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CN108366579A - 油菜籽蛋白质分离物、包含所述分离物的食物以及作为发泡剂或乳化剂的用途 - Google Patents

油菜籽蛋白质分离物、包含所述分离物的食物以及作为发泡剂或乳化剂的用途 Download PDF

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CN108366579A
CN108366579A CN201680073207.9A CN201680073207A CN108366579A CN 108366579 A CN108366579 A CN 108366579A CN 201680073207 A CN201680073207 A CN 201680073207A CN 108366579 A CN108366579 A CN 108366579A
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protein
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约翰内斯·亨德里克斯·安东尼厄斯·杰伦·维尔穆恩特
尼恩克·尼娜·海尔克马
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Abstract

本申请涉及包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物和获得所述包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法。

Description

油菜籽蛋白质分离物、包含所述分离物的食物以及作为发泡 剂或乳化剂的用途
发明领域
本发明涉及包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物和获得所述包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法。
发明背景
油菜籽是世界上最重要的油籽之一(排名第3，在大豆和棕榈油之后)。油菜籽含有大量的油(30-45％)和蛋白质(20-30％)。然而，油菜籽中也存在抗营养化合物，例如硫代葡萄糖苷、多酚和植酸。因此，由于此类抗营养化合物的存在，油菜籽在人类营养学方面受到的关注较少。然而，现在可以使用更新的技术来消除此类化合物。
用于油生产的油菜籽种加工提供了油籽饼，也被称为油籽粕，作为冷压和任选地从油菜籽种中提取油的副产物。油籽粕具有高蛋白质含量，其可被进一步提取以产生油菜籽蛋白质分离物。
由于油菜籽蛋白质分离物具有与许多动物蛋白质不相上下且优于大多数植物蛋白质的平衡氨基酸谱，其现在被建议作为用于人类食物用途的其他蛋白质的替代物。此外，天然油菜籽蛋白质分离物具有良好的潜在功能特性，例如乳化、发泡和胶凝能力。所有这些特性表明：油菜籽种是用于食品加工业中的高品质蛋白质分离物的宝贵来源，并且还可用作大豆衍生品和其他动植物产品的良好替代物。
在人类营养中使用基于植物的蛋白质是已知的，例如WO2008/094434公开了使用小麦蛋白分离物作为在组合物中使用蛋黄蛋白的替代物。然而，使用小麦蛋白分离物可能不适合那些谷蛋白过敏的人。
谷蛋白是在小麦和相关谷粒(包括大麦和黑麦)中发现的蛋白质复合物。谷蛋白是等量的两种贮藏蛋白(麦醇溶蛋白和麦谷蛋白)的复合物，并与多种草类相关谷粒的内胚乳中的淀粉结合在一起。正是这种蛋白质复合物在烘烤过程中增强和粘合面团。
已经发现：小部分人口对谷蛋白敏感，其中谷蛋白消耗会产生负面副作用。例如，非乳糜泻谷蛋白敏感(non-coeliac gluten sensitivity)(也常被描述为小麦过敏)是由谷蛋白胃肠反应综合征引起的病症。据估计，谷蛋白相关疾病的全球患病率约为人口的5％。
在患有乳糜泻的个体中，消耗谷蛋白会引起不利的健康问题。乳糜泻是一种影响小肠消化过程的自身免疫性疾病。在2009年，研究显示：美国和英国的人口中有0.5％至1.0％由于乳糜泻对谷蛋白敏感。乳糜泻无法治愈，但可以用不含谷蛋白的饮食控制。
油菜籽(甘蓝油菜(Brassica Napus))也称为油菜、油籽油菜(rape，oilseedrape，rapa，rappi，rapaseed)(在一个特定品种组的情况下，为芥花籽(canola))，其是十字花(Brassicaceae)科(芥末或甘蓝科)的亮黄色开花成员(Wanasundara，2011)。授粉后，油菜籽植物形成细长的荚，所述荚具有被膜隔开的两个室，每个室内有一排种子。荚包含15-30个小的球形种子。成熟时，甘蓝油菜物种的种子呈褐色至黑色。每磅有约115000粒种子。种子的直径为约0.8-2.4mm，虽然种子大小可以因品种和环境影响而异，但与约6mm长且3-3.5mm宽的细长小麦粒的尺寸和形状相比，差异较小。
