CN107847556A - Prg4作为抗炎剂的应用 - Google Patents

Abstract

本文公开了使用PRG4糖蛋白，也已知为润滑素，通过CD44拮抗、调控促炎性细胞因子生产、抑制NF‑κB易位和/或促进诱发炎症的细胞或基质碎片或过敏原的移除，来减少、抑制或者下调处于炎症反应或过敏症状风险或者患有炎症反应或过敏症状的患者的促炎症通路的方法。

Description

PRG4作为抗炎剂的应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年1月26日提交的US临时申请序列号62/107,799以及2015年12月30日提交的临时申请序列号62/273,059的提交日的权益，该专利的全文作为参考并入本申请。

技术领域

本发明涉及一种人类糖蛋白PRG4或润滑素的新用途。更具体地，涉及一种使用PRG4作为抗炎剂以减少或抑制炎症反应并且治疗炎症状态。

背景技术

蛋白多糖4基因(PRG4)编码巨核细胞刺激因子(MSF)以及也已知为润滑素的“浅表层蛋白”的高度糖基化的不同的剪接变体和糖链异质体。浅表层蛋白最初位于来源于浅表层的外植体软骨的表面并且在条件培养基中被鉴别。润滑素最初是从滑液分离的，并且在体外展示与软骨-玻璃界面处和乳胶-玻璃界面中的滑液相似的润滑能力。其随后被鉴别为滑膜成纤维细胞的产物，并且其润滑能力被发现依赖于由外显子6编码的940氨基酸的大的类粘蛋白结构域中的O联β(1-3)Gal-GalNAc低聚糖。润滑素分子差异地糖基化并且已经报道了几个自然存在的剪接变体。本文将其统称为PRG4。除了其他部位，PRG4已经表现出在体内存在于的滑膜、肌腱、诸如半月板的关节软骨处的表面，以及在眼睛的保护膜中，并且在关节润滑和滑膜内稳态中起到重要作用。

在申请人的发明之前，PRG4已经被视为仅具有机械性质的蛋白质，提供诸如润滑关节、肌腱、软骨的机械功能，并且用作机械屏障以抑制细胞间的相互作用。然而，如本文所示，申请人已经发现润滑素具有延伸到其能力以外的性质以提供边界润滑和抗粘连。特别地，申请人已经确定PRG4具有抗炎性质，由于其能用作配体或者信号分子的能力，参与配体受体相互作用以调控例如CD44活化、NF-κB易位以及细胞因子介导的炎症。

发明内容

本发明开拓了先前未知的PRG4的抗炎性，PRG4也已知为润滑素。因此，本发明提供例如抑制或者降低炎症反应的方法和治疗炎症状态的方法。下文的PRG4的抗炎性的发现是基于PRG4通过其获得抗炎作用的各种假定机制的理解。这些机制被确定PRG4结合CD44受体使得其用作CD44受体拮抗物的申请人发现。结果，PRG4能够下调CD44受体信号介导的促炎症反应。PRG4影响CD44信号的能力也具有下调NF-κB的易位的作用。此外，PRG4的施用已经显示出抑制若干促炎性细胞因子的生产，并且调控由于促炎性细胞因子诱导(例如，TNF-a)的细胞响应和增殖；PRG4独有而诸如高分子量透明质酸的其他润滑剂没有的特征。因此，PRG4能够以若干新颖的方式在治疗和预防环境下使用，以通过其对产生炎症反应涉及的信号通路的作用而发挥抗炎作用。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低或抑制患者的炎症反应的方法，该方法包括对在非软骨的、非骨骼的、非骨性的、和非关节的、并且不是角膜、膀胱、或口腔的表面组织的部位(site)向所述患者全身地(systemically)或者局部性地(locally)施用PRG4。

在一个实施例中，PRG4通过静脉的、肌肉的、皮下的、腹膜内的、口服的、直肠的、口颊的或者舌下的施用或者通过吸入对所述患者全身地施用。

在本发明的另一个实施例中，包含PRG4的组合物能够通过将PRG4制剂为用于注射或者放置在患者的位置中的基质/骨架剂量形式而便利地向患者施用。这样的包含PRG4的组合物可以是能够在患者的位置缓慢释放PRG4的控释制剂的形式。合适的基质/骨架剂量形式包括但不限于生物相容性聚合物、聚合物基体、胶囊、微胶囊、微粒、扩散装置和脂质体。本发明的其他的这样的制剂包括在与基质配合的情况下或者在向患者施用时形成固体或者凝胶的液体。除了被制剂为包含PRG4的这样的组合物，这样的组合物也可以制剂为包含设计为表达PRG4的重组的工程细胞。包含PRG4的组合物可以以适于将PRG4引导至患者中的位置的任意方式施用，包括在开放式手术期间或者腹腔镜检查或者关节镜程序期间直接注射或放置预成形PRG4组合物。

在另一个实施例中，PRG4例如外敷地(topically)或者通过注射局部性地向患者施用。在一些实施例中，PRG4在选自皮肤、肾、肺、肝脏、诸如皮肤烧伤或手术切口的伤口、甲状腺、胰脏、脾、胸腺、卵巢、睾丸、子宫、肾上腺、脑垂体、下丘脑、尿道、前列腺、心、动脉或静脉、心包液、脑、胃的部位局部性地施用。施用也在包括直肠、鼻子、耳朵、咽、喉、气管的孔(orifice)中进行。其他的用于施用的区域包括舌头、后眼(posterior eye)、或者肿瘤的部位。施用也在visci(in visci)中进行，包括小肠、大肠、结肠或者食管。、咽、喉、气管、舌头、后眼或者肿瘤的部位。在一些实施例中，局部施用的部位是患者炎症或者炎症反应的部位。

在另一个实施例中，PRG4全身地施用至患有选自下列的炎症状态的患者：关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、视网膜炎症(retinalinflammation)、视网膜炎(retinitis)、舍格伦综合征、黄斑变性、痛风、假性痛风、心包炎、或者葡萄膜炎。

在另一个实施例中，PRG4全身地或者局部性地施用至患有选自下列的炎症状态的患者：痤疮、急性器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾迪生氏病、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应(allograft rejection)、斑秃、阿尔茨海默病、过敏性反应(anaphylaxis)、阑尾炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎(atopic dermatitis)、自体免疫疾病包括自体免疫性脱发、自体免疫性甲亢、自体免疫性垂体机能减退、自体免疫性多腺体疾病、贝赛特氏症、脑损伤、支气管炎、癌症、心肺旁路综合征、心肾综合征、乳糜泻、慢性光化性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾衰竭、结肠炎、接触性皮炎、克罗恩病、皮肌炎、糖尿病、湿疹、肺气肿、异物排斥反应(foreign body rejection)、青光眼、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、痛风、移植物抗宿主疾病(graft vs.host disease)、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、枯草热、肝肾综合征、超敏反应或过敏(hypersensitivity or allergy)、包涵体肌炎、由于病毒、真菌、寄生虫或者微生物侵袭引起的感染、炎性肠病、炎性肾病、由于热或化学暴露或照射(irridiation)引起的损伤、肠易激综合征、局部缺血、肺炎症(lung inflammation)、硬斑病、多发性硬化症、蕈样真菌病、心肌梗塞、坏死、非感染性肺损伤、胰腺炎、恶性贫血、肺炎(pneumonia)、多肌炎、前列腺炎、假性痛风、银屑病、掌跖脓疱病(Pustulosis palmoplantaris)、坏疽性脓皮症、呼吸道过敏、硬皮病、败血症、血清病、赛扎里综合征、皮肤过敏、中风、全身炎症反应综合征(SIRS)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、T-细胞介导的超敏反应疾病、移植排斥反应(transplantrejection)、包括源于枪弹伤、刀伤、交通事故、坠落(fall)、或者战斗的创伤、结核病、溃疡性结肠炎、心包炎、荨麻疹、以及白癫风。

在另一实施例中，患者的炎症反应与患者患有的炎症状态相关。

在又一实施例中，施用的PRG4是重组人PRG4。在另一个实施例中，PRG4具有SEQ IDNO:1减去信号序列的序列。在一个实施例中，PRG4以不足以对患者提供边界润滑(boundarylubrication)的量施用。在另一个实施例中，PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量施用，或者作为从PRG4溶液涂覆至组织表面的涂层施用，PRG4溶液包括例如10μg/mL至约2mg/mL的PRG4浓度。

在一个实施例中，可以通过患者促炎性细胞因子的生产水平测量炎症反应的减少或者抑制。例如，在一个实施例中，促炎性细胞因子选自由下列所组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17α、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、TNF-α、TNF-β(淋巴毒素-α)、淋巴毒素-β、CXC31L(膜结合型趋化因子，fractalkine)、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ、VEGF、MCP-1、MCP-3、EGF、GMCSF、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、TRAIL、FGF-2、GRO、MDC、Rantes、G-CSF、M-CSF、FGF-2、EPO、MCSF、MIP3α、MG-CSF、以及GCSF。

在另一方面中，本发明提供一种用于降低或抑制具有炎症状态的患者的炎症反应的方法，该方法包括对患者施用PRG4。炎症状态可以是本文提及的任意病况。

在一方面中，本发明提供一种通过对患者施用PRG4而降低或抑制患者的炎症反应的方法。PRG4的施用结合患者细胞上的CD44受体，降低或者抑制患者促炎性细胞因子的生产，和/或降低或者抑制患者细胞中NF-κB的易位并且从而降低或者抑制患者的炎症反应。

在另一个实施例中，PRG4在非软骨组织、非骨骼组织、非骨性组织、并且不是角膜、膀胱、或口腔组织处的细胞或附近的细胞局部性地施用至所述患者，以上组织是患者炎症的部位。

在又一实施例中，细胞是肥大细胞、脾细胞、肺细胞、肾细胞、脑细胞、心脏细胞、肝细胞、癌细胞、皮肤细胞、上皮细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、尿道细胞、血管细胞、神经细胞、胰细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、直肠细胞、胆囊细胞、干细胞、或者甲状腺细胞。

在又一实施例中，PRG4全身地施用至患者以接触滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、视网膜细胞、角膜缘细胞、小梁网细胞、角膜细胞、结膜细胞、眼部细胞(ocular cell)、或者眼科细胞(ophthalmic cell)。

在又另一个实施例中，无论PRG4局部性地还是全身地施用，其以不足以对患者提供边界润滑的量施用。例如，在一个实施例中，PRG4以0.1μg/kg-4,000μg/kg范围内的量施用。

在又一实施例中，PRG4的施用降低或者抑制选自由以下所组成的组中的促炎性细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、IFN-γ、TNF-α、IL-1α、IL-1β、MCP-1、EGF、FGF-2、膜结合型趋化因子、IFN-α2、GRO、MCP-3、MDC、EPO、IL-13、IL-18、MCSF、MIP-3α、MG-CSF、IL-7、IL-5、G-CSF、Rantes、IL-17α或者IL-12p70。

在另一方面中，本发明提供一种抑制激活配体与存在于表面上的CD44的结合的方法。该方法包括将表面暴露于足以结合CD44并且抑制配体的结合的浓度的PRG4。根据一个实施例，PRG4以足以结合CD44但不足以提供边界润滑的量存在于表面。在另一个实施例中，表面是哺乳动物的细胞膜，并且在另一个实施例中表面位于表面等离子体共振检测器中。在又另一个实施例中，PRG4是rhPRG4(重组人PRG4)或者nhPRG4(天然人PRG4)。

在又一实施例中，表面在人类受试者中。在另一个实施例中，PRG4全身地施用。在另一个实施例中，PRG4外敷地向患者施用。在又另一个实施例中，PRG4，例如rhPRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量施用于人类受试者。在另一个实施例中，PRG4，例如rhPRG4以每剂量1-100μL的小体积以0.1μg/mL至30mg/mL的量施用。在另一个实施例中，PRG4以每剂量100μL-4L的体积以10μg/mL至4mg/mL的量施用，例如作为灌肠剂。

在一个实施例中，当表面在人类受试者中时，该人患有骨代谢紊乱，并且将受体暴露于PRG4降低或者抑制破骨细胞分化。在又一实施例中，该人患有炎症状态。示例性炎症状态已经在上文中列出。在一个实施例中，将受体暴露于PRG4，例如rhPRG4降低炎症或者炎症状态的位置的促炎性细胞因子的水平。

根据一个实施例，细胞是滑膜细胞、肥大细胞、脾细胞、肺细胞、肾细胞、脑细胞、心脏细胞、眼细胞、肝细胞、癌细胞、皮肤细胞、上皮细胞、或者内皮细胞。在又一实施例中，细胞是具有风湿性关节炎的受试者的滑膜细胞、糖尿病患者的胰细胞、哮喘患者的肺细胞、具有眼部感染、烧伤或者其他刺激作用的受试者的眼部细胞；具有结核病或其他肺部感染或损伤或病况的受试者的细支气管或者肺泡上皮细胞；囊胞性纤维症受试者的肺细胞；具有结肠炎或者克罗恩病的人的下端肠上皮细胞；具有银屑病的受试者的皮肤细胞、具有痤疮的受试者的皮肤细胞；激光消融治疗后的受试者的皮肤细胞、或者具有败血症的受试者的内皮细胞。在又另一个实施例中，细胞是T细胞，而在另一实施例中，细胞是淋巴细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、癌细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或者内皮细胞。

