CN108057122A - 一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法 - Google Patents
一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法，该方法包括如下步骤：1)制备双硒化合物；2)将羧甲基普鲁兰多糖水溶液、EDC水溶液混合，再将溶解有双硒化合物的DMF加入混合液中，滴加DMF，反应结束后，向反应液中加入萃取剂，反应结束后，静置，取下层液，透析，将透析液冻干，得到普鲁兰载体；3)将去盐酸化阿霉素、普鲁兰载体分别溶于DMSO中，混合，透析，超滤，得到所述天然普鲁兰多糖载药系统。本发明提高系统稳定性的同时，大大提高了载药量，实现对肝脏的靶向性给药。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗药物领域，特别是涉及一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法。
背景技术
药物载体是一种药物传送系统，智能型纳米药物载体有利于实现靶向给药，进而征服癌症等疑难病症。肿瘤组织由于其组织的特点，可使纳米粒子药物传送系统经EPR现象被动集中于肿瘤部位，以内吞的形式摄入胞内。在胞内的初级溶酶体及次级溶酶体内，由于其内部pH值低于人体血液循环系统的pH值，这种pH的变化使纳米粒子药物传送系统所载药物与其在酸性条件下分离，从而实现肿瘤的环境敏感型被动靶向治疗。因此，纳米粒子药物载体的研究一直倍受关注。
顾晓瑜等人公开了两亲性双硒聚合物的制备及其聚集体形成[见“ActaChimicaSinica”,第8期1136-1140页，(2013年)]，所述ABA型两亲性双硒聚合物(CS-PUSeSe-CS)其中间部分PUSe引入了Se-Se双键，双硒键对氧化还原环境十分敏感，容易发生双硒键的断裂，从而达到控制药物释放的目的。
Deepagan V G等人研究的用ROS介导的抗癌药物递送的原位双硒化物交联的聚合物胶束[见“Biomaterials”,103卷56-66页，(2016年)]，双硒化物交联胶束(DCM)包裹阿霉素(DOX)相较于游离药物具有稳定性高的优点。但DOX-DCMs在体内靶向性低，其释放的高浓度DOX也可对其他正常组织造成损伤。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法，用于解决现有技术中阿霉素的载物系统不稳定、药物释放能以得到控制等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统的制备方法，包括如下步骤：
1)制备双硒化合物；
2)将羧甲基普鲁兰多糖水溶液、EDC水溶液混合，再将溶解有双硒化合物的DMF加入混合液中，滴加DMF，反应结束后，向反应液中加入萃取剂，反应结束后，静置，取下层液，透析，将透析液冻干，得到普鲁兰载体；
3)将去盐酸化阿霉素、普鲁兰载体分别溶于DMSO中，混合，透析，，得到所述天然普鲁兰多糖载药系统。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，制备双硒化合物的方法包括如下步骤：
a)将硒粉与氢氧化钠加入DMF中，得到第一反应液；
b)将水合肼加入所述第一反应液中，再加入4-溴苄醇，加热反应，得到第二反应液；
c)加水稀释所述第二反应液，再加入萃取剂萃取，收集上层液，除水，得第三反应液；
d)将所述第三反应液固液分离，对所得液体旋转蒸发，得到所述双硒化合物。
在本发明的一些实施例中，步骤a)中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值≤1，优选为0.8-1，更优选为0.9-1，氢氧化钠可稍微过量。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，水合肼与硒粉的摩尔量比值≥0.25，优选为0.25-0.3，更优选为0.25-0.27，水合肼可稍微过量。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值≥0.5，优选为0.5-0.7，更优选为0.5-0.6，4-溴苄醇可稍微过量。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，加热至160℃进行反应。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，反应时间为4h。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，将反应液置于油浴中加热反应。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加热反应时，对蒸发的物质进行冷凝回流。
在本发明的一些实施例中，步骤c)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。
在本发明的一些实施例中，步骤c)中，收集上层液后，加入无水硫酸钠进行除水处理。
在本发明的一些实施例中，步骤c)中，加入无水硫酸钠后，静置2h以上。