当油菜籽与小麦、黑麦或大麦轮作生长时，可导致收获的油菜籽种中存在含有谷蛋白的谷粒。此外，油菜籽种可在也用于小麦等的容器中被运输或储存。谷蛋白包含在小麦或大麦籽粒中。这可导致从油菜籽种提取的油中以及来源于其的任何蛋白质中存在谷蛋白。在提取油之前使用基本分离技术去除污染物例如棒和石头以及使用正常精炼工艺去除较大颗粒应该足以产生不含谷蛋白的油菜籽油。然而，对于其中制备并非如此精细的冷压油菜籽油，可存在残留的谷蛋白污染物。此外，来源于冷压油菜籽饼的油菜籽蛋白质分离物中存在谷蛋白的问题没有得到充分解决，因为制备油菜籽蛋白质分离物的过程可导致浓缩存在的任何谷蛋白，从而增强该作用。
WO2014/147068公开了从油籽粕、优选从冷压的油籽粕选择性地优先于油提取蛋白质，以生产由天然蛋白质构成的蛋白质分离物。
然而，仅筛选和清洁不足以去除所有含谷蛋白的污染物，因为筛选通常用于去除较大的石头和枝条。有时，先将油菜籽种脱皮，然后再压榨以提取油，因为剩余的种子粕中存在的皮可导致油的营养价值降低。脱皮过程涉及利用压力粉碎辊之间的油菜籽种，其中压力的施加量足以使皮破裂但不会粉碎籽粒。随后，可以通过筛选将皮和籽粒分开。油菜籽种的脱皮不会去除小麦或大麦污染物，因为脱皮过程可能导致粉碎存在的任何小麦或大麦，从而使得分离出含谷蛋白的污染物甚至更加困难。
US 4,253,946公开了一种用于谷粒螺旋输送机的清洁附属件，其中在螺旋管的下侧提供一系列半圆形开口部分，当不使用清洁装置时，用坯件(blanks)覆盖所述开口部分，当期望清洁被螺旋输送的谷粒等时，用半圆形筛覆盖所述开口部分。选择筛网的网目以适应期望的清洁。覆盖物(shroud)围住筛，辅助螺旋位于覆盖物的基部并由主螺旋驱动器驱动。无论主螺旋组装体的倾斜角度如何，该辅助或返回螺旋将已通过筛的小麦种子等移到覆盖物下端的排放口。
US 2015/208689公开了据称不含小麦谷蛋白的宠物肉类食品，并提供了其制备方法。所述宠物肉类食品及其制备方法采用(i)芥花籽蛋白质分离物(IsolexxTM)、(ii)亚麻籽粕和芥花籽蛋白质分离物的组合或(iii)亚麻籽粕和蛋清的组合来替代小麦谷蛋白，而不对产品结构、外观和适口性产生负面影响。
为了确保油菜籽蛋白质分离物适用于患乳糜泻的个体，必须确保油菜籽蛋白质分离物的谷蛋白水平已经过检测。已经发现：应该在粉碎以从油籽中提取油之前进行有效的清洁，然后从所得到的油籽饼中提取蛋白质。低水平谷蛋白的问题尚未被确定，因为认为由于油菜籽种不含谷蛋白，所有其固有地不含谷蛋白。
发明概述
因此，需要确保油菜籽蛋白质分离物可以不含谷蛋白。不含谷蛋白是指蛋白质分离物包含小于20ppm谷蛋白，更优选小于10ppm谷蛋白。通常通过测量麦醇溶蛋白含量来测量谷蛋白。
因此，根据本发明，提供了包含小于10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物。根据本发明，还提供了制备包含小于10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然蛋白质分离物的方法。
发明详述
在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包含”、“包括”以及变化形式应被解释为包含性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素或整体。
不使用数量词修饰时在本文中指代一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)的语法对象。举例来说，“要素”可意指一个/种要素或多于一个/种要素。
根据本发明，提供了不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含小于10ppm麦醇溶蛋白。更优选地，所述不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物包含小于5ppm麦醇溶蛋白；最优选地，检测不到麦醇溶蛋白。
蛋白质分离物
蛋白质可以以水解物、浓缩物和分离物的形式获得。水解物是通过将蛋白质暴露于热、酸或断开连接氨基酸的键的酶而部分分解了的蛋白质。这使得其味苦，但也使其在消化过程中比天然(非水解的)蛋白质更快地被吸收。分离物比浓缩物更纯，这意味着其他非蛋白质组分已被部分去除以“分离”蛋白质。
本发明的油菜籽蛋白质分离物是天然油菜籽蛋白质分离物。天然意味着蛋白质没有被有意水解，并且蛋白质处于其正确折叠的形状(处于其天然“构象”或“结构”)。
许多蛋白质浓缩物是约80％的蛋白质，这意味着以干基计，总重量的80％是蛋白质。分离物通常是约90％蛋白质(干基)。这是使用凯氏(Kjeldahl)法计算的。通常，蛋白质分离物的非蛋白质内含物包括非蛋白质化合物，如抗营养物质、脂肪、纤维和其他组分。
