CN108456136B - 海松二烯酸的提取分离方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学技术领域，公开一种海松二烯酸的提取分离方法，其具有式(Ⅰ)的结构，且从五加科植物细柱五加中提取分离得到，其提取分离步骤包括：1)用有机溶剂或有机溶剂‑水混合溶剂浸提细柱五加物料；2)减压浓缩步骤1)的提取液；3)用亲脂性有机溶剂萃取步骤2)的浓缩液；4)减压浓缩步骤3)的萃取液，得到萃取物；5)柱层析分离步骤4)的萃取物；6)减压浓缩步骤5)的洗脱液；7)重结晶步骤6)的所得干燥物。本发明首次从细柱五加的干燥根皮中分离纯化海松二烯酸，上述提取分离方法可实现海松二烯酸的工业化分离和高纯度制备。本发明首次验证海松二烯酸的抑制黄嘌呤氧化酶活性。
Description
技术领域
本发明药物化学技术领域，涉及天然活性成分的提取分离技术，具体涉及从五加皮中提取制备高纯度海松二烯酸的方法，以及海松二烯酸对黄嘌呤氧化酶的抑制活性。
背景技术
海松二烯酸(pimaradienoic acid；ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid)，具有式(Ⅰ)所示的化学结构，属于海松烷型(pimarane)二萜类化合物，日本学者于1967年首先报道其从中药独活中分离得到。此后的药理学研究表明，海松二烯酸具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗动脉痉挛、抗菌、杀虫等广泛的药理作用，其中抗炎活性最为显著，已被多种体内外炎症模型证实，具有较好的开发应用前景。
截至目前，海松二烯酸除了在独活中被发现外，尚有文献报道其存在于Araliaracemosa、Aralia cordata Thunb(九眼独活)、Aralia fargesii(龙眼独活)、Araliacontinentalis、Jungermannia thermarum、Jungermannia hattoriana、Mikaniapyramidata、Mikania alvimii、Helianthus strumosus、Notopterygium incisium Ting(羌活)、Herbertus sakuraii(樱井剪叶苔)、Viguiera arenaria、Acanthopanaxtrifoliatus(白簕)、Gnaphalium gaudichaudianum等20余种植物中。由于海松二烯酸作为对照品或研究对象的市场需求巨大，但国内外基本上未对海松二烯酸的制备工艺(包括化学合成)进行过研究报道。
五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith，其干燥根皮为中药五加皮，具有祛风除湿，强筋壮骨之功效。五加皮的化学成分研究表明，截至目前自五加皮中分离鉴定的化合物有40余个，其中主要为贝壳杉烷型二萜。迄今，还未见有从五加皮中分离得到海松二烯酸的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供海松二烯酸的提取分离方法。本发明所述海松二烯酸(pimaradienoic acid；ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid)，具有式(Ⅰ)所示的化学结构。这种提取分离方法具有操作简便、效率高、工艺稳定、成本较低等优点，可实现海松二烯酸的工业化分离和高纯度制备。
本发明所述海松二烯酸的提取分离方法，其以五加科植物细柱五加的干燥根皮(即本发明所述五加皮)为原料，具体的提取分离的步骤包括：
1)用有机溶剂或有机溶剂-水混合溶剂浸提所述细柱五加物料；
2)减压浓缩步骤1)的提取液；
3)用亲脂性有机溶剂萃取步骤2)的浓缩液；
4)减压浓缩步骤3)的萃取液，得到萃取物；
5)柱层析分离步骤4)的萃取物；
6)减压浓缩步骤5)的洗脱液；
7)重结晶步骤6)的所得干燥物。
优选地，步骤1)所述有机溶剂为丙酮；丙酮-水混合溶剂中，丙酮与水的体积比为100:0～50:50。
优选地，步骤1)所述物料为细柱五加的干燥根皮。
优选地，步骤3)所述亲脂性有机溶剂为乙酸乙酯。
优选地，步骤5)所述柱层析选用硅胶柱层析，洗脱液为石油醚或正己烷。
优选地，步骤7)所述重结晶所用溶剂为己烷、二氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种或其组合。
本发明所述海松二烯酸的提取分离方法优选为混合溶剂浸提，在其它的实现方式中，还可以选用水浸提、有机溶剂浸提、超临界二氧化碳提取或是其它常规的方式。有机溶剂浸提可以作为获取所述海松二烯酸的另一优选方式，其操作过程大致如下：粉碎细柱五加的干燥根皮，用有机溶剂浸提粉碎物，回收浸提液中的有机溶剂，得到提取物的浓缩液。本发明所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一种或是其混合物，或其它可以获得所述提取物的有机溶剂。在另外的实施方式中，也可采取有机溶剂热回流提取的方式，一般提取3次，合并提取物。所选用的有机溶剂可以为醇类(比如甲醇、乙醇等)、酮类(比如丙酮等)、醚类(比如乙醚等)。