根据一个实施例，将表面暴露于PRG4，例如rhPRG4拮抗CD44的促炎症配体。在一个实施例中，配体是透明质酸(HA)、透明质酸-血清衍生的透明质酸相关蛋白复合物(hyaluronan serum-derived hyaluronan-associated protein complex)(HA-SHAP)、或者基质金属蛋白酶9(例如MMP-9)。在另一个实施例中，配体是血液结合素、EMMPRIN、生长调节素B、骨桥蛋白(osteopontin)、OKT3、或者诸如C3a、CD3、CD46的补体相关蛋白质。

在另一方面中，本发明提供一种降低或抑制例如人类受试者的血液中促炎性细胞因子的方法。该方法包括以足以减少或抑制促炎性细胞因子水平的量全身地施用PRG4的步骤。示例性促炎性细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、IFN-γ、TNF-α、IL1-α、IL-1-β、MCP-1、EGF、FGF-2、膜结合型趋化因子、IFN-α2、GRO、MCP-3、MDC、EPO、IL-13、IL-18、MCSF、MIP-3α、MG-CSF、IL-7、IL-5、G-CSF、Rantes、IL-17α或者IL-12p70。

在再一方面中，本发明提供抑制细胞中NF-κB易位的方法。该方法包括用PRG4接触包含NF-κB的细胞的步骤，其中PRG4结合至细胞表面受体以抑制NF-κB信号通路的激活。在又一实施例中，PRG4抑制细胞表面上的TNF-α受体或者IL-1受体。

在又另一个实施例中，细胞在与PRG4接触时在人类中。在又一实施例中，细胞是滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞，而在又另一个实施例，细胞是脾细胞、肺细胞、肾细胞、脑细胞、心脏细胞、脑细胞、肝细胞、上皮细胞、或者内皮细胞。

附图说明

图1A-C是示出在450nm由TMB-ELISA检测的证明重组人蛋白多糖4(rhPRG4)、高分子量透明质酸(HMW HA)、以及中等分子量透明质酸(MMW HA)结合至重组人CD44受体的数据。数据表示每组三个复孔(triplicate wells)的4次独立实验的平均值。图1A描绘了rhPRG4、HMW HA、MMW HA和玻璃体结合蛋白结合至CD44-IgG1Fc和使用IgG1Fc。星(*)表示CD44-IgG1Fc孔中的450nm吸收率统计上显著地高于(p<0.001)rhPRG4、HMW HA和MMW HA的IgG1Fc孔。图1B示出rhPRG4、HMW HA和MMW HA的浓度依赖的CD44结合。CD44与rhPRG4的结合显著高于HMW HA或者MMW HA(p<0.001)。两星(**)表示CD44与rhPRG4的结合显著高于MMWHA(p<0.001)。图1C描绘rhPRG4(5μg/mL)和HMW HA或者MMW HA任一(0.01μg/mL至50μg/mL)之间与96孔ELISA板上包被的CD44结合的竞争。星(*)表示HMW HA+rhPRG4孔中结合的CD44的百分率显著低于rhPRG4孔(p<0.05)；(**)表示MMW HA+rhPRG4孔中结合的CD44的百分率显著低于rhPRG4孔(p<0.05)。

图2A-B描述使用表面等离子体共振测试重组人蛋白多糖4(rhPRG4)与重组CD44的结合和rhPRG4与高分子量透明质酸(HMW HA)在CD44结合上的竞争。图2A是描绘了浓度依赖的rhPRG4(300μg/mL至50μg/mL)与固定CD44-IgG₁Fc的联合与分离的感应图(sensogram)。虚线曲线代表rhPRG4与CD44嵌合蛋白的结合曲线，并且黑线代表拟合的1:1结合模型。图2B是示出HMW HA结合的相对响应与rhPRG4结合的相对响应的比较。rhPRG4和HMW HA之间与固定CD44-IgG₁Fc的结合的竞争。rhPRG4以300(1)、250(2)、200(3)、150(4)、100(5)、50(6)和0(7)μg/mL注入。在rhPRG4解离之后，HMW HA以50μg/mL注入。随着rhPRG4浓度提高，随后HMWHA与CD44的结合降低。

图3A-B示出重组人蛋白多糖4(rhPRG4)的唾液酸酶A和O糖苷酶消化对rhPRG4和CD44的结合的影响。数据表示每组三个复孔的4次独立实验的平均值。图3A是描绘rhPRG4、唾液酸酶A消化的rhPRG4、O糖苷酶消化的rhPRG4和唾液酸酶A+O糖苷酶消化的rhPRG4与CD44的结合的柱状图。不同组中的450nm吸收率值按照未消化的rhPRG4组的吸收率值归一化。(*)表示唾液酸酶A消化的和O糖苷酶消化的rhPRG4中的CD44结合显著高于未消化的rhPRG4(p<0.01)。(**)表示唾液酸酶A+O糖苷酶消化的rhPRG4中的CD44结合显著高于唾液酸酶A消化的、O糖苷酶消化的和未消化的rhPRG4(p<0.01)。图3B是rhPRG4、唾液酸酶A消化的rhPRG4、O糖苷酶消化的rhPRG4和唾液酸酶A与O糖苷酶消化的rhPRG4的SDS-PAGE的照片。凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。用唾液酸酶A和O糖苷酶消化导致rhPRG4的表观分子量降低。

图4A-B显示重组人蛋白多糖4(rhPRG4)和高分子量透明质酸(HMW HA)处理对细胞因子诱导的风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞(RA-FLS)的增殖的影响。数据表示每种处理的三个复孔的3次独立实验的平均值。图4A是描绘通过rhPRG4和HMW HA抑制细胞因子诱导的RA-FLS增殖的柱状图。(#)表示细胞因子刺激的RA-FLS具有与未处理的细胞相比显著更高的吸收率(p<0.001)。(*)表示IL-1β刺激的RA-FLS的rhPRG4(40和80μg/mL)或者HMWHA(40和80μg/mL)处理与未处理的IL-1β刺激的细胞相比显著地降低细胞增殖(p<0.05)。(**)表示rhPRG4(20、40和80μg/mL)处理与未处理的TNF-α刺激相比显著地降低细胞增殖(p<0.05)。图4B是描绘在IM7、一种CD44特异性抗体的存在或不存在的情况下，通过rhPRG4和HMW HA抑制细胞因子诱导的RA-FLS增殖的柱状图。(#)表示细胞因子刺激的RA-FLS具有与未处理的细胞相比显著更高的吸收率(p<0.001)。(*)表示rhPRG4或者HMW HA处理与未处理的IL-1β或者(rhPRG4或者HMW HA)+IM7处理相比具有显著降低的细胞增殖(p<0.05)。(**)表示rhPRG4处理与未处理的TNF-α或者rhPRG4+IM7处理相比具有显著降低的细胞增殖(p<0.05)，该结果未被HMW HA重复。图4C是描绘RA-FLS中TNF-α诱导的NF-κB核易位的rhPRG4抑制。TNF-α+rhPRG4组中NF-κB的核易位显著低于仅TNF-α或者TNF-α+rhPRG4+IM7组(p<0.001)。用rhPRG4或者NF-κB易位抑制剂MG132的处理与TNF-α处理的RA-FLS相比显著减少NF-κB核易位。

图5A-C描述促炎性细胞因子对Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞增殖的影响和rhPRG4的作用。图5A示出使用抗CD44抗体(IM7)(绿色)和DAPI(蓝色)的Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞免疫细胞染色的荧光显微照片。Prg4-/-滑膜细胞中增强的绿色荧光表示与Prg4+/+滑膜细胞相比增加的CD44定位。图5B示出描绘细胞因子诱导的Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞的增殖的柱状图。IL-1β诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖显著地高于IL-1β诱导的Prg4+/+滑膜细胞的增殖(p<0.001)和TNF-α诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖(p＝0.002)。TNF-α诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖显著地高于TNF-α诱导的Prg4+/+滑膜细胞的增殖(p<0.001)。图5C示出在IM7存在或不存在的情况下，rhPRG4处理对细胞因子诱导的Prg4-/-滑膜细胞增殖的影响的柱状图。(#)表示细胞因子刺激的Prg4-/-滑膜细胞与未处理的细胞相比具有显著更高的吸收率(p<0.001)。(*)表示IL-1β刺激的Prg4-/-滑膜细胞的rhPRG4处理与未处理的IL-1β或者rhPRG4+IM7处理相比显著地减少细胞增殖(p<0.001)。(**)表示TNF-α刺激的Prg4-/-滑膜细胞的rhPRG4处理与未处理的TNF-α或者rhPRG4+IM7处理相比显著地减少细胞增殖(p<0.001)。

图6是全长(未截短的)人PRG4(SEQ ID NO:1：1404残基)的氨基酸序列。残基1-24(加粗表示的)表示信号序列并且残基25-1404表示人PRG4的成熟序列。糖蛋白不要求引导序列处于活化型。

图7是编码全长1404AA人PRG4蛋白的PRG4基因(SEQ ID NO:2)的核酸序列。

图8A-B示出脂多糖的施用如何上调炎性细胞因子的生产。图8A是示出测量的在用盐水(对照)挑战(challange)和用脂多糖挑战后全血样本中存在的每个细胞因子的水平。各种细胞因子的浓度表示重复测定的平均值并且表示为pg/mL(ng/L)。百分比变化在图8B中示出为柱状图并且基于LPS刺激的结果与盐水对照组的结果的比较。

图9A-B示出润滑素的施用如何下调炎性细胞因子的生产。图9A是示出测量的在用盐水(对照)挑战和用润滑素挑战后全血样本中存在的每个细胞因子的水平。各种细胞因子的浓度表示重复测定的平均值并且表示为pg/mL(ng/L)。每个单个细胞因子的百分比变化是基于润滑素补充的样品与盐水对照组的比较，并且在图9B中以柱状图示出。

图10A-B示出润滑素的施用如何抑制LPS介导的炎性细胞因子产生。图10A是示出测量的在用LPS和用LPS与润滑素挑战后全血样本中存在的每个细胞因子的水平。各种细胞因子的浓度表示重复测定的平均值并且表示为pg/mL(ng/L)。每个单个细胞因子的百分比变化是基于仅LPS与用润滑素补充的LPS的比较，并且在图10B中以柱状图示出。

图11A-B示出润滑素的施用如何抑制TNF-α介导的炎性细胞因子产生。图11A是示出测量的在用TNF-α和用润滑素与TNF-α挑战后全血样本中存在的每个细胞因子的水平。各种细胞因子的浓度表示重复测定的平均值并且表示为pg/mL(ng/L)。每个单个细胞因子的百分比变化是基于仅TNF-α与用润滑素补充的TNF-α的比较，并且在图11B中以柱状图示出。

图12A-B示出润滑素的施用如何抑制组织因子(TF)介导的炎性细胞因子产生。图12A是示出测量的在用TF和用润滑素与TF挑战后全血样本中存在的每个细胞因子的水平。各种细胞因子的浓度表示重复测定的平均值并且表示为pg/mL(ng/L)。每个单个细胞因子的百分比变化是基于仅TF与用润滑素补充的TF的比较，并且在图12B中以柱状图示出。

图13是示出与接受手术但术后施用盐水而不是润滑素的对照小鼠相比，术后接受重组人润滑素的关节内施用的测试小鼠中采集的血清样本中的EPO、IL-13、IL-10、IL-18、IL-1α、IL-2、MCSF、IL-1β、IL-4、IFN-γ、MIP-3α、GMCSF、IL-7、TNF-α、VEGF、MCP-1、IL-5、G-CSF、RANTES、IL-6、GRO、IL-17α以及IL-12p70的水平的图表。

图14A-B是示出当暴露于重组人润滑素时骨关节炎和正常人滑膜细胞表达的细胞因子的水平的柱状图。图14A示出FGF-2浓度，图14B示出IL-1Ra浓度。

图15证明重组人蛋白多糖4(rhPRG4)的关节内施用对单钠尿酸盐(MSU)晶体诱导的公Lewis大鼠的缩足压力(PWT)变化的影响。使用电子Von Frey仪器测量缩足压力，并且数据以从基线值的百分比变化表示。

具体实施方式

本文公开的本发明是基于先前未知和未认识到的PRG4的抗炎性的发现，PRG4也已知为润滑素。本发明利用PRG4的抗炎性以提供PRG4的若干新的治疗和预防用途。例如，本发明提供抑制或者降低炎症反应的方法和治疗炎症状态的方法。

