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CN108384819A - 一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法 - Google Patents

一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法。所述培养基包括碳源和氮源，其中所述的碳源包括可溶性淀粉30‑70g/L、果糖5‑20g/L和乳糖5‑20g/L，所述氮源包括鱼粉蛋白胨1‑40g/L和酵母浸膏10‑30g/L。采用本发明的培养基或发酵方法发酵他克莫司的产率高，效价为现有的培养基发酵效价的3倍，达到1000mg/L以上。

Description

一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法。
背景技术
他克莫司是从链霉菌属中分离出的发酵产物，是一种强力的免疫抑制剂，较环孢素强100倍。临床试验证明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中有很好的疗效，在多种免疫性疾病中年也发挥着积极作用。
目前他克莫司的获得主要通过细菌微生物(或放线菌发酵)发酵获得。提高他克莫司的发酵产量主要通过菌株改造和培养基组分的改良。
其中，对菌株的改造方面主要包括扩增乙酰CoA合成酶、羧化酶等基因片段，提高菌株对目标产物的耐受(Jung S,Moon S,Lee K,et al.Strain development ofStreptomyces sp.for tacrolimus production using sequential adaptation.[J].Journal of Industrial Microbiology,2009,36(12):1467-71)等方式。
关于培养基组分的改良，现有工艺主要通过添加前体氨基酸(Singh B P,BeheraB K.Regulation of tacrolimus production by altering primary source of carbonsand amino acids[J].Letters in Applied Microbiology,2009,49(2):254-9.)、哌啶酸(J,Gajzlerska W,Klimaszewska M.Enhancement of tacrolimus productivity inStreptomyces tsukubaensis by the use of novel precursors for biosynthesis[J].Enzyme&Microbial Technology,2012,51(6-7):388-95)、油酸甲酯(Mo S J,Ban Y H,Park J W,et al.Enhanced FK506production in Streptomyces clavuligerus,CKD1119by engineering the supply of methylmalonyl-CoA precursor[J].Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology,2009,36(12):1473-1482.)、植物油(玉米油(Kim H S,Park Y I.Lipase activity and tacrolimus production in StreptomycesclavuligerusCKD 1119 mutant strains.[J].Journal of Microbiology&Biotechnology,2007,17(10):1638-1644)：提高脂肪酶活性)、复合碳源(糊精、可溶性淀粉等配比)(王亚,黄鹤,边佳昕,等.他克莫司工程菌的构建及初步发酵工艺优化[J].中国医药工业杂志,2016,47(2):152-157)、以及加入丙酸、丙二醇和丙醇等物质(3碳链化合物(Gajzlerska W,Kurkowiak J,J.Use of three-carbon chain compounds asbiosynthesis precursors to enhance tacrolimus production in Streptomycestsukubaensis[J].New Biotechnology,2015,32(1):32-39))来提高他克莫司的产量。
而目前对培养基组分进行改良，大多需要针对特定的他克莫司生产菌株；换言之，不同的他克莫司生产菌株，例如他克莫司产生菌筑波链霉菌(S.tsukubaensis)No.9993(即CGMCC No.0083)的野生菌株及其基因工程菌需要对培养基中的不同组分进行改良才有较高的他克莫司的产量(他克莫司工程菌的构建及初步发酵工艺优化[J].中国医药工业杂志,2016,47(2):152-157)。培养基的普适性不强，且菌株构建的过程繁琐、投入大、耗时久；另外，目前培养基的配方复杂、成本高，多采用含有重金属离子的无机盐。上述存在问题均不利于他克莫司的工业化生产。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是解决上述现有技术的缺陷，提供一种新的用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法，其可以简化配方、减少金属污染并适用于不同种产他克莫司的筑波链霉菌菌株，提高他克莫司的发酵单位，提高生产效率，以利于适用于工业化生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种用于发酵他克莫司的培养基，包括碳源和氮源，所述碳源包括可溶性淀粉30-70g/L、果糖5-20g/L和乳糖5-20g/L；所述氮源包括鱼粉蛋白胨1-40g/L和酵母浸膏10-30g/L。