本发明的另一目的是探究所述海松二烯酸的生物活性。经本专利申请发明人团队的严谨研究发现，所述海松二烯酸对黄嘌呤氧化酶具有强烈的抑制活性，可有效降低尿酸的生成。
本发明包括一种药物组合物，其活性成分至少包括所述海松二烯酸或其药学上可接受的盐。
“药学上可接受的盐”，是包含式(Ⅰ)的化合物与其它有机物或无机物形成的盐，表示保留式(Ⅰ)结构的化合物的生物有效性和性质的盐。易于理解地，所述海松二烯酸具有羧基(-COOH)，其可以与有机碱或无机碱形成盐，即式(Ⅰ)结构中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
“药物组合物”，指的是在此描述的一种或多种化合物或者它们的药学上可接受的盐和前药与其它的化学成分，例如药学上可接受的载体和赋形剂的混合物。药学上可接受的赋形剂或载体，或称为药物制剂上用的辅料，如水、硬脂酸镁、滑石、淀粉、有机酸、葡聚糖或类脂质等，适于口、肠、胃肠外或局部施用的药物辅料。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。为了便于药物吸收或将药物输送至靶位，这种药物组合物可制成适宜的供药剂型，比如颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、栓剂、胶囊剂、胶囊缓释剂、缓释片剂、混悬剂或注射液等制剂形式。
在上述药物组合物中，所述海松二烯酸或其药学上可接受的盐在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂药物方面的应用。基于所述海松二烯酸的生物活性，所述海松二烯酸或其药学上可接受的盐可以用于预防和治疗与黄嘌呤氧化酶相关疾病，例如，高尿酸症、心力衰竭、心血管疾病、高血压、糖尿病、肾疾病、关节病等。
本发明至少具有下述的有益效果或优点。
(1)本发明首次从细柱五加的干燥根皮中分离得到式(Ⅰ)结构的海松二烯酸，拓展了海松二烯酸的制备来源，同时也实现了中药植物细柱五加的综合利用。
(2)本发明所述海松二烯酸的提取分离方法具有操作简便、效率高、工艺稳定、成本较低等优点，可实现海松二烯酸的工业化分离和高纯度制备。
(3)本发明首次探知海松二烯酸对黄嘌呤氧化酶具有强烈的抑制作用，所述海松二烯酸或其药学上可接受的盐，可用于制备预防或治疗高尿酸症、痛风、糖尿病、肾疾病、关节病等的药物方面。
附图说明
图1是本发明所述海松二烯酸的1H-NMR谱图。
图2是本发明所述海松二烯酸的13C-NMR谱图。
图3是本发明所述海松二烯酸的HPLC谱图。
图4是本发明所述海松二烯酸的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制IC50曲线图。
以下将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
具体实施方式
实施例1
本实施例为所述海松二烯酸的提取分离优选实施方式之一，具体的操作过程如下。
称取10kg细柱五加的干燥根皮，经粉碎机打成细粉，物料粉碎粒度在3-5mm，备用。在室温条件下，用80L丙酮-水(70:30，v:v)浸泡2次，每次72小时。将两次浸泡液合并后，用旋转蒸发仪减压浓缩至小体积，控制浓缩温度不高于55℃。所得浓缩液用与之等量的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的萃取液。将所得萃取液浓缩至干燥，得到乙酸乙酯萃取部分700g。将乙酸乙酯萃取部分用少量二氯甲烷-甲醇(2:1，v:v)溶解后吸附于1.5kg硅胶上，经减压硅胶柱色谱(200-300目，5kg，18×100cm)，用石油醚洗脱。将石油醚洗脱液减压浓缩至干，干燥物经二氯甲烷-甲醇(1:2，v:v)重结晶即得海松二烯酸单体产品112g。
采用本实施例的提取分离方法，所述海松二烯酸的得率为：112/10000*100％＝1.12％。
实施例2
实施例为所述海松二烯酸的提取分离优选实施方式之一，具体的操作过程如下。
称取2kg细柱五加的干燥根皮，经粉碎机打成细粉，物料粉碎粒度在3-5mm，备用。在室温条件下，用20L丙酮-水(80:20，v:v)浸泡2次，每次72小时。将两次浸泡液合并后，用旋转蒸发仪减压浓缩至小体积，控制浓缩温度不高于55℃。所得浓缩液用与之等量的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的萃取液。将所得萃取液浓缩至干燥，得到乙酸乙酯萃取部分180g。将乙酸乙酯萃取部分用少量二氯甲烷-甲醇(2:1，v:v)溶解后吸附于400g硅胶上，经减压硅胶柱色谱(200-300目，4kg，18×100cm)，用石油醚洗脱。将石油醚洗脱液减压浓缩至干，干燥物经二氯甲烷-甲醇(1:3，v:v)重结晶即得海松二烯酸单体产品27g。
采用本实施例的提取分离方法，所述海松二烯酸的得率为：27/2000*100％＝1.35％。
实施例3