在本发明的一些实施例中，步骤d)中，固液分离的方式为抽滤。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述羧甲基普鲁兰中羧甲基的摩尔数：所述EDC的摩尔数＝1:1.5。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，滴加DMF至溶液澄清透亮后，反应5-10h。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。
在本发明的一些实施例中，步骤3)中，按质量计，普鲁兰载体：阿霉素＝2:1。此处普鲁兰载体即普鲁兰双硒化合物，是用羧甲基普鲁兰和双硒化合物反应后得到的固体产物。
在本发明的一些实施例中，步骤3)中，超滤得到所述天然普鲁兰多糖载药系统。
本发明第二方面提供上述方法制得的天然普鲁兰多糖载药系统。
如上所述，本发明的一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法，具有以下有益效果：(一)采用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，所述羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与双硒化合物结合率高，提高系统稳定性的同时，大大提高了载药量。
(二)由于本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体以天然多糖普鲁兰作为主链，该主链可以跟肝癌细胞的去唾液酸糖蛋白受体相结合，因而可实现对肝脏的靶向性给药。
(三)用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，载药后形成的纳米粒子粒度均匀，分散好，不团聚，有利于提高治疗效果。
(四)本发明所述方法原料易于获取，操作简单，使用的设备为常规设备，便于工业化生产。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中天然普鲁兰多糖纳米药物载体电镜图。
图2显示为本发明实施例1中双硒化合物及普鲁兰双硒化合物的红外图。
图3显示为本发明实施例1中载药纳米粒子粒径分布图。
图4显示为本发明实施例1中荷瘤鼠死亡曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例中，DMF是指二甲基甲酰胺，EDC是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
以下实施例中所涉及的化学反应如下：
以下各实施例中的透析均是采用去离子水，目的是去除小分子物质和其他杂质。
实施例1
(一)制备普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)
1.取100mL DMF，将1.98g硒粉与1.52g固体氢氧化钠逐渐加入其中，机械搅拌反应得第一反应液；
2.取水合肼1.25mL加入第一反应液中，再缓慢加入4.675g 4-溴苄醇，置于160℃油浴锅中冷凝回流4小时，之后停止加热，待其自然冷却，得第二反应液；
3.第二反应液中加水100mL稀释，再加入100mL乙酸乙酯萃取，收集上层液，加入无水硫酸钠，静置过夜，得第三反应液；
4.采用布氏漏斗抽滤(所用滤纸为快速滤纸)得第三反应液，所得液体旋转蒸发(溶剂蒸发完全，所剩为固体，旋蒸温度为50℃)，即得双硒化合物；
5.取羧甲基普鲁兰50mg，加入1mL水，磁力搅拌助溶，得第四反应液；
6.取15.53mg EDC溶于0.5mL水中，将其加入第四反应液中，磁力搅拌0.5h，得第五反应液；
7.称取上述所得双硒化合物197.8mg，溶于2mLDMF中，将第五反应液逐渐加入其中，在磁力搅拌下缓慢滴加DMF至溶液澄清透亮，反应5h，得第六反应液；
8.向第六反应液中加入4mL乙酸乙酯，摇晃均匀，静置0.5h，取下层液，透析2h，取出透析液冻干(冻干条件为-80℃，7h)，即得普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)。
(二)盐酸阿霉素去盐酸化
1.取14mg盐酸阿霉素溶于5mL去离子水中，得到第一溶液；
2.取5.6g氢氧化钾固体溶于1L水中，取该溶液逐滴加入第一溶液中，至pH为9.6，得到第二溶液；
3.将第二溶液离心，去除上清液，干燥沉淀，即得去盐酸化阿霉素。
(三)制作负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统
1.取上步制备的去盐酸化阿霉素10mg溶于2mLDMSO中，配置得到第三溶液；
2.取20mgPu-PBSe，用1mLDMSO配置为溶液，将该溶液加入第三溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，得第四溶液；
3.将第四溶液超滤，即得负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。
(四)载药纳米粒子靶向治疗肿瘤
通过裸鼠尾静脉注射DOX-PBSe溶液(DOX:5-10mg/kg体重)。
图1显示为本实施例中天然普鲁兰多糖纳米药物载体电镜图。
