CN107937459A - 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵规模化生产TRIM72蛋白的方法。本发明利用大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72经过试管斜面活化、摇瓶培养、种子罐扩大培养制备种子液、发酵罐高密度发酵等工艺步骤发酵生产TRIM72蛋白。本发明采用的高密度发酵方法，解决了TRIM72蛋白发酵菌体量少、表达产量低、难以工业化大规模生产的问题；能显著提高大肠杆菌发酵密度，增加单位菌体蛋白表达量，从而提高TRIM72蛋白表达总量，具有减少试剂消耗、节约成本、操作简单、重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵重组大肠杆菌制备人骨骼肌TRIM72重组蛋白的方法。
背景技术
TRIM72蛋白共有477个氨基酸，分子量为53kD，因最初在骨骼肌细胞中发现所以也叫做mitsu-gumin 53(M653)，是一种肌肉特异性tripartite motif family(TRIM)家族蛋白(该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别称为RING，B-BOX和卷曲结构域。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白带上泛素标记以便降解)，也是一种细胞膜修复机制的重要组成部分。在医学应用方面，TRIM72具有治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效，能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加TRIM72的含量保护心脏损伤，可用于治疗心脏缺血或再灌损伤，也有报道可以用于治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病及其相关病症。但目前通过已知的人源野生型TRIM72蛋白表达基因，通过体外原核细胞蛋白表达体系无法获得更高的蛋白产量，所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的生产成本，特别是在同样的纯化技术条件下。为了提高细菌发酵菌体生长密度和目标产物的表达总量，提高发酵产物的比生产率，进一步降低生产成本，我们开发出了一种高密度发酵生产TRIM72蛋白的方法。本发明显著提高了菌体密度及蛋白表达量，可实现规模化产TRIM72蛋白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可规模化产TRIM72蛋白的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
本发明提供一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，所述方法步骤如下：
(1)种子培养：将试管斜面活化后的BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72种子，接入摇瓶过夜培养后，接入种子罐，扩大培养至对数生长期，作为种子液；
(2)配制培养基：配制高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；
(3)发酵：以5％-10％的接种量将步骤(1)所得的种子液转接到步骤(2)的发酵培养基，50％-70％装液量的发酵罐中，保持溶氧在10％-50％，保持罐压为0-0.05Mpa，发酵温度为36-37℃，搅拌转速为300-1000rpm；
(4)补料：当培养至溶氧开始反弹时，开始加入补料培养基，控制补料速度与溶氧联动，溶氧控制在10％以上；
(5)诱导：当培养至一定阶段时，降温至20-30℃，一次性加入0.5-1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，诱导约4h放罐。
其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(1)的种子是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET22b(+)为载体，可用于高密度发酵人骨骼肌TRIM72蛋白。
其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(1)是按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养2-4h，至OD600在1.0-1.2时，移种至发酵罐中。
其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(2)培养基的主要成分及其含量如下：胰蛋白胨10～20g/L、酵母粉20～30g/L、氯化钠0～1g/L、甘油2～8g/L、葡萄糖6～10g/L、KH2PO4·H2O 2～5g/L、Na2HPO4·3H2O 10～30g/L、2mM MgCl2·6H2O 0.5～2ml/L。
其中，优选胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O5g/L，Na2HPO4·3H2O15g/L，2mMMgCl2·6H2O溶液1ml/L，微量盐溶液1ml/L，pH为7.0。
其中，微量盐溶液为：15ml浓盐酸加入适量的水稀释，依次加入ZnSO4·7H2O0.71g、CuSO4·5H2O 0.4g、H3BO40.06g、MnSO4·H2O 0.8g、CaCl20.07g、Na2MoSO4·2H2O 1g、CoCl2·6H2O0.01g，定容至100ml，待彻底溶解后，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤。
