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CN108137819B - 制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法 - Google Patents

制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法 Download PDF

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Abstract

本公开的主题提供了连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的方法，该方法包括：使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到该封闭室中；以及使第一流和第二流在该封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。还公开了由本公开的方法生产的组合物以及用于生产该组合物的装置。

Description

制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月6日提交的美国临时申请第62/346,001号、2016年2月29日提交的美国临时申请第62/301,149号和2015年8月13日提交的美国临时申请第62/204,739号的权益，每一个申请的内容通过引用以其整体并入本文。
联邦政府资助的研究或开发
本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)(NIH)授予的R21EB013274和R02E018358在政府支持下进行。政府在本发明中具有一定权利。
背景
开发用于疾病的检测和治疗的基因治疗的前景对于许多临床应用，包括癌症、免疫缺陷和代谢紊乱，仍然很高(Ginn等人，2013；Peer等人，2007)。基于病毒的递送系统包括迄今为止用于基因治疗临床试验的大多数基因载体(gene carrier)；然而，安全问题激发了对设计替代的递送系统的需求(Ginn等人，2013；Yin等人，2014)。已经开发了非病毒性基因递送方法来克服与病毒有关的主要限制，例如关于致命的全身性免疫应答、插入诱变、有限的DNA载体尺寸(limited DNA vector size)以及与大规模生产病毒相关的问题的可能性(Yin等人，2014；Baum等人，2004)。
聚合物纳米颗粒是最广泛使用的非病毒性载体，因为它们保护DNA免于降解并且改善了感兴趣的基因的细胞内递送和转染率(Bertrand等人，2005；Mura等人，2005；Bonnet等人，2008)。聚电解质络合物(PEC)由于其捕获治疗剂的能力已经被用于药物递送。
在被开发用于基因治疗应用的所有聚合物中，线性聚乙烯亚胺(lPEI)经常被使用，因为它在体外和体内都展示出高的基因递送效率。此外，与其支化的PEI对应物相比，lPEI具有更好的安全性特性(Bonnet等人，2008；Jere等人，2001；Patnaik等人，2001)。其还主要通过组织特异性施用途径，在若干临床试验中被测试(例如，NCT01274455和NCT00595088)(Buscail等人，2015)。虽然已经有越来越多的努力以通过分子工程和纳米颗粒优化来改善lPEI作为DNA递送载体的物理化学性质和生物性能，但是临床应用的进展已受到缺乏用于组装这些络合物纳米材料的可再现的和可缩放的方法的阻碍。
以涡旋或移液(pipetting)的形式的批量混合(bulk mixing)在实验室环境中被广泛使用；但是由于它们的差的微量混合环境，它们常常由于不可控的聚集体而导致在制备批次内或在批次之间的高度的可变性(Mangraviti等人，2013；Mangraviti等人，2015；Mastorakos等人，2009；Mastorakos等人，2015；Valencia等人，2012；Yang等人，2013；Murday等人，2009)。例如，最近的研究报告了，通过常规批量方法的纳米颗粒制剂的批次体积显著地影响PEI/siRNA纳米颗粒尺寸，其中较大的制剂溶液体积导致较大和较宽的颗粒尺寸范围(Lim等人，2014)。因此，开发通过其能够可再现地调整DNA纳米颗粒性质而不损害生物性能的生产方法是最重要的。
已经报告了具有不同设计的微流体装置，目的是对颗粒尺寸及其分布提供更好的控制。例如，通过微流体装置制备的lPEI/siRNA纳米颗粒显示出与通过批量混合制备的那些相比在体外显著地更高的基因敲低效率(Lim等人，2014)。此外，当微流体混合的批量大小变化时，纳米颗粒性质不变。另一项研究使用微流体辅助的封闭空间(confinement)来制备聚阳离子/DNA纳米络合物(Ho等人，2011)。与批量制备相比，微流体制备导致纳米颗粒尺寸分布的减少，导致产生高度浓缩的(condensed)、紧凑的和稳定的纳米结构，导致细胞毒性的降低以及体外转染率的提高。然而，微流体系统可能具有一些局限性，例如需要配制用于纳米颗粒制剂的络合物材料以及由于微流体通道的小尺寸造成的有限的生产能力(<7.2g每天)(Kolishetti等人，2010；Romanowsky等人，2012)。
瞬时纳米沉淀法(flash nanoprecipitation)(FNP)提供了连续的并且可缩放的工艺，该工艺已经被用于生产嵌段共聚物纳米颗粒。此工艺使用快速微量混合条件(大约1毫秒)来建立均相的过饱和条件以及使用嵌段共聚物自组装的疏水性溶质(有机或无机的)的受控的沉淀(Johnson等人，8月J.Chem.，2003；Johnson等人，Phys.Rev.Lett.，2003；Johnson等人，AicheJ.，2003；Shen等人，2011)。与批量制备方法相比，此工艺允许在连续流动操作过程中形成具有可调尺寸的均匀的聚集体，这适合于扩大规模生产。这个工艺还提供了对于颗粒尺寸及分布的更高程度的通用性和控制、更高的药物包封效率、以及改善的胶体稳定性(Shen等人，2011；D'Addio等人，2013；D'Addio等人，2011；D'Addio等人，2012；Gindy等人，2008；Lewis等人，2015；Luo等人，2014；Santos等人，2014)。
然而，与嵌段共聚物纳米颗粒相比，聚电解质络合物的组装是由“络合反应(complexation reaction)”驱动的，这与两亲性共聚物通过FNP方法在水介质中的组装大不相同。似乎这样的PEC纳米颗粒不太可能可预见地用FNP方法组装。因此，本领域仍然期望找到用于制备PEC纳米颗粒的方法，该方法导致与使用FNP的嵌段共聚物纳米颗粒的性质相当的性质。
概述
除非另有说明，否则本发明的实施通常将使用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术。这些技术中的某些的非限制性描述见于以下出版物：Ausubel,F.等人,(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols inImmunology,Current Protocols in Protein Science和Current Protocols in CellBiology,全部是John Wiley&Sons,N.Y.,截至2008年12月的版本；Sambrook,Russell,和Sambrook,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies—ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique”,第5版,John Wiley&Sons,Hoboken,N.J.,2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息见于Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGrawHill,2005,Katzung,B.(编辑)Basic and Clinical Pharmacology,McGraw-Hill/Appleton&Lange第10版(2006)或第11版(July 2009)。关于基因和遗传性疾患的非限制性信息见于McKusick，V.A.：Mendelian Inheritance in Man.A Catalog of Human Genesand Genetic Disorders。Baltimore:Johns Hopkins University Press,1998(第12版)或更近期的在线数据库:Online Mendelian Inheritance in Man,OMIMTM。McKusick-NathansInstitute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,Md.)和National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,Md.),截至2010年5月1日,互联网URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/，以及在位于http://omia.angis.org.au/contact.shtml的、为一种动物物种(不同于人类和小鼠)中的基因、遗传疾病和性状的数据库的Online Mendelian Inheritance inAnimals(OMIA)中。
在一些方面中，本公开的主题提供了一种连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的瞬时纳米络合(flash nanocomplexation)(FNC)方法，该方法包括：(a)使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室(confined chamber)中；(b)使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到封闭室中；以及(c)使第一流和第二流在封闭室中撞击(impinge)，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
在一些方面中，本公开的主题提供了由瞬时纳米络合(FNC)方法生成的均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒制剂，该方法包括：使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到封闭室中；以及使第一流和第二流在封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
