CN107903257A - 一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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本发明属于荧光光谱检测分析技术领域，特别涉及一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法。该荧光探针包括花菁荧光基团和苯并噻唑基团，制备方法包括步骤：(1)向N,N‑二甲基甲酰胺中滴加三氯氧磷，后加入溴乙酸反应得产物Ⅱ；(2)2,3,3‑三甲基吲哚与碘乙烷反应得产物Ⅲ；(3)向产物Ⅱ和产物Ⅲ中滴加哌啶反应得产物Ⅳ；(4)产物Ⅳ与邻氨基苯硫酚在室温反应即得；本发明可视有机分子荧光探针在自然光下或紫外灯下都可看出明显的颜色变化，通过建立荧光强度和过氧亚硝酸根阴离子的线性关系，可以快速实现对过氧亚硝酸根阴离子的定性、定量检测；本发明荧光探针选择性好、灵敏度高，检测方法操作简单，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于荧光光谱检测分析技术领域，特别涉及一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法。
背景技术
活性氧自由基在生物体衰老与疾病，以及正常的免疫代谢与细胞信号传导等过程中都起着重要的生理作用。由于活性氧具有较强的反应活性，它们可以与许多不同的化合物发生化学反应，根据这些反应产物或者反应物的变化程度可以进行定性或定量分析。但到目前为止除了过氧化氢以外，其它活性氧的测定仍然是一项国际性难题，因此，它们已经吸引了来自化学、生物和医学领域的很多关注。过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)是NO·与O2·-相互反应的产物，并是较两者氧化作用更强、作用更为广泛的一种强效细胞毒性物质。过氧亚硝酸根阴离子可作用于酶、蛋白、脂质及DNA等大分子物质，参与机体的多种病理过程。因此，研究简便、灵敏、准确测定过氧亚硝酸根阴离子的方法是生命科学研究中的重要课题之一，对于深入研究各种疾病的病理及促进人体健康具有十分重要的意义。
近些年来，荧光传感技术已经越来越广泛地应用于阴离子、重金属、生物小分子以及一些有害气体的检测。与传统的分析检测方法相比，如分光光度法、色谱分析法和电化学分析法等，荧光光谱技术具有其独特的优点，如灵敏度高，选择性好，响应速度快，操作简便，最重要的一点是，荧光光谱技术可用于生物体内细胞成像及目标物的实时检测。目前已经开发的荧光探针主要包括有机分子，生物分子以及纳米材料等。探针分子可以简单地分为荧光基团、识别基团和被分析物三部分。荧光探针由于能够对目标物具有实时在线，以及空间分辨的检测能力，并且对样品损伤少等特点而越来越受到人们的重视。有机小分子荧光探针设计灵活，易于修饰，毒性较低，能够更快的渗透到细胞内，很容易满足人们的特殊检测要求，已成为荧光探针研究的热点之一。目前，用于检测过氧亚硝酸根阴离子的有机荧光探针有荧光素类、罗丹明类、氟硼荧(BODIPY)类及花菁类等。
文献Dan Yang,Hua-Li Wang,Zhen-Ning Sun,Nga-Wai Chung,and Jian-GangShen，Journal of the American Chemical Society,2006，128，6004-6005.报道了基于二氯荧光素(DCF)荧光基团建立的用于检测过氧亚硝酸根阴离子的荧光探针HKGreen-1，该探针与过氧亚硝酸根阴离子作用15min后产生绿色荧光，但其对于羟基自由基也有一定的响应，反应时间较长，特异性和灵敏性都有待提高。文献Jian Zhang,Yaping Li,JingjingZhao,Wei Guo，Sensors and Actuators B:Chemical,2016，237，67-74.报道了基于芳基硼酸盐设计的用于检测过氧亚硝酸根阴离子的荧光探针，该荧光探针与过氧亚硝酸根阴离子作用后产生绿色荧光，并将该探针应用于细胞内过氧亚硝酸根阴离子的检测时，背景荧光会产生干扰作用，影响检测时灵敏度。
花菁染料一般具有大的摩尔吸光系数和高的荧光量子产率，部分花菁的吸收光谱和发射光谱在近红外区，可以避免背景荧光干扰，其在生物体系中应用具有明显的优越性。在过氧亚硝酸根阴离子的氧化作用下，能够将花菁类染料氧化为对应的羟基吲哚，并淬灭花菁染料的荧光。
因此，提供一种响应速度快、检测灵敏度高、选择性好的荧光探针对过氧亚硝酸根阴离子的检测研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法，具体技术方案如下：
一种基于花菁可视有机分子荧光探针，所述荧光探针包括花菁荧光基团和苯并噻唑基团，结构如式Ⅰ所示化合物。
所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下具体步骤：