较佳地，所述碳源为可溶性淀粉30-70g/L、果糖5-20g/L和乳糖5-20g/L，和/或所述氮源为鱼粉蛋白胨1-40g/L和酵母浸膏10-30g/L。
较佳地，所述培养基还包括氨基酸，所述氨基酸的含量优选为1-10g/L。所述氨基酸为本领域常规，较佳地为L-精氨酸。
更佳地，所述培养基还包括无机盐，其中，所述无机盐较佳地为(NH4)2SO4和无水硫酸镁；所述(NH4)2SO4和无水硫酸镁的含量分别优选为1-20g/L和1-10g/L。
进一步更佳地，所述培养基还包括无机盐CaCO3，所述CaCO3的含量优选为0.5-1.5g/L。
最佳地，所述培养基还包括泡敌；所述泡敌的含量优选为1-20g/L。
本发明中，所述的培养基的pH为常规，可以自然，也可以调节，较佳地为pH6.2-6.8。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种他克莫司的发酵方法，其包括如下步骤：
(1)将产他克莫司的筑波链霉菌的种子液接种于上述发酵培养基中进行液体发酵培养，得到发酵液；
(2)从所述发酵液中分离出他克莫司。
本发明中，所述的筑波链霉菌可以是现有的各种产他克莫司的筑波链霉菌，较佳地为筑波链霉菌(S.tsukubaensis)No.9993，即CGMCC No.0083。
本发明发酵培养的种子液的制备及接种方法为本领域常规，较佳地，其中一级种子培养时间为48-72h(小时)，二级种子培养时间为24-48h，二级种子接种量为1-2％，发酵液接种量为5-15％；所述的百分比为体积百分比。
在本发明一较佳实施例中，所述的一级种子培养时间为60h，所述的二级种子培养时间为48h，所述的二级种子接种量为1％，且所述的发酵液接种量为10％；所述的百分比为体积百分比。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种有利于链霉菌高效发酵生产他克莫司的发酵培养基及相应的发酵方法。通过对培养基配方的碳氮源进行综合配比，简化了配方、降低了成本、并减少了现有技术中Cu2+、Zn2+、Mn2+和Co2+等金属离子的使用及其导致的污染，另外，本发明培养基不仅可以提高筑波链霉菌对他克莫司的发酵产量，其对不同种产他克莫司的筑波链霉菌野生菌及基因工程菌均有提高作用，普适性强。结合本发明提供的发酵方法，他克莫司的发酵效价最高可达1000mg/L以上，约为现有技术中他克莫司发酵效价的3倍，有利于他克莫司的工业化生产。
附图说明
图1为他克莫司的液相检测图谱。
图2为采用不同的种子培养时间以及接种量后获得的相对效价柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下列实施例中的材料来源为：
鱼粉蛋白胨、无水硫酸镁、可溶性淀粉、(NH4)2SO4、果糖、酵母浸膏、乳糖以及CaCO3购自国药集团；L-精氨酸购自上海维编；泡敌购自川抗制药。
下述百分比均为体积百分比。
实施例1发酵培养方法及标准效价的指定
1、确定种子生长时间以及接种量的正交实验
1)种子的制备
在无菌条件下，取一株筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)CGMCC No.0083(购自CGMCC)，即SIPI-F001接种到斜面培养基，将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，传代周期10-14d(天)，接种周期18-20d，依菌落生长情况而定，一般培养15天，得到成熟的孢子。然后将成熟的孢子接种于装有30ml种子培养基的250ml摇瓶(或接种于装有100ml种子培养基的750ml摇瓶)中，在28℃、240rpm摇床上培养。然后在其他条件相同的条件下，具体按照下述表1对一级种子的培养时间、二级种子接种量、二级种子的培养时间以及发酵液的接种量进行测验。
表1种子生长时间以及接种量的正交实验
2)所用培养基的组成
斜面培养基(ISP4)：可溶性淀粉10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁1g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化锰0.01g/L，硫酸锌0.01g/L，CaCO32 g/L，琼脂20g/L，pH 7.2、121℃灭菌25分钟。
种子培养基：可溶性淀粉10g/L、口服葡萄糖15g/L、牛肉浸膏20g/L，硫酸铵3g/L、酵母粉2.5g/L、花生粕5g/L，CaCO3 2g/L，种子瓶，pH 7.0、121℃灭菌25分钟。
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、鱼粉蛋白胨20g/L、酵母浸膏20g/L、果糖10g/L以及乳糖10g/L，(NH4)2SO4 10g/L、无水硫酸镁5g/L、L-精氨酸5g/L、泡敌10g/L、CaCO3 1g/L、pH 6.5。
3)发酵