在一些实施方案中，第一流和第二流在进入封闭室时是在相对侧上，并且其中第二流的流量与第一流的流量的比率是从约1至约10。在一些实施方案中，第一流和/或第二流还包含一种或更多种水溶性治疗剂。
在一些实施方案中，该方法还包括使第三流流入到封闭室中，其中当进入封闭室时，每个流与其他两个流是等距的。在一些实施方案中，第三流包含一种或更多种水溶性治疗剂、一种或更多种可混溶的有机溶剂、和/或一种或更多种冷冻保护剂。
在一些实施方案中，所生成的PEC纳米颗粒包封至少一种或更多种水溶性治疗剂。在一些实施方案中，一种或更多种水溶性治疗剂选自由以下组成的组：小分子、碳水化合物、糖、蛋白质、肽、核酸、抗体或其抗体片段、激素、激素受体、受体配体、细胞因子和生长因子。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：壳聚糖、PAMAM树状聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)、聚(β-氨基酯)、阳离子肽及其衍生物。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物选自由以下组成的组：聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、带负电荷的嵌段共聚物、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、透明质酸、藻酸盐(alginate)、三聚磷酸盐(tripolyphosphate)(TPP)、寡聚(谷氨酸)、细胞因子、蛋白质、肽、生长因子和核酸。
在一些实施方案中，核酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、指导RNA、质粒DNA、载体DNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA和siRNA。
在一些实施方案中，第一可变流量、第二可变流量和第三可变流量，如果存在的话，是大于约5毫升/分钟。在一些实施方案中，雷诺数在从约2,000至约8,000的范围内。在一些实施方案中，雷诺数在从约3,000至约5,000的范围内。在一些实施方案中，第一流的pH值和第二流的pH值在从约2.5至约8.4的范围内。在一些实施方案中，第一流的pH值和第二流的pH值在从约3.5至约7.4的范围内。
在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约20nm至约500nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约25nm至约100nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约25nm至约60nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径是约30nm至约45nm。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径是约30nm。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的多分散指数在从约0.05至约0.1的范围内。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物是质粒DNA，并且一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由线性聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物组成的组。
在一些实施方案中，第二流包含一种或更多种水溶性治疗剂，并且聚电解质络合过程将一种或更多种水溶性治疗剂包封在所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒中。
在一些实施方案中，第一流包含壳聚糖，并且第二流包含三聚磷酸盐(TPP)和蛋白质，其中蛋白质被TPP和壳聚糖共包封(co-encapsulate)在所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒中。
在一些方面中，本公开的主题提供了一种用于连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的装置，该装置包括：(a)壳体，该壳体包括：(i)封闭室；(ii)第一入口，该第一入口被配置成允许包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流流入到封闭室中；(iii)第二入口，第二入口被配置成允许包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流流入到封闭室中；和(iv)任选的第三入口，第三入口被配置成允许第三流流入到封闭室中；(b)第一导管，第一导管提供第一流路(first stream path)，第一流路被配置成允许第一流通过第一入口以第一可变流量流入到封闭室中，其中第一导管具有第一可变直径；(c)第二导管，第二导管提供第二流路，第二流路被配置成允许第二流通过第二入口以第二可变流量流入到封闭室中，其中第二导管具有第二可变直径；以及(d)任选的第三导管，第三导管提供第三流路，第三流路被配置成允许第三流通过第三入口以第三可变流量流入到封闭室中，其中第三导管具有第三可变直径；其中第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，是以允许所述流在封闭室中撞击直到雷诺数为从约1,000至约20,000的方式相对于彼此等距地定位在壳体的外表面上，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
在一些实施方案中，封闭室是直径在从约1.25mm至约7.5mm的范围内并且高度在从约2.5mm至约15mm的范围内的圆柱体。在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，从壳体的外部延伸到入口中并且延伸到封闭室。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分(section)，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率在从约1.5至约3.0的范围内。在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率在从约1.8至约2.5的范围内。在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径为d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率是约2.0。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中第一部分和第二部分在壳体内部并且在封闭室的外部。
在一些实施方案中，第三导管是存在的。在一些实施方案中，被撞击的流包含含有所生成的PEC纳米颗粒的混合溶液，并且壳体还包括至少一个出口，该至少一个出口被配置成在封闭室中发生流的撞击之后从装置中移除含有所生成的PEC纳米颗粒的混合溶液。
上文已陈述了本公开的主题的某些方面，其全部或部分由本公开的主题所呈现，当与下面作为本文最佳描述的所附实施例和附图一起使用时，其他方面随着描述进行将变得明显。
附图简述
已经以一般术语如此描述了本公开的主题，现将参考附图，附图不必按比例绘制，且其中：
图1A、图1B、图1C、图1D和图1E描绘了本公开的封闭的撞击射流(confinedimpinging jet)(CIJ)装置的代表性实施方案的图(图1A、图1B和图1C)和照片(图1D和图1E)。图1A描绘了用于在快速混合条件下制造聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的CIJ装置的实施方案。流独立地装载有线性聚乙烯亚胺(lPEI)和质粒DNA，并且lPEI-DNA络合物纳米颗粒在小的封闭室中形成，然后被收集；图1B描绘了示出具有以120°角分开的3个射流的CIJ装置的示意图。射流1可以装载有带正电荷的聚合物，该带正电荷的聚合物包括壳聚糖、PAMAM树状聚合物、PEI、硫酸鱼精蛋白、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)和带正电荷的嵌段共聚物。射流2装有带负电荷的大分子，该带负电荷的大分子包括聚(天冬氨酸)、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、透明质酸、三聚磷酸盐、寡聚(谷氨酸类)、细胞因子、蛋白质、肽、生长因子、DNA、siRNA、mRNA。射流3可以覆盖(cap)有或装载有水混溶性有机溶剂，以便在原位控制最终制剂的极性；图1C描绘了在实施例中使用的CIJ装置的工程图；并且图1D(侧视图)和图1E(顶视图)是实际的CIJ装置的照片(红色入口允许每个流流入到装置中，白色端口用于使每个流路穿孔至封闭室，并且通常当装置在使用时穿孔被阻塞)。
图2A、图2B、图2C、图2D、图2E和图2F描绘了流量对颗粒尺寸和分布的影响。lPEI-DNA络合物纳米颗粒以不同的流量来制备并且通过TEM来分析。DNA浓度是25μg/mL，N/P＝8(N/P是胺:磷酸盐)，并且lPEI溶液的pH是3.5。以5mL/min(图2A)、10mL/min(图2B)、20mL/min(图2C)、30mL/min(图2D)、40mL/min(图2E)和50mL/min(图2F)制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的TEM图像。比例尺是500nm；
图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F描绘了通过图3A中的批量混合以及在图3B、图3C、图3D、图3E和图3F中的动态和受控的混合下制备的1PEI 22kDa:DNA纳米颗粒的TEM图像。流量对lPEI:DNA纳米颗粒的影响：图3B，1mL/min，比例尺(sb)200nm；图3C，10mL/min，sb200nm；图3D，20mL/min；图3E，35mL/min，sb 200nm；以及图3F，50mL/min，sb 500nm；
图4A和图4B描绘了流量对lPEI-DNA纳米颗粒的数量平均尺寸分布(numberaverage size distribution)的影响(图4A)以及对于以40mL/min的流量制备的lPEI-DNA纳米颗粒的批次间的变化性(图4B)。以100μg/mL的初始DNA浓度、N/P＝8来制备lPEI-DNA纳米颗粒，且lPEI溶液的pH为3.5；