(1)在冰浴中向冷却的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中滴加三氯氧磷(POCl3)，保持温度低于5℃，除去冰浴，在室温下搅拌1h；然后加入溴乙酸，70℃加热24h；加入冰水终止反应同时萃取出溶解在水中的DMF，加入碳酸钠直至PH＝8、加入无水乙醇滤出无机盐、将有机滤液在旋转蒸发仪上蒸发除去溶剂、加入硫酸中和旋蒸得到的淡黄色残余物、萃取有机相、干燥，得到式Ⅱ所示化合物：
(2)将2,3,3-三甲基吲哚与碘乙烷溶于无水乙腈中，在氮气、电磁搅拌下油浴回流24h，将真空干燥除去溶剂后的紫色固体结晶纯化后，即得到式Ⅲ所示化合物：
(3)将式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物溶于无水乙醇，加入哌啶催化，通氮气、加热回流2h，旋转蒸发脱除溶剂、洗涤、连续萃取3次后收集有机层，干燥除去溶剂后，将固体在硅胶色谱柱上进行洗脱，结晶纯化得到式Ⅳ所示化合物：
(4)将式Ⅳ所示化合物与邻氨基苯硫酚溶于无水乙醇中，室温下搅拌12h，旋转蒸发脱除溶剂，然后经硅胶色谱柱洗脱得到式Ⅰ所示化合物，即为荧光探针。
具体反应如式1所示：
所述步骤(1)中溴乙酸、三氯氧磷、N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1:(2.8-2.9):10，萃取剂为一氯甲烷，干燥剂为硫酸镁。
所述步骤(2)中2,3,3-三甲基吲哚与碘乙烷的摩尔比为1:5，油浴温度为81℃，结晶纯化溶剂为乙醚。
所述步骤(3)中式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物、哌啶原料比为1mmol：2.2mmol：200μL，反应温度为78℃，洗涤剂为食盐水、萃取剂为二氯甲烷、干燥剂为无水硫酸钠、洗脱剂为体积比95:5的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
所述步骤(3)中结晶纯化具体为，旋蒸洗脱后的混合物以除去溶剂，将得到固体产物溶于二氯甲烷，室温下过滤除去溶解在甲醇中的硅胶，将残余物真空干燥并将固体产物溶解在乙醚中，加热至沸，冷却后析出晶体。
所述步骤(4)中式Ⅳ所示化合物与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1.2，无水乙醇5mL，洗脱剂为体积比40:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
所述荧光探针或所述制备方法制备的荧光探针可应用于可视化检测过氧亚硝酸根阴离子，具体地，将本发明有机分子荧光探针溶于乙醇中制备荧光探针储备液，在荧光检测时，将荧光探针储备液分散到50mmol/L，PH为7.0的磷酸盐缓冲液中，得到基于花菁可视的有机分子荧光探针溶液，加入不同浓度的过氧亚硝酸根阴离子进行可视化检测，在自然光或紫外光下观察探针颜色变化即可。
向配制的荧光探针溶液中加入含有过氧亚硝酸根阴离子的待测样品，随着待测样品浓度的不断增加，越来越多的荧光探针分子与过氧亚硝酸根阴离子发生反应，导致荧光探针的荧光强度逐渐发生改变，红色的荧光峰强度不断降低，而其他的活性氧和活性氮物种对探针的荧光强度不产生明显的影响。在自然光下，我们可以直接观察到荧光探针的颜色由蓝色变为无色；而在紫外灯的辅助下，通过肉眼可观察到过氧亚硝酸根阴离子加入前后，荧光探针的红色荧光强度明显降低。这种荧光强度的变化可作为过氧亚硝酸根阴离子定性检测的依据。建立荧光峰强度与过氧亚硝酸根阴离子浓度的线性关系，可以实现过氧亚硝酸根阴离子的定量检测；因此，本发明有机分子荧光探针溶液中加入过氧亚硝酸根阴离子后，本发明有机荧光探针的荧光强度发生明显的降低，并且其荧光强度变化与过氧亚硝酸根阴离子的浓度间呈现出良好的线性关系，因为可以实现目标物的定性定量检测。
本发明有机分子荧光探针对其他的活性氧如H2O2，ClO-，·OH和O2 ·-及活性氮如NO2 -,NO3 -都没有明显的响应，而对过氧亚硝酸根阴离子响应明显，在紫外灯下可以看出明显的荧光强度的变化，因此本发明有机分子荧光探针对过氧亚硝酸根阴离子有非常好的选择性。
本发明有机分子荧光探针以花菁基团为荧光基团，过氧亚硝酸根阴离子通过氧化作用，将花菁基团氧化为相应的羟基吲哚，使花菁基团的荧光强度逐渐降低；本发明的荧光探针，最大激发波长为630nm，最大发射波长为650nm。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用红色荧光的花菁基团和过氧亚硝酸根阴离子的氧化作用设计成淬灭型荧光探针可以实现可视地定性检测过氧亚硝酸根阴离子，本发明有机分子荧光探针在自然光或紫外灯下都可看出明显的颜色深浅的变化，只需在自然光或手提式紫外灯下就可以实现过氧亚硝酸根阴离子的定性检测，操作简单，方便快捷，效果显著；
(2)本发明荧光探针能有效避免样品中其他杂质的干扰，选择性好，样品不需要繁琐的预处理过程，检测效率高；过氧亚硝酸根阴离子的检测限达到了26nmol/L，灵敏度高；