将制得的发酵液中的成熟种子以上述表1中的接种量接种于发酵培养基中，装量30mL/250mL，于25℃，250rpm的旋转式摇床培养168小时，取发酵液1ml，离心取上清用高效液相色谱(HPLC)进行他克莫司含量的测定。
具体如下：
仪器：安捷伦1200高效液相；
分析柱：月旭XB-C18(2.1×150mm，3um)；
流动相：A：10％乙腈含0.1％的磷酸、B：100％乙腈；
柱温：40℃；
波长：200nm；
进样量：5μl；
表2冲洗程序：
时间/min B(％) 流速ml/min 压力(bar)
0 50 0.3 250
1.0 50 0.3 250
13.0 85 0.3 250
15.0 85 0.3 250
16.0 50 0.3 250
22.0 50 0.3 250
他克莫司的液相检测图谱如图1所示。
实验结果见图2，其中编号为1的实验组为对照组。经对比发现，在编号为6的实验的接种量以及培养时间下培养筑波链霉菌获得相对效价最高为1082.81mg/L，他克莫司(TAC)产率为6.45mg/h。
表3种子正交实验结果：不同实验的相对效价和TAC产率
因此下述实施例中，一级种子的培养时间均采用60h，二级种子的培养时间均采用48h，二级种子接种量均采用1％，发酵液接种量均采用10％。
实施例2
1、种子的培养
在无菌条件下，取一株筑波链霉菌，即SIPI-F001接种到斜面培养基，将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，培养15天，得到成熟的孢子。然后将成熟的孢子接种于装有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，在28℃、240rpm摇床上培养60h得到一级种子，以1％的比例转接入装有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，相同条件下进行二级种子培养48h，得到成熟种子。所用种子培养基以及斜面培养基同实施例1。
2、发酵
将制得的发酵液中的成熟种子以10％接种量接种于下述的发酵培养基中。发酵条件同实施例1。
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、鱼粉蛋白胨20g/L、酵母浸膏20g/L、果糖10g/L、乳糖10g/L、(NH4)2SO4 10g/L以及无水硫酸镁5g/L，pH 6.5。高效液相测得TAC效价为823.5317mg/L，TAC产率为4.90mg/h。
实施例3
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、鱼粉蛋白胨20g/L、酵母浸膏20g/L、果糖10g/L、乳糖10g/L、(NH4)2SO4 10g/L、无水硫酸镁5g/L以及L-精氨酸5g/L，pH 6.5。余同实施例2。高效液相测得TAC效价为1031.169mg/L，TAC产率为6.14mg/h。
实施例4
发酵培养基组成：可溶性淀粉30g/L、果糖5g/L、乳糖5g/L、鱼粉蛋白胨1g/L、酵母浸膏10g/L、(NH4)2SO4 1g/L、无水硫酸镁1g/L、L-精氨酸1g/L、泡敌1g/L以及CaCO3 0.5g/L，pH 6.2，余同实施例2。高效液相测得TAC效价为850.2672mg/L，TAC产率为5.06mg/h。
实施例5
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、果糖10g/L、乳糖10g/L、鱼粉蛋白胨20g/L以及酵母浸膏20g/L，pH 6.5，余同实施例2。高效液相测得TAC效价为675.2141mg/L，TAC产率为4.024mg/h。
实施例6
可溶性淀粉70g/L、果糖20g/L、乳糖20g/L、鱼粉蛋白胨40g/L、酵母浸膏30g/L、(NH4)2SO4 20g/L、无水硫酸镁10g/L、L-精氨酸10g/L、泡敌20g/L以及CaCO3 1.5g/L，pH6.8，余同实施例2。高效液相测得TAC效价为809.2933mg/L，TAC产率为4.82mg/h。
对比例1
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、鱼粉蛋白胨20g/L，pH 6.5，余同实施例2。高效液相测得TAC效价为242.6045mg/L，TAC产率为1.44mg/h。
对比例2
发酵培养基组成：可溶性淀粉50g/L、鱼粉蛋白胨20g/L以及酵母浸膏20g/L，pH6.5，余同实施例2。高效液相测得TAC效价为416.73mg/L，TAC产率为2.50mg/h。
效果实施例1
以实施例1为发酵培养基配方，与文献报道中菌种TAC发酵水平对比如下：
参考文献：
[1]Singh B P,Behera B K.Regulation of tacrolimus production byaltering primary source of carbons and amino acids[J].Letters in AppliedMicrobiology,2009,49(2):254-9.
[2]J,Gajzlerska W,Klimaszewska M.Enhancement of tacrolimusproductivity in Streptomyces tsukubaensis by the use of novel precursors forbiosynthesis[J].Enzyme&Microbial Technology,2012,51(6-7):388-95.