图5A和图5B描绘了数量平均尺寸分布以及流量对尺寸分布的影响。图5A描绘了在批量和动态混合条件下制备的lPEI 22kDa:DNA纳米颗粒的数量平均尺寸分布；并且图5B描绘了流量对1PEI 22kDa:DNA纳米颗粒的尺寸分布的影响；
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F描绘了在CIJ中在快速混合条件下(图6A、图6B和图6C)以及使用不同的DNA浓度批量混合(图6D、图6E和图6F)制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的TEM图像。对于快速混合条件，使用20mL/min的流量。lPEI溶液的pH被调节至3.5并且使用为8的N/P比率。用于络合的DNA浓度是25μg/mL(图6A、图6D)、50μg/mL(图6B、图6E)和100μg/mL。比例尺是500nm；
图7A、图7B、图7C和图7D描绘了使用具有不同pH的PEI溶液在CIJ中在快速混合条件下制备的具有各种形状的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的TEM图像。使用20mL/min的流量、25μg/mL的DNA浓度和N/P＝8。图7A，lPEI溶液的pH是5.5；图7B，lPEI溶液的pH是4.5；图7C，lPEI溶液的pH是3.5；以及图7D，lPEI溶液的pH是2.5。比例尺是500nm；
图8A、图8B和图8C描绘了在CIJ-3i中在快速混合条件下并且使用具有不同pH的PEI溶液制备的具有各种形状的lPEI 22kDa:DNA纳米颗粒的TEM图像。使用37mL/min的流量。图8A，PEI溶液的pH是2.5；图8B，PEI溶液的pH是3.2；图8C，PEI溶液的pH是5.2；
图9A和图9B描绘了在快速混合和批量混合条件下生成的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的物理化学表征。图9A示出了使用圆柱体照明相关光谱术(Cylindrical IlluminationCorrelation Spectroscopy)的关于在快速混合和批量混合条件下制备的颗粒的DNA含量的分布。对于快速混合和批量混合，发现每个颗粒的DNA的平均数目分别为4.2和4.7。图9B示出在快速混合和批量混合以及具有若干pH值的聚合物溶液的条件下制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的ζ-电位。DNA浓度是25μg/mL并且N/P比率是8；
图10描绘了以各种流量流过CIJ混合器的裸质粒DNA(bare plasmid DNA)的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1代表标准DNA，并且泳道2至泳道7分别对应于以5mL/min、10mL/min、20mL/min、30mL/min、40mL/min和50mL/min的流量流过CIJ的DNA；
图11描绘了以2.5mL/min(凝胶泳道编号2和3)和35mL/min(凝胶泳道编号4和5)的裸DNA(凝胶泳道编号2和4)和使用CIJ-3i装置制备的lPEI22kDa:DNA纳米颗粒(凝胶泳道编号3和5)制剂的琼脂糖凝胶电泳。泳道1代表标准DNA；
图12A和图12B描绘了(图12A)jetPEI DNA和(图12B)Lipofectamine纳米颗粒在海拉细胞(HeLa cell)中的体外转染率。DNA以若干种流量流过CIJ并与jetPEI或Lipofectamine进一步络合(批量混合)，并且与未暴露于流(flow)的DNA相比较。每个条代表平均值±标准差(n＝3)；
图13描绘了在处理在CIJ-3i中通过批量混合(批量100μg/ml DNA)以及在快速和均匀混合条件下制备的lPEI22kDa:DNA纳米颗粒之后48小时海拉细胞的体外转染。50、100和200是用于络合的DNA的以μg/mL计的浓度(*指示具有p值<0.05的统计学显著性，studentt-检验)；
图14A和图14B描绘了lPEI-DNA络合物纳米颗粒在海拉细胞的体外转染率。图14A示出以10％血清和无血清的条件、在快速混合和批量混合的条件下生成的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的DNA剂量依赖的转染率。图14B示出在快速混合和批量混合条件下生成的以及采用在不同pH值的lPEI聚合物溶液制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的转染率。DNA浓度是25μg/mL并且N/P比率是8。流量是20mL/min。每个条代表平均值±标准差(n＝4)；
图15描绘了流量对壳聚糖纳米颗粒的平均尺寸和多分散性的影响。将壳聚糖溶解于0.5％v/v乙酸中，并且在纳米颗粒配制之前使用氢氧化钠的浓溶液将最终的pH调节至5.0；
图16A、图16B和图16C描绘了在动态条件下制备的壳聚糖:TPP纳米颗粒的数量平均颗粒尺寸(图16A)、pH对壳聚糖:TPP纳米颗粒的颗粒尺寸和ζ电位(图16B)以及多分散性(PDI，图16C)的影响；
图17A、图17B和图17C描绘了在快速混合条件下使用CIJ-3i装置和不同pH值的壳聚糖溶液制备的具有不同尺寸的壳聚糖:TPP纳米颗粒的TEM图像。图17A，pH壳聚糖＝3.5；图17B，pH壳聚糖＝5.0；以及图17C，pH壳聚糖＝6.5；
图18A、图18B、图18C、图18D和图18E描绘了壳聚糖:TPP纳米颗粒在相关生物培养基中的稳定性。图18A示出了在PBS 10mM中5天内的稳定性，插图示出在PBS中的数量平均颗粒尺寸；并且图18B示出在PBS 2％v/v中3小时内的稳定性。还示出了壳聚糖:TPP纳米颗粒在水中(图18C)、在PBS中3天后(图18D)和在PBS中5天后(图18E)的TEM图像；
图19A、图19B、图19C和图19D描绘了使用CIJ-3i装置的若干聚电解质纳米颗粒的制剂。图19A示出了壳聚糖:Glu5纳米颗粒，图19B示出了壳聚糖-g-PEG750:Glu5，图19C示出了硫酸鱼精蛋白:硫酸肝素，以及图19D示出了壳聚糖:聚(天冬氨酸钠盐)；
图20A、图20B、图20C、图20D和图20E描绘了使用动态条件的牛血清白蛋白(BSA)在壳聚糖:TPP纳米颗粒中的包封。图20A示出了在不同pH值制备的空的或包封BSA的纳米颗粒的数量平均尺寸分布；蓝线：pH 3.5，红线：pH 5.0，并且绿线：pH 6.0。图20B示出了空的或包封BSA的纳米颗粒的数量平均颗粒尺寸，图20C示出了空的或包封BSA的纳米颗粒的ζ电位，图20D示出了空的纳米颗粒的TEM图像，以及图20E示出了包封BSA的纳米颗粒的TEM图像。BSA以0.25mg/mL的初始浓度被包封。壳聚糖和TPP浓度分别为0.5mg/mL和0.25mg/mL；并且
图21描绘了来自在37℃在PBS中的壳聚糖:TPP纳米颗粒的BSA的体外累积释放曲线。纳米颗粒使用罗丹明标记的BSA(初始浓度0.1mg/mL)以20mL/min的流量来制备。壳聚糖(pH 5.0)和TPP的浓度分别为0.5mg/mL和0.25mg/mL。
本专利或申请文件包含以彩色展示的至少一幅图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本经请求并支付必要的费用后将由专利局提供。
详细描述
现在将参考附图在下文中更全面地描述本公开的主题，在附图中示出了本公开的主题的某些但非全部的实施方案。相同的数字自始至终指的是相同的元件。本公开的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应该被解释为限于本文列出的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，受益于前面的描述和相关的附图中呈现的教导，本文提出的本公开的主题的许多修改形式和其他实施方案将被本公开的主题所属领域中的技术人员所想到。因此，应该理解，本公开的主题不限于所公开的具体实施方案并且修改形式和其他实施方案意图被包括在所附权利要求书的范围内。
本公开的主题提供了能够以连续的且可缩放的方式生产聚电解质络合物纳米颗粒的新方法，即瞬时纳米络合(FNC)。FNC由于聚电解质络合而生成纳米颗粒，而不依赖于溶剂诱导的共聚物的过饱和。据信，本文公开的是用于制备聚电解质络合物纳米颗粒的FNC的第一个实例。还提供的是由FNC生产的组合物和用于制备该组合物的装置。
通过FNC生产的聚电解质络合物纳米颗粒具有比使用常规方法制备的聚电解质络合物更小的尺寸、更好的均匀性和更低的多分散性。例如，与批量制备方法相比，FNC工艺允许在连续流动操作过程中形成具有可调尺寸的均匀的聚集体，这适合于放大生产。FNC还提供了对颗粒尺寸和分布的更高程度通用性和控制、更高的药物包封效率和改善的胶体稳定性(Shen等人，2011；D’Addio等人，2013；D’Addio等人，2012；Gindy等人，2008；Lewis等人，2015；D’Addio等人，2011；Luo等人，2014；Santos等人，2014)。
此外，本公开的方法通过改进的聚合物链缠结导致浓缩的且致密的聚电解质纳米颗粒。另外，这些方法提供了将诸如蛋白质或核酸的治疗剂有效地包封在聚电解质纳米颗粒中同时保持其固有的物理化学性质的手段。此外，用这些新颖的方法制备的含有DNA的纳米颗粒的制剂具有改善的颗粒尺寸和形状分布，并且在与批量制备方法相比时，展示出更高的细胞转染率。
I.制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法
在一些实施方案中，本公开的主题提供了一种连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的瞬时纳米络合(FNC)方法，该方法包括：(a)使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；(b)使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到封闭室中；以及(c)使第一流和第二流在封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
在一些实施方案中，本公开的主题涉及形成聚电解质络合物纳米颗粒的方法。如本文使用的“聚电解质络合物”(也称为聚电解质凝聚体(polyelectrolyte coacervate)或“PEC”)是在带相反电荷的颗粒之间形成的缔合络合物(例如，聚合物-聚合物、聚合物-药物和聚合物-药物-聚合物)。聚电解质络合物是由于在带相反电荷的聚离子(即水溶性聚阳离子和水溶性聚阴离子)之间的静电相互作用而形成的。如本文使用的，术语“连续地”是指在时间上不间断的过程，例如在至少两个本公开的流正在流入到封闭室中时生成PEC纳米颗粒。如本文使用的，术语“水溶性的”是指化合物能够溶解在水中的能力。