优选地，本发明的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有以干重计至少90重量％(按照凯氏N x 6.25计算)，更优选至少94重量％，最优选至少96重量％，特别地至少98重量％的蛋白质含量。
在油菜籽种中发现的主要储藏蛋白是十字花科植物素(cruciferins)和芸苔籽蛋白(napins)。十字花科植物素是球蛋白，是种子中的主要储藏蛋白。十字花科植物素由6个亚基构成，总分子量为约300kDa。芸苔籽蛋白是白蛋白，是分子量为约14kDa的低分子量储藏蛋白。芸苔籽蛋白更容易溶解，例如EP 1715752中公开了一种方法，以分离出可溶性较强的芸苔籽蛋白级分，优选达到至少85重量％。芸苔籽蛋白被主要建议用于溶解度很关键的应用中。
根据以斯韦德贝里单位(S)计的相应沉降系数，油菜籽蛋白质也可以被分成多种级分。该系数表示大分子在离心场中的沉降速度。对于芥花籽蛋白质而言，主要报道的级分是：12S、7S和2S。芸苔籽蛋白是2S白蛋白，而十字花科植物素是12S球蛋白。此外，Schwenke,K.D.和K.J.Linow指出：来自油菜籽(Brassica napus L.)的12S球蛋白的可逆解离取决于离子强度。Die Nahrung＝Food,1982(1)]指出：十字花科植物素复合物在暴露于较高离子强度(μ≥0.5mS/cm)时以300kDa 12S六聚体的形式存在，在暴露于低离子强度条件时可逆地解离成150kDa的7S三聚体分子。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物包含40-65重量％的十字花科植物素和35-60重量％的芸苔籽蛋白。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有0.9-1.3范围内的十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物包含至少5％、更优选至少15％(以干物质计)的12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE(Blue Native PAGE)来核实12S的存在。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物包含少于20％(以干物质计)的7S油菜籽蛋白质。
为了在人类食物消费中使用，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物优选包含低水平的盐。这是通过电导率来测量的。优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中在2至12的pH范围内的电导率小于9000μS/cm。更优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中在2.5至11.5的pH范围内的电导率小于4000μS/cm。为了进行比较，5g/l NaCl水溶液的电导率为约9400μS/cm。
为了在人类食物消费中、特别是在营养饮料中使用，重要的是，油菜籽蛋白质分离物在宽pH范围内可溶，以改善口感和减少沙砾感(grittiness)。因此，优选地，当在23+/-2℃的温度下在4至10的pH范围内测量时，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有至少88％、更优选至少90％、最优选至少94％、特别地至少96％的溶解度。这也被称为可溶性固体指数(SSI)。
为了在人类食物消费中使用，去除植酸盐、酚化合物(phenolics)(或多酚化合物(polyphenolics))和硫代葡萄糖苷防止不吸引人的风味和着色并防止降低蛋白质分离物的营养价值。同时，这种去除提高蛋白质分离物的蛋白质含量。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有低于0.4重量％、更优选低于0.3重量％、最优选低于0.15重量％的植酸盐水平。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有以干物质计小于0.1重量％、优选小于0.05重量％的酚化合物含量，酚化合物含量被表示为芥子酸当量。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物具有低于0.8μmol/g、更优选低于0.5μmol/g的硫代葡萄糖苷(glucosinolate)水平。
根据本发明的一个实施方式，提供了包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物；当在23+/-2℃的温度下在4至10的pH范围内测量时，其溶解度为至少88％；其在2重量％水溶液中在2至12的pH范围内的电导率小于9000μS/cm；并且其具有在0.9至1.3的范围内的十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值。
