CN108101962B - 一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用 - Google Patents
一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用。其公开了一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽的结构及应用。本发明具有以下有益效果：合成成本低，而且对各种年龄的猪都可使用，均无毒副作用，可以刺激机体的细胞免疫和体液免疫，进而大大提高疫苗抗体效价，还可以延长抗原在体内的时间，从而延长疫苗的免疫持续期。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) ，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均可感染，该病以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状、免疫抑制、高感染率、高死亡率为特征的一种高致病性疫病。该病已给全球养猪业造成严重的经济损失。为了有效地控制该病，国内外已开发出多种用于预防PRRS的疫苗。
免疫增强剂，是一类通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异性反应的物质，由于目前大多数疫苗存在免疫性低的问题，寻找安全有效的免疫佐剂是解决这一问题的有效途径之一。小分子免疫肽具有诸多优势，可以作为一种免疫增强剂，小分子多肽一般分子量低、膜透过性好、药效活性强、给药方式和吸收途径多样化、生物利用度高以及在机体生理条件下表现出高稳定性而不易被酶所降解等特性，还可以通过对小分子多肽进行结构改造及衍生化修饰，得到一系列的环肽类、拟肽类、糖肽类及脂多肽类等多种多肽类似物，以便发挥更好、更大的药效。
鉴于此，本发明提供一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，不仅安全有效，在大大提高疫苗抗体效价的同时，同时也能延长疫苗的免疫保护期。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用的技术方案。
所述的一种如式（1）所述的多肽，或其药学上可接受的盐
[AA1]- [AA2]- [AA3]- [AA4]- [AA5]- [AA6]- [AA7]- [AA8]- [AA9]-[AA10]- [AA11]- [AA12]- [AA13]- [AA14]- [AA15]- [AA16]- [AA17] - [AA18] -[AA19]（1）；
式（1）中：
AA1: 选的氨基酸为无，或1-3个氨基酸构成肽段
AA2: 选的氨基酸为Ala、Pro或Asp
AA3: 选的氨基酸为Lys、Cys或 Trp
AA4: 选的氨基酸为Gln、Ala或His
AA5： 选的氨基酸为Gly、Asp或Glu
AA6： 选的氨基酸为Thr、Pro或Ser
AA7： 选的氨基酸为Pro或Glu
AA8：选的氨基酸为Trp或Leu
AA9：选的氨基酸为Arg 、Ala或Pro
AA10：选的氨基酸为Tyr 、Ser或Val
AA11：选的氨基酸为Glu 、Cys或Asp
AA12：选的氨基酸为：Gln、Arg、Ala或Pro
AA13：选的氨基酸为：Gly、Val 或Ala
AA14：选的氨基酸为Arg、Glu或Cys
AA15：选的氨基酸为Gly、Ala或Ser
AA16：选的氨基酸为Tyr、Ala或Cys
AA17：选的氨基酸为Val、Pro或Ala
AA18：选的氨基酸为Cys 、Pro或Arg
AA19：选的氨基酸为无，或1-3 个氨基酸构成肽段。
所述的多肽，其特征在于该多肽长度为17-23个氨基酸，优选为18-20个氨基酸。
所述的多肽，其特征在于所述的AA1和AA19为无。
所述的多肽，其特征在于所述的AA1和AA19为1-3 个氨基酸构成肽段。
所述的多肽，其特征在于所述的AA3为Lys或Cys。
所述的多肽，其特征在于所述的AA9为Arg 或Ala。
所述的多肽，其特征在于所述的AA17为Val。
所述的多肽，其特征在于该多肽采用聚乙二醇修饰的方法对合成的小分子多肽进行修饰，将PEG的端羟基转变为活性更高的PEG 活性中间体，然后用PEG活性中间体与具有邻羟基、α‐羟基酸、β‐氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得聚乙二醇中间体；将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生物，而后用于小分子多肽类N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化小分子多肽。
所述的多肽特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的用途。
所述的多肽在制备特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果制剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所提出的一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，不仅合成成本低，而且对各种年龄的猪都可使用，均无毒副作用。
2、本发明所提出的一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，可以刺激机体免疫系统，进而大大提高疫苗抗体效价。
3、本发明所提出的一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，可以延长抗原在体内的时间，从而延长疫苗的免疫保护期。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽的制备
由上海生工合成[Met]- [Ala]- [Ala]- [Lys]- [Gln]- [Gly]- [Thr]- [Pro]-[Trp]- [Arg]- [Tyr]- [Glu]- [Gln]- [Gly]- [Arg]- [Gly]- [Tyr] - [Val] - [Cys]（MAAKQGTPWRYEQGRGYVC），其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。采用聚乙二醇修饰的方法对合成的小分子多肽进行修饰，将PEG的端羟基转变为活性更高的基团得到PEG 活性中间体，然后用PEG活性中间体与具有邻羟基、α‐羟基酸、β‐氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得聚乙二醇中间体；将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生物，而后用于小分子多肽类N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化小分子多肽。
实施例2：一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽的制备
由上海生工合成[Val]- [Pro]- [Lys]- [Ala]- [Asp]- [Pro]- [Glu]- [Leu]-[Ala]- [Ser]- [Cys]- [Arg]- [Val]- [Glu]- [Ala]- [Cys]- [Pro] - [Pro]
（VPKADPELASCRVEACPP），其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。采用聚乙二醇修饰的方法对合成的小分子多肽进行修饰，将PEG的端羟基转变为活性更高的基团得到PEG 活性中间体，然后用PEG活性中间体与具有邻羟基、α‐羟基酸、β‐氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得聚乙二醇中间体；将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生物，而后用于小分子多肽类N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化小分子多肽。
