液中的病毒样颗粒含量高，说明含有1M NaCl、0.01％Tween的洗脱液能够充分将病毒样颗粒洗脱。

图2是本发明实施例中的上样液流经Capto SP ImpRes离子交换层析柱纯化的280nm检测图谱。图2中示出的为实验组A的检测图谱，其中横坐标为层析时间。

图2所示，使用Capto SP ImpRes进行离子交换层析时，洗脱峰窄而集中，说明在Capto SP ImpRes对病毒样颗粒的吸附和解吸效果良好。

实施例2.凝胶过滤层析纯化病毒样颗粒

本实施例主要采用离子交换层析对实施例1得到的病毒样颗粒粗纯液(即洗脱过程中的收集液)进行凝胶过滤层析，提高病毒样颗粒的纯度。

本实施例中采用Sephacryl S-500HR凝胶过滤层析纯化病毒样颗粒，具体过程如下：

1)溶液配制

本实施例中所用的溶液配方如下：

生理盐水：9g NaCl，Milli-Q水定容至1L，pH5.95

2)样品超滤浓缩处理

本实施例中，离子交换层析得到的粗纯液先进行超滤浓缩后再进行凝胶过滤层析，具体超滤浓缩的过程为：取40mL病毒颗粒粗纯液，装入Millipore 15ml/30KD中，在离心机中4000rpm离心30-60min，直至液体体积至4mL左右，即完成了超滤浓缩，获得病毒样颗粒浓缩液。

3)Sephacryl S-500 HR层析柱平衡

用200mL Milli-Q水以0.5mL/min流速冲洗柱子，冲洗完成后再用500mL生理盐水以0.5mL/min流速平衡柱子，待A280基线平稳后标定此时的280nm处吸光值为零点。

4)病毒样颗粒纯化

取4mL病毒样颗粒浓缩液上样，用生理盐水以0.5mL/min的流速进行洗脱，当吸光值A280值出现上升后收集洗脱液，待A280值趋于平稳后停止收集。所收集的洗脱液即为高纯度的猪圆环病毒2型病毒样颗粒溶液。

5)Sephacryl S-500 HR层析柱清洗

上述层析过程结束后，可对凝胶过滤层析的填料进行清洗和再生，以恢复填料使用时的最佳性能。清洗再生的具体过程如下：

用300mL Milli-Q水以0.5mL/min流速清洗柱子，然后用200mL 0.5M NaOH以0.5mL/min流速进行清洗，再用300mL Milli-Q水以0.5mL/min流速清洗柱子，最后用200mL20％乙醇以0.5mL/min流速冲洗柱子。

图3为本发明实施例中抗原粗纯液Sephacryl S-500HR凝胶过滤层析柱时的280nm检测图谱。图3中，横坐标为层析时间。

如图3所示，使用Sephacryl S-500HR进行凝胶过滤层析时，洗脱峰窄而集中，并且其他时间段出现了明显的多个杂质峰，说明Sephacryl S-500HR对病毒样颗粒的吸附和解吸效果良好，且对杂质的分离效果良好。

实施例3.猪圆环病毒2型病毒样颗粒的离子交换层析和凝胶过滤层析纯化样品的检测

本实施例主要过程为对实施例1和实施例2的分离纯化过程中的样品进行检测和分析。

1)首先，使用SDS-PAGE电泳检测Capto SP Impres离子交换层析纯化得到的病毒样颗粒样品(即粗纯液样品)。

图4为本发明实施例中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒离子交换纯化前后样品的SDS-PAGE电泳检测结果。图4中，各个泳道的样品为：泳道1：蛋白Marker；泳道2：离子交换层析纯化前样品；泳道3-4：离子交换层析的流穿液；泳道5：离子交换层析洗涤液；泳道6：离子交换层析纯化的病毒样颗粒。