[3]Mo S J,Ban Y H,Park J W,et al.Enhanced FK506 production inStreptomyces clavuligerus,CKD1119 by engineering the supply of methylmalonyl-CoA precursor[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2009,36(12):1473-1482.
[4]Kim H S,Park Y I.Lipase activity and tacrolimus production inStreptomyces clavuligerusCKD 1119 mutant strains.[J].Journal of Microbiology&Biotechnology,2007,17(10):1638-1644.
[5](碳源)王亚,黄鹤,边佳昕,等.他克莫司工程菌的构建及初步发酵工艺优化[J].中国医药工业杂志,2016,47(2):152-157.
[6]Gajzlerska W,Kurkowiak J,J.Use of three-carbon chaincompounds as biosynthesis precursors to enhance tacrolimus production inStreptomyces tsukubaensis[J].New Biotechnology,2015,32(1):32-39.
[7]Jung S,Moon S,Lee K,et al.Strain development of Streptomycessp.for tacrolimus production using sequential adaptation.[J].Journal ofIndustrial Microbiology,2009,36(12):1467-71.
效果实施例2
对照组发酵培养基配方：糊精50g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉5g/L、亮氨酸3g/L、哌啶-2-甲酸1g/L、K2HPO4 1g/L、CuSO4·5H2O 0.003g/L、FeSO4·7H2O 0.0025g/L、MnCl2·4H2O 5×10-4g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.003g/L、CaCO3 1g/L、Mg3(PO4)2 5g/L以及泡敌1g/L；pH7.2(参见上述参考文献[5])；发酵方法，如种子制备、接种量、培养温度以及培养时间等，同上述实施例2。
本发明选用实施例1中发酵培养基配方。
发酵结果如下：
SIPI-F001 SIPI-F002 SIPI-F003
对照组TAC产生水平(mg/L) 489.0435 402.1252 670.3715
实施例1TAC产生水平(mg/L) 1314.749 699.6951 793.0005
其中筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)基因工程菌SIPI-F002、SIPI-F003可取自上海医药工业研究院，或通过上述参考文献[5]披露的方法制得，其中构建SIPI-F002以及SIPI-F003所用的天蓝色链霉菌M145和游动放线菌N902-109均可取自上海医药工业研究院，载体pLYW2和pIJ8660购自GIBCO-BRL。所用的筑波链霉菌No.9993即CGMCCNo.0083。
通过上表可知，本发明发酵培养基用于其他工程菌菌株也对他克莫司的产生具有不同程度的促进作用，并不局限于实验菌株SIPI-F001，对他种产生相同目标产物的菌株均具有一定程度的促进作用。

Claims (10)

1.一种用于发酵他克莫司的培养基，包括碳源和氮源；其特征在于所述碳源包括可溶性淀粉30-70g/L、果糖5-20g/L和乳糖5-20g/L，所述氮源包括鱼粉蛋白胨1-40g/L和酵母浸膏10-30g/L。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碳源为可溶性淀粉30-70g/L、果糖5-20g/L和乳糖5-20g/L，和/或所述氮源为鱼粉蛋白胨1-40g/L和酵母浸膏10-30g/L。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括氨基酸，所述氨基酸的含量为1-10g/L；较佳地所述氨基酸为L-精氨酸。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括无机盐。
5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述无机盐为(NH4)2SO4和无水硫酸镁；较佳地，所述(NH4)2SO4和无水硫酸镁的含量分别为1-20g/L和1-10g/L。
6.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述无机盐还包括CaCO3，较佳地，所述CaCO3的含量为0.5-1.5g/L。
7.如权利要求1-6任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括泡敌；较佳地，所述泡敌的含量为1-20g/L。
8.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基的pH值为6.2-6.8。
9.一种他克莫司的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将产他克莫司的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)，较佳地为筑波链霉菌CGMCC No.0083的种子液接种于权利要求1-8任一项所述培养基中进行液体发酵培养，得到发酵液；
(2)从所述发酵液中分离出他克莫司。
10.如权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，所述的种子液的制备中一级种子培养时间为48-72h，二级种子培养时间为24-48h，二级种子接种量为1-2％，发酵液接种量为5-15％；较佳地，所述的一级种子培养时间为60h，所述的二级种子培养时间为48h，所述的二级种子接种量为1％，且所述的发酵液接种量为10％；所述百分比为体积百分比。
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