实施例3：一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽的制备
由上海生工合成[Asp]- [Trp]- [His]- [Glu]- [Ser]- [Glu]- [Leu]- [Pro]-[Val]- [Asp]- [Pro]- [Ala]- [Cys]- [Ser]- [Cys]- [Ala] - [Arg]
（DWHESELPVDPACSCAR） ，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。采用聚乙二醇修饰的方法对合成的小分子多肽进行修饰，将PEG的端羟基转变为活性更高的基团得到PEG 活性中间体，然后用PEG活性中间体与具有邻羟基、α‐羟基酸、β‐氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得聚乙二醇中间体；将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生物，而后用于小分子多肽类N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化小分子多肽。
试验例一： 一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽的应用
1材料
1.1提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽
按本发明实施例1-3制备
1.2猪繁殖与呼吸综合征疫苗为现有产品，如采用浙江诗华诺倍威生物技术有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合征疫苗
1.3试验动物28日龄健康易感仔猪、妊娠母猪，检测猪繁殖与呼吸综合征抗体、抗原双阴性。
2 方法
2.1 28日龄健康断奶仔猪免疫效果试验
将60头28日龄健康断奶仔猪分为四组，第一组15头，作为实验一组，采用本发明实施例1制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第二组15头，作为实验二组，采用本发明实施例2制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第三组15头，作为实验三组，采用本发明实施例3制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第四组15头，作为实验四组，直接进行免疫，按1 头份/ml进行免疫。在免疫后的第7、14、21d前腔静脉采血抗凝，进行淋巴细胞转化试验；在免疫后7、14、21、28、35d采血，分离血清，测其抗体水平。
2.2 妊娠母猪免疫效果试验
将40头2妊娠母猪分为四组，第一组10头，作为实验一组，采用本发明实施例1制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第二组10头，作为实验二组，采用本发明实施例2制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第三组10头，作为实验三组，采用本发明实施例3制备的用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽，按1:1与疫苗混合使用，每头猪按1 头份/ml进行免疫；第四组10头，作为实验四组，直接进行免疫，按1 头份/ml进行免疫。在免疫后的第7、14、21、28d前腔静脉采血抗凝，进行淋巴细胞转化试验；在
免疫后7、14、21、28、63、90d采血，分离血清，测其抗体水平。
3 结果
3.1 28日龄健康断奶仔猪免疫效果试验结果
采用MTT法测定脾脏淋巴细胞转化及增殖试验,结果如表1：
表1 脾脏淋巴细胞转化及增殖试验结果
在免疫后14、21、28、42、60、90、120、180d采血，分离血清，测其抗体水平结果如表2：
表2 断奶仔猪抗体检测结果
3.2 妊娠母猪免疫效果试验结果
采用MTT法测定脾脏淋巴细胞转化及增殖试验,结果如表3：
表3 脾脏淋巴细胞转化及增殖试验结果
在免疫后14、21、28、42、60、90、120、180d采血，分离血清，测其抗体水平结果如表4：
表4 妊娠母猪抗体检测结果
4 结论
综上所述，本发明用于提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽不仅合成方便，成本低，使用安全，还可以提高淋巴细胞转化率，提高疫苗的免疫效果，延长疫苗的保护持续期。
试验例二：其它衍生多肽的制备和活性
按照实施例1-3的制备方法制备了以下数种衍生多肽，并按照试验例一的方法进行活性测试，测定结果如下：
多肽1：序列同SEQ ID NO：1所示，其中AA2的Ala被Asp替换；
多肽2：序列同SEQ ID NO：2所示，其中AA17的Pro被Val替换；
多肽3：序列同SEQ ID NO：3所示，其中AA9的Pro被Arg替换。
结果表明：多肽1-3能提高淋巴细胞转化率，提高疫苗的免疫效果，延长疫苗的保护持续期。
序列表
<110> 浙江美保龙生物技术有限公司
<120> 一种特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果的小分子多肽及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 多肽(polypeptide)
<400> 1
Met Ala Ala Lys Gln Gly Thr Pro Trp Arg Tyr Glu Gln Gly Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Val Cys
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 多肽(polypeptide)
<400> 2
Val Pro Lys Ala Asp Pro Glu Leu Ala Ser Cys Arg Val Glu Ala Cys
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 多肽(polypeptide)
<400> 3
Asp Trp His Glu Ser Glu Leu Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Cys Ala
1 5 10 15
Arg
Claims (2)
1.一种聚乙二醇化小分子多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该多肽采用聚乙二醇修饰的方法对合成的小分子多肽进行修饰，将PEG的端羟基转变为活性更高的PEG 活性中间体，再用PEG活性中间体与具有邻羟基、α‐羟基酸、β‐氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得聚乙二醇中间体；将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生物，再用于小分子多肽N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化小分子多肽。
2.如权利要求1所述的多肽在制备特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果制剂中的应用。
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Denomination of invention: A small molecule peptide with specificity to enhance the immune response of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine and its application Granted publication date: 20210604 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Jinhua Economic Development Zone Branch Pledgor: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980059143 |