(3)本发明提供的有机分子荧光探针作用时间短，探针稳定性好，选择性好，最大发射波长为650nm，发射红色荧光，有效的避免了背景荧光干扰，在生物体系中应用具有明显的优越性，对于探究过氧亚硝酸根阴离子在人体细胞中的致病机理具有重要意义。
附图说明
图1是本发明有机分子荧光探针的荧光光谱图；
图2是本发明有机分子荧光探针的光稳定性图；
图3是本发明有机分子荧光探针对溶液中过氧亚硝酸根阴离子的荧光响应变化图；
图4是加入过氧亚硝酸根阴离子前后的荧光峰强度比值(F/F0)和过氧亚硝酸根阴离子浓度之间的线性关系图；
图5是本发明有机分子荧光探针的选择性示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法，下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
图1是本发明有机分子荧光探针的荧光光谱图；从图1可以看出本发明有机分子荧光探针的最大激发波长为630nm，最大发射波长为650nm。
图2是本发明有机分子荧光探针的光稳定性图；从图2可以看出，在紫外灯连续扫描90分钟，本发明有机分子荧光探针的发射峰一直保持稳定的状态，荧光强度基本没有变化，因此，本发明有机分子荧光探针的稳定性非常好。
图3是本发明有机分子荧光探针对溶液中过氧亚硝酸根阴离子的荧光响应变化图；选择0-3.3μmol/L不同浓度的过氧亚硝酸根阴离子，置于有机分子荧光探针溶液中，利用荧光光谱仪测定荧光强度；图4是加入过氧亚硝酸根阴离子前后的荧光峰强度比值和过氧亚硝酸根阴离子浓度之间的线性关系图；图4是根据图3得出的线性关系，从图3、图4中可以看出，当激发波长为620nm时，随着过氧亚硝酸根阴离子浓度的增加，本发明有机分子的荧光探针的荧光发生明显的变化，650nm处的荧光强度逐渐降低，且加入过氧亚硝酸根阴离子前后的荧光强度比值(F/F0)与过氧亚硝酸根阴离子浓度之间的线性关系为y＝1.0604-0.49709x，R＝0.99228，即线性关系良好，可以精准定量检测过氧亚硝酸根阴离子的浓度。
图5是本发明有机分子荧光探针的选择性示意图；从图5中可以看出，其他物种与探针作用荧光强度没有明显的变化，因此本发明的有机分子荧光探针对过氧亚硝酸根阴离子具有良好的选择性。
实施例1
1、制备有机分子荧光探针，结构式如下：
(1)在50mL圆底烧瓶中，将0.147mol三氯氧磷(POCl3)滴加到0.518mol冷却至0℃的N，N-二甲基甲酰胺(DMF，C3H7NO)中，保持温度低于5℃，除去冰浴，将混合物在室温下搅拌1小时；加入0.051mol溴乙酸，将混合物在70℃加热24小时。反应后加入冰水终止反应同时萃取去除溶解在水中的DMF，加入大量碳酸钠直到pH＝8，加入无水乙醇滤出无机盐，将得到的有机滤液在旋转蒸发仪上蒸发至溶剂完全去除，用10mL、50％的H2SO4中和淡黄色残余物，用200mL CH3Cl萃取3次，用MgSO4干燥，除去溶剂后得到三甲酰甲烷，即化合物Ⅱ；
(2)将0.0125mol 2,3,3-三甲基吲哚和0.0625mol碘乙烷溶于50mL无水乙腈中，在氮气、81℃油浴条件下电磁搅拌24小时。反应完成后，在真空中除去溶剂。得到紫色固体产物，通过在乙醚中结晶纯化，得到3.87g、99％的1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓季铵盐晶体，即为化合物Ⅲ；
(3)将1mmol化合物Ⅱ和2.2mmol化合物Ⅲ溶于20mL无水乙醇中；加入200μL哌啶作为催化剂；在氮气氛围下，将混合物在78℃下加热2小时。冷却至室温后，浓缩混合物，除去溶剂；然后用100mL饱和盐溶液洗涤产物，并用50mL二氯甲烷(DCM)萃取3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，除去溶剂后，利用以体积比95:5的二氯甲烷和甲醇洗脱剂的硅胶色谱上纯化。通过除去溶剂获得的固体产物再溶于二氯甲烷中，然后在室温下过滤以除去溶解在甲醇中的硅胶；将残余物真空干燥并在乙醚中纯化即得到化合物Ⅳ。
(4)在氮气氛围下，将0.348mmol化合物Ⅳ和0.418mmol邻氨基苯硫酚溶于5mL乙醇中，将混合物在室温下搅拌12小时，旋转蒸发除去溶剂后，粗产物通过以体积比为40:1的DCM/甲醇洗脱剂的硅胶色谱法纯化后可得目标产物Ⅰ，即为荧光探针。
对目标产物Ⅰ进行质谱分析和核磁分析，得到以下数据：
质谱分析：ESI-MS：m/z(％):[M+H]+544.28；found 544.28。
核磁分析：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝12.0Hz,1H),8.15(s,1H),7.54(dd,J＝71.0,33.9Hz,6H),6.65(s,1H),4.56(s,7H),4.11(s,2H),2.71(s,7H),2.19–1.72(m,7H),1.36(d,J＝36.2Hz,6H).