在本发明的另一个实施方式中，提供了包含<10ppm麦醇溶蛋白的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含以干物质计至少85重量％、优选至少90重量％、最优选92-99重量％的蛋白质含量；和以干物质计小于0.1重量％的酚化合物含量，所述酚化合物含量被表示为芥子酸当量。
本发明的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物可以用于任何人类营养食物应用中，包括作为发泡剂以代替蛋清，作为乳化剂以代替例如蛋黄酱中的蛋黄以及简单地作为营养组分以提供优异的氨基酸谱。
方法
根据本发明的另一个实施方式，提供了制备根据本发明的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法至少包括以下步骤：
i)将油菜籽种与含有谷蛋白的污染物分离；
ii)冷压经分离的油菜籽种以提取油菜籽油，从而产生油籽饼；
iii)用水溶液提取所述油籽饼以获得包含油菜籽蛋白质的水溶液；
iv)从经提取的油籽饼分离出包含油菜籽蛋白质的水溶液；
v)浓缩所述包含油菜籽蛋白质的水溶液；
vi)从浓缩的水溶液中获得油菜籽蛋白质分离物，其包含<10ppm麦醇溶蛋白。
优选地，用于从油籽中分离油的方法中的条件不导致油籽或饼中存在的蛋白质实质变性。一个例子是在提取过程中避免使用溶剂如己烷。温和条件的另一个例子是冷压油菜籽。维持蛋白质的天然性(nativity)和功能性对于在广泛食品应用中使用这些蛋白质是有利的，例如在期望发泡或乳化的食品应用中。已发现，通过本发明的方法产生的油菜籽蛋白质分离物是天然(非变性的)蛋白质。
优选地，油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，所述方法不包括用于分离出十字花科植物素和芸苔籽蛋白的分级步骤。
优选地，不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，其中保持芸苔籽蛋白和十字花科植物素的水平基本恒定在要求保护的范围内(即，不通过分级有意提高芸苔籽蛋白(2S)和十字花科植物素(12S)的水平)。
在本发明的另一个实施方式中，提供了制备不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，其包括以下附加步骤：
洗涤包含油菜籽蛋白质分离物的水溶液；
干燥浓缩物以获得油菜籽蛋白质分离物。
分离
为了从油菜籽种中去除任何含有谷蛋白的污染物，可以进行多种分离技术，包括筛分、图像分析、重力法和旋转。
在一个实施方式中，为了去除任何含有谷蛋白的污染物，收获后将油菜籽种过筛。已知用于种子的一般清洁的许多筛分工艺和机器。例如，可以使用包含至少两个筛的空气筛分机，其中第一筛例如具有尺寸为9mm的圆形穿孔，从而允许种子穿过，仅保留较大的材料(例如绿色谷粒、荚、茎、秆和培养物碎片(culture debris))。包含种子和其他较小杂质的材料落在另一个筛上，该筛具有小于种子尺寸(宽度和厚度)的穿孔。小于种子的材料穿过第二筛并被收集用于处置。同时，可以利用抽吸来去除重量比种子轻的材料。可商业获得的清洁机器包括Cimbria Manufacturing A/S的Cimbria DELTA Super 101系列。这些机器聚焦于分离较轻的颗粒和较重的颗粒(如石头等)。
为了从油菜籽种中去除含有谷蛋白的污染物，优选使用具有在2mm至2.8mm范围内的孔的圆孔筛。这允许油菜籽种穿过，因此分离出较大的含有谷蛋白的污染物以便处置。
冷压
冷压油菜籽种以制备油籽饼的方法在本领域中是公知的。为了保持蛋白质的天然状态，用于蛋白质提取的油籽饼优选来源于未经己烷处理的油籽。
提取
为了从油籽饼中提取蛋白质级分，可以采用几种提取技术。这些技术包括用水或碱、NaCl和六偏磷酸钠溶液提取。碱提取方法导致最高产率，但具有产品变暗的风险并对味道或气味有负面影响。
以与从油籽饼中连续提取蛋白质相符的任何方便方式从油籽饼中提取蛋白质，例如使油籽饼和食品级水溶液的混合物通过管道，所述管道的具长度以及流速获得足以实现期望的提取的停留时间。
或者，可以在搅拌罐中进行提取，将油籽饼和水溶液的混合物连续或不连续地进料到所述搅拌罐中，并从所述搅拌罐中连续或不连续地移除蛋白质水溶液。此外，该程序可以以等价于连续的半连续方式进行，其中将油籽饼水溶液的混合物进料到第一搅拌容器中，在所述第一搅拌容器中进行提取以形成蛋白质水溶液，以及将蛋白质水溶液从第二搅拌容器连续进料到下文描述的残留油籽饼分离步骤。当第一容器中已经形成蛋白质水溶液并且第二容器已经耗尽蛋白质水溶液时，第一容器于是变成第一容器，反之亦然。
优选地，使用比例在0.5:15至2:8的范围内的水性提取液从油菜籽油饼中提取蛋白质。优选地，水性提取液为水性盐溶液。更优选地，水性盐溶液包含NaCl。最优选地，水性盐溶液包含0.1-5％、特别地1-5％的NaCl(w/w)。
