CN108179169B - 一种微生物转化法制备达木林a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物转化法制备达木林A的方法，包括孢子和种子制备、微生物转化、转化产物收集和分离纯化。本发明发现，转化原料为绞股蓝皂苷LI时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林A；转化原料为绞股蓝皂苷L时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林B。绞股蓝皂苷LI、绞股蓝皂苷L的C20位羟基的构型决定了短刺小克银汉霉AS3.153菌株的脱水选择性，短刺小克银汉霉AS3.153菌株对该位置的脱水具有选择性，可以选择性制备达木林A或达木林B，原料利用率高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微生物转化法制备达木林A的方法。
背景技术
绞股蓝中含有的皂苷成分众多，研究较多、活性较好的有绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A(DamulinA)和达木林B(DamulinB)。
达木林A和达木林B在绞股蓝生品中的含量极低，为稀有皂苷。绞股蓝经过加热炮制后，达木林A和达木林B的含量会显著升高，这是因为高温导致绞股蓝皂苷LVI、XLVI脱糖基得到绞股蓝皂苷L、LI，再进一步发生C20(21)、C20(22)脱水得到达木林A和达木林B。绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI向达木林A和达木林B的转化途径如下所示。
从化学式可知，达木林A和达木林B为双键位置异构体。因为加热脱水缺乏选择性，所以通过加热脱水的方式会同时得到达木林A和达木林B，二者含量比约为1:1。
微生物转化是替代天然产物结构修饰的一种方法。它具有很高的区域选择性、立体选择性和基团选择性，可以完成一些化学方法难以进行的反应，选择性制备特定结构的化合物。
发明内容
本发明目的在于提供一种微生物转化法制备达木林A的方法。
上述目的通过如下技术方案实现：
一种微生物转化法制备达木林A的方法，包括通过如下步骤：
步骤S1，孢子和种子制备：将短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基上，置于28℃恒温培养7d，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物；取适量孢子接入种子瓶，于28℃振荡培养24h，得到种子培养物；
步骤S2，微生物转化：以5％的接种量将种子培养物转至转化瓶，28℃振荡预培养24h后加入绞股蓝皂苷LI无菌水溶液，使绞股蓝皂苷LI终浓度为0.2g/L，28℃振荡培养96h；
步骤S3，转化产物收集：取转化培养物上清液，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩得到转化产物粗品；
步骤S4，将转化产物粗品上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样；依次用体积比为40:1:2、20:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱8BV、10BV；收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱9-10BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林A。
优选地，斜面培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，成分为：蔗糖1.5g，琼脂2.0g，马铃薯20g和蒸馏水100ml。
优选地，种子瓶和转化瓶培养基成分为：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水100ml，pH调至8.3。
优选地，培养基均于115℃灭菌30min后使用。
优选地，步骤S1中，短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基之前于4℃保存。
优选地，步骤S1中，用无菌接种环取一环富含孢子的菌丝体，仅将孢子接入种子瓶中。
本发明技术优势：
本发明发现，转化原料为绞股蓝皂苷LI时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林A；转化原料为绞股蓝皂苷L时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林B。绞股蓝皂苷LI、绞股蓝皂苷L的C20位羟基的构型决定了短刺小克银汉霉AS3.153菌株的脱水选择性，短刺小克银汉霉AS3.153菌株对该位置的脱水具有选择性，可以选择性制备达木林A或达木林B，原料利用率高。
附图说明
图1为实施例1转化产物粗品的HPLC分析结果，上图为对照品溶液色谱图(达木林A、B单体勾兑制备，浓度均为0.1mg/mL)，下图为供试品溶液色谱图(转化产物粗品0.5mg溶于适量甲醇制备而成)；图2为实施例2转化产物粗品的HPLC分析结果，上图为对照品溶液色谱图(达木林A、B单体勾兑制备，浓度均为0.1mg/mL)，下图为供试品溶液色谱图(转化产物粗品0.5mg溶于适量甲醇制备而成)。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于这些具体实施例。
实施例1：绞股蓝皂苷LI制备达木林A
一种微生物转化法制备达木林A的方法，包括如下步骤：
步骤S1，孢子和种子制备：将4℃保存的短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基上，置于28℃恒温培养7d，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物；用无菌接种环取一环富含孢子的菌丝体，仅将孢子接入种子瓶(250mL三角瓶内装50mL培养基)，于28℃振荡培养24h，得到种子培养物；
步骤S2，微生物转化：以5％的接种量将种子培养物转至转化瓶(100mL三角瓶内装20mL培养基)，28℃振荡预培养24h后加入绞股蓝皂苷LI无菌水溶液，使绞股蓝皂苷LI终浓度为0.2g/L，28℃振荡培养96h；
步骤S3，转化产物收集：取转化培养物上清液，用乙酸乙酯等体积萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至干得到转化产物粗品；
步骤S4，将转化产物粗品上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样(转化产物粗品用甲醇溶解后与拌样硅胶混合均匀、干燥，转化产物粗品与拌样硅胶的质量比1:1)；依次用体积比为40:1:2、20:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱8BV、10BV；收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱9-10BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林A；