在一些实施方案中，水溶性聚离子被溶解在合适的溶剂中，导致沿着大分子链分布的基本电荷。在各种实施方案中，聚电解质络合物在允许具有相反电荷的大分子相互作用时形成。例如，在一些实施方案中，聚电解质络合物的瞬时沉淀的纳米颗粒通过快速且均匀地使流(即溶解在流中的水溶性聚阳离子和溶解在流中的水溶性聚阴离子)混合而形成。
在一些实施方案中，所述流是包含一种或更多种流体组分的组合物并且能够在溶液或悬浮液中携带一种或更多种固体。典型地，这些流是极性的，例如乙酸或水。更典型地，所述流是水。
使流在封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使水溶性聚阳离子聚合物和水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。如本文使用的，术语“撞击”是指至少两个流以高流量在封闭室中彼此相撞。使用本公开的方法和装置，已经令人惊讶地示出，在这样的高剪切条件下，诸如DNA分子的分子保持完整。
例如，可以通过多种方法来实现第一流和第二流的快速且均匀的混合以生成聚电解质络合物纳米颗粒，在这些方法中流量以及混合效率和速度是受控的。在一些实施方案中，聚电解质络合物纳米颗粒可以通过瞬时纳米络合，使用向心混合器(centripetalmixer)或分批式快速混合器(batch flash mixer)来制备。参见，例如Johnson等人，美国专利申请公布第2004/0091546号，其通过引用以其整体并入本文。
作为另一个实例，可以使用具有至少两个高速射流的封闭的撞击射流(CIJ)装置(图1A、图1B、图1C、图1D和图1E)来完成第一流和第二流的混合。在典型的实施方案中，带相反电荷的流被装载到单独的注射器中，并且通过数字控制的注射泵(例如New Era PumpSystem，型号NE-4000)被进料至CIJ装置的封闭室中。在一些实施方案中，使用充当出口的长管流道(long tube runner)以确保被带入到封闭室中的相对的流在收集之前完全反应。在一些实施方案中，当进入封闭室时，第一流和第二流在相对侧上。如本文使用的，术语“相对侧”意指这些流大体上彼此相对。在一些实施方案中，这些流彼此正好相对(directlyopposite)。在一些实施方案中，这些流可以不是彼此正好相对。
本公开内容的方法还包括提供一个或更多个另外的流。例如，在一些实施方案中，所述方法可以包括提供第三流，第三流包含另外的添加剂例如如下文所述的治疗剂、盐溶液、用以原位控制最终制剂的极性的水混溶性有机溶剂(例如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇)，或用以在重构时改善纳米颗粒的胶体稳定性的冷冻保护剂(例如，甘油、海藻糖、蔗糖、右旋糖)，。在一些实施方案中，可以将第三、第四或甚至更多数目的射流添加到CIJ装置以容纳具有诸如本文所述的那些的添加剂的另外的流。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括使第三流流入到封闭室中，其中当进入封闭室时，每个流与其他两个流是等距的。在一些实施方案中，保持流彼此等距允许发生流的均匀混合。
在一些实施方案中，第一流的pH值和第二流的pH值在从约2.5至约8.4的范围内。在一些实施方案中，第一流的pH值和第二流的pH值在从约3.5至约7.4的范围内。
例如，可以通过可编程的注射泵容易地调整在上述CIJ装置的注射器中包含的流可撞击到封闭室中的流量。此外，在一些实施方案中，特征混合时间随着流量而变化，并且可以通过改变流量来调节。例如，在高流量，流动模式可以呈现湍流样的特性，并且混合时间可以是大约几毫秒。在这些条件下，实现了有效的质量传递，并且可以制备具有窄的尺寸分布的离散且均匀的纳米颗粒。在各种实施方案中，最终的平均颗粒尺寸随着聚电解质的混合时间、浓度和化学组成而变化。
影响混合速度的流的混合效率和流的性质通常由雷诺数(Re)定义，雷诺数是表示惯性流与粘性力的比率的无量纲的数。对于CIJ装置，通过累加多个流的贡献来计算总Re数(collective Re numbers)：
Figure GDA0001821687160000161
其中ρi是在第i个入口流中的溶液的密度(kg/m3)；Qi是第i个入口流的流量(m3/s)；μi是第i个入口流的流体粘度(Pa s)；di是第i个入口喷嘴的直径(m)并且n是流的数目。
在一些实施方案中，在反应物的混合期间得到的雷诺数是约1,000至约20,000，例如约1,600至约10,000、约2,000至约10,000、约2,000至约8,000、约1,900至约5,000，以及约3,000至约5,000。
在一些实施方案中，流的可变流量在从约1毫升(mL)/分钟至约50mL/分钟的范围内，例如在约5mL/分钟至约40mL/分钟之间，以及在约20mL/分钟至约30mL/分钟之间。在一些实施方案中，流的可变流量大于约5mL/分钟。在一些实施方案中，第二流的流量与第一流的流量的比率是从约0.1至约10。
在一些实施方案中，添加剂被包含在流中。例如，可将治疗剂添加至含有水溶性聚阳离子的第一流和/或含有水溶性聚阴离子的第二流。在一些实施方案中，第一流和/或第二流还包含一种或更多种水溶性治疗剂。在一些实施方案中，所生成的PEC纳米颗粒包封至少一种或更多种水溶性治疗剂。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性治疗剂选自由以下组成的组：小分子，例如小的有机或无机分子；糖类；寡糖类；多糖类；选自由肽、蛋白质、肽类似物和衍生物组成的组的生物大分子；肽模拟物；核酸，例如DNA、选自由siRNA、shRNA、反义RNA、miRNA和核酶组成的组的RNA干扰分子(interference molecule)、树状聚合物和适体；抗体，其包括抗体片段和胞内抗体；由选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织组成的组的生物材料制成的提取物；天然存在的或合成的组合物；及其任何组合。在一些实施方案中，一种或更多种水溶性治疗剂选自由以下组成的组：小分子、碳水化合物、糖、蛋白质、肽、核酸、抗体或其抗体片段、激素、激素受体、受体配体、细胞因子和生长因子。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：壳聚糖、PAMAM树状聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)、聚(β-氨基酯)、阳离子肽及其衍生物。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物选自由以下组成的组：聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、带负电荷的嵌段共聚物(聚(乙二醇)-b-聚(丙烯酸)、聚(乙二醇)-b-聚(天冬氨酸)、聚(乙二醇)-b-聚(谷氨酸))、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、透明质酸、藻酸盐、三聚磷酸盐(TPP)、聚(谷氨酸)、细胞因子(例如趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子)、蛋白质、肽、生长因子和核酸。
如本文使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸的聚合物。如本文使用的，“肽”是指氨基酸单体的短链，例如约50个或更少的氨基酸。
如本文使用的，“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的物质，例如蛋白质或激素。生长因子的非限制性实例包括血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素相关的生长因子-I(IGF-I)、胰岛素相关的生长因子-II(IGF-II)、成纤维细胞生长因子(FGF)、β-2-微球蛋白(BDGF II)和骨形态发生因子(bonemorphogenetic factor)。
如本文使用的，“核酸”或“多核苷酸”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其以单链形式或以双链螺旋的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)和硫代酸酯。双链的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，且特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级结构和二级结构，并且不将其限制于任何特定的三级形式。因此，该术语包括尤其在线性或环状DNA分子(例如限制片段)、质粒和染色体中发现的双链DNA。
在一些实施方案中，核酸是RNA干扰剂。如本文使用的，“RNA干扰剂”被定义为干扰或抑制靶基因的表达(例如通过RNA干扰(RNAi))的任何剂。这样的RNA干扰剂包括但不限于反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列例如但不限于指导RNA、小的干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、短干扰寡核苷酸、反义寡核苷酸、适体、CRISPR RNA、包括与靶基因同源的RNA分子的核酸分子、或其片段、以及通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因的表达的任何分子。
在一些实施方案中，核酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、指导RNA、质粒DNA、载体DNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA和siRNA。在一些实施方案中，核酸不是siRNA。如本文使用的，术语“质粒DNA”是指通常为环状且能够独立复制的小DNA分子。
在一些实施方案中，一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物是质粒DNA，并且一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：线性聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物，例如但不限于聚(乙二醇)-b-PEI和聚(乙二醇)-g-PEI。
在一些实施方案中，第二流包含一种或更多种水溶性治疗剂，并且聚电解质络合过程将一种或更多种水溶性治疗剂包封在所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒中。