虽然炎症反应对于抵御感染和疾病是必要的，但是许多炎症状态是过度的、恶劣的(rogue)和无保证的(unwarranted)炎症反应的结果。这样的情形例如，自身免疫状况、过敏反应、慢性炎症状态、以及败血症。虽然在一些情况下，炎症可能形成慢性疼痛或者不适并且导致生活的低质量，但是在其他情况下，例如在具有败血症的情况下，炎症可能是危及生命的。因此，PRG4能够用作抗炎剂的发现，例如，用于缓解过度的、恶劣的和无保证的炎症，提供了治疗慢性或急性炎症状态和调节、降低或抑制相关炎症的水平的保证。

PRG4蛋白

PRG4，也称作润滑素，是一种润滑多肽，其在人体中由巨核细胞刺激因子(MSF)基因表达，也已知为PRG4(见NCBI登录号AK131434-U70136)。润滑素是无处不在的内生糖蛋白，其覆盖身体的关节表面。润滑素是高度表面活性的分子(例如保持在水上)，其主要用作强力细胞保护的、抗粘和边界润滑剂。分子具有位于末端蛋白结构域之间的长、中央类粘蛋白结构域，其使得分子粘附并保护组织表面。在所有调查的哺乳动物中，其天然形式包含与KEPAPTT(SEQ ID NO:3)至少50％相同的氨基酸序列的多个重复体。天然的润滑素典型地包括该重复的多个冗余形式，其典型地包括脯氨酸和苏氨酸残基，在大多数重复中具有至少一个糖基化的苏氨酸。苏氨酸锚定O联糖侧链对润滑素的边界润滑功能非常重要。侧链组成部分典型地为β(1-3)Gal-GalNAc组成部分，β(1-3)Gal-GalNAc典型地由唾液酸或者N-乙酰神经氨酸封端。多肽也包括N联低聚糖。编码天然存在的全长润滑素的基因包含12个外显子，并且天然存在的MSF基因产物包含1,404个氨基酸(包括分泌序列)，其中多个多肽序列与包括类血红素和类生长调节素结构域的玻璃体结合蛋白同源。位于中心的外显子6包含940个残基。外显子6编码重复的富O糖基化的类粘蛋白结构域。

润滑素的蛋白质骨架的氨基酸序列取决于人MSF基因的外显子的选择性剪接而不同。当研究人员由中央粘蛋白结构域形成缺失474个氨基酸的润滑素的重组形式时例证了对异质性的鲁棒性，但是仍然获得了虽然减弱(muted)但合理的润滑性(Flannery et al.,Arthritis Rheum2009；60(3):840-7)。PRG4已经表现出不仅作为单体存在，并且也作为通过N和C端两者出的保守富半胱氨酸区域二硫键合的二聚体和多聚体。卢布里斯有限责任公司(Lubris,LLC)已经研发了人润滑素的全长重组形式。使用Selexis中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-M)表达分子，通过与SDS三醋酸盐3-8％聚丙烯酰胺凝胶的分子量标准比较估计，其具有450-600kDa的最终表观分子量，多分散多聚体通常测量为1,000kDa以上。在全部糖基化中，约一半包括两个糖单元(GalNAc-Gal)，并且一半为三个糖单元(GalNAc-Gal-唾液酸)。该重组人PRG4的生产方法在国际专利申请No.PCT/US014/061827中公开。

各种天然和重组PRG4蛋白和异构体的任意一个以上可以在本文描述的各种实施例中使用。例如，美国专利No.6,433,142、6,743,774、6,960,562、7,030,223、和7,361,738公开了如何制造人PRG4表达产物的各种形式，每一种都作为参考并入本申请。优选在本发明的实践中使用由CHO细胞表达的全长、糖基化、重组PRG4或者润滑素。该蛋白质包括1,404个氨基酸(见图6；SEQ ID NO:1)，该1,404个氨基酸包括中央的外显子，其包括利用O联β(1-3)Gal-GalNAc低聚糖不同地糖基化的序列KEPAPTT(SEQ ID NO:3)的重复，并且该1,404个氨基酸包括与玻璃体结合蛋白同源的N端和C端序列。分子是多分散的，个别分子的糖基化模式不同，并且分子能够包括单体、二聚体和多聚体物种。

如本文所述的，术语“PRG4”与术语“润滑素”可交换使用。广义地，这些术语是指任意功能性分离或纯化的天然或者重组PRG4蛋白、同源体(homolog)、功能性片段、异构体、和/或其突变体。所有有用的分子包括由外显子6编码的序列或者其同源体或截短版本，例如，在中央的类粘液素KEPAPTT重复区域具有较少重复的版本，优选为还具有O联糖基化。所有有用的分子还包括至少外显子1-5和7-12编码的序列的生物活性部分，即用于赋予分子与ECM和内皮表面亲和性的序列的生物活性部分。在某些实施例中，优选的PRG4蛋白具有50kDa和500kDa之间的平均摩尔质量，优选为224至467kDa之间的平均摩尔质量，包括PRG4蛋白、或者诸如润滑片段的功能性片段、或者其同源体的一个以上生物活性部分。在更多的优选实施例中，PRG4蛋白包括220kDa至约280kDa之间的平均摩尔质量的单体。

用于诸如PRG4蛋白的蛋白质的分离、纯化、以及重组表达的方法在现有技术中是已知的。在某些实施例中，方法开始于使用标准分子生物学技术，诸如PCR或者RT-PCR，克隆和分离编码PRG4蛋白或者异构体的mRNA和cDNA。分离的编码PRG4蛋白或者异构体的cDNA然后被克隆至表达载体中，并且在宿主细胞中表达以生产重组PRG4蛋白，并且从细胞培养上清液分离。生产重组人PRG4的方法在国际专利申请No.PCT/US014/061827中提供。

之前PRG4的功能几乎完全与摩擦的减少和关节头之间的磨损的预防以及诸如眼睛的表面和眼皮之间的界面组织的润滑相关。PRG4在关节养护中的功能地位已经由导致屈曲指-关节炎-髋内翻-心包炎(camptodactyly-arthropathy-coxa vara-pericarditis)(CACP)病综合征的突变体展示。CACP显示为屈曲指、非炎性关节病、以及肥大性滑膜炎，伴随髋内翻变形、心包炎、以及胸腔积液。另外，在零PRG4小鼠中，观察到软骨退化和随后的关节故障。因此，PRG4表达是健康滑膜关节的必要构成。然而，根据申请人的知识，如本发明中描述的诸如PRG4蛋白的全身边界润滑剂作为抗炎剂的应用在之前并未被提出。

PRG4作为抗炎剂

PRG4的抗炎性的发现是基于PRG4通过其获得抗炎作用的各种假定机制的观察。PRG4产生抗炎作用的一种机制涉及CD44。申请人发现PRG4结合CD44受体，使得其用作CD44受体拮抗物。结果，PRG4能够下调CD44受体信号介导的促炎症反应。

CD44是糖蛋白和具有通过选择性剪接和糖基化产生的各种异构体的在炎症中起到主要作用的主要的细胞表面受体(Cutly et al.,J Cell Biol 1992；116(4):1055-62)，并且涉及各种细胞-细胞相互作用、肿瘤转移、以及淋巴细胞活化。CD44在大量的哺乳动物的细胞类型中表达并且其表达水平在细胞类型和其活化状态之间变化。癌细胞或肿瘤细胞也可以表达CD44并且CD44在这样的细胞中的存在表示其参与癌扩散的调节。在人类中，CD44由1号染色体上的CD44基因编码。通过CD44的信号作用(signaling)诱导T细胞增殖和IL-2生产、NK细胞毒活性的剂量依赖效应的增强、以及细胞因子和趋化因子的巨噬细胞生产、以及其他的功能。

CD44已确立的配体是高分子量透明质酸(HMW HA)，其中HMW HA结合至与其他HA结合蛋白具有同源性的CD44中的胞外基序，导致随后的HMW HA的胞内摄取(Knudson et al.,Matrix Biol 2002；21(1):15-23；Harada et al.,J Biol Chem 2007；282(8):5597-607；Tibesku et al.,Ann Rheum Dis 2006；65(1):105-8)。在骨关节炎的实验模型中，软骨细胞CD44表达随着疾病发展而增加，并且关节软骨中CD44的表达可能与人类疾病严重度相关(Fuchs et al.,J Orthop Res 2004；22(4):774-80；Zhang et al.,Mod Rheumatol 2013；23(6):1186-91)。HA/CD44相互作用在各种病况中是普遍的。结肠上皮细胞产生的癌易于在富HA微环境中发展，其中上皮肿瘤细胞上的CD44受体活化酪氨酸激酶介导的细胞存活通路，导致不受抑制的细胞分裂和增殖(Misra S et al.Connect Tissue Res.2008；49(3):219-24)。内皮细胞上的CD44用作向抗原激活的T淋巴细胞上的CD44呈递HA，从而介导一种滚动相互作用，其指导炎症部位的白细胞聚集(Johnson P et al.Inflamm Allergy DrugTargets.2009Jul；8(3):208-20)，例如在肾缺血再灌注模型中，肾脏毛细血管内皮细胞的快速CD44上调介导中性粒细胞聚集并且弱化肾脏功能和形态，然而CD44缺乏独立于表达的趋化因子的水平而减少中性粒细胞的流入(Rouschop KMA et al.J Am Soc Nephrol2005；16:2034-43)。

CD44的作用能够根据细胞类型、炎症状态和部位特异性而变化。例如，CD44缺乏被发现加重大肠杆菌诱导的而不加重S.肺炎诱导的肺炎中的炎症，提示CD44-HA依赖的相互作用可以限制而非增加对大肠杆菌的炎症反应(Wang Q et al.Am J Pathol.2002Dec；161(6):2219-28)。

其他CD44配体包括细胞外基质成分，例如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白(Naoret al.,Adv Cancer Res 1997；71:241-319；Knudson et al.,Cell Mol.Life Sci.2002；59:36-44)、HA、基质金属蛋白酶9、HA-血清衍生透明质酸相关蛋白复合物(HA-SHAP)、血液结合素、EMMPRIN、生长调节素B、骨桥蛋白、OKT3、或者补体相关蛋白(诸如C3a、CD3、CD46)。

如下文实施例1示出的数据所示，润滑素-CD44相互作用表现出糖蛋白具有其边界润滑和机械性质之外的功能。事实上，实施例1A-D示出润滑素作为配体，结合CD44。因此，由于润滑素结合CD44，所以润滑素可以用作CD44拮抗物以防止CD44与诸如透明质酸的配体的结合，该结合导致通过CD44的促炎症信号作用。此外，由于这些展现出的抗炎性，润滑素被认定为用于治疗炎症状态、降低或抑制炎症并且降低或抑制炎症反应的试剂。

申请人发现的PRG4通过其提供抗炎作用的另一种机制是通过下调NF-κB的易位。NF-κB是控制DNA转录的蛋白质复合物，其对细胞存活很重要，并且在调控对感染的免疫反应中发挥关键作用，并且进而调控细胞因子生产。NF-κB通常位于几乎所有动物的细胞类型的细胞质中，并且当被诸如压力(stress)、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化的LDL、和细菌性或病毒性抗原的刺激诱导时，迁移至核。NF-κB的不当调控已经与癌症、炎症和自身免疫性疾病、败血性休克、病毒性感染、以及不适当的免疫发育关联。NF-κB信号通路一直被认为是原型的促炎症通路。NF-κB信号作用的激活通过三个可识别的通路中的一个经一系列步骤而触发：经典的(canonical)、非经典的以及非典型的IκK独立通路。在未激活状态下，NF-κB结合至IκK。激活信号(例如，与TNF-α、IL-1α、LPS、CD40、淋巴毒素、UV、HER2/Neu、H₂0₂、或者其他配体的结合)导致IκK的磷酸化并触发其降解。然后，自由的未结合的NF-κB能够移位至核并且激活例如促炎性细胞因子、趋化因子和粘附分子的转录。

如下文实施例1F所示，润滑素的施用能够减少在风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞模型中的NF-κB易位。明显地，PRG4对NF-κB易位的影响由PRG4至少对CD44的影响介导，如实施例1F中的数据所示。基于这些数据，PRG4被指定为抗炎剂并且也被指定为治疗炎症状态、降低或抑制炎症、并且降低或抑制炎症反应的试剂。PRG4也被指定为能够通过减少NF-κB的易位而改善的任意病情的治疗。这包括炎症状态，因为NF-κB是涉及由先天性和适应性免疫系统两者产生的许多促炎性细胞因子的表达的调控的转录因子。