其中，配制高密度发酵培养基的方法如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)除葡萄糖、MgCl2·6H2O、微量盐溶液外，将其他组分在发酵罐中用蒸馏水溶解，121℃条件下，灭菌20分钟；
(3)葡萄糖单独灭菌，115℃条件下，灭菌20分钟；
(4)待发酵罐冷却至50℃左右时，加入MgCl2·6H2O溶液，微量盐溶液，混合后降温至37℃即得。
其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(3)是发酵温度37℃，搅拌转速300-1000转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；当转速达到1000r/min以上时，固定在1000r/min，随着培养过程中养分的消耗，营养物质会逐渐减少，继续培养2-4h左右。
其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，步骤(4)中补料的主要组分及其含量为胰蛋白胨5～10g/L、酵母粉5～10g/L、葡萄糖200～500g/L，其中优选胰蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖300g/L。
其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，步骤(5)是降温至25℃，加入诱导剂0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，此时溶氧与补料联动，保持溶氧在10％以上，继续诱导培养4h左右放罐。
所述的高密度发酵方法，用30％氨水控制pH在7.0左右。
本发明提供的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，所述的高密度发酵方法也可应用于BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72突变体种子，发酵TRIM72突变体蛋白。
本发明的有益效果是：
上述用于规模化产重组人骨骼肌TRIM72蛋白的高密度发酵方法，在重组大肠杆菌发酵过程中实现重组大肠杆菌的高密度生长，能显著提高大肠杆菌工程菌发酵密度，增加目的蛋白表达量，从而提高目的蛋白表达总量，提高重组人骨骼肌TRIM72或TRIM72突变体的单位产率，从而有效地减少试剂的消耗，节约成本，适合规模化工业生产的需要。
附图说明
图1为SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳图，其中：
1、MARKER
2、标准品
3、TRIM72诱导前上清样品
4、原发酵方法发酵TRIM72诱导后上清样品
5、高密度方法发酵TRIM72诱导后上清样品
6、TRIM72突变体诱导前上清样品
7、原发酵方法发酵TRIM72突变体诱导后上清样品
8、高密度方法发酵TRIM72突变体诱导后上清样品
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步说明。
本发明下列实施例所用的仪器型号、试剂及其来源如下：
发酵罐：BLBlO-5SJA-50SJA-VIP上海百仑生物科技有限公司
蛋白纯化仪：AKTA pure GE
凝胶成像仪：Universal Hood III BIO-RAD
紫外可见分光光度计：752上海菁华科技仪器有限公司
胰蛋白胨：Cat.No：LP0042 OXOID
酵母粉：Cat.No：LP0021 OXOID
实施例1高密度发酵TRIM72蛋白
种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L；100mg/ml Ampilicillin1ml/L；
发酵培养基：按g/L计，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O5g/L，Na2HPO4·3H2O15g/L，2mMMgCl2·6H2O溶液1ml/L，微量盐溶液1ml/L，pH为7.0。
补料培养基：按g/L计，胰蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖300g/L。
所述用于重组人骨骼肌TRIM72蛋白的种子培养基配制，按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分配制3L溶液，加入到5L种子罐中，121℃灭菌20min，冷却降温至37℃，待接种。
所述用于重组人骨骼肌TRIM72蛋白的高密度发酵培养基的制备方法，配制30L培养基加入到50L发酵罐中，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)除葡萄糖、MgCl2·6H2O、微量盐溶液外，将其他组分在发酵罐中用蒸馏水溶解，121℃条件下，灭菌20分钟；
(3)葡萄糖单独灭菌，115℃条件下，灭菌20分钟；
(4)待发酵罐冷却至50℃左右时，加入MgCl2·6H2O溶液，微量盐溶液，混合后降温至37℃即得。
所述的高密度发酵方法如下：
A：种子培养阶段是将甘油管保藏的菌体，在无菌条件下接种至试管斜面，待长出单菌落后挑取一环接种至摇瓶培养基中过夜培养，经检测各项性能指标都正常的情况下，按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养4h，至OD600在1.1时，移种至发酵罐中。
B：发酵培养-补料阶段：发酵温度37℃，搅拌转速300-1000转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；当转速达到1000r/min时，固定在1000r/min，随着培养过程中养分的消耗，营养物质会逐渐减少，继续培养4h左右，开始缓慢流加补料培养基，使补料速度和溶氧联动，保持溶氧在20％以上，培养至对数生长期时，准备诱导。