优选地，提取时间在5-60分钟的范围内，更优选在30-60分钟的范围内。
优选地，提取温度在4-75℃、更优选20-75℃、最优选40-75℃、特别地45-65℃的温度下进行。
可以以任何方便的方式将由提取步骤产生的水相或水溶液与残留的油籽饼分离，例如通过应用过滤和/或离心来除去残留的饼。
经分离的残留油籽饼可被干燥并用于例如动物饲料。
富含蛋白质的溶液在下文中被称为提取物。从提取物制备油菜籽蛋白质分离物的替换性方法包括但不限于：A)浓缩提取物或B)通过从提取物中沉淀出蛋白质分离物。
A)浓缩不含谷蛋白的天然蛋白质分离物提取物
优选地，利用离心使含有油菜籽蛋白质分离物的提取物脱乳脂(decreamed)。也可以使用过滤。优选地，脂肪水平降低至少30％，更优选至少50％(w/v)。可以进一步处理提取物以澄清材料并去除非蛋白质物质。优选地，从水溶液或浓缩水溶液中除去可溶性碳水化合物、硫代葡萄糖苷或其衍生物、植酸盐或多酚(或酚)化合物或这些化合物中的一种或多种的组合。
然后可以浓缩并洗涤包含油菜籽蛋白质分离物的水相。浓缩步骤可以以与(半)连续或分批(不连续)操作相符的任何方便方式进行，例如通过使用任何适当的选择性膜技术，例如超滤(UF)，以允许所期望的蛋白质水溶液浓缩程度。优选地，在浓缩步骤之前、之后或期间，可以进行渗滤。在提取步骤之后且在添加水溶性溶剂之前进行该渗滤。UF可用于渗滤。所以UF可用于渗滤以及浓缩，或者UF可用于渗滤，而浓缩步骤是分开进行的。通过使用用于渗滤的UF，存在于水提取物中的大部分可溶性碳水化合物和ANF(抗营养因子，如硫代葡萄糖苷及其衍生物、植酸盐和大多数多酚化合物)也可以被有利地除去。
有利的是，在本发明的方法中，在提取步骤之后，优选通过使用UF(超滤)对水溶液或浓缩水溶液进行渗滤。
优选地，使用约5-15倍浓缩物体积的渗滤水洗涤浓缩物。例如，如果初始体积为300L，则将液体浓缩至约50L(6x浓缩)，然后用500L(10x)水洗涤。
可以以任何方便的方式，例如通过喷雾干燥(单级或多级)、流化床干燥、冷冻干燥或真空转鼓干燥，将包含不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的浓缩物干燥成干燥形式。
B)从提取物中沉淀不含谷蛋白的天然蛋白质分离物
在本发明的一个替代性实施方式中，提供了一种制备不含谷蛋白的油菜籽蛋白质分离物的方法，其中将水性提取物浓缩成包含5-30重量％蛋白质、优选10-30重量％蛋白质的水溶液，然后向浓缩的水溶液中加入水溶性溶剂以获得蛋白质沉淀物；随后从液体级分中分离蛋白质沉淀物以获得油菜籽蛋白质分离物。
水溶性溶剂优选选自甲醇、乙醇、丙酮或其混合物，更优选乙醇。优选地，分离后的液体级分包含任何多酚化合物。
优选地，该方法可以进一步包括下述附加步骤或后续步骤中的一个或其组合：洗涤蛋白质沉淀物；和干燥蛋白质沉淀。
从沉淀的蛋白质制剂中除去酚化合物的方法之一是用水溶性溶剂(如甲醇、丙酮、乙醇等)将它们洗出。可以使用不同的方法，例如预处理，例如在提取蛋白质之前应用溶剂浸出步骤，或后处理，例如在提取或分离之后洗涤蛋白质分离物。
在其中加入水溶性溶剂(如乙醇)的步骤中，优选使用至少90体积％溶剂，优选至少92体积％的溶剂的水溶性溶剂。因此，在其中加入乙醇的步骤中，优选使用至少90体积％的乙醇，优选至少92体积％的乙醇。然而，约70体积％乙醇的浓度足以使蛋白质沉淀。
蛋白质沉淀物和液体级分的分离可以在任何合适的分离器中进行，例如通过使用过滤和/或离心分离。液体级分可包含抗营养化合物(如植酸盐、酚化合物和硫代葡萄糖苷)和糖。如果如上所述使用渗滤步骤，则可仅存在少部分的这些化合物。
可以例如用含有少于70体积％的水溶性溶剂的水/水溶性溶剂(如乙醇溶液)洗涤沉淀物，其优选包含50-70体积％的水溶性溶剂，更优选50-70体积％的乙醇，最优选50-60体积％的乙醇。
方法和材料
蛋白质含量
根据AOAC官方方法991.20(乳中的(总)氮)通过凯氏法测定蛋白质含量。使用6.25的转换因子来确定蛋白质的量(％(w/w))。
电导率
使用电导率仪：Hach sensION+EC71，测量2重量％水溶液中的天然油菜籽蛋白质分离物的电导率。
溶解度试验：
称量足以提供0.8g蛋白质的蛋白质粉放入烧杯中。
向粉末中加入少量脱矿质水并搅拌混合物直至形成光滑的糊状物。然后加入额外的脱矿质水以使总重量为40g(产生2％w/w蛋白质分散体)。使用磁力搅拌器缓慢搅拌分散体至少30分钟。之后，测定pH并利用NaOH或HCl将pH调节至期望的水平(2、3、4等)。测量分散体的pH并在60分钟的搅拌期间定期校正pH。搅拌60分钟后，保留一份蛋白质分散液用于蛋白质含量测定(凯氏分析)。将另一部分样品在20000G下离心2分钟。离心后分离上清液和沉淀。上清液的蛋白质含量也通过凯氏分析来测定。
蛋白质溶解度(％)＝(上清液中的蛋白质/总分散体中的蛋白质)×100