如图4所示，利用Capto SP Impres离子交换层析可以将猪圆环病毒2型病毒样颗粒从酵母细胞裂解液中分离出来，纯度达到50％以上。

2)然后，凝胶过滤层析纯化步骤得到的病毒样颗粒纯度采用SDS-PAGE电泳和HPLC方法检测。其中，HPLC分析法选用的层析柱为TSKgel G4000SWXL(7.8×300mm，5μm)，为流动相为50mM NaH2PO4，50mM Na2HPO4，100mM Na2SO4，pH6.75，流速0.6ml/min，检测波长280nm。

图5为本发明实施例中凝胶过滤层析纯化病毒样颗粒SDS-PAGE电泳检测结果。图5中，各个泳道的样品分别为：泳道1：蛋白Marker；泳道2：凝胶过滤层析纯化病毒样颗粒。

图6为利用本发明方法纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒HPLC检测结果。

如图5和图6所示，凝胶过滤层析纯化步骤后获得的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯度可达95％以上。

3)最后，采用透射电镜观察检测了本发明的纯化得到的PCV2病毒样颗粒(即凝胶过滤层析纯化步骤后得到的病毒样颗粒样品)。使用碳支持膜铜网吸附，3％磷钨酸负染后，采用透射电子显微镜观察类病毒颗粒的形成情况。

如图7所示，利用本发明的纯化方法获得的圆环病毒2型Cap蛋白以病毒样颗粒形式存在，说明其具有良好的免疫原性和反应原性。

实施例作用与效果

根据本实施例提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，由于采用了Capto SP Impres作为离子交换层析的层析填料来进行阳离子交换层析，该填料与同类的其他填料相比具有更大的吸附量和更高的选择性，因此能够从细胞裂解液中吸附病毒样颗粒并在洗脱过程中释放，达到从细胞裂解液中富集病毒样颗粒的目的。同时，该阳离子交换层析的吸附过程采用了含50～150mM NaCl、0.01％Tween 80的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱过程采用了含1M NaCl、0.01％Tween 80的50mM磷酸盐缓冲液，这些缓冲液均添加了适当浓度的表面活性剂，因此能够增强缓冲体系中的离子强度、显著提高PCV2 VLP的纯化效率。

与常规的沉淀法或梯度离心法相比，本实施例采用的阳离子交换层析这一富集过程选择性更好，中间过程的产物杂质含量相对较低，因此更有利于后续纯化过程的进行。

本实施例中，由于采用了Sephacryl S-500 HR作为凝胶过滤层析的填料，因此能够去除离子交换层析后的剩余杂质，对病毒样颗粒进行进一步的纯化，使病毒样颗粒的纯度在离子交换层析后再经过一次层析就可达到95％以上，基本满足实际应用中的需求。另外，凝胶过滤层析前还设有超滤浓缩的步骤，因此还能够减小体积，提高凝胶层析的效率。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，用于从重组酵母细胞裂解液中分离纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，收集表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的重组酵母细胞并进行破碎，获得含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞裂解液；

步骤S2，对所述细胞裂解液进行高速离心澄清，获得病毒样颗粒初提液；

步骤S3，对所述病毒样颗粒初提液进行离子交换层析，获得病毒样颗粒粗纯液；

步骤S4，对所述病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩3~5倍，获得病毒样颗粒浓缩液；

步骤S5，对所述病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒，

其中，步骤S3中，所述离子交换层析的介质采用强阳离子交换介质，该强阳离子交换介质为Capto SP ImpRes，吸附过程所采用的缓冲液为50～150mM NaCl、0.01％Tween 80 的50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.8，洗脱过程中所采用的缓冲液为1M NaCl、0.01％Tween 80的50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.8，

步骤S4中，所述超滤浓缩采用截留分子量为30kDa的超滤管离心浓缩。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，其特征在于：

其中，步骤S1中，所述破碎采用机械碾磨破碎、超声波破碎或高压均质破碎中的任意一种或多种联用。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，其特征在于：

其中，所述高速离心的条件为10000g离心 30min。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，其特征在于：

其中，步骤S5中，所述凝胶过滤层析的介质采用Sephacryl S-500 HR 或Sephacryl S-300 HR。