图2显示为本实施例中双硒化合物及普鲁兰双硒化合物的红外图；其中，Pu-PBSe为普鲁兰双硒化合物载体，PBSe为双硒化合物，Pu为天然普鲁兰多糖。
图3显示为本实施例中载药纳米粒子粒径分布图。
图4显示为实施例中荷瘤鼠死亡曲线图；其中，曲线(1)空白对照组，曲线(2)为盐酸阿霉素组，曲线(3)阿霉素-普鲁兰多糖载药组。
从图1的天然普鲁兰多糖纳米药物载体电镜图可以看出，负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统的粒径大小均一，呈球形，分散性良好。
关于图2中红外谱图的图解如下：通过对比天然普鲁兰多糖、双硒化合物、普鲁兰载体材料的红外谱图，能够明显看出在普鲁兰载体材料的谱图中出现了双硒化合物的特征峰，表明成功负载双硒化合物。
从图3的载药纳米粒子粒径分布图可以看出，负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统的粒径大小在78纳米左右，粒径较小，分布较窄，有利于体内的靶向分布。
本发明选择荷瘤鼠进行实验，通过裸鼠尾静脉分别注射PBS、DOX·HCl、Pu-PBSe溶液。治疗结果如图4所示，图4为荷瘤鼠的死亡曲线图，图中，从左到右依次为(1)：空白对照组；(2)：盐酸阿霉素组；(3)：阿霉素-普鲁兰多糖载药组，各组溶液中阿霉素的注射浓度为5mg/kg体重。通过对比可以看出，负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统能够明显延长动物死亡时间，展示出优良的疗效。
以下实施例2-3中制得的天然普鲁兰多糖纳米药物载体电镜图类似于图1；制得的双硒化合物及普鲁兰双硒化合物的红外图类似于图2；制得的载药纳米粒子粒径分布图类似于图3；荷瘤鼠死亡曲线图类似于图4。
实施例2
(一)制备普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)
1.取100mL DMF，将1.98g硒粉与1.52g固体氢氧化钠逐渐加入其中，机械搅拌反应得第一反应液；
2.取水合肼1mL加入第一反应液中，再缓慢加入4.675g 4-溴苄醇，置于160℃油浴锅中冷凝回流4小时，之后停止加热，待其自然冷却，得第二反应液；
3.第二反应液中加水100mL稀释，再加入100mL乙酸乙酯萃取，收集上层液，加入无水硫酸钠，静置2h，得第三反应液；
4.采用布氏漏斗抽滤(所用滤纸为快速滤纸)得第三反应液，所得液体旋转蒸发(溶剂蒸发完全，所剩为固体，旋蒸温度为50℃)，即得双硒化合物；
5.取羧甲基普鲁兰50mg，加入1mL水，磁力搅拌助溶，得第四反应液；
6.取15.53mg EDC溶于0.5mL水中，将其加入第四反应液中，磁力搅拌0.5h，得第五反应液；
7.称取上述所得双硒化合物197.8mg，溶于5mLDMF中，将第五反应液逐渐加入其中，在磁力搅拌下缓慢滴加DMF至溶液澄清透亮，反应5h，得第六反应液；
8.向第六反应液中加入4mL乙酸乙酯，摇晃均匀，静置0.5h，取下层液，透析2h，取出透析液冻干(冻干条件为-80℃，7h)，即得普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)。
(二)盐酸阿霉素去盐酸化
1.取14mg盐酸阿霉素溶于5mL去离子水中，得到第一溶液；
2.取5.6g氢氧化钾固体溶于1L水中，取该溶液逐滴加入第一溶液中，至pH为9.6，得到第二溶液；
3.将第二溶液离心，去除上清液，干燥沉淀，即得去盐酸化阿霉素。
(三)制作负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统
1.取上步制备的去盐酸化阿霉素10mg溶于2mLDMSO中，配置得到第三溶液；
2.取20mgPu-PBSe，用1mLDMSO配置为溶液，将该溶液加入第三溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，得第四溶液；
3.将第四溶液超滤，即得负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。
(四)载药纳米粒子靶向治疗肿瘤
通过裸鼠尾静脉注射DOX-PBSe溶液(DOX:5-10mg/kg)。
实施例3
(一)制备普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)
1.取100mL DMF，将1.98g硒粉与1.52g固体氢氧化钠逐渐加入其中，机械搅拌反应得第一反应液；
2.取水合肼1mL加入第一反应液中，再缓慢加入4.675g 4-溴苄醇，置于160℃油浴锅中冷凝回流4小时，之后停止加热，待其自然冷却，得第二反应液；
3.第二反应液中加水100mL稀释，再加入100mL乙酸乙酯萃取，收集上层液，加入无水硫酸钠，静置2h，得第三反应液；
4.采用布氏漏斗抽滤(所用滤纸为快速滤纸)得第三反应液，所得液体旋转蒸发(溶剂蒸发完全，所剩为固体，旋蒸温度为50℃)，即得双硒化合物；
5.取羧甲基普鲁兰50mg，加入2mL水，磁力搅拌助溶，得第四反应液；
6.取15.53mg EDC溶于0.5mL水中，将其加入第四反应液中，磁力搅拌0.5h，得第五反应液；
7.称取上述所得双硒化合物197.8mg，溶于2mLDMF中，将第五反应液逐渐加入其中，在磁力搅拌下缓慢滴加DMF至溶液澄清透亮，反应10h，得第六反应液；