通过蓝色非变性PAGE测定MW
在非变性PAGE的情况下，蛋白质电荷对电泳迁移率有影响。在蓝色非变性PAGE的情况下(与清澈(clear)非变性PAGE相反)，考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供电泳分离所需的电荷。
将蛋白质溶解在500mM NaCl中。由于高盐浓度与电泳分离不相容，所以将样品用水稀释10倍(最终盐浓度：50mM)。使用G-250(SimplyBlueTM,ThermoFischerScientific)，并利用ExQuestTM Spot Cutter(BioRad)扫描凝胶。观察进行蓝色非变性PAGE之后产生的条带。
预计约14kDa的条带指示2S，约150kDa的条带指示7S，300kDa的条带指示12S蛋白质左右。
十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值
通过尺寸排阻色谱(SEC)分析来确定C/N比值：
将样品溶解在500mM NaCl盐溶液中并使用与流动相相同的溶液通过HP-SEC进行分析。通过测量280nm处的UV吸光度来进行检测。按照每种蛋白质的峰面积相对于两个峰面积总和的比值来计算十字花科植物素和芸苔籽蛋白的相对贡献(重量％)。
植酸盐水平
基于Ellis等人,Analytical Biochemistry Vol.77:536-539(1977)，使用方法QD495在Eurofins测量植酸盐水平。
谷蛋白含量：
国际食品法典(Alinorm 08/31/26)根据谷蛋白含量将食物标记为两类：
1)含有小于20ppm谷蛋白的食品可被标记为“不含谷蛋白”，并被认为适用于患有乳糜泻的那些人。
2)标记为“非常低谷蛋白”的食品可以具有20-100ppm的谷蛋白含量，并被认为适用于对谷蛋白敏感的那些人。
麦醇溶蛋白是夹心酶免疫测定法，用于定量分析初级产品如面粉(和香料)以及加工食品(如面条、即食餐、烘焙产品、香肠、饮料和冰淇淋)中来自小麦(麦醇溶蛋白)、黑麦(黑麦醇溶蛋白)和大麦(大麦醇溶蛋白)的谷醇溶蛋白的污染。使用来自r-Biopharm的试剂盒：夹心ELISA麦醇溶蛋白，根据制造商的说明从提取样品测定麦醇溶蛋白水平。
UPEX(通用的谷醇溶蛋白和谷蛋白提取剂溶液)提取方法
1)称量0.25g份的磨碎的材料样品并转移到10cm3聚丙烯管中。
(2)向含有所述份的管中加入2.5cm3份的UPEX溶液(5mM TCEP，2％N-月桂酰肌氨酸的PBS溶液，pH为7)。为了防止还原剂失活，在使用前制备UPEX溶液。
(3)将管关紧并用膜覆盖盖以避免蒸发。
(4)通过涡旋5-10秒将管的内容物充分混合，然后将管置于架子中。
(5)将管在50℃的水浴中孵育40分钟。
(6)将管在室温下冷却5分钟。
(7)加入7.5cm3份的80％乙醇/水(v/v)，通过涡旋10-60秒将样品充分分散(直至获得样品的总分散体)，然后在室温下在旋转(头顶式)摇床中以45转/分钟孵育1小时。
(8)将管在台式离心机中以2500g在室温下离心10分钟。
检测麦醇溶蛋白ppm：
使用来自R-Biopharm的夹心ELISA(货号R7001，批次14434)，根据制造商的说明书来测定提取物中麦醇溶蛋白ppm。
实施例
实施例1：油菜籽种
该实施例显示了收获的油菜籽中谷蛋白交叉污染的存在以及可如何去除所述污染。
样品1和2包含可从Rickermann获得的脱皮油菜籽种(直径为1.5-2.0mm)。将种子过筛两次以分离含谷蛋白的污染物。所使用的筛是具有不同直径的Retsch筛。第一筛具有直径为2.5mm的孔，其能够捕获含有谷蛋白的污染物如小麦谷粒，其他较大的污染物例如枝条，第二筛具有直径为1.4mm的孔以捕获油菜籽种并允许例如灰尘通过。将筛过的油菜籽首先在水中洗涤，然后在乙醇中洗涤以除去任何灰尘，然后干燥。
样品3和4包含在制备样品1和2时从油菜籽种中分离出的含有谷蛋白的污染物。
使用来自IKA的咖啡磨(研磨机)研磨样品1至4。
检测样品的麦醇溶蛋白含量，结果示于下表1中。麦醇溶蛋白和麦谷蛋白(glutenin)以等量存在于谷蛋白中，但只有麦醇溶蛋白能够容易地测定。因此，为了确定谷蛋白含量，将麦醇溶蛋白含量加倍。
表1
样品 麦醇溶蛋白ppm(mg/Kg) SD RSD％ 谷蛋白ppm(mg/Kg)
1 <5 n/a n/a <10
2 <5 n/a n/a <10
3 274 173.9 63.5 548
4 561 149.3 26.6 1122
从上表1可以看出：商业油菜籽含有麦醇溶蛋白，因此可以通过有效筛分去除谷蛋白。谷蛋白来自收获和/或运输和储存过程中的交叉污染。SD和RSD是指标准偏差和相对标准偏差。
实施例2：油菜籽蛋白质分离物
该实施例显示了油菜籽蛋白质分离物之间的谷蛋白水平差异，所述油菜籽蛋白质分离物是使用下述方法从经筛分和未经筛分的油菜籽种获得的。