在一些实施方案中，聚电解质络合物纳米颗粒包含聚阳离子和聚阴离子，例如壳聚糖/TPP、鱼精蛋白/硫酸肝素、PEI/DNA、壳聚糖-g-PEG17/Glu5、壳聚糖/聚天冬氨酸钠盐和硫酸鱼精蛋白/肝素。在一些实施方案中，第一流包含壳聚糖，并且第二流包含三聚磷酸盐(TPP)和蛋白质，其中蛋白质被TPP和壳聚糖共包封在所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒中。
聚阳离子和聚阴离子的浓度将取决于所使用的具体大分子以及所得聚电解质络合物纳米颗粒的期望的形状和均匀性。在以下实施例中描述了特定的实施方案。
在一些实施方案中，增加水溶性聚阳离子和/或水溶性聚阴离子的浓度和/或增加流的pH可以影响形状、颗粒尺寸和/或颗粒尺寸均匀性。例如，当包含DNA的流的浓度增加，而诸如PEI的水溶性聚阳离子的浓度保持恒定时，在一些实施方案中，在瞬时纳米络合期间形成的所得纳米颗粒的形状通常可以是更棒状的，而不是球形。此外，增加水溶性聚阳离子流和/或水溶性聚阴离子流的pH还可以导致更棒状形状的纳米颗粒。相反地，在一些实施方案中，通常可以通过增加水溶性聚阳离子流和/或水溶性聚阴离子流的浓度和/或pH来获得球形形状的纳米颗粒。
如本文所述，在一些实施方案中，所述流将包含添加剂如治疗剂，例如水溶性治疗剂。例如，可以将水溶性治疗剂例如蛋白质添加到含有水溶性聚阴离子例如TPP的流中。例如，可以将含有蛋白质的水溶性聚阴离子流和含有壳聚糖的水溶性聚阳离子流独立地装载到CIJ装置的注射器中以获得由壳聚糖和TPP共包封的含蛋白质的纳米颗粒。
在一些实施方案中，水溶性治疗剂如核酸(例如siRNA)可以与例如纳米颗粒中的水溶性聚阳离子如PEI络合。因此，本公开内容的水溶性聚阴离子可以被用于形成本文所述的即刻产生的聚电解质络合物纳米颗粒以及用于充当治疗剂。
II.聚电解质络合物纳米颗粒
在一些实施方案中，本公开的主题提供了由瞬时纳米络合(FNC)方法生成的均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒制剂，该方法包括：使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到封闭室中；以及使第一流和第二流在封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
本公开的均匀的聚电解质络合物纳米颗粒具有如上文所述和下文实施例中所述的颗粒尺寸、颗粒尺寸分布以及聚阴离子组分和聚阳离子组分。在一些实施方案中，本公开内容的均匀的聚电解质络合物纳米颗粒包封一种或更多种如本文所述的添加剂，例如水溶性治疗剂。
在一些实施方案中，根据本方法形成的聚电解质络合物纳米颗粒的颗粒尺寸是均匀的，即存在窄的颗粒尺寸分布。例如，在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有小于约500nm、小于约100nm、小于约60nm或小于约40nm(均一直径)的平均颗粒尺寸。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从约20nm至约500nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从约25nm至约100nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从约30nm至约80nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从约25nm至约60nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从约30nm至约45nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径是约30nm。
在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的多分散指数(PDI)可以在从约0.05至约0.2的范围内，更典型地约0.05至0.1，甚至更典型地约0.05。通常，PDI越低，纳米颗粒群体中颗粒尺寸的分布越低。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的多分散指数在从约0.05至约0.1的范围内。在一些实施方案中，所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的多分散指数是约0.05。
III.用于制备聚电解质络合物纳米颗粒的装置
本公开的主题还提供了一种用于连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的装置，该装置包括：(a)壳体，该壳体包括：(i)封闭室；(ii)第一入口，第一入口被配置成允许包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流流入到封闭室中；(iii)第二入口，第二入口被配置成允许包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流流入到封闭室中；和(iv)任选的第三入口，第三入口被配置成允许第三流流入到封闭室中；(b)第一导管，第一导管提供第一流路，第一流路被配置成允许第一流通过第一入口以第一可变流量流入到封闭室中，其中第一导管具有第一可变直径；(c)第二导管，第二导管提供第二流路，第二流路被配置成允许第二流通过第二入口以第二可变流量流入到封闭室中，其中第二导管具有第二可变直径；以及(d)任选的第三导管，第三导管提供第三流路，第三流路被配置成允许第三流通过第三入口以第三可变流量流入到封闭室中，其中第三导管具有第三可变直径；其中第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，是以允许所述流在封闭室中撞击直到雷诺数为从约1,000至约20,000的方式相对于彼此等距地定位在壳体的外表面上，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。
在一些实施方案中，壳体可以由多种材料制成，例如高密度聚乙烯、聚甲醛、聚四氟乙烯和/或不锈钢，只要该材料允许形成封闭室和用于将导管插入壳体内的路径。在一些实施方案中，壳体可以是各种形状，例如包括但不限于球体、长方体(rectangularcuboid)、棱锥体、立方体和圆柱体。在一些实施方案中，壳体呈圆柱体的形状。
在一些实施方案中，导管从壳体的外部延伸到入口中并且延伸到封闭室。在一些实施方案中，导管被永久地固定到对应的入口。在一些实施方案中，导管以可移除的方式连接到入口。在一些实施方案中，导管的长度根据壳体和封闭室的尺寸而变化。在一些实施方案中，导管包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)或不锈钢。
生成PEC纳米颗粒的流的撞击发生在封闭室中。在一些实施方案中，封闭室是允许流彼此等距地进入到封闭室中的任何形状。在一些实施方案中，封闭室是圆柱体。在一些实施方案中，封闭室的直径范围从约0.5毫米(mm)至约10mm。在一些实施方案中，封闭室是直径范围从约1.0mm至约7.5mm的圆柱体。在一些实施方案中，封闭室是直径范围从约1.25mm至约7.5mm的圆柱体。在一些实施方案中，封闭室是直径范围从约1.25mm至约5.0mm的圆柱体。在一些实施方案中，封闭室是高度范围从约2.5mm至约15mm的圆柱体。
在一些实施方案中，撞击的流包含含有所生成的PEC纳米颗粒的混合溶液，并且壳体还包括至少一个出口，所述至少一个出口被配置成在封闭室中发生流的撞击之后从装置中移除含有所生成的PEC纳米颗粒的混合溶液。
在一些实施方案中，通过独立的入口管将两个流引入到装置中用于实验室规模生产，该独立的入口管具有约0.2mm至约6mm的内径，典型地直径约0.25mm至约3.0mm。该装置可以包括温度控制元件以调节入口管中和封闭室中的流体的温度。可以通过PTFE管道系统(PTFE tubing)将PEC纳米颗粒收集在闪烁管中，所述PTFE管道系统例如(ID＝约0.75mm)具有足以确保组分在封闭室中完全混合的长度，例如12.7cm。
本公开的装置的代表性实施方案在图1B、图1C、图1D和图1E中示出。如图1C中所见，在一些实施方案中，直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，例如从约0.3mm至约1.0mm，以及从约0.4mm至约0.8mm。如图1C中所见，在一些实施方案中，直径d3等于直径d1的约0.5倍，直径d2等于约两倍的直径d1，并且直径D(输出通道)等于约五倍的直径d1。在一些实施方案中，D＝2.5mm，d1＝0.5mm，d2＝1.0mm，d3＝0.25mm，H＝0.9D，Z＝1.3D，并且Q＝6.35mm。在一些实施方案中，直径Q可以变化，并且其他直径不依赖于直径Q。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率在从约1.5至约3.0的范围内。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率在从约1.8至约2.5的范围内。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，其中直径d1在从约0.25mm至约1.5mm的范围内，并且直径d2与直径d1的比率是约2.0。
在一些实施方案中，第一导管、第二导管和第三导管如果存在的话，各自具有第一部分，第一部分具有直径d2、与第二部分流体连通，第二部分具有直径d1、与封闭室流体连通，并且其中，第一部分和第二部分在壳体内部并且在封闭室的外部。
在一些实施方案中，在装置中存在第三导管。在一些实施方案中，在装置中存在第三导管并且第三导管的流路被阻断。
尽管本文中采用了特定术语，但它们仅用于一般的和描述性的意义，而非用于限制的目的。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
根据长期以来的专利法惯例，在该申请包括权利要求书中当使用术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”时，指“一个或更多个”。因此，例如，提及“一个对象(a subject)”包括多个对象，除非上下文清楚地是意思相反的(例如，多个对象)等等。
贯穿该说明书和权利要求书，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”被用于非排他性含义，除了上下文另有要求的情况。同样地，术语“包括(include)”和其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的列举不排除可被取代或添加至所列项目的其他类似的项目。