其中，斜面培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，成分为：蔗糖1.5g，琼脂2.0g，马铃薯20g和蒸馏水100ml；种子瓶和转化瓶培养基成分为：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水100ml，pH调至8.3。115℃灭菌30min后使用。
经换算，1摩尔绞股蓝皂苷LI可以转化、分离纯化得到0.92摩尔达木林A，转化率在90％以上，达木林A纯度为98.2％。
实施例2：绞股蓝皂苷L制备达木林B
一种微生物转化法制备达木林B的方法，包括如下步骤：
步骤S1，孢子和种子制备：将4℃保存的短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基上，置于28℃恒温培养7d，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物；用无菌接种环取一环富含孢子的菌丝体，仅将孢子接入种子瓶(250mL三角瓶内装50mL培养基)，于28℃振荡培养24h，得到种子培养物；
步骤S2，微生物转化：以5％的接种量将种子培养物转至转化瓶(100mL三角瓶内装20mL培养基)，28℃振荡预培养24h后加入绞股蓝皂苷L无菌水溶液，使绞股蓝皂苷L终浓度为0.2g/L，28℃振荡培养96h；
步骤S3，转化产物收集：取转化培养物上清液，用乙酸乙酯等体积萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至干得到转化产物粗品；
步骤S4，将转化产物粗品上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样(转化产物粗品用甲醇溶解后与拌样硅胶混合均匀、干燥，转化产物粗品与拌样硅胶的质量比1:1)；依次用体积比为40:1:2、20:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱8BV、8BV；收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱7-8BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林B；
其中，斜面培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，成分为：蔗糖1.5g，琼脂2.0g，马铃薯20g和蒸馏水100ml；种子瓶和转化瓶培养基成分为：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水100ml，pH调至8.3。115℃灭菌30min后使用。
经换算，1摩尔绞股蓝皂苷L可以转化、分离纯化得到0.91摩尔达木林B，转化率在90％以上，达木林B纯度为98.5％。
实施例3：高效液相色谱法比较实施例1、2转化产物粗品中达木林A、B含量差异
高效液相色谱分析条件：
色谱仪：LC-20ADXR高压泵；SPD-M20A二极管阵列紫外可见光检测器；CTO-20AC柱温箱；CBM-20A系统控制器；SIL-20ACXR自动进样器；
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A相：水(含万分之五四氢呋喃)；
流动相B相：乙腈(含万分之五四氢呋喃)；
洗脱程序：0-3min，20％B相；3-15min，20％→40％B相；15-30min，40％→80％B相；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：203nm；
进样量：10μL。
图1为实施例1转化产物粗品的HPLC分析结果，上图为对照品溶液色谱图(达木林A、B单体勾兑制备，浓度均为0.1mg/mL)，下图为供试品溶液色谱图(转化产物粗品0.5mg溶于适量甲醇制备而成)。图2为实施例2转化产物粗品的HPLC分析结果，上图为对照品溶液色谱图(达木林A、B单体勾兑制备，浓度均为0.1mg/mL)，下图为供试品溶液色谱图(转化产物粗品0.5mg溶于适量甲醇制备而成)。
从图1、图2可以看出，转化原料为绞股蓝皂苷LI时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林A；转化原料为绞股蓝皂苷L时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林B。绞股蓝皂苷LI、绞股蓝皂苷L的C20位羟基的构型决定了短刺小克银汉霉AS3.153菌株的脱水选择性，短刺小克银汉霉AS3.153菌株对该位置的脱水具有选择性，可以选择性制备达木林A或达木林B，原料利用率高。
Claims (6)
1.一种微生物转化法制备达木林A的方法，其特征在于，包括通过如下步骤：
步骤S1，孢子和种子制备：将短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基上，置于28℃恒温培养7d，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物；取适量孢子接入种子瓶，于28℃振荡培养24h，得到种子培养物；
步骤S2，微生物转化：以5%的接种量将种子培养物转至转化瓶，28℃振荡预培养24h后加入绞股蓝皂苷LI无菌水溶液，使绞股蓝皂苷LI终浓度为0.2g/L，28℃振荡培养96h；
步骤S3，转化产物收集：取转化培养物上清液，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩得到转化产物粗品；
步骤S4，将转化产物粗品上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样；依次用体积比为40:1:2、20:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱8BV、10BV；收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱9-10BV的洗脱液，浓缩干燥得到达木林A。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：斜面培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，成分为：蔗糖1.5g，琼脂2.0g，马铃薯20g和蒸馏水100ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：种子瓶和转化瓶培养基成分为：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水100ml，pH调至8.3。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：培养基均于115℃灭菌30min后使用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基之前于4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，用无菌接种环取一环富含孢子的菌丝体，仅将孢子接入种子瓶中。
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