8.向第六反应液中加入4mL乙酸乙酯，摇晃均匀，静置0.5h，取下层液，透析4h，取出透析液冻干(冻干条件为-80℃，7h)，即得普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)。
(二)盐酸阿霉素去盐酸化
1.取14mg盐酸阿霉素溶于5mL去离子水中，得到第一溶液；
2.取5.6g氢氧化钾固体溶于1L水中，取该溶液逐滴加入第一溶液中，至pH为9.6，得到第二溶液；
3.将第二溶液离心，去除上清液，干燥沉淀，即得去盐酸化阿霉素。
(三)制作负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统
1.取上步制备的去盐酸化阿霉素10mg溶于2mLDMSO，配置得到第三溶液；
2.取20mgPu-PBSe，用1mLDMSO配置为溶液，将该溶液加入第三溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，得第四溶液；
3.将第四溶液超滤，即得负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。
(四)载药纳米粒子靶向治疗肿瘤
通过裸鼠尾静脉注射DOX-PBSe溶液(DOX:5-10mg/kg)。
综上所述，本发明的一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统及制备方法，具有以下有益效果：(一)采用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与双硒化合物结合率高，提高系统稳定性的同时，大大提高了载药量。
(二)由于本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体以天然多糖普鲁兰作为主链，该主链可以与肝癌细胞的去唾液酸糖蛋白受体相结合，因而可实现对肝脏的靶向性给药。
(三)用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，载药后形成的纳米粒子粒度均匀，分散好，不团聚，有利于提高治疗效果。
(四)本发明所述方法原料易于获取，操作简单，使用的设备为常规设备，便于工业化生产。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备双硒化合物；
2)将羧甲基普鲁兰多糖水溶液、EDC水溶液混合，再将溶解有双硒化合物的DMF加入混合液中，滴加DMF，反应结束后，向反应液中加入萃取剂，反应结束后，静置，取下层液，透析，将透析液冻干，得到普鲁兰载体；
3)将去盐酸化阿霉素、普鲁兰载体分别溶于DMSO中，混合，透析，得到所述天然普鲁兰多糖载药系统。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备双硒化合物的方法包括如下步骤：
a)将硒粉与氢氧化钠加入DMF中，得到第一反应液；
b)将水合肼加入所述第一反应液中，再加入4-溴苄醇，加热反应，得到第二反应液；
c)加水稀释所述第二反应液，再加入萃取剂萃取，收集上层液，除水，得第三反应液；
d)将所述第三反应液固液分离，对所得液体旋转蒸发，得到所述双硒化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值≤1，优选为0.8-1，更优选为0.9-1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，水合肼与硒粉的摩尔量比值≥0.25，优选为0.25-0.3，更优选为0.25-0.27。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值≥0.5，优选为0.5-0.7，更优选为0.5-0.6。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，加入4-溴苄醇后，加热至160℃进行反应；
和/或，步骤b)中，反应时间为4h；
和/或，步骤b)中，加热反应时，对蒸发的物质进行冷凝回流；
和/或，步骤c)中，所述萃取剂为乙酸乙酯；
和/或，步骤c)中，收集上层液后，加入无水硫酸钠进行除水处理；
和/或，步骤d)中，固液分离的方式为抽滤。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述羧甲基普鲁兰中羧甲基的摩尔数：所述EDC的摩尔数＝1:1.5。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，滴加DMF至溶液澄清透亮后，反应5-10h；
和/或，步骤2)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，按质量计，普鲁兰载体：阿霉素＝2:1；
和/或，步骤3)中，超滤得到所述天然普鲁兰多糖载药系统。
10.根据权利要求1-9任一项所述制备方法制得的负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。
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