图1给出了所述海松二烯酸的1H-NMR谱图。图2给出了所述海松二烯酸的13C-NMR谱图。图3给出了所述海松二烯酸的HPLC谱图。经确认，实施例1和2提取分离的海松二烯酸具有式(Ⅰ)结构，其相关的理化参数、结构数据如下。
分子式：C20H30O2；
分子量：302.45；
性状：白色块状结晶；
溶解性：易溶于二氯甲烷、氯仿、丙酮中，几乎不溶于水；
熔点：162–163℃；
旋光[α]25D＝–129°(c＝0.8,CHCl3)；
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δH:5.72(1H,dd,J＝17.1,10.4Hz,H-15),5.13(1H,br s,H-14),4.93(1H,dd,J＝10.4,2.0Hz,H-16a),4.90(1H,dd,J＝17.1,2.0Hz,H-16b),1.24(3H,s,H-17),0.98(3H,s,H-18),0.64(3H,H-20)。
13C-NMR(CDCl3,150MHz)δC:39.3(t,C-1),19.3(t,C-2),38.0(t,C-3),44.1(s,C-4),56.2(d,C-5),24.2(t,C-6),35.9(t,C-7),138.0(s,C-8),50.6(d,C-9),39.3(s,C-10),19.6(t,C-11),36.5(t,C-12),38.6(s,C-13),128.0(d,C-14),147.3(d,C-15),113.0(t,C-16),29.3(q,C-17),29.4(q,C-18),184.5(s,C-19),13.9(q,C-20)。
实施例4
本实施例测定了海松二烯酸抑制黄嘌呤氧化酶活性。
黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是一种催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸的蛋白酶。XO存在于多种生物体中，当其活性过高，则会使生物体体内尿酸生成增加，进而导致高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)。HUA与痛风和多种代谢性疾病(糖尿病、代谢综合征、高脂血症等)、心血管疾病、慢性肾病、脑卒中等密切相关。目前，临床上使用的XOI主要有两个，即别嘌呤醇(allopurinol)和非布司他(febuxostat)。本实施例通过构建体外XO抑制活性评价模型，以测试海松二烯酸抗XO活性。
1材料
吸光度用全波长酶标仪(Multiskan GO，Thermo Scientific，USA)测定，黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤、别嘌呤醇分别购自成都西亚化工股份有限公司，EDTA-2Na、KH2PO4、K2HPO4和甲醇等均为国产分析纯试剂。
2方法
2.1溶液配制
a.缓冲液的配制
精密称取KH2PO4 0.4780g，K2HPO4.3H2O 3.4730g及EDTA-2Na 10.00mg置于250ml容量瓶中，用蒸馏水定容即得。
b.底物配制
精密称取3.65mg黄嘌呤，加入缓冲液定容至50ml，超声溶解即得。
c.酶液配制
取黄嘌呤氧化酶(XO，5U)用50ml缓冲液稀释后分装在多个EP管中，于-70摄氏度保存，用时取出。
2.2活性测试
精密称取海松二烯酸适量，用DMSO溶解备用，反应体系总体积为200μl，反应时先依次向96孔板加入缓冲液20μl、样品20μl，酶液80μl，在酶标仪内37摄氏度孵育三分钟，之后加入底物黄嘌呤80μl，启动反应，立即在295nm处记录吸收度值(每隔30s一次)，共计6min。本实验设置样品组(加样品、底物和酶)、酶组(加底物和酶但不加样品)、空白组(只加底物和样品不加酶)和阳性对照组(别嘌呤醇)。
抑制率(％)用下列公式计算：
抑制率(％)＝(ΔA酶－ΔA样品)/(ΔA酶－ΔA空白)×100。
其中，ΔA指一定时间内吸光度的差值。
将海松二烯酸的6个系列浓度抑制结果，通过GraphPad Prism 5软件计算其IC50。所述海松二烯酸的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制IC50曲线见图4。
3结果
由图4可知，海松二烯酸具有显著的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其IC50为55.4μg/ml(阳性别嘌醇的IC50为9.1μg/ml)。本实施例首次得出海松二烯酸的抗XO活性，由此推测海松二烯酸可能具有潜在的抗高尿酸症作用。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (1)
1.具有式（Ⅰ）结构的海松二烯酸或其药学上可接受的盐在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂药物方面的应用，所述海松二烯酸从五加科植物细柱五加中提取分离得到，
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