申请人也观察到了润滑素通过未知的机制通过抑制或者下调若干促炎性细胞因子的生产而实现其抗炎作用。如下文实施例2和3中公开的数据所示，润滑素下调促炎性细胞因子的生产，并且因此具有抗炎作用。该作用通过脂多糖(LPS)介导的炎性细胞因子产生、TNF-α介导的炎性细胞因子产生、以及组织因子(TF)介导的炎性细胞因子产生而证明。因此，已经通过若干不同途径证实了润滑素对促炎性细胞因子生产的作用。

润滑素也能够通过其作为抗粘/润滑剂的功能而实现其抗炎作用。申请人已经观察到在承受机械压力的细胞中的线粒体能够变形，扰乱其功能，并且导致反应性氧化产物的生产、细胞死亡、以及局部的细胞碎片生产，并且导致局部炎症。这样的机械受压的细胞中或者这样的机械受压的细胞附近存在的润滑素的润滑作用，以减轻细胞和其线粒体上的机械压力的程度，也抑制局部炎症的发展。

由于其抗炎性，润滑素相应地作为泛免疫调节剂和作为抗炎剂对通过例如降低或抑制促炎性细胞因子生产而减少或抑制炎症反应是有用的。因此，润滑素被认定为用于治疗炎症状态、降低或抑制炎症、并且降低或抑制炎症反应的试剂。

因此，通过这些作用模式，PRG4具有下调炎症反应中涉及的各种信号通路的能力并且因此作为抗炎剂是有用的。如本文所述，PRG4的施用被指定为用于治疗许多炎症状态和疾病以及与那些病况相关的炎症。

PRG4作为抗炎剂的应用

由于本文公开的PRG4的抗炎性，PRG4被指定用于之前未认识到的新用途。特别地，PRG4被指定作为抗炎剂使用并且也被指定为用于治疗炎症状态和降低或抑制炎症。

在一方面中，本发明提供一种用于通过对患者施用PRG4而降低或抑制患者的炎症反应的方法。在一些实施例中，患者可能已经患有炎症状态。在其他实施例中，患者可能处于发展炎症发作的风险中，例如在承受复发或者慢性炎症状态时。

在一些实施例中，“治疗”患者可以涉及防止病况恶化，而在另一些实施例中，其可以涉及缓解或者降低或抑制与病况相关的炎症。在再其他实施例中，“治疗”可以是指降低患者的一个以上促炎性细胞因子的水平。

在又另一方面中，本发明提供一种通过对患者施用PRG4而降低或抑制患者的炎症反应的方法，其中PRG4在非骨性的、非软骨的、非眼睛的、非骨骼的、非骨性的、以及非关节的部位或者在膀胱、角膜、或口腔表面组织之外的部位施用至患者。因此，PRG4局部性和直接地施用至骨或软骨组织、眼睛前表面、关节头(articulating joint)、膀胱、或嘴部不属于本文要求保护的主题的范围。

在又另一方面中，本发明提供一种降低或抑制患者炎症反应的方法，其中该方法涉及对患者施用PRG4，其结合患者细胞上的CD44受体、降低或者抑制患者促炎性细胞因子的生产、或者降低或者抑制患者细胞中NF-κB的易位。结果，患者体验到炎症反应的减少或者抑制。

虽然患者优选为人类，但是患者也可以是任意哺乳动物，例如马、牛、猪、大鼠、小鼠、狗、或者猫。

虽然润滑素在体内自然地产生，但是当外源性润滑素施用至患者时也观察到本发明的效果。因此，在一个实施例中，施用至患者的PRG4是外源性人润滑素，而在另一个实施例中，施用至患者的PRG4是重组人润滑素(rhPRG4)。在另一个实施例中，rhPRG4具有SEQ IDNO:1的序列。

在一个实施例中，PRG4以不足以提供边界润滑的量施用。因此，根据本发明的施用润滑素的治疗有效量在0.1μg/kg至4,000μg/kg、或者0.1μg/kg至1,000μg/kg、或者0.1μg/kg至100μg/kg、或者0.1至50μg/kg的范围内。在另一个实施例中，通过例如涂覆至组织表面而以0.1μg/mL至30mg/mL、或者1μg/mL至10mg/mL、或者10μg/mL至1mg/mL的量施用润滑素。在一些实施例中，以每剂量1至100μL的小体积施用润滑素。在一些实施例中，以100μL至4L的大体积施用润滑素作为灌肠剂。在进一步的实施例中，以不超过60μg/mL的浓度施用润滑素。

施用的润滑素的量取决于诸如炎症的水平或者部位、待治疗的病况的程度、患者的整体健康、药物剂型、以及施用途径的变量。为了快速达到期望的血液水平或者组织水平，能够将初始剂量增加得超过上限水平(upper level)。可替换地，初始剂量能够小于最有效剂量，并且剂量可以在治疗过程期间逐渐增加。最佳的剂量能够通过常规确定。

为了施用，润滑素优选为与药学上可接受的载体组合。如本文所述的，“药学上可接受的载体”是指使用在与人类和动物组织接触中使用而没有过多毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症，具有相当的合理的效益/风险比的缓冲液、载体、以及赋形剂。载体在与制剂的其他成分兼容的意义上应该是“可接受的”并且对接受者无毒性。药学上可接受的载体包括与药物使用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延缓剂等。载体也可以包括诸如基质、水凝胶、聚合物、组织支架、以及包括胶原海绵的可吸收载体材料的生物材料。这样的药物活性物质的介质和试剂的使用是现有技术已知的。能够通过药物领域已公知的方法制备有用的制剂。例如，见Remington’s Pharmaceutical Sciences,18thed.(Mack Publishing Company,1990)。适用于肠胃外施用的配方成分包括：诸如注射用水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他的合成溶剂的无菌稀释剂；诸如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯的抗菌药物；诸如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如EDTA的螯合剂；诸如醋酸盐、柠檬酸盐或者磷酸盐的缓冲剂；以及诸如氯化钠或者葡萄糖的用于调节张力(tonicity)的试剂。用于施用的润滑素能够以剂量单位形式存在并且能够通过任意适当方法制备并且应当制剂成与其预期的施用途径兼容。

本发明设想PRG4可以全身地或者局部性地施用至患者。在炎症反应位于特定组织或器官的情况下保证(warrant)局部施用并且通过例如能够注射或者局部施用进入所述组织或器官。然而，本发明的一些实施例也设想了全身的施用。当炎症反应是局部的但是局部施用不可行或者另有要求时，可以保证全身的施用。全身的施用也可以在炎症反应不定位在患者的一个区域中而是在患者中到处被发现或者在患者的超过一个位置被发现时，保证全身的施用。此外，因为促炎性细胞在患者的循环系统中穿行，所以全身的施用是施用的最佳模式以在例如败血症的治疗中确保PRG4有最大的机会与促炎性细胞相互作用并且阻碍促炎性细胞的活性。

因此，在本发明的一个实施例中，润滑素全身地施用以实现减少或者抑制炎症反应或者治疗炎症状态。例如，润滑素可以以肠内方式，诸如口服的、直肠的、舌下的、唇下的、或者口颊的递送全身地施用。在另一个实施例中，润滑素可以以胃肠外的方式，诸如鼻的、通过吸入的、静脉的、肌肉的、皮下的、皮内的、腹膜内的、或者透黏膜的递送全身地施用。

在另一个实施例中，润滑素局部性地施用以实现炎症反应的减少或者抑制或者治疗炎症状态。例如，润滑素可以外敷地或者通过局部注射至身体组织或器官而局部性地施用并且可以向特定身体组织或器官、其内部、或者周围提供润滑素的涂覆。根据本发明的一个实施例，当局部性地施用PRG4时，其在一个位置并且在非软骨的、非骨性的、非骨骼的、和非关节的、并且不是角膜、口腔、或膀胱的组织处、周围、上或者附近中施用。例如，在一个实施例中，PRG4不局部性地施用至角膜或者周围组织或者软骨的、骨的、或者关节头或者组织。在另一个实施例中，PRG4不局部性地施用至膀胱或者嘴部。然而，在另一个实施例中，PRG4例如外敷地或者通过注射局部性地施用至眼后区域、至皮肤、肾、肺、肝脏、伤口或手术切口、甲状腺、胰脏、脾、胸腺、卵巢、睾丸、子宫、肾上腺、脑垂体、下丘脑、尿道、前列腺、心、动脉或静脉、脑、或者胃。施用也在包括直肠、鼻子、耳朵、咽、喉、气管的孔中进行。其他的用于施用的区域包括舌头、后眼、或者肿瘤的部位。施用也在visci中进行，包括小肠、大肠、结肠或者食管。在一些实施例中施用的部位可以是炎症的位置，而在其他实施例中，施用的部位可以以容易施用为目的而选择。

在又一实施例中，润滑素通过注射到甲状腺中或甲状腺处局部性地施用至甲状腺以治疗痛风相关的炎症。在另一个实施例中，润滑素通过注射或者外敷用药至部位而局部性地施用至外伤或者组织损伤诸如伤口或手术切口的部位。在另一个实施例中，润滑素通过外敷施用局部性地施用至皮肤。

为了在本发明的实践中使用，PRG4可以以1μg/mL至1,000μg/mL，并且更优选为100-500μg/mL的范围的浓度制剂至例如悬浮在磷酸盐缓冲液中的载体中。适当的载体包括生理盐水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或者磷酸盐缓冲液(PBS)，可选地与诸如聚山梨醇酯的表面活性剂混合。载体应当在制造和存储条件下是稳定的，并且应当抗微生物地保存。载体能够是包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液态聚乙二醇)、和其适当的混合物的溶剂或者分散介质。

施用的时机取决于各种因素和待治疗的病况。例如，在一个实施例中，润滑素用于治疗与慢性疾病相关的炎症的施用可以是每日、每周、每两周、每日两次或者每月的施用。在另一个实施例中，治疗与急性疾病相关的炎症可以要求在固定周期内例如经由静脉滴注持续地施用润滑素。

在一个实施例中，炎症反应是急性炎症反应。因此，在一个实施例中，根据本发明治疗的炎症状态或者患者患有的炎症状态与以下相关或由其导致：感染，例如病毒、细菌、真菌、寄生虫感染或者暴露于感染相关的微生物毒素；坏死，例如由局部缺血、外伤、物理或化学损伤、热损伤或者照射导致的；异物，诸如碎片、污物、异体组织、或者缝合线或者其他医学植入体；或者由于诸如导致过敏性炎症的过敏的超敏反应导致的免疫反应。在另一个实施例中，根据本发明治疗的炎症状态或者患者患有的炎症状态与以下相关或由其导致：慢性炎症反应，诸如诸如结核病或者溃疡的持续性损伤或者感染；持续暴露于毒素；过敏或自身免疫状况。一些慢性炎症状态包括糖尿病、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、肺部疾病(例如结核病)、关节炎(例如，痛风、骨关节炎)、自身免疫疾病(例如，多发性硬化症、风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻等)、以及神经疾病。

可以由本发明的方法治疗的炎症状态包括但不限于：痤疮、急性器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾迪生氏病、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应、斑秃、阿尔茨海默病、过敏性反应、阑尾炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自体免疫性脱发、自体免疫疾病、自体免疫性甲亢、自体免疫性垂体机能减退、自体免疫性多腺体疾病、贝赛特氏症、脑损伤、支气管炎、癌症、心肺旁路综合征、心肾综合征、乳糜泻、慢性光化性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾衰竭、结肠炎、接触性皮炎、克罗恩病、皮肌炎、皮肌炎、糖尿病、糖尿病视网膜病变、湿疹、肺气肿、异物排斥反应、青光眼、肾小球肾炎、痛风、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、枯草热、肝肾综合征、超敏反应或过敏、包涵体肌炎、由于病毒、真菌、寄生虫或者微生物侵袭引起的感染、炎性肠病、炎性肾病、由于热或化学暴露或照射引起的损伤、肠易激综合征、局部缺血、肺炎症、黄斑变性、硬斑病、多发性硬化症、蕈样真菌病、心肌梗塞、坏死、非感染性肺损伤、骨关节炎、胰腺炎、恶性贫血、肺炎、多肌炎、前列腺炎、假性痛风、银屑病、银屑病性关节炎、掌跖脓疱病、坏疽性脓皮症、呼吸道过敏、视网膜炎症、视网膜炎、风湿性关节炎、硬皮病、败血症、血清病、赛扎里综合征、舍格伦综合征、皮肤过敏、中风、全身炎症反应综合征(SIRS)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、T-细胞介导的超敏反应疾病、移植排斥反应、包括源于枪伤、刀伤、交通事故、坠落、或者战斗的创伤、结核病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、葡萄膜炎、心包炎、或白癫风。

在一些实施例中，关节或者骨骼的炎症状态以及眼睛的炎症状态可以通过PRG4的全身的施用和降低或抑制眼睛、关节、软骨和骨骼的组织中的炎症反应而治疗。这样的炎症状态包括但不限于黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎、和关节炎，包括骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎和风湿性关节炎。