为了此说明书以及所附的权利要求书的目的，除非另有说明，否则在所有的实例中，在说明书和权利要求书中使用的所有表示量、尺寸、维度、比例、形状、制剂、参数(parameter)、百分比、系数(parameter)、数量、特征、及其它数值的数字应理解为由术语“约”修饰，即使术语“约”可能未明确地与该值、量或范围一起出现。因此，除非相反地指示，在以下说明书和所附的权利要求书中列出的数值参数不是精确的且不需要是精确的，但是如所期望的可以是接近的和/或更大或更小，反映了公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，取决于旨在通过本公开的主题获得的期望特性。例如，当术语“约”指值时能够用意在于包括与特定的量在一些实施方案中±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、以及在一些实施方案中±0.1％的差异，因为此类差异对于进行所公开的方法或采用所公开的组合物是适当的。
此外，当与一个或更多个数值或数值范围关联使用时，术语“约”应理解为指所有此类数值，包括范围内的所有数值以及通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值修改该范围。通过端点引述的数值范围包括归入该范围内的所有数值例如全部的整数，包括其分数(例如，1至5的引述包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在该范围内的任何范围。
实施例
以下实施例已被包括以向本领域普通技术人员提供用于实践本公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例意图仅是示例性的，且可采用许多变化、修改和改变而不偏离本公开的主题的范围。下文的实施例通过说明的方式而不是通过限制的方式被提供。
实施例1
PEI/DNA聚电解质络合物纳米颗粒
材料和方法
材料：lPEI(线性聚乙烯亚胺，分子量22kDa的)是来自Polymer ChemistryInnovations,Inc.(Tucson,AZ)的惠赠，并且使用Amicon离心过滤器来分级。编码由巨细胞病毒启动子驱动的萤火虫萤光素酶的基因的质粒DNAVR1255C(6.4kb)由Vical(San Diego，CA)友情提供。质粒DNA在DH5α大肠杆菌中扩增，并且使用EndoFree Giga试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化，并以1mg/mL溶解在无内毒素的TE缓冲液中。除非另有说明，否则所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich。
纳米颗粒制剂：在配备有两个流的CIJ混合器中制备lPEI-DNA络合物纳米颗粒。CIJ装置中的FNC工艺在图1A中图示。室的尺寸与先前在Johnson和Liu的工作中使用的尺寸相同，并且在图1C中表示(Johnson等人，2003；Han等人，2012，它们通过引用以其整体并入本文)。应当注意，本文使用的混合器被设计成允许来自两个相对的射流的不相等的流动动量(flow momentum)(Han等人，2012；Zhu等人，2014)，其通过引用以其整体并入本文。典型地，混合器入口通过具有1.55mm的内径(ID)的PTFE管道系统连接到气密的塑料注射器(5mL、10mL、20mL和50mL)。通过PTFE管道系统(ID＝0.75mm)将络合物纳米颗粒收集在闪烁管中，PTFE管道系统的长度(12.7cm)足以确保组分在室中的完全混合。注射器中包含的聚合物和核酸的溶液被撞击到封闭室中的流量通过可编程的注射泵(New Era Pump System，型号NE-4000)容易地调整。流的混合效率和性质通常由如上所述的雷诺数(Re)定义。
对于典型的纳米颗粒制剂，将DNA在2mL的DI水中稀释以得到25μg/mL DNA至200μg/mL DNA的最终浓度。将lPEI的溶液在DI水中稀释至2mL以得到8的最终的N/P比率(在lPEI中的胺与在DNA中的磷酸酯的比率)。将两种溶液装载在单独的注射器中，并且将两个流在混合室内部以变化的流量(1mL/min高至50mL/min)进行撞击。络合物纳米颗粒被收集并且立即通过DLS、电荷、TEM来表征，并且使用癌细胞系对转染率进行评估。
透射电子显微术：纳米颗粒的TEM成像通过将10μL的lPEI-g-PEG/DNA纳米颗粒溶液温育到覆盖有碳膜的离子化镍网(nickel grid)上来完成。10min之后，除去溶液，并向网中添加6μL的2％乙酸双氧铀的液滴。20s之后，除去染色溶液，并且将网在室温干燥。样品用Technai FEI-12电子显微镜成像。使用Image J 1.44从TEM图像表征纳米颗粒尺寸。
尺寸和ζ电位测量：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Southborough，MA)分别通过光子相关光谱法(photon correlation spectroscopy)和激光多普勒测速法(laser Doppler anemometry)来测量颗粒尺寸和ζ电位。尺寸测量在25℃以90°散射角进行。平均流体动力学直径(hydrodynamic diameter)通过累积分析(cumulative analysis)来确定。在自动模式下使用DTS1070-折叠的毛细管样品池(DTS1070-folded capillary cell)进行ζ电位测量。
DNA纳米颗粒中的DNA含量分布：我们使用先前描述的系统(Beh等人，2014)分析了颗粒，该文献通过引用以其整体并入本文。质粒DNA使用Mirus Bio Label
Figure GDA0001821687160000261
TrackerTM胞内核酸定位试剂盒，Cy5(Mirus Bio LLC.Madison，WI)来标记，并且用于采用批量方法和FNC方法合成具有lPEI的颗粒。使用圆柱体照明相关光谱学将这些颗粒单独地测量它们在670nm处的荧光强度，并且与游离的标记的DNA(free labeled DNA)进行比较。使用裸露的标记的DNA(naked labeled DNA)作为对照来对峰强度去卷积，以便获得具有不同DNA含量的颗粒的分布。
lPEI-g-PEG/DNA络合物纳米颗粒的体外转染：将海拉细胞保持在补充有10％PBS和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium)(DMEM)中，并且将细胞在37℃和5％CO2条件下培养。在转染实验前24h时，将细胞以2×104个细胞/孔的密度接种在48孔板中。将相当于0.5μg的DNA剂量的各种纳米颗粒溶液添加到细胞中并温育持续4h，之后更新培养基。48h之后，除去培养基，并且用1×PBS(pH 7.4)洗涤细胞。将100μL的报告基因裂解缓冲液(reporter lysis buffer)(Promega，Madison，WI)添加到每个孔中。然后使细胞经受两次冻融循环。使用萤光素酶测定试剂盒(Promega，Madison，WI)在光度计(20/20n，Turner BioSystems，Sunnyvale，CA)上测定来自每个孔的20μL的细胞裂解物。将萤光素酶活性转化为萤光素酶的量，该萤光素酶的量是使用重组荧光素酶蛋白质(Promega)作为标准物并且使用BCA测定(Pierce，Rockford，IL)针对裂解物中的总蛋白质含量进行标准化来表达的。
结果
具有高度可再现性的大规模的高度均匀的lPEI/DNA络合物纳米颗粒、的配制对于将这些纳米颗粒从实验室应用(bench application)到临床应用成功转变是关键步骤。在本工作中，我们首次说明了使用FNC工艺来生成包含阳离子聚合物lPEI和阴离子生物聚合物DNA的PEC纳米颗粒。该工艺利用具有两个或更多个撞击流体流的封闭的沉淀几何结构(precipitation geometry)来实现快速混合条件，这产生具有明确定义的尺寸和窄分布的纳米颗粒(Johnson等人，Aiche J，2003；D'Addio等人，2011)，其通过引用以其整体并入本文。在本研究中，我们使用封闭的撞击射流(CIJ)装置，该装置允许通过连续流以较小规模和较大规模的生产来高通量筛选合成纳米颗粒。图1A示意性地示出了本文使用的工艺，并且图1B、图1C、图1D和图1E示出了该装置的代表性实施方案。使用数字可编程的泵将分别装载在注射器中的lPEI溶液和DNA的溶液以可变的流量撞击到封闭室中。诸如流量的工艺变量可以影响所制造的纳米颗粒的物理化学性质(尺寸、形状和PDI)。为了评估流量对lPEI/DNA络合物纳米颗粒的制备的作用，保持DNA和PEI的浓度恒定，以不同流量(l mL/min，雷诺数Re＝95mL直至75mL，Re＝7,200)运行实验。lPEI/DNA纳米颗粒的透射电子显微术(TEM)图像(图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F)表明流量对颗粒尺寸和分布的显著的影响。对于低于20mL/min的流量(Re<1,900，图2A和图2B)，纳米颗粒较大并且更加不均匀。另一方面，对于流量>20mL/min(Re>1,900)，生成较小并且均匀的lPEI/DNA纳米颗粒(平均30-40nm)。特征混合时间随着流量而变化。在低流量时，混合时间(τ混合)不足够短以提供均匀的微量混合环境，并且因此形成纳米颗粒的较大且更不均匀的群体。当流量足够高时，流动模式采取湍流样的特性，并且混合时间是大约几毫秒(<10ms)。在这些条件下，获得了有效的质量传递，并且制备了离散且窄尺寸的lPEI/DNA纳米颗粒。对以各种流量制得的1PEI/DNA纳米颗粒的DLS分析还表明，纳米颗粒的平均尺寸是依赖于流量的，在流量大于20mL/min时达到平台(图4A)，表明达到快速混合的极限。这些结果与先前对于通过FNP方法制备的两亲聚合物纳米颗粒所观察到的结果一致，其中，对于Re数高于1600，纳米颗粒尺寸变成与流量无关(Shen等人，2011；Santos等人，2014；Johnson等人，Phys.Rev.Lett.，2003；Johnson等人，Aiche J.，2003)，其通过引用以其整体并入本文。最终的平均颗粒尺寸随着混合时间、组分的浓度和化学组成以及每种组分的成核和聚集的具体时间而变化(Santos等人，2014；Johnson等人，Phys.Rev.Lett.，2003；Johnson等人，Aiche J.，2003)，其通过引用以其整体并入本文。为了进一步说明在CIJ装置中的lPEI/DNA纳米颗粒形成工艺的鲁棒性(robustness)和可再现性，由不同的操作者在不同的时间制备若干批次的纳米颗粒。DLS数据(图4B)示出没有显著的批次间变化性。另外，由于CIJ可以以连续模式操作，所以纳米颗粒的物理化学性质与批量大小无关，并且确保制备足够的纳米材料用于临床研究(>0.1kg每天)以及确保工业规模生产(>1kg每天)(Kamaly等人，2012)，该文献通过引用以其整体并入本文。