天然油菜籽蛋白质分离物是由冷压的(非己烷提取的)油菜籽种生产的，产生了具有基于干物质低于15％的油含量的油菜籽油籽饼，然后清洗并在低于75℃下加工。
在40-75℃之间的温度下，将油菜籽油籽饼与盐水溶液(1-5％NaCl)混合。饼与水的比值在1:5至1:20的范围内。约30分钟至1小时后，将富含蛋白质的溶液(提取物)与不溶物质分离。进一步处理提取物以澄清材料并去除非蛋白质物质。通过液/液分离步骤除去残余脂肪和形成的沉淀物。然后浓缩提取物并在超滤/渗滤(UF/DF)步骤中洗涤。最后，将经洗涤的浓缩物在入口温度为150-200℃且出口温度为50-100℃的喷雾干燥器中干燥，从而产生了天然油菜籽蛋白质分离物。
样品1至3是不同批次的来源于油籽饼的天然油菜籽蛋白质分离物，所述油籽饼是从尚未分离出含有谷蛋白的污染物的油菜籽种获得的。
样品4至6是不同批次的来源于油籽饼的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，所述油籽饼是从已如实施例1中所述通过筛分分离出含有谷蛋白的污染物的油菜籽种获得的。
检测样品的麦醇溶蛋白含量，结果示于下表2中。
表2
样品 麦醇溶蛋白ppm(mg/Kg) SD RSD％ 谷蛋白ppm(mg/Kg)
1 12.3 0.9 7.5 24.6
2 42.0 2.5 6.0 84.0
3 26.6 2.3 8.5 53.3
4 4.41 0.48 10.9 8.81
5 4.74 0.52 10.9 9.48
6 2.0 0.45 22.6 4.0
从上表2可以看出：来源于已经分离出含有谷蛋白的污染物的油菜籽种的油菜籽蛋白质分离物中的谷蛋白水平低得多。
实施例3：对比性油菜籽蛋白质分离物
表3显示了不同的油菜籽油籽饼之间的谷蛋白水平差异，其中使用实施例2中所述的方法制备油菜籽蛋白质分离物样品。
样品1：由可得自Teutoburger的油菜籽油籽饼制备的油菜籽蛋白质分离物，所述油菜籽油籽饼是从脱皮的油菜籽种获得的。
样品2：由可得自Gecko的油菜籽油籽饼制备的油菜籽蛋白质分离物，所述油菜籽油籽饼是从未脱皮的油菜籽种获得的。
样品3：由可得自Rickermann的油菜籽油籽饼制备的油菜籽蛋白质分离物，所述油菜籽油籽饼是从未脱皮的油菜籽种获得的，所述未脱皮的油菜籽种在粉碎之前被筛分，如实施例2样品4中所述。
表3
样品 麦醇溶蛋白ppm(mg/Kg) SD RSD％ 谷蛋白ppm(mg/Kg)
1 41.0 4 9.7 82.0
2 24.5 5.25 22.25 49.0
3 4.41 0.48 10.9 8.81
从上表3可以看出：来源于已经分离出含有谷蛋白的污染物的油菜籽种的油菜籽蛋白质分离物中的麦醇溶蛋白水平低得多，因此谷蛋白水平低得多。此外，可以看出：脱皮不会固有地降低谷蛋白水平。
实施例4：对比性油菜籽蛋白质分离物
表4显示了两种不同的油菜籽蛋白质分离物样品之间的谷蛋白水平差异。每个样品检测两次(A和B)。
样品1：Advantexx 80(可得自Bioexx)#BIOCENA120248。
样品2：Isolexx(可得自Teutexx/Bioexx)#BIOEXX120120214。
Teutexx数据：蛋白质>90％，在pH 7时溶解度小于60％；
植酸<1.25％，酚化合物<0.7％。
表4
从上面的实施例可以看出：这些油菜籽蛋白质分离物具有较高的麦醇溶蛋白水平，因此并非不含谷蛋白。
实施例5：
使用如实施例2中所述的方法制备油菜籽蛋白质分离物样品，并如下表5所示测量溶解度。所得的油菜籽蛋白质分离物在23+/-2℃的温度下在4至10的pH范围内具有至少88％的溶解度。
表5
实施例6：
使用如实施例2中所述的方法制备油菜籽蛋白质分离物，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中在2.5至11.5的pH范围内的电导率小于4000μS/cm。
实施例7：
使用如实施例2中所述的方法制备油菜籽蛋白质分离物样品并测定C/N比值，发现C/N比值分别为1.0、1.3和0.9。蓝色非变性PAGE：观察到大致约300kDa的主要条带，在242kDa MW标记和480kDa MW标记之间。一些染色可见曳尾(smear)，因为分子量较低(150kDa及以下)。在150kDa处没有观察到清晰的条带。基于这些结果，油菜籽蛋白质分离物样品含有12S形式的十字花科植物素。
天然油菜籽蛋白质分离物包含40-65重量％十字花科植物素和35-60重量％芸苔籽蛋白。
实施例8：
使用如实施例2中所述的方法制备油菜籽蛋白质分离物，其含有少于0.26重量％的植酸盐，并具有以干物质计0.04重量％的酚化合物含量，酚化合物含量被表示为芥子酸当量。

Claims (20)

1.一种不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含<10ppm麦醇溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含<5ppm麦醇溶蛋白。