在一些PRG4与细胞上的CD44受体结合的实施例中，细胞可以是白血细胞(即，白细胞)诸如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞、或者树突状细胞；肾上腺细胞；脑细胞；癌细胞；心脏细胞；软骨细胞；结肠细胞；结膜细胞；角膜细胞；树突状细胞；内皮细胞；上皮细胞；成纤维细胞；胆囊细胞；胃细胞；肝细胞；免疫细胞诸如肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞或者巨噬细胞；肠细胞；白细胞；角膜缘细胞；肺细胞；淋巴细胞；巨噬细胞；肥大细胞；肌肉细胞；神经细胞；眼部或者眼科细胞；成骨细胞；破骨细胞；胰细胞；直肠细胞；肾细胞；视网膜细胞；脾细胞；干细胞；滑膜细胞；胸腺细胞；甲状腺细胞；小梁网细胞；尿道细胞；或者血管细胞。然而，这个列表不是限制性的。

在一些PRG4施用降低或者抑制细胞中NF-κB易位的实施例中，细胞可以是白血细胞(即，白细胞)诸如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞或者树突状细胞；肾上腺细胞；脑细胞；癌细胞；心脏细胞；软骨细胞；结肠细胞；结膜细胞；角膜细胞；树突状细胞；内皮细胞；上皮细胞；成纤维细胞；胆囊细胞；胃细胞；肝细胞；免疫细胞诸如肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞或者巨噬细胞；肠细胞；白细胞；角膜缘细胞；肺细胞；淋巴细胞；巨噬细胞；肥大细胞；肌肉细胞；神经细胞；眼部或者眼科细胞；成骨细胞；破骨细胞；胰细胞；直肠细胞；肾细胞；视网膜细胞；脾细胞；干细胞；滑膜细胞；胸腺细胞；甲状腺细胞；小梁网细胞；尿道细胞；或者血管细胞。然而，这个列表不是限制性的。

在一些PRG4结合细胞上的CD44受体或者PRG4施用降低或者抑制细胞中NF-κB易位实施例中，当细胞是滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、视网膜细胞、角膜缘细胞、小梁网细胞、角膜细胞、结膜细胞、眼部细胞、或者眼科细胞时，PRG4全身地施用至所述患者。

在又一实施例中，其生产被润滑素的施用抑制或减少的促炎性细胞因子是：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17α、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、TNF-α、TNF-β(淋巴毒素-α)、淋巴毒素-β、CXC31L(膜结合型趋化因子)、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ、VEGF、MCP-1、MCP-3、EGF、GMCSF、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、TRAIL、FGF-2、GRO、MDC、Rantes、G-CSF、M-CSF、FGF-2、EPO、MCSF、MIP3α、MG-CSF、或者GCSF。在又一实施例中，润滑素的施用降低或者抑制一个以上、两个以上、或者三个以上或者四个以上上述的促炎性细胞因子的水平。

在一个实施例中，减少或者抑制促炎性细胞因子的生产可以通过润滑素施用之后从患者采样的体液样本中细胞因子的下限水平(lower level)与润滑素施用之前的水平相比较来确认。例如，体液样本可以是血液或者血浆。鉴于润滑素对给定的细胞因子水平的影响不能在润滑素施用的情况下立刻测量，所以可以在润滑素初始使用后过数小时、数天或者数周观察到减少或者抑制。

在另一方面中，本发明提供一种抑制配体与存在于表面上的CD44的结合的方法。根据该方法，表面暴露于润滑素并且润滑素结合至CD44并抑制配体的结合。

在一个实施例中，表面可以是表达CD44的细胞的表面，诸如哺乳动物的细胞的表面。在另一个实施例中，表面在表面等离子体共振检测器中。在又另一个实施例中，细胞的表面在人体内。

根据一个实施例，表达CD44的细胞包括白血细胞(即，白细胞)诸如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞或者树突状细胞；上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、肥大细胞、肌细胞、肺细胞、肾细胞、肝细胞、脑细胞、脾细胞、尿道细胞、血管细胞、神经细胞、胰细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、直肠细胞、眼部或者眼科细胞、胆囊细胞、以及干细胞。

在另一个实施例中，表达CD44的细胞是肿瘤或者癌细胞。在一个实施例中，癌细胞包括乳腺癌细胞、结肠癌细胞、子宫内膜癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、舌癌细胞、胰腺癌细胞、非小细胞性肺肿瘤细胞、头颈癌细胞、前列腺癌细胞、子宫癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、胆囊癌细胞、肛门癌细胞、骨肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、横纹肌肉瘤细胞、神经纤维肉瘤细胞、胃肠道间质瘤细胞、血管瘤细胞、纤维肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、以及脑癌细胞。

在方法的一个实施例中，被PRG4抑制与表面上存在的CD44结合的配体可以是透明质酸(HA)、透明质酸-血清衍生的透明质酸相关蛋白复合物(HA-SHAP)、基质金属蛋白酶9、细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞间介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、生长因子、或者激素。

在该方法的一个实施例中，以不足以提供边界润滑的量提供润滑素。申请人已经确定润滑素对CD44结合的作用能够以远低于实现边界润滑所需的浓度的浓度实现。因此，在一个实施例中，润滑素以0.1μg/kg-4,000μg/kg范围内的量施用。在一个实施例中，润滑素全身地施用，即静脉、皮下、或者肌肉注射地施用润滑素，尽管其可以局部性地施用。

在一个实施例中，表达CD44的细胞是哺乳动物的细胞，并且在另一个实施例中，细胞是人类细胞。本发明可以在若干情形下应用以治疗涉及CD44结合配体和/或由配体激活的疾病和病理状况。

证据表明CD44信号参与癌症的发展并且也干扰特定化疗药物的有效性。例如，其已经显示出能够由于CD44与HA接触而导致多发性骨髓瘤对通过地塞米松、一种化学疗法的治疗的抗性(Ohwada et al.,Eur J Heamatol 2008；80:245)。因此，在一个实施例中，润滑素能够用于结合至癌细胞表面上的CD44以抑制参与癌细胞生长、存活、发展和代谢活动的CD44信号。在另一个实施例中，润滑素施用至具有癌症的患者或者处于发展癌症风险中的患者，以治疗癌症或者减缓肿瘤的生长或发展。根据另一个实施例，润滑素可以与癌症的化疗或放疗治疗同时施用。因此，在一个实施例中，润滑素施用至具有癌症的患者，其中施用润滑素以治疗癌症，或者其中润滑素与另一抗癌药物或疗法联合施用以治疗癌症。在一个实施例中，癌症在人类受试者中。

在另一个实施例中，癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS癌、基底细胞皮肤癌、乳癌、卡斯特雷曼氏症、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、尤文氏肿瘤家族、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃癌、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌(kidneycancer)、喉癌及下咽癌、白血病、肺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性间皮细胞瘤、梅克尔细胞癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、神经内分泌癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、肾癌(renal cancer)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤鳞状细胞癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、或者威尔姆氏瘤。

CD44也参与糖尿病的发展，并且证据表明阻断CD44能够提供降血糖作用。HA在胰脏的胰岛细胞中发现并且HA与胰岛细胞上的CD44的结合导致胰岛细胞的炎症和破坏导致形成胰岛素依赖型糖尿病。因此，在一个实施例中，本发明提供一种通过向具有糖尿病或者处于发展糖尿病风险中的患者施用润滑素而预防或者治疗糖尿病的方法。在另一个实施例中，润滑素以足以结合CD44的浓度接触胰细胞，从而抑制或者降低胰脏中CD44和HA的相互作用。

在另一个实施例中，PRG4可以用于治疗诸如克罗恩病或者结肠炎的炎性肠病。在这样的情况下，通过简单的吞咽(ingestion)、灌肠剂、饲管、G管、J管或者结肠造口术将PRG4的浓缩液引入胃肠道。在吞咽的情况下，PRG4可以封装到药片、外壳(enclosure)或胶囊中，优选为能生物降解的药片、外壳或胶囊，其中药片、外壳或胶囊由在暴露于患者的胃肠道中存在的病况时降解或者分解的物质制成。这样的口服制剂可以存在作为缓释递送系统的聚合体中。口服制剂在药物递送技术中是公知的并且本领域技术人员可以选择适合的例如药片、外壳或胶囊用于PRG4的吞咽递送。

在另一个实施例中，PRG4可以用于治疗中风、栓塞或者外伤(trauma)导致的脑损伤。为了治疗脑损伤，将在脑损伤后，在中风、栓塞或者外伤后的有限的时间段中静脉注射PRG4的浓缩液。可替换地，在脑手术期间PRG4可以置于所述手术期间的脑内的位置。这样的组合物向脑的施用设计成稳定血管、限制血管渗透并且也提供抗炎作用。

在另一个实施例中，PRG4可以用于减少与过敏和/或呼吸道感染相关的症状。这样的症状举例而言包括充血、鼻后滴流、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、喉咙痒、皮肤痒、以及眼睛痒流泪。在本发明的实施例中，通过一种用于治疗展现这样的症状或者处于发展这样的症状的风险中的患者的方法，包括向患有过敏症状或者处于发展过敏症状的风险中的患者身体的表面，例如皮肤或者呼吸道(例如上呼吸道)施用足以改善症状的量的包含PRG4的组合物。本实施例的方法可以包括向患者的鼻子和鼻窦的粘膜表面鼻内地放置足以改善过敏和/或上呼吸道感染症状中的至少一个的量的包括PRG4的鼻腔组合物。在一个实施例中，包含PRG4的鼻腔组合物作为鼻喷雾施用。

过敏是一种炎症，包括诸如过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎和几种眼部过敏疾病的固疾的适应性免疫反应。其特征在于对抗原挑战的Th2介导的体液应答。在典型的I型超敏性过敏反应中，初次暴露于过敏原导致B细胞产生结合至肥大细胞/嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体，使那些细胞对过敏原敏感。后续暴露于相同抗原导致肥大细胞的直接脱粒并且随后释放组织胺、前列腺素、白细胞三烯(LTC4、LTD4、LTE4)、趋化因子(CXCL8、CXCL10、CCL2、CCL4、CCL5)、蛋白酶(类胰蛋白酶、糜酶)和诸如IL-4、IL-5、以及IL-13的细胞因子(Janeway et al.,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease.5thedition.New York:Garland Science 2001；Larchéet al.,Nat Rev Immunol.2006；6(10):761-71)。这些效应分子导致过敏反应相关的常见症状中产生的小血管扩张，增加血管通透性，产生大量粘液以及平滑肌的局部收缩。几个小时后，过敏反应晚期观察到嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2淋巴细胞在反应的部位聚集。嗜酸性粒细胞释放一系列颗粒蛋白，诸如嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞过氧化酶和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素，还释放一系列反应性氧物种(过氧化物)，其用于通过氧化应激和核糖核酸酶活性以清理该区域。在对入侵生物体有毒的同时，嗜酸性粒细胞反应还破坏(disrupt)过敏反应附近的宿主细胞。

一旦已经建立组织损伤的正反馈循环和炎性细胞聚集，慢性炎症状态可以持续，甚至在没有持续暴露于原始过敏原的情况下(Murdoch JR,Lloyd CM.ChronicInflammation and Asthma.Mutat Res.2010；Aug7；690(1-2):24-39.doi:10.1016/j.mrfmmm.2009.09.005.Epub 2009Sep19)。特别地，慢性炎症伴随组织重塑，其导致受损害的(compromised)上皮屏障功能、基质金属蛋白酶表达和黏液腺增生，以及TGF-β介导的纤维症(Murdoch et al.)。例如，在慢性哮喘中，嗜酸性粒细胞介导的损伤的重复周期和随后成纤维细胞的基质合成导致增厚的、变窄的、弹性更小的气道，而气道重塑(remodeling)直接地与慢性紊乱关联(Murdoch et al.)。值得注意的是主流的哮喘治疗方法旨在减轻炎症(皮质类固醇)，在改善重塑上展现有限的效果(Murdoch et al.；Ward C,Walters H.,CurrOpin Allergy Clin Immunol.2006；Feb；5(1):43-8)。这样的异常组织重塑和TGF-β介导的纤维症也可以被发现与患者中部位处的重复手术相关。

因此，在本发明的实施例中，包含PRG4的组合物对经历慢性过敏反应的组织的施用将得益于提高过敏原清除和通过雾化的PRG4的吸入而减轻炎症。这样的组合物的边界润滑能力也防止黏液颗粒粘附到上皮、并且改善水合作用，因为多电荷PRG4分子是吸湿性的并且沿着上皮细胞的界面保水。由于包含PRG4的组合物的使用后组织表面润滑提高，所以随着微粒(包括大量粘液素、碎片和过敏原)与上皮之间的摩擦减少，过敏原的机械清除将要求更少的力。利用低摩擦力，通过例如气流和黏膜纤毛清除(呼吸系统)的机械清除将要求更小的力并导致更小的组织损伤和炎症。包含PRG4的组合物向患有慢性过敏的患者的施用将通过预防成纤维细胞粘附和移动的而导致纤维症缓解，其将减少减少整体纤维化反应。