在已经建立了人们能够在CIJ装置中制备具有高度可再现性的lPEI/DNA纳米颗粒的条件的情况下，我们研究了对于FNC工艺和批量沉淀对应工艺两者，DNA浓度如何可以影响颗粒尺寸和尺寸分布。在保持lPEI浓度恒定的情况下，以25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的DNA浓度制备lPEI/DNA纳米颗粒。在图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F中示出的颗粒的代表性TEM图像表明，不管所使用的DNA的初始量如何，相比于批量混合对应工艺(图6D、图6E和图6F)，通过FNC在CIJ装置中以20mL/min的流量制备的lPEI/DNA纳米颗粒(图6A、图6B和图6C)是较小的并且呈现优良的尺寸分布。发生了通过FNC形成较小的且均匀的络合物纳米颗粒，这是因为在CIJ装置中的混合方案比在批量混合中的受更精确地控制。另外，通过FNC工艺提供的强烈混合导致比聚集的特征时间短得多(大约几毫秒)的混合时间。相反，批量混合中的混合性质被非常差地限定，这导致更不均匀的颗粒尺寸分布。有趣的是，当在FNC制备中DNA的浓度从25μg/mL增加至100μg/mL时(图6A、图6B和图6C)，纳米颗粒经历了从纯球形到短棒状纳米颗粒的形态转变。除了提供对于颗粒尺寸和分布的更好的控制之外，FNC还可用于通过微调工艺中使用的条件来制备具有不同形状的颗粒。由于FNC以连续模式操作，具有不同形状的纳米颗粒可以可再现地制备，而与批量大小无关。
配制参数和CIJ工艺变量在确定所制备的纳米颗粒的物理化学性质(包括颗粒尺寸和均匀性)中发挥作用。我们试图研究在CIJ装置中通过FNC经由调整例如lPEI溶液的pH值来制备具有不同形状的lPEI/DNA纳米颗粒的可能性。纳米颗粒形状与尺寸一起被认为是纳米颗粒的生理学命运(physiological fate)中最有影响力的变量之一。为了在CIJ装置中制备具有不同形状的颗粒，在与DNA在CIJ中撞击之前调整lPEI溶液的初始pH值。随着lPEI溶液的pH值从2.5提高到4.5，lPEI/DNA络合物纳米颗粒经历显著的形状转变，从在pH2.5时的非常均匀且小的球形颗粒(30-40nm)到在pH 4.5时的棒状形态(图7B、图7C和图7D)。将lPEI溶液的pH进一步提高至5.5(图7A)显著地降低溶液中存在的球样的颗粒的量(从在pH 4.5时的25％至在pH 5.5时的12％)。这与lPEI净电荷的效果及其有效浓缩DNA的能力相一致。在低pH值(pH<3.5)，lPEI是完全质子化的并且可以更有效地将DNA浓缩成球形纳米颗粒，而在高pH值(pH>4)，lPEI的正净电荷显著地降低，使得聚合物链骨架更硬，这可能转化为独特的纳米颗粒形成途径。
通过FNC和批量混合两者制备的一系列纳米颗粒被评估其在纳米颗粒分布内的DNA含量。DNA/纳米颗粒的量与尺寸和形状一起，在基因转染中起重要作用。为了分析通过FNC制备的DNA纳米颗粒的组成分布，我们使用了最近在我们的实验室中开发的单颗粒分析方法(Beh等人，2014)，该文献通过引用以其整体并入本文。本文使用的方法，圆柱体照明共焦光谱术(cylindrical illumination confocal spectroscopy)(CICS)，提供了高的检测一致性和质量检测效率。lPEI-DNA络合物纳米颗粒使用Cy5标记的质粒DNA来制备，并且然后通过微流体芯片以允许使用CICS对该纳米颗粒在670nm处的荧光强度的单颗粒测量。使用游离的DNA作为对照来使峰强度去卷积，以便获得具有不同DNA含量的颗粒的分布。lPEI-DNA络合物纳米颗粒使用25μg/mL DNA和对于lPEI溶液3.5的pH值、以20mL/min的流量来制备。在这些条件下，通过FNC方法获得高度均匀的球体。CICS分析示出，对于通过FNC制备的络合物颗粒，每个纳米颗粒的DNA分子的平均数目稍低，其为4.2个DNA分子相对关于批量混合的4.8个DNA分子(图9A)。虽然每个颗粒的DNA分子的平均数目是相似的，但是DNA/颗粒的分布示出显著的差异。对于通过FNC制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒，大多数的颗粒含有4个DNA分子，而通过批量混合制备的那些主要含有平均5个的DNA分子。这个结果与通过DLS确定的观察到的纳米颗粒平均尺寸和通过TEM确定的均匀性是一致的。通过FNC制备的络合物颗粒比通过批量混合制备的颗粒更小且更均匀。
然后，我们测量了通过FNC使用在不同pH值的lPEI溶液制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒的表面电荷。无论1PEI溶液的pH如何，通过FNC制备的纳米颗粒在水中具有+30mV的平均正表面电荷(图12B)。对于通过批量混合制备的络合物颗粒观察到类似的值，这反映了1PEI聚合物的高的正电荷密度。然而，在生理培养基中温育之后，所有颗粒的表面电荷下降至+20mV，这是由于lPEI聚合物的去质子化和在缓冲溶液中的络合物纳米颗粒的电荷屏蔽效应。
已知剪切引起质粒DNA严重断裂成较小分子量的片段。FNP工艺中的剪切速率对于Re数8000可获得～9300s-1的值(Luo等人，2014)，该文献通过引用以其整体并入本文，并且可能对生物大分子例如DNA和大的蛋白质是有害的。为了评估在CIJ装置中在颗粒形成期间可能的DNA的断裂，在不存在lPEI的情况下，以从1mL/min高至50mL/min变化的流量对裸DNA进行撞击。样品通过凝胶电泳进一步分析，并且与标准转染试剂(jetPEI和Lipofectamine2000)络合以测试转染效力。如在图10和图11中所示，暴露于不同流量的所有DNA样品呈现与对照DNA样品(没有流动)相似的带和强度，这表明DNA结构不被流量损害。为了测试暴露于高流量的裸DNA是否仍然保持其生物活性，我们将DNA与包括体内-jetPEI和Lipofectamine 2000的标准转染试剂络合，并且在海拉细胞中使用荧光素酶报告基因质粒DNA在体外测试其转染率。所有暴露于流的DNA样品示出与未暴露于流的DNA样品相当的转染率的水平(图12A、图12B和图13)，这表明DNA是完整的并且完全生物活性的。
对通过FNC制备的lPEI/DNA络合物纳米颗粒评估其在海拉细胞中的转染率。转染实验是在10％PBS和无血清培养基的存在下以DNA剂量依赖的方式进行的。如图14A和图14B中所示，转染率随着DNA剂量从0.1μg/孔增加至0.5μg/孔而增加。另外，无血清培养基中的颗粒的转染率显著地高于含血清培养基中的，特别是在较低的DNA剂量(0.1μgDNA/孔或0.2μg DNA/孔)。然而，通过由FNC制备的lPEI-DNA络合物纳米颗粒获得的转染水平并不显著地高于通过经由批量混合制备的络合物纳米颗粒获得的转染水平。考虑到lPEI是高效的转染剂，我们认为，由FNC提供的在颗粒尺寸和均匀性方面的显著改进被这种转染剂的效果所掩盖。
我们还评估了通过FNC制备的具有不同形状的纳米颗粒的转染效力。通过FNC方法制备的纳米颗粒展示出与通过以200μL规模的分批模式混合方法制备的纳米颗粒相当水平的转染率。在通过这两种方法合成的纳米颗粒之间未观察到在物理化学性质和转染率方面的显著差异。
总结
我们已成功地开发了用于连续制备具有均匀的且小的尺寸的lPEI/DNA纳米颗粒的有效FNC工艺。该方法包括带负电荷的DNA质粒和带正电荷的lPEI在高度动态的且均匀的混合条件下的复合凝聚。用此工艺制备的lPEI/DNA纳米颗粒的品质依赖于若干实验参数，包括溶液的流量、lPEI溶液的pH、N/P比率以及lPEI和DNA溶液的浓度。对于用此FNC方法制备的DNA纳米颗粒不存在明显的批次间变化性。更重要地，DNA样品在经受流动条件之后保持完整以及完全生物活性的。FNC制备的纳米颗粒产生与用小规模分批模式混合制备的纳米颗粒相同的转染率。此FNC工艺可以被应用于制备具有其他聚阳离子载体的含有DNA和RNA的纳米颗粒。这些结果证实FNC适合于在临床应用和工业规模生产中制备聚电解质凝聚体(PEC)纳米颗粒。
实施例2
壳聚糖/TPP聚电解质络合物纳米颗粒
材料和方法
可控尺寸的壳聚糖:TPP纳米颗粒制剂的制备：
在快速微量混合条件下使用在我们的实验室中设计并制造的具有三个高速射流的封闭的撞击射流装置来制备离散的聚电解质纳米颗粒。在典型的程序中，带相反电荷的生物大分子溶液被装载到单独的注射器中，并且通过数字控制的注射泵(New Era PumpSystem，型号NE-4000)被进料至封闭室中。使用充当出口的长管流道(由箭头表示)以确保所有通过相对的流被带入到封闭室中的生物大分子在收集之前完全反应。加入第三射流以例如控制极性、盐浓度或者允许在纳米颗粒形成期间在原位添加冷冻保护剂，而不影响装置的性能。
具有各种尺寸的离散的壳聚糖:TPP纳米颗粒通过调整流量或通过优化配制条件(例如壳聚糖溶液的pH值、壳聚糖和TPP浓度)来制备。将壳聚糖溶解于乙酸0.5％v/v中，最终浓度为0.5mg/mL，持续24h。刚好在配制之前，将最终的pH分别调节至3.5、5.0和6.5。以0.25mg/mL将TPP溶解于水中。将溶液装载到单独的注射器中，并且如上所述在CIJ-3i装置中制备纳米颗粒。
结果
如图15中所示，流量显著地影响平均颗粒尺寸及其多分散性。在高流量(≥10mL/min)时，平均颗粒尺寸以及其多分散性变成不依赖于流动。在这些条件下，获得具有60nm的(如由Z平均给出的)离散且高度均匀(PDI 0.05)的纳米颗粒。对于较低的流量(<10mL/min)，颗粒尺寸的显著增加(在流量为1mL/min时Dh＝140nm)伴随有颗粒均匀性的降低。图16A、图16B和图16C示出通过优化配制条件制备具有可调整的尺寸和表面电荷的壳聚糖:TPP纳米颗粒。使用pH值为3.5、5.0和6.5的壳聚糖溶液。在pH 3.5时，配制的纳米颗粒具有20nm的尺寸和28mV的表面电荷(图16A、图16B和图16C)。另一方面，当使用pH 6.5的壳聚糖溶液时，获得平均60nm且9mV的表面电荷的颗粒。当使用pH 5的壳聚糖溶液时，产生中等的尺寸(40nm)和电荷(19mV)的壳聚糖纳米颗粒。TEM图像(图17A、图17B和图17C)证实所有使用的条件都导致具有明确定义的尺寸的高度均匀且离散的球形纳米颗粒的制剂。
壳聚糖:TPP纳米颗粒在相关生物培养基中的稳定性(盐稳定性和血清稳定性)：对于药物递送应用，纳米颗粒应当在盐和蛋白质溶液的生理浓度中是稳定的。在这些条件下纳米颗粒的聚集显著地影响其物理化学性质，这常常导致被巨噬细胞快速清除以及差的生物分布。当与批量混合相比时，快速微量混合提供改进的混合条件，并且预期所得的纳米颗粒通过更好的聚合物链缠结是高度浓缩的且致密的。为了评估盐稳定性和血清稳定性，我们如上所述但稍作修改地使用在pH 5的壳聚糖溶液来制备了壳聚糖:TPP纳米颗粒。对于盐稳定性研究，使第三射流装载有3x浓缩的PBS，并且以20mL/min的流量制备纳米颗粒，得到具有最终PBS浓度等于1x且最终pH为6.7的制剂。将颗粒留在此培养基中持续5天。