3.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，基于干重，其蛋白质含量为至少90重量％(按照凯氏N x 6.25计算)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其具有在0.9至1.3的范围内的十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值。
5.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含至少5％(以干物质计)的12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE来核实12S的存在。
6.根据权利要求5所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含以干物质计至少15％的12S油菜籽蛋白质。
7.根据权利要求5所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含以干物质计少于20％的7S油菜籽蛋白质。
8.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其在2重量％水溶液中在2至12的pH范围内的电导率小于9000μS/cm。
9.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，当在23+/-2℃的温度下在4至10的pH范围内测量时，其溶解度为至少88％。
10.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其具有低于0.4重量％的植酸盐水平。
11.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，其具有以干物质计小于0.1重量％的酚化合物含量，酚化合物含量被表示为芥子酸当量。
12.根据前述权利要求中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物，当在23+/-2℃的温度下在4至10的pH范围内测量时，其溶解度为至少88％；其在2重量％水溶液中在2至12的pH范围内的电导率小于9000μS/cm；并且其具有在0.9至1.3的范围内的十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值。
13.一种制备根据权利要求1-12中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法至少包括以下步骤：
i)将油菜籽种与含有谷蛋白的污染物分离；
ii)冷压经分离的油菜籽种以提取油菜籽油，从而产生油籽饼；
iii)用水溶液提取所述油籽饼以获得包含油菜籽蛋白质的水溶液；
iv)从经提取的油籽饼分离出包含油菜籽蛋白质的水溶液；
v)浓缩所述包含油菜籽蛋白质的水溶液；
vi)从浓缩的水溶液中获得不含谷蛋白的油菜籽蛋白质分离物，其包含<10ppm麦醇溶蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中使用具有在2mm至2.8mm范围内的孔的圆孔筛分离含有谷蛋白的污染物。
15.根据权利要求13所述的制备不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，其包括以下附加步骤：
洗涤包含油菜籽蛋白质的浓缩溶液v)；
干燥浓缩物以获得油菜籽蛋白质分离物。
16.根据权利要求13所述的制备不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物的方法，其包括以下附加步骤：
向所述浓缩的水溶液中加入水溶性溶剂以获得蛋白质沉淀物；和
将所述蛋白质沉淀物与液体级分分离以获得所述油菜籽蛋白质分离物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述水溶性溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮或其混合物。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物作为食品发泡剂的用途。
19.根据权利要求1-12中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物作为食品乳化剂的用途。
20.一种食品，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的不含谷蛋白的天然油菜籽蛋白质分离物。
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