不希望受限于理论，本发明的该方面部分基于以下认识：与免疫失调或者慢性的暴露于过敏原相关的后遗症可以由抗原、PAMP和DAMP的受损的机械清除，以及与重复的重塑相关的受损害的组织功能所导致。润滑素能够促进过敏原或者细胞碎片的机械清除。这些过程不仅加强炎症，并且也导致对组织的长期损伤，不论是对呼吸道、眼部或者皮肤，并且相信的是正反馈循环状况是相似的。

进一步证据表明CD44-HA相互作用可能导致脾肿大，一种常与糖尿病相关的病况。因此，本发明的一个方面提供一种用润滑素接触脾以防止脾的炎症和肿大的方法。在另一个实施例中，润滑素以足以结合CD44的浓度接触脾细胞，从而降低脾的肿大和炎症。

CD44也存在于滑膜组织中并且在具有风湿性关节炎的患者中上调。已经示出在从人类风湿性关节炎患者获得的滑液中表达CD44的滑膜细胞结合至HA-SHAP。形成的复合体的量与炎症程度正相关。这由实施例4所示的数据证明。因此，全身施用的润滑素被指定为用于减轻患有风湿性关节炎的患者的炎症的治疗。在一个实施例中，润滑素全身地施用至具有风湿性关节炎的患者以阻断CD44上调的影响并减少炎症。在一个实施例中，润滑素经由静脉途径周期性地施用。在另一个实施例中，润滑素经由外置便携泵通过留置皮下导管递送。

CD44-HA相互作用也可以在血脑屏障和眼前段免疫病理学处转运有害白细胞中发挥关键作用(Xu H,et al.Journal of Leukocyte Biology2002；72(6):1133-41)，以及在青光眼中发挥关键作用，在青光眼中发现了可溶解CD44水平与视野缺损严重度之间显著相关(Mokbel TH et al.,Clin Experiment Ophthalmol.2010Aug；38(6):560-5)。在一方面中，rhPRG4施用至眼睛以拮抗CD44和阻断HA相互作用。在一个实施例中，注射的rhPRG4减轻炎症并能改善血流和视网膜细胞的存活能力。在另一个实施例中，注射到眼部中的rhPRG4防止原发性开角型青光眼中CD44介导的小梁网状组织的阻塞，导致降低眼内压。在另一个实施例中，rhPRG4阻止体液中可溶CD44活化，防止可溶CD44的细胞毒性。在另一个实施例中，rhPRG4拮抗跨膜CD44，阻断胞外域金属蛋白酶分裂，并且防止可溶CD44增加。在另一个实施例中，注射入眼部内的润滑素降低视觉后遗症诸如飞蚊症、视力模糊、以及与后葡萄膜炎相关的闪光幻觉。在另一个实施例中，注射到眼部内的润滑素通过防止低分子量HA分解产物相互作用的联合而阻断CD44和RHAMM介导的血管生成和内皮细胞迁移。其他的实施例包括将润滑素注射或者局部用药至眼部用于防止非CD44介导的黄斑变性、视网膜炎、视网膜血管炎、脉络膜视网膜炎、新血管形成和糖尿病视网膜病变的发展。例如，针对局部的眼科环境，润滑素以每剂量小体积(1-100μL)以0.1μg/mL至30mg/mL的量施用。

在本发明的又另一个实施例中，使用如上所述的方法和组合物，rhPRG4可以用于治疗非CD44介导的眼病。在这样的情况下，将润滑素注射或者局部用药至眼部可以用于防止非CD44介导的黄斑变性、视网膜炎、视网膜血管炎、脉络膜视网膜炎、新血管形成和糖尿病视网膜病变的发展。

在另一方面中，本发明提供一种降低或抑制身体中促炎性细胞因子水平的方法，该方法包括以足以抑制或减少促炎性细胞因子水平的量全身地、吸入地或者外敷地施用PRG4。在一个实施例中，方法降低或者抑制一个促炎性细胞因子的水平，而在另一个实施例中，方法降低或者抑制多于一个促炎性细胞因子的水平。本申请已经通篇公开了示例性的导致炎症反应的炎症状态、损伤、以及自身免疫状况，所述炎症反应导致血液中促炎性细胞因子水平的增加，并且待进行根据本发明的治疗的患者患有所述炎症反应。

根据一个实施例，其生产可以被润滑素的施用抑制或减少的细胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17α、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、TNF-α、TNF-β(淋巴毒素-α)、淋巴毒素-β、CXC31L(膜结合型趋化因子)、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ、VEGF、MCP-1、MCP-3、EGF、GMCSF、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、TRAIL、FGF-2、GRO、MDC、Rantes、G-CSF、M-CSF、FGF-2、EPO、MCSF、MIP3α、MG-CSF、或者GCSF。

在一个实施例中，血液是人类血液。在又一实施例中，血液是正在经历炎症状态或者病况的人类患者的血液。在一个实施例中，炎症反应或者病况是组织损伤的结果，而在另一个实施例中，是自身免疫状况的结果，在又一个实施例中，炎症反应是细菌或病毒感染或者存在毒素的结果。在又另一个实施例中，患者患有败血症或者处于败血症的风险。

在又一实施例中，人类细胞是免疫细胞诸如肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞、或者巨噬细胞；上皮细胞；内皮细胞；成纤维细胞；滑膜细胞；软骨细胞；破骨细胞；成骨细胞；心脏细胞；肥大细胞；肺细胞；肾细胞；肝细胞；脑细胞；脾细胞；膀胱或者尿道细胞；血管细胞；神经细胞；胰细胞；胃细胞；肠细胞；结肠细胞；直肠细胞；视网膜细胞；角膜缘细胞；小梁网细胞；角膜细胞；结膜细胞；眼部或者眼科细胞；胆囊细胞；或者癌细胞。

在一个实施例中，润滑素以不足以提供边界润滑的量施用，即以0.1μg/kg至4,000μg/kg的范围内的量施用。在另一个实施例中，润滑素以0.1μg/mL至30mg/mL的量施用并且以每剂量1至100μL的小体积施用。在另一个实施例中，以每剂量100μL至4L的量施用润滑素。在一个实施例中，润滑素通过全身的施用提供至人类患者。

在特定实施例中，细胞是患有败血症或者处于发展败血症风险的患者，败血症由例如暴露于病毒或细菌毒素，诸如LPS、鞭毛蛋白等而导致。因此，在一个方面中，润滑素被指定为用于败血症的治疗。

在进一步的方面中，本发明提供一种通过使细胞与PRG4接触而抑制细胞中NF-κB易位的方法，其中PRG4抑制NF-κB信号通路的激活。在一个实施例中，PRG4提供结合至CD44或者降低或抑制CD44信号或者与其他细胞表面结合受体互相作用而间接抑制NF-κB易位。可以根据本文描述的本发明的实施例施用PRG4，包括全身的施用。细胞可以是人类细胞，并且特别地可以是本文针对本发明描述的任意示例性人类细胞。

在又一实施例中，PRG4介导的NF-κB易位的减少或者抑制的结果导致血液中促炎性细胞因子水平的降低并且从而可以用于炎症状态的治疗。本申请通篇已经描述了示例性炎症状态。

实施例1PRG4拮抗CD44并且抑制CD44介导的炎症途径的实验证据

为了评价人蛋白多糖4和CD44受体之间的相互作用以及此相互作用对促炎性细胞因子诱导的滑膜细胞增殖的影响，进行下列实验。

使用直接酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振评估结合至CD44并且与高分子量透明质酸(HMW HA)竞争的rhPRG4。进行rhPRG4的唾液酸酶A和O糖苷酶消化，并且使用ELISA评估CD44结合。在20、40和80μg/mL的rhPRG4或者HMW HA存在或不存在的情况下，用白细胞间介素1β(IL-1β)或者肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞(RA-FLS)48小时并且测量细胞增殖。通过与抗CD44抗体(IM7)共同孵育而评估CD44的贡献。在IM7存在或不存在的情况下用IL-1β或者TNF-α处理Prg4-/-滑膜细胞后，研究rhPRG4的抗增殖作用。

开始时对于各变量测试正态性和等方差性。对于满足两项假设的变量测试统计显著性，对两组或多于两组的比较分别使用学生t检验或者利用图基事后检验的方差分析(ANOVA)进行测定。使用曼-惠特尼U检验或者等级方差分析(ANOVA on the ranks)对不满足正态假设的变量进行测试。统计学显著性的水平设定为α＝0.05。数据图示为平均值±标准差。

1A.使用直接ELISA测试rhPRG4、高分子量HA、中等分子量HA和玻璃体结合蛋白与CD44的结合

用PBS缓冲液(100μL每孔)中400μg/mL的rhPRG4高分子量HA(HMWHA；)(R&D System,USA)、中等分子量HA(MMW HA；)(R&DSystem)和玻璃体结合蛋白(Sigma Aldrich)在4℃包被(coat)高结合微量滴定板(Corning,Sigma Aldrich,USA)过夜。rhPRG4是CHO-M细胞(Lubris,Framingham,MA,USA)产生的全长产物。在用PBS+0.1％吐温20洗涤后，在室温下用2％牛血清白蛋白(BSA；300μL每孔)封闭复孔至少2小时。分别以1μg/mL向板添加CD44-IgG₁Fc(R&D systems)或者IgG₁Fc(R&D systems)(100μL每孔)并且在室温下培育60分钟。用PBS+0.1％吐温20洗涤后，添加1:10,000稀释率的抗IgG₁Fc-HRP(Sigma Aldrich)(100μL每孔)并且在室温下培育60分钟。在用PBS+0.1％吐温20洗涤后，使用1步Turbo TMB ELISA试剂(ThermoScientific,USA)进行试验并且在450nm测量吸收率。数据表示每组三个复孔的4次独立试验的平均值。

图1A示出了rhPRG4、HMW HA、MMW HA和玻璃体结合蛋白与CD44-IgG₁Fc融合蛋白和IgG₁Fc的结合。对于rhPRG4、HMW HA和MMW HA包被的孔，CD44-IgG₁Fc组450nm的吸收率显著高于(p<0.001)IgG₁Fc组的吸收率。与之相反，在玻璃体结合蛋白包被的孔中，CD44-IgG₁Fc和IgG₁Fc之间没有显著差异。

这些数据显示rhPRG4结合CD44并且干扰HMW HA与CD44的结合。rhPRG4、HMW HA和MMW HA以极低的非特异性结合，特异性地结合至嵌合型CD44。与之相反，与润滑素共享显著的序列同源性的玻璃体结合蛋白不显示对CD44结合的任何特异性。因为rhPRG4结合CD44，其可以用作CD44的拮抗物，从而干扰CD44促炎症信号作用。

1B.使用直接ELISA测试rhPRG4、HMW HA、MMW HA与CD44的浓度依赖性结合，以及rhPRG4和HA之间对于与CD44结合的竞争

通过用400、200、100、20、4、2和0.1μg/mL的大分子包被微量滴定板而进行rhPRG4、HMW HA、MMW HA与CD44的浓度依赖性结合。如上所述地进行试验。从CD44IgG₁Fc孔中的吸收率值减去IgG₁Fc孔中的吸收率值，并且校正的CD44IgG₁Fc吸收率值归一化为400μg/mLrhPRG4组的吸收率值，并且数据表达为与CD44结合的百分率。图1B描绘了rhPRG4、HMW HA、MMW HA与重组CD44的浓度依赖性结合。对于400、100、20、4和2μg/mL浓度，在rhPRG4包被的孔中重组CD44结合百分率显著高于(p<0.001)HMW HA或者MMW HA包被的孔。此外，对于200μg/mL浓度，在rhPRG4包被的孔中重组CD44结合百分率显著高于(p<0.001)MMW HA包被的孔。在0.1μg/mL浓度，rhPRG4、HMW HA和MMW HA包被的孔之间的CD44结合百分率没有显著的差异。数据表示每组三个复孔的4次独立试验的平均值。

为了评价rhPRG4与HMW HA或MMW HA的任一之间对CD44结合的竞争，以1μg/mL(100μL每孔)在4℃用CD44IgG₁Fc或者IgG₁Fc任一包被微量滴定板过夜。随后，用PBS+0.1％吐温20洗涤复孔并且在室温下使用2％BSA(300μL每孔)封闭复孔至少2小时。向复孔添加5μg/mL的rhPRG4，或者rhPRG4(5μg/mL)与0.01、0.05、0.25、1、5或者50μg/mL的HMW HA或者MMW HA的组合，并且在室温下培育60分钟。用PBS+0.1％吐温20洗涤后，添加1:1,000的润滑素特异性单克隆抗体(Mab 9G3)(100μL每孔)并且在室温下培育60分钟。用PBS+0.1％吐温20洗涤后，添加1:1,000稀释率的羊抗鼠IgG-HRP(Thermo Scientific)(100μL每孔)并且在室温下培育60分钟。如上所述地进行试验。从CD44IgG₁Fc孔中的吸收率值减去IgG₁Fc孔中的吸收率值，并且校正的rhPRG4+HA组中的吸收率值归一化为rhPRG4组的吸收率值，并且数据表达为与CD44结合的百分率。数据表示每组三个复孔的4次独立试验的平均值。