壳聚糖:TPP纳米颗粒在所分析的时间段内保持不变：DLS数据(图18A、图18B、图18C、图18D和图18E)示出了在所分析的时间段内颗粒尺寸(图18A中的插图)和尺寸分布两者都保持不变。在第3天(图18D)和第5天(图18E)获得的壳聚糖:TPP纳米颗粒的TEM图像进一步证实了壳聚糖:TPP纳米颗粒在高盐浓度中被成功制备并且在至少5天的期间保持稳定。另外，我们评估了纳米颗粒在3h期间内在PBS 2％v/v中的稳定性。通过快速混合形成的纳米颗粒表现出良好的稳定性，没有聚集的迹象(图18B)。
CIJ-3i作为用于制备若干聚电解质纳米颗粒的通用平台：为了示出CIJ-3i关于带电荷的聚合物的选择的通用性，我们使用若干带相反电荷的生物大分子制备了具有不同的化学性质、尺寸和形状的聚电解质纳米颗粒。例如，我们能够制备具有100nm的离散且高度均匀的壳聚糖：Glu5(五嵌段谷氨酸肽)纳米颗粒(图19A)。当使用壳聚糖-g-PEG 17(0.5mg/mL，pH 5.0，2％PEG 17K接枝)和Glu5(0.5mg/mL，pH＝9)时制备50nm纳米颗粒(图19B)。当壳聚糖(0.5mg/mL，pH 3.5)和聚天冬氨酸钠盐(0.25mg/mL，pH＝9.2)以25mL/min络合时获得30-60nm的短棒状颗粒(图19D)。在另一种情况中，在硫酸鱼精蛋白(0.25mg/mL)和肝素(1mg/mL)溶液的快速络合之后获得10-15nm的纳米颗粒(图19C)。
生物治疗剂的包封：在制药工业中，诸如蛋白质、细胞因子和核酸的水溶性治疗剂的有效包封是最重要的。在我们的包封和释放研究中我们使用BSA作为模型蛋白质。为了确定BSA的包封效率，将BSA(0.25mg/mL)溶解于TPP(0.25mg/mL)的溶液中并且在使用前在室温(RT)匀化持续30min。低分子量壳聚糖(LMWC)溶液是在RT以0.5mg/mL在乙酸中(0.5％v/v)持续24小时而制备，并且在使用前将其pH调节至5。将两种溶液独立地装载到10mL注射器中，并且然后使用20mL/min的流量在CIJ-3i中制备含有BSA的壳聚糖NP。使用具有100kDa的截留分子量(MWCO)的膜、通过超速离心(700g以避免颗粒沉降)来纯化纳米颗粒。重复纯化步骤直到在裂解物(lysate)中检测不到游离的BSA(平均4x)。使用BCA测定法和以下等式来确定包封效率：
Figure GDA0001821687160000341
如表1中所示，在CIJ-3i装置中，我们能够实现BSA在壳聚糖：TPP纳米颗粒中的90％包封。包封的BSA的量取决于壳聚糖溶液的pH，其在壳聚糖溶液的pH为约3.5时较小(EE70％)。另外，含有BSA的壳聚糖纳米颗粒具有与空的壳聚糖纳米颗粒相当的数量平均尺寸和表面电荷，以及具有与空的壳聚糖纳米颗粒相同的颗粒尺寸分布(图20A、图20B和图20C)。在CIJ-3i中实现的快速且均匀的混合条件证明了尽管包封的蛋白质的高含量，仍然成功地保持了颗粒尺寸和形态(图20E)。
表1.使用CIJ-3i的壳聚糖纳米颗粒中BSA蛋白质的包封效率。
壳聚糖溶液的pH EE％
3.5 69.2+1.9
5.0 90.4+1.4
对于释放研究，使用以0.1mg/mL的浓度的罗丹明标记的BSA(rhod-BSA)。释放研究在37℃、pH 5.5和7.2、在PBS 10mM溶液中进行。在预定时间点取样(1mL)，并且用具有适当的pH的新鲜PBS代替该体积。将纳米颗粒在4℃以15000g离心持续30min，收集上清液，并且通过荧光测量释放的蛋白质的量。如图21中所示，在前6小时内观察到BSA的初始的突释(burst release)，随后是更平缓的释放。
参考文献
在说明书中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表示本发明公开的主题所属领域的技术人员的水平。在说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献(例如网站、数据库等)在此通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体和单独指明通过引用并入的相同程度。将理解，尽管一些专利申请、专利和其他参考文献在本文中被提及，此类参考文献并不构成任何这些文件形成本领域公知常识的部分的承认。如果本说明书与任何并入的参考文献之间有冲突，应当以本说明书(包括其的任何修改，该修改可能基于并入的参考文献)为准。本文中使用了术语的标准的领域接受的含义，除非另有说明。本文中使用了各种术语的标准缩写。
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虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式稍微详细地描述了前述主题，但本领域技术人员将理解，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims (23)

1.一种连续地生成均匀的聚电解质络合物纳米颗粒的瞬时纳米络合方法，所述方法包括：
(a)使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；
(b)使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到所述封闭室中，其中所述第一流和所述第二流在进入所述封闭室时是在相对侧上；以及
(c)使所述第一流和所述第二流在所述封闭室中撞击，直到雷诺数为从1,900至20,000，从而使所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成聚电解质络合物纳米颗粒的聚电解质络合过程；
其中所述第二流的流量与所述第一流的流量的比率是从1至10；
其中所述第一可变流量和所述第二可变流量大于5毫升/分钟；以及
其中所述第一流的pH值和所述第二流的pH值在从2.5至8.4的范围内。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一流和/或所述第二流还包含一种或更多种水溶性治疗剂。
3.如权利要求1所述的方法，还包括使第三流流入到所述封闭室中，其中当进入所述封闭室时，每个流与其他两个流是等距的。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第三流包含一种或更多种水溶性治疗剂、一种或更多种可混溶的有机溶剂、和/或一种或更多种冷冻保护剂。
5.如权利要求2或权利要求4所述的方法，其中所生成的聚电解质络合物纳米颗粒包封所述一种或更多种水溶性治疗剂。
6.如权利要求2或权利要求4所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性治疗剂选自由以下组成的组：碳水化合物、蛋白质和核酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：壳聚糖、PAMAM树状聚合物、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白、聚(β-氨基酯)、阳离子肽及其衍生物。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)及其衍生物。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物选自由以下组成的组：聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、带负电荷的嵌段共聚物、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、透明质酸、藻酸盐、三聚磷酸盐、蛋白质、肽和核酸。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物选自寡聚(谷氨酸)。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、指导RNA、质粒DNA、载体DNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA和siRNA。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、指导RNA、质粒DNA、载体DNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA和siRNA。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述雷诺数在从2,000至8,000的范围内。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述雷诺数在从3,000至5,000的范围内。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述第一流的pH值和所述第二流的pH值在从3.5至7.4的范围内。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物是质粒DNA，并且所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由线性聚乙烯亚胺及其衍生物组成的组。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述第二流包含所述一种或更多种水溶性治疗剂，并且所述聚电解质络合过程将所述一种或更多种水溶性治疗剂包封在所生成的聚电解质络合物纳米颗粒中。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述第一流包含壳聚糖，并且所述第二流包含三聚磷酸盐和蛋白质，其中所述蛋白质被所述三聚磷酸盐和壳聚糖共包封在所生成的聚电解质络合物纳米颗粒中。
19.如权利要求6所述的方法，其中所述碳水化合物是多糖。
20.一种均匀的聚电解质络合物纳米颗粒制剂，由权利要求1所述的方法生成，其中所述均匀的聚电解质络合物纳米颗粒制剂具有从0.05至0.1的范围内的多分散指数。
21.如权利要求20所述的纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从20nm至100nm的尺寸范围内。
22.如权利要求21所述的纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径在从25nm至60nm的尺寸范围内。
23.如权利要求22所述的纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物纳米颗粒的直径是30nm。
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