2、定性、定量检测过氧亚硝酸阴根离子
利用上述制备有机分子荧光探针定性、定量检测细胞中过氧亚硝酸阴根离子；将上述制备得到的有机分子荧光探针8.3mg溶于7.625mL乙醇中制备荧光探针储备液，在荧光检测时，取4μL荧光探针储备液分散到2mL，50mmol/L，PH为7.0的磷酸盐缓冲液(PB)中，得到最终浓度为2μmol/L的荧光探针溶液；
利用配置的荧光探针溶液定性、定量检测细胞内过氧亚硝酸阴根离子浓度；在自然光下，可以直接观察到，荧光探针的颜色由蓝色变为无色，在紫外灯下，肉眼可观察到荧光探针的红色荧光强度明显降低；利用荧光光谱仪检测荧光探针和待测细胞混合溶液的荧光强度，根据图4所得线性关系，即可得知细胞中过氧亚硝酸阴根离子浓度。由此，利用实施例1制备的荧光探针，能够完成细胞内过氧亚硝酸阴根离子的定性、定量检测分析。
Claims (9)
1.一种基于花菁可视有机分子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括花菁荧光基团和苯并噻唑基团，结构如式Ⅰ所示化合物。
2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下具体步骤：
(1)在冰浴中向冷却的N，N-二甲基甲酰胺中滴加三氯氧磷，除去冰浴，在室温下搅拌1h；然后加入溴乙酸，70℃加热24h；加入冰水终止反应，萃取出N，N-二甲基甲酰胺、调节PH＝8、滤出无机盐、旋蒸、酸中和、萃取、干燥，得到式Ⅱ所示化合物：
(2)将2,3,3-三甲基吲哚与碘乙烷溶于无水乙腈中，在氮气、电磁搅拌下加热回流24h，真空干燥、结晶纯化后的晶体即为式Ⅲ所示化合物：
(3)将式Ⅱ所示化合物与式Ⅲ所示化合物溶于无水乙醇，加入哌啶，通氮气、加热回流2h，旋蒸、洗涤、萃取后收集有机层，经干燥、洗脱、结晶纯化得到式Ⅳ所示化合物：
(4)将式Ⅳ所示化合物与邻氨基苯硫酚溶于无水乙醇中，室温下搅拌12h，经旋蒸、洗脱得到式Ⅰ所示化合物，即为荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溴乙酸、三氯氧磷、N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1:(2.8-2.9):10，利用碳酸钠调节PH值，一氯甲烷萃取有机相，硫酸镁干燥。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中2,3,3-三甲基吲哚与碘乙烷的摩尔比为1:5，结晶纯化溶剂为乙醚。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物、哌啶比例为1mmol：2.2mmol：200μL，洗涤剂为食盐水、萃取剂为二氯甲烷、干燥剂为无水硫酸钠、洗脱剂为体积比95:5的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将所述步骤(3)中结晶纯化具体为，旋蒸洗脱后的混合物以除去溶剂，将得到的固体产物再溶于二氯甲烷，经室温过滤、真空干燥、在乙醚中结晶纯化。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中式Ⅳ所示化合物与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1.2，洗脱剂为体积比40:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
8.利用权利要求1所述荧光探针或权利要求2-7任一项所述制备方法制备的荧光探针在可视化检测过氧亚硝酸根阴离子中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，将过氧亚硝酸根阴离子置于基于花菁可视的有机分子荧光探针溶液中，在自然光或紫外光下观察探针颜色变化。
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Granted publication date: 20200911 Termination date: 20201116 |
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