图1C公开了rhPRG4和HMW HA或MMW HA之间与重组CD44结合的竞争。0.05、0.25、1、5和25μg/mL的HMW HA或者MMW HA显著地减少rhPRG4与CD44的结合(p<0.05)。

这些数据表明rhPRG4以浓度依赖的方式结合至CD44，与HMW HA的亲和力相当。此外，rhPRG4与HMW HA在CD44结合方面竞争。HMW或者MMW HA过量的存在仅降低rhPRG4与CD44的结合约50％。这些数据表明rhPRG4是CD44拮抗物；因此，其具有干扰CD44促炎症信号的潜力。

1C.使用表面等离子体共振测试rhPRG4与CD44的浓度依赖性结合，以及rhPRG4和HMW HA之间的竞争

使用表面等离子体共振(Biacore T100,GE Healthcare Lifesciences,NJ,USA)研究rhPRG4与CD44-IgG₁Fc的结合。见图1C。使用人抗体捕获试剂盒(GE Life Sciences)使S系列芯片(chip)功能化，并且使CD44-IgG₁Fc或者IgG₁FC任一能够分别结合至流动池1(Fc₁)和流动池2(Fc₂)中的功能化的芯片的表面。rhPRG4以300、250、200、150、100和50μg/mL的浓度按30μL/min注射8分钟，然后使用0.1M HEPES、1.5M NaCl、30mM EDTA、以及0.5％P20(GE Life Sciences)分离(dissociation)10分钟。在每个周期结束时用1分钟3M MgCl₂脉冲重建芯片的表面。每个分析物浓度一式两份地注射。结果曲线双重对照(doulbereferenced)(即Fc₂-Fc₁，随后再减去0μg/mL曲线)。通过BiaEvaluation软件，分别使用1:1结合/构象的变化模型或者通过稳态平衡，确定结合动力学和结合亲和性。为了研究rhPRG4和HMW HA在结合CD44方面的竞争，如上所述地以0和300μg/mL之间的浓度范围注射rhPRG4。在分离阶段结束后，以50μg/mL(30μL每分钟)注射HMW HA1分钟。然后双重对照的rhPRG4与CD44的结合信号(各种浓度的)相对rhPRG4注射后结合至CD44的HMW HA而产生的结合信号而标绘。

使用表面等离子体共振确认rhPRG4与重组CD44的结合。rhPRG4显示出与固定CD44-IgG₁Fc的浓度依赖性结合以及分离(图2A)，具有基于240KDa的rhPRG4分子量的表观如HMW HA结合信号强度(X轴)和rhPRG4结合信号强度(Y轴)之间的反比关系示出的，rhPRG4干扰HMW HA与重组CD44的结合(图2B)。

这些数据表明rhPRG4以浓度依赖的方式结合至CD44，与HMW HA的亲和力相当。此外，如实施例1B和1C所证明的，结合至CD44的rhPRG4的存在以浓度依赖的方式防止HMW HA与CD44结合，并且可以表示rhPRG4和HMW HA共享受体上的公用结合部位。在HA SF浓度大致10倍于润滑素的浓度的关节环境中，并且基于本文所示的竞争结合数据，预期润滑素将结合至滑膜细胞和软骨细胞表面上的CD44并且在HA存在的情况下发挥CD44介导的生物功能，由此提高干扰促进炎症的中介物而提供关节内平衡的作用。

1D.粘蛋白结构域糖基化去除对rhPRG4与CD44结合的影响

润滑素的边界润滑能力由O联(β1-3)Gal-GalNAc低聚糖介导(Jay et al.,Glucoconj J 2001；18(10):807-15)。神经氨酸苷酶与β1,3,6半乳糖苷酶消化物的组合将润滑素的边界润滑能力减少50％(Jay et al.,Glucoconj J 2001；18(10):807-15)。从RASF样本分离的润滑素包含增加的核心1糖基化结构并且显示硫酸化的表位，其被提出是L选择素配体的一部分(Estrella et al.,Biochem J 2010；429(2):359-67)。此外，来自RA SF的润滑素以糖基化依赖的方式结合L选择素并且覆盖聚集至具有RA的患者的发炎的滑液和SF的多形核粒细胞(Jin et al.J Biol Chem2012；287(43):35922-33)。

使用唾液酸酶A(Prozyme,USA)、O糖苷酶(New England Biolabs,USA)或者唾液酸酶A和O糖苷酶的组合在37℃消化rhPRG4 16小时。在唾液酸酶A消化中，向180μL的总反应体积并且rhPRG4最终浓度300μg/mL的rhPRG4添加12μL的酶(1U/200μL)。在O糖苷酶消化中，在非变性情况下向180μL的总反应体积并且rhPRG4最终浓度300μg/mL的rhPRG4添加4.8μL的酶(40百万单位/mL)。在唾液酸酶A和O糖苷酶消化中，以与上述任一相同的体积使用所述酶，并且与如上所述的总反应体积和最终rhPRG4浓度的rhPRG4一起培育。唾液酸酶A和O糖苷酶消化对rhPRG4表观分子量的影响通过使用4-12％Bis-Tris凝胶(NuPage,lifetechnologies,USA)的SDS-PAGE而确定。总共20μL的rhPRG4或者酶消化的rhPRG4在还原条件下(60分钟200mV)运行，随后用Gelcode蓝染色剂(Thermo Scientific,USA)染色。酶消化的rhPRG4与CD44的结合与未消化的rhPRG4进行比较，使用上述直接ELISA方法并且使用30μg/mL的rhPRG4包被浓度。数据表示每组三个复孔的4次独立实验的平均值。

唾液酸酶A消化导致与未处理的对照组相比，rhPRG4与CD44的结合百分率显著增加(p<0.001)，如图3A所示。类似地，O糖苷酶消化导致与未处理的对照组相比，rhPRG4与CD44的结合百分率显著增加(p＝0.008)。唾液酸酶A消化的和O糖苷酶共消化的rhPRG4之间CD44结合百分率没有显著差异(p＝0.105)。唾液酸酶A和O糖苷酶消化的rhPRG4中结合CD44的百分率显著高于唾液酸酶A消化的rhPRG4(p＝0.007)、O糖苷酶消化的rhPRG4(p<0.001)和未处理的对照组(p<0.001)。用唾液酸酶A和O糖苷酶消化rhPRG4导致rhPRG4的表观分子量降低至大约200KDa(图3B)。

唾液酸和O糖基化的去除显著地增加rhPRG4的CD44结合(p<0.001)。唾液酸酶A和O糖苷酶处理分别导致rhPRG4与CD44受体结合的提高。累积的唾液酸酶A和O糖苷酶消化导致与单个酶消化相比更显著的由rhPRG4对CD44的结合。唾液酸酶A从糖蛋白切断分支或不分支的末端唾液酸残基，而O糖苷酶催化核心1和2从糖蛋白移除。CD44结合的增强表示在rhPRG4与CD44结合中均不需要核心1糖基化和唾液酸末端残基。因此，rhPRG4蛋白核心的唾液酸苷化和核心1糖基化水平对PRG4与CD44的结合能力不是至关重要的。与之相反，这些残基的移除可能导致rhPRG4半刚性杆状结构的构象变化，导致与CD44相互作用增强。

1E.促炎性细胞因子诱导的风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞增殖和rhPRG4或者HMW HA治疗的影响

患有RA的患者的滑液包含相当大量的各种CD44异构体并且与OA或者正常滑液相比通常以更高的程度存在(Naor et al.,Arthritis Res Ther 2003；5(3):105-15；Grisaret al.,Clin Exp Rheumatol 2012；30(1):64-72)。风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞(RA-FLS)在具有RA的患者的滑液的浸润方面发挥重要作用。特别的CD44变体的表达有助于RA-FLS体外的增殖(Wibulswas et al.,Am J Pathol 2000；157(6):2037-2044)，并且以随后受体脱落结合细胞表面CD44的药物试剂在实验性关节炎模型中显示出效力(Runnelset al.Adv Ther 2010；27(3):168-80)。

第三和第六通道(passage)间的风湿性关节炎成纤维细胞状的滑膜细胞(RA-FLS；Cell Applications,USA)用于进行这些实验。在灭菌96孔板中，在用1％FBS和1mM丙酮酸盐补充的DMEM中培养并且用20ng/mL重组人白细胞间介素1β(IL-1β；R&D systems)或者5ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α；R&D systems)刺激下，在最终浓度20、40或者80μg/mL的rhPRG4或者HMW HA存在或不存在的情况下，在37℃培养RA-FLS(80μL，每孔中5,000细胞)48小时。每孔的总体积是200μL。使用CellTiter 96AQueous，一种单一溶液细胞增殖试验(MTS；Promega,USA)确定作为炎症的指标的细胞增殖并且确定490nm吸收率。数据表示为与未处理的对照组RA-FLS相比，在490nm吸收率变化的倍数。数据表示每种处理的至少三个复孔的3次独立实验的平均值。为了评估CD44对rhPRG4或者HMW HA的效果的贡献，如上所述地用IL-1β或者TNF-α刺激RA-FLS。在IM7(Abcam,USA)，一种识别跨所有CD44异构体的保守表位的CD44中和抗体(Samson et al.,Exp Eye Res,2014；127C:14-19)存在或不存在的情况下，用rhPRG4或者HMW HA的处理进行至80μg/mL的最终浓度，最终稀释度为1:200。每孔的总体积是200μL。如上所述地确定跨实验组的细胞增殖，并且数据表示为与未处理的对照组RA-FLS相比，在490nm吸收率变化的倍数。数据表示每种处理的至少三个复孔的3次独立实验的平均值。

图4A示出48小时周期的IL-1β和TNF-α诱导的RA-FLS增殖。用40和80μg/mL rhPRG4或者HMW HA处理显著地抑制IL-1β刺激的RA-FLS增殖(p<0.05)。用20、40和80μg/mL rhPRG4处理显著地抑制TNF-α刺激的RA-FLS增殖(p<0.05)。用HMW HA处理不导致抑制利用TNF-α的RA-FLS增殖。用IM7抗CD44抗体共同处理逆转rhPRG4和HMW HA对IL-1β刺激的RA-FLS的作用，由用rhPRG4+IM7或者HMW HA+IM7处理的IL-1β刺激的RA-FLS和IL-1β刺激的RA-FLS之间吸收率的变化缺乏显著差异所表示，如4B图所示。相似地，用IM7抗体的共同处理逆转rhPRG4对TNF-α诱导的RA-FLS增殖的影响。

40和80μg/mL的rhPRG4和HMW HA显著地抑制IL-1β诱导的RA-FLS增殖(p<0.05)。20、40和80μg/mL的rhPRG4显著地抑制TNF-α诱导的RA-FLS增殖(p<0.05)。CD44中和逆转rhPRG4对IL-1β和TNF-α刺激的RA-FLS的作用以及HMW HA对IL-1β刺激的RA-FLS的作用。

IL-1β和TNF-α诱导的RA-FLS增殖具有用TNF-α刺激观察到的更高的细胞增殖，这与其他公开的报道一致(例如Lacey et al.Arthritis Rheum 2003；48(1):103-109)。rhPRG4以参与CD44结合的机制抑制IL-1β和TNF-α诱导的RA-FLS增殖。rhPRG4和CD44相互作用的下游效应是抑制NF-κB的核易位。在这样的细胞增殖试验中，HMW HA抑制IL-1β诱导的RA-FLS增殖但是不抑制TNF-α诱导的增殖。当用rhPRG4处理时，HMW HA的作用被CD44抗体逆转，表示CD44在介导该作用中起作用。

这些数据显示rhPRG4对IL-1β或者TNF-α刺激后的RA-FLS发挥抗增殖、抗炎作用。有趣地，证明这一抗增殖作用的rhPRG4浓度通常低于提供边界润滑所需的最佳的rhPRG4浓度。rhPRG4的抗增殖作用由CD44与下游的NF-κB核易位的抑制的相互作用介导的，表明治疗应用的润滑素可以经由CD44依赖机制缓和促炎性细胞因子对有毒的细胞类型的增殖的作用。