C：诱导阶段：降温至25℃，加入诱导剂0.5mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，此时溶氧与补料联动，保持溶氧在10％以上，继续诱导培养4h左右放罐。
所述的高密度发酵方法，用30％氨水控制pH在7.0左右。
在发酵过程中，每隔1h取样，用752紫外可见分光光度计检测菌体密度，最后用BIO-RAD公司产的蛋白电泳仪和凝胶成像仪进行灰度扫描，检测目的蛋白含量。
实施例2高密度发酵TRIM72突变体蛋白
种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L；100mg/ml Ampilicillin1ml/L；
发酵培养基：按g/L计，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O5g/L，Na2HPO4·3H2O15g/L，2mMMgCl2·6H2O溶液1ml/L，微量盐溶液1ml/L，pH为7.0。
补料培养基：按g/L计，胰蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖300g/L。
所述用于重组人骨骼肌TRIM72突变体蛋白的种子培养基配制，按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分配制3L溶液，加入到5L种子罐中，121℃灭菌20min，冷却降温至37℃，待接种。
所述用于重组人骨骼肌TRIM72突变体蛋白的高密度发酵培养基的制备方法，配制30L培养基加入到50L发酵罐中，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)除葡萄糖、MgCl2·6H2O、微量盐溶液外，将其他组分在发酵罐中用蒸馏水溶解，121℃条件下，灭菌20分钟；
(3)葡萄糖单独灭菌，115℃条件下，灭菌20分钟；
(4)待发酵罐冷却至50℃左右时，加入MgCl2·6H2O溶液，微量盐溶液，混合后降温至37℃即得。
所述的高密度发酵方法如下：
A：种子培养阶段是将甘油管保藏的菌体，在无菌条件下接种至试管斜面，待长出单菌落后挑取一环接种至摇瓶培养基中过夜培养，经检测各项性能指标都正常的情况下，按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养4h，至OD600在1.1时，移种至发酵罐中。
B：发酵培养-补料阶段：发酵温度37℃，搅拌转速300-1000转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；当转速达到1000r/min时，固定在1000r/min，随着培养过程中养分的消耗，营养物质会逐渐减少，继续培养4h左右，开始缓慢流加补料培养基，使补料速度和溶氧联动，保持溶氧在20％以上，培养至对数生长期时，准备诱导。
C：诱导阶段：降温至25℃，加入诱导剂0.5mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，此时溶氧与补料联动，保持溶氧在10％以上，继续诱导培养4h左右放罐。
所述的高密度发酵方法，用30％氨水控制pH在7.0左右。
在发酵过程中，每隔1h取样，用752紫外可见分光光度计检测菌体密度，最后用BIO-RAD公司产的蛋白电泳仪和凝胶成像仪进行灰度扫描，检测目的蛋白含量。
实施例3原方法发酵TRIM72蛋白
原培养基配方：胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4g/L、KH2PO42.3g/L、K2HPO4·3H2O16.4g/L，pH为7.0；补料培养基：甘油。
培养基配制方法如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在发酵罐中用蒸馏水溶液中溶解胰蛋白胨、酵母粉、甘油；121℃，灭菌20分钟；
(3)KH2PO4、K2HPO4·3H2O溶液单独灭菌；
(4)冷却至50℃左右时，加入KH2PO4、K2HPO4·3H2O溶液，降温至37℃即得。
将大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72经过试管斜面活化、摇瓶培养、以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，溶氧控制在20％以上，培养温度37℃，当溶氧开始反弹时，开始缓慢加入补料培养基，培养至对数生长期时，加入诱导剂0.5mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，得TRIM72目的蛋白。
实施例4原方法发酵TRIM72突变体蛋白
原培养基配方：胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4g/L、KH2PO42.3g/L、K2HPO4·3H2O16.4g/L，pH为7.0；补料培养基：甘油。
培养基配制方法如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在发酵罐中用蒸馏水溶液中溶解胰蛋白胨、酵母粉、甘油；121℃，灭菌20分钟；
(3)KH2PO4、K2HPO4·3H2O溶液单独灭菌；
(4)冷却至50℃左右时，加入KH2PO4、K2HPO4·3H2O溶液，降温至37℃即得。
将大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72突变体，经过试管斜面活化、摇瓶培养、以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，溶氧控制在20％以上，培养温度37℃，当溶氧开始反弹时，开始缓慢加入补料培养基，培养至对数生长期时，加入诱导剂0.5mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，得目的蛋白。
结果分析：
表1高密度发酵方法与原发酵方法蛋白表达量比较
重复实验三批取平均值，与原培养基发酵工艺进行对比，实验结果如表1及图1所示，由结果可知，利用本发明所示培养基及其发酵工艺，可制得大量大肠杆菌重组菌菌体，在蛋白表达量相当的情况下，菌体得率提高到6倍以上，从而使得批得率提高到6倍以上。
以上仅是本发明的最佳实施例，本发明的培养基和方法包括但不限于上述实施例，本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，步骤如下：
(1)种子培养：将试管斜面活化后的BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72种子，接入摇瓶过夜培养后，接入种子罐，扩大培养至对数生长期，作为种子液；
(2)配制培养基：配制高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；
(3)发酵：以5％-10％的接种量将步骤(1)所得的种子液转接到步骤(2)的发酵培养基，50％-70％装液量的发酵罐中，保持溶氧在10％-50％，保持罐压为0-0.05Mpa，发酵温度为36-37℃，搅拌转速为300-1000rpm；
(4)补料：当培养至溶氧开始反弹时，开始加入补料培养基，控制补料速度与溶氧联动，溶氧控制在10％以上；
(5)诱导：当培养至一定阶段时，降温至20-30℃，一次性加入0.5-1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，诱导约4h时放罐。
2.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)的种子是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET22b(+)为载体，可用于高密度发酵人骨骼肌TRIM72蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)是按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养2-4h，至OD600在1.0-1.2时，移种至发酵罐中。
4.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)培养基的主要成分及其含量如下：胰蛋白胨10～20g/L、酵母粉20～30g/L、氯化钠0～1g/L、甘油2～8g/L、葡萄糖6～10g/L、KH2PO4·H2O 2～5g/L、Na2HPO4·3H2O 10～30g/L、2mM MgCl2·6H2O 0.5～2ml/L；
其中，优选胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1.0g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O 5g/L，Na2HPO4·3H2O 15g/L，2mMMgCl2·6H2O溶液1ml/L，微量盐溶液1ml/L，pH为7.0；
其中，微量盐溶液为：15ml浓盐酸加入适量的水稀释，依次加入ZnSO4·7H2O 0.71g、CuSO4·5H2O 0.4g、H3BO4 0.06g、MnSO4·H2O 0.8g、CaCl20.07g、Na2MoSO4·2H2O 1g、CoCl2·6H2O0.01g，定容至100ml，待彻底溶解后，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤；
其中，配制高密度发酵培养基的方法如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)除葡萄糖、MgCl2·6H2O、微量盐溶液外，将其他组分在发酵罐中用蒸馏水溶解，121℃条件下，灭菌20分钟；
(3)葡萄糖单独灭菌，115℃条件下，灭菌20分钟；
(4)待发酵罐冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的MgCl2·6H2O溶液，微量盐溶液，混合后降温至37℃即得。
5.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)是发酵温度37℃，搅拌转速300-1000转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；当转速达到1000r/min时，固定在1000r/min，随着培养过程中养分的消耗，营养物质会逐渐减少，继续培养2-4h。
6.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)中补料的主要组分及其含量为胰蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖300g/L。
7.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(5)是降温至25℃，加入诱导剂0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，此时溶氧与补料联动，保持溶氧在10％以上，继续诱导培养4h左右放罐。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，用30％氨水控制pH在7.0左右。
9.根据权利要求1-8所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述的高密度发酵方法可应用于BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72突变体种子，发酵TRIM72突变体蛋白。
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