1F.rhPRG4处理对RA-FLS的TNF-α刺激后的NFκB核易位的效果

培育RA-FLS(400,000个细胞/孔)并用TNF-α(5ng/mL)刺激并在无血清培养基中用rhPRG4(200μg/mL)或可商购的NFκB易位抑制剂MG 132(3μM；Tocris Bioscience)处理24小时。收获细胞并且使用可商购试剂盒(Thermo scientific)进行核蛋白提取。使用微二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(Thermo scientific)测量蛋白质总量，并且使用每个实验组3μg的核提取物。使用可商购NFκB DNA结合试验试剂盒(Abcam)在核提取物中检测到p50亚单位的NFκB。数据表示为与未处理的对照组相比，NFκB核蛋白水平变化的倍数。为评估rhPRG4对NFκB易位的禁止是否是CD44依赖的，在IM7CD44抗体(1:1,000稀释)存在或不存在的情况下重复上述实验。数据表示每种处理的至少三个复孔的3次独立实验的平均值。

TNF-α处理导致与未处理的对照组相比显著的NFκB核易位(p<0.001)(图4C)。用rhPRG4或者NF-κB易位抑制剂MG132的处理与TNF-α处理的RA-FLS相比显著减少NF-κB核易位。TNF-α+rhPRG4+IM7组中NFκB核易位显著地高于TNF-α+rhPRG4组中的NFκB易位(p<0.001)并且与TNF-α组无显著不同。因此，rhPRG4的抗增殖、抗炎作用是由CD44与下游的NF-κB核易位的抑制的相互作用介导的，表明rhPRG4能够直接减轻NF-κB核易位经由CD44依赖机制的促炎症效果。

1G.Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞的分离和CD44免疫细胞化学

从Prg4-/-和Prg4+/+雄性小鼠(8-10周龄；每基因型5-8只动物)收获滑膜组织并且在无菌的HBSS缓冲液中在37℃震荡地用链霉蛋白酶(2mg/mL；Sigma Aldrich)消化30分钟。随后在37℃震荡地用I型胶原酶(1mg/mL；Sigma Aldrich)消化4小时。使用DMEM+10％FBS停止酶反应。细胞在DMEM+10％FBS中生长并且在第二和第四通道间使用Prg4-/-滑膜细胞，同时在其次要通道中使用Prg4+/+滑膜细胞。

Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞在载玻片(Thermo Scientific)上生长。细胞用4％甲醛固定15分钟并且用PBS缓冲液洗涤两次。细胞用0.2％Triton X-100渗透10分钟并且用PBS缓冲液洗涤3次。细胞用2％BSA封闭30分钟。用IM7抗CD44抗体(1:200)在4℃培育过夜。在用PBS洗涤三次后，用Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG(Life Technologies)以1:400稀释度在黑暗中培育1小时。除非另有说明，所有的培育在室温下进行。在用PBS洗涤5分钟后，添加包含DAPI的Vectashield载体介质(Vector Labs,Burlingame,CA,USA)。用Nikon Eclipse90i荧光显微镜，使用NIS元素成像软件对细胞成像。

Prg4-/-和Prg4+/+滑膜细胞的CD44免疫细胞化学如图5A所示。Prg4-/-滑膜细胞观察到强绿色荧光，为CD44定位和未占用的CD44表位的表示。或者，在Prg4+/+滑膜细胞未观察到绿色荧光或观察到微弱的绿色荧光，表示大部分CD44受体(表位)被固有Prg4表达占用或拮抗。IL-1β和TNF-α处理导致与未处理的Prg4-/-滑膜细胞相比，Prg4-/-滑膜细胞增殖显著的增加(p<0.001)(图5B)。与之相反，仅IL-1β刺激导致与未处理的Prg4+/+滑膜细胞相比，Prg4+/+滑膜细胞增殖显著的增加(p<0.001)(图5B)。此外，IL-1β和TNF-α诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖的成倍增加显著地高于细胞因子诱导的滑膜细胞增殖中成倍增加(p<0.001)。

用rhPRG4处理显著地抑制IL-1β和TNF-α诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖(p<0.001)(图5C)。用IM7共同处理逆转rhPRG4的作用。这由IL-1β+rhPRG4+IM7和TNF-α+rhPRG4+IM7组中Prg4-/-滑膜细胞增殖分别与IL-1β+rhPRG4和TNF-α+rhPRG4组相比的显著增加(p<0.001)而说明。在TNF-α+rhPRG4+IM7和TNF-α组之间，Prg4-/-滑膜细胞增殖没有显著差异。与之相反，IL-1β组中Prg4-/-滑膜细胞增殖显著高于IL-1β+rhPRG4+IM7组(p<0.001)。

Prg4-/-小鼠展现软骨退变的早期征象，表现为表面纤维化(fibrillation)和与Prg4+/-和Prg4+/+小鼠相比增加的关节摩擦系数(Jay et al.,Arthritis Rheum,2007；56(11):3662-9)。此外，Prg4-/-小鼠展现与年龄匹配的Prg4+/+软骨相比，关节软骨中激活的半胱天冬酶3软骨细胞染色增加(Waller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013；110(15):5852-7)，并且在Prg4-/-小鼠中滑液增生和过度生长明显，而Prg4+/-或者Prg4+/+小鼠中没有明显的滑液增生(Rhee et al.,J.Clin.Invest,2005；115(3):622-31)。Prg4-/-滑膜细胞显示与Prg4+/+滑膜细胞相比增强的CD44染色。此外，促炎性细胞因子诱导Prg4-/-滑膜细胞的显著增殖对Prg4+/+滑膜细胞没有明显的作用。这些观察结果组合起来表明了与RA-FLS类似的具有增殖滑膜细胞表型的Prg4-/-关节中持续的炎症。rhPRG4抑制细胞因子诱导的Prg4-/-滑膜细胞增殖并且该作用由rhPRG4-CD44相互作用介导。中和CD44完全转TNF-α刺激后rhPRG4的抗增殖作用并且部分逆转IL-1β刺激后rhPRG4的抗增殖作用。与TNF-α和IL-1β刺激Prg4-/-滑膜细胞的设定中的rhPRG4-CD44相互作用相关的这些差异可能潜在地由于rhPRG4独立于其与CD44相互作用的能力的调控其他信号通路的能力。因此，rhPRG4以涉及CD44的机制抑制IL-1β和TNF-α诱导的Prg4-/-滑膜细胞的增殖，并且因此是能够下调CD44信号的促炎症活动的CD44拮抗物。

实施例2润滑素调控人全血系统中炎性细胞因子的生产

在革兰氏阴性菌的外膜中发现脂多糖(LPS)，并且其引起动物强烈的免疫炎症反应。使用生物芯片阵列技术在含柠檬酸的人类全血中研究LPS对炎性细胞因子生产的挑战的作用，以绘谱(profile)各种细胞因子的产生和它们生产的调节。在37℃培育60分钟的样本中的添加盐水(1-10比率)和10μg/mL的LPS的含柠檬酸的全血样本中研究IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、VEGF、IFNg、TNFa、IL1a、IL1b、MCP1和EGF的产生。离心这些混合物并且使用Randox Invesitigator生物芯片读取器上的高灵敏度细胞因子阵列分析14个炎症生物标记的上清液血浆。这些研究一式两份地进行并且以表格和图的形式列表。如图8A-B所示，在全血中以1:10稀释度补充的脂多糖导致特定病况下炎性细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TNF-α、IL1-β、及MCP-1的生产增加。但是注意到在IL2、IFNg、以及IL1b中没有变化。图8B示出各种参数中的百分比变化清楚地证明IL6、IL8、VEGF和TNFa的显著增加。

利用相同的方法，也使用详细的实验设定研究润滑素对全血中炎性细胞因子的产生的作用。在这些研究中，通过向从正常健康志愿者抽取的含柠檬酸的全血添加润滑素来研究润滑素(57mg/mL)的作用。针对发症细胞因子水平对样本以及培育60分钟的样本中的盐水对照组绘谱。离心全血以获得血浆，使用高灵敏度细胞因子试验针对各种炎性细胞因子对血浆绘谱。如图9A-B所示，在全血中补充0.57mg/mL的润滑素导致IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TNF-α、IL-1β、MCP-1和EGF的生产减少。在VEGF、IL8、IL6和IL10中观察到最突出的减少。

使用生物芯片阵列技术研究润滑素对LPS介导的炎性细胞因子产生的作用。在这些研究中，仅10ng/mL的LPS和以10ng/mL预补充LPS随后补充0.57mg/mL的润滑素，在含柠檬酸的全血中针对各种炎性细胞因子的产生进行比较。所有的样本培育60分钟并且离心以获得血浆。随后使用针对炎性细胞因子的生物芯片阵列分析该血浆。LPS以1:10稀释度补充至全血。如图10A-B所示，润滑素的存在导致IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TNF-α、IL-1β、MCP-1和EGF的减少，即使如上文所讨论的LPS单独的存在导致这些细胞因子中的每个的生产增加。如图10B所示，润滑素导致EGF、IL10、VEGF、MCP1、IL1b和TNF的水平明显减少。这些数据提示润滑素的补充以显著的方式干扰LPS介导的炎性细胞因子产生，表明润滑素具有抗炎性。

使用生物芯片阵列技术研究润滑素对TNF-α介导的炎性细胞因子产生的作用。重组TNF-α用作在全血中产生炎性细胞因子的触发器。研究润滑素对TNF-α介导的各种细胞因子的产生的作用。100mg/mL浓度的TNF-α单独地补充至在37℃培育60分钟的全血。TNF-α以1:10稀释度补充至全血。通过在紧接着TNF-α添加前向全血中补充0.57mg/mL的润滑素来研究润滑素对TNF-α介导的各种细胞因子的产生的调节作用。在60分钟后，通过离心获得血浆并且使用Randox生物芯片阵列分析发炎性细胞因子。如图11A-B所示，润滑素的存在导致IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TNF-α、IL-1β和EGF的减少，即使用TNF-α单独的挑战导致这些细胞因子中的每个的生产。图11B示出润滑素在10-100％的范围内降低细胞因子的水平。与不存在润滑素的刺激相比，TNF-α刺激的细胞因子表达中最剧烈地减少被发现为刺激的IFN-γ和TNF-α的减少(由于润滑素明显地中断TNF-α生产的正反馈循环)。这些数据提示润滑素的施用以显著的方式干扰TNF-α介导的炎性细胞因子产生，表明润滑素具有抗炎性。

使用生物芯片阵列技术研究润滑素对重组组织因子(TF)介导的炎性细胞因子产生的作用。在这些研究中，使用recombiplastin牌(IL Laboratories)组织因子用于触发人全血中炎性细胞因子的产生。通过在向全血添加组织因子之前补充润滑素而研究0.57mg/mL润滑素的作用。单独的组织因子作为正向对照。离心血液样本并回收血浆。血浆然后在Randox生物芯片阵列上针对炎性细胞因子绘谱。TF以1:10稀释度补充至全血。如图12A-B所示，润滑素的存在导致IL-6、IL-8、VEGF、TNF-α、IL-1α、IL-1β、MCP-1和EGF的减少，即使用TF单独的挑战导致这些细胞因子中的每个的生产。如图12B所示，润滑素导致组织因子补充的样本中TNF-α和VEGF水平显著的减少。这些数据提示润滑素的施用以显著的方式干扰TF介导的炎性细胞因子产生，表明润滑素具有抗炎性。

这些研究显示润滑素能够抑制补充了细菌脂多糖(LPS)、TNF-α和组织因子的全血中各种炎性细胞因子的产生。所有的这些试剂是炎症的中介物。因此，润滑素能够跨越很多中介物地下调炎性细胞因子的产生。

实施例3润滑素降低体内促炎性细胞因子的水平

为了确定润滑素是否能够调控体内促炎性细胞因子水平，使用大鼠模型。对九只大鼠进行手术以使内侧半月板不稳定(DMM手术)。手术后七天，每只大鼠接受单次的200μg/kg的润滑素的关节内剂量。对照大鼠接受等量盐水的注射。从测试小鼠采样的血清样本中的细胞因子的水平与接受手术但术后未给药润滑素的对照小鼠进行比较。在润滑素剂量施用三周抽取样本并使用Luminex多路传输平台分析。图13示出结果，其中示出了EPO、IL-13、IL-10、IL-18、IL-1α、IL-2、MCSF、IL-1β、IL-4、IFN-γ、MIP-3α、GMCSF、IL-7、TNF-α、VEGF、MCP-1、IL-5、G-CSF、RANTES、IL-6、GRO、IL-17α以及IL-12p70的测量水平。与仅接受盐水注射的大鼠相比，在接受润滑素的大鼠中IL-18、MCSF、MCP-1、RANTES和GRO的水平都减少了。更具体地，这表现出润滑素的广泛抗炎作用，因为这一类型的炎性细胞因子区别于TNF-α/IL-6/IL-8主导的LPS和TF中介物的线型(其在这样的模型中通常不上调)。尽管如此，润滑素能够显著地减少体内的促炎性细胞因子生产。

实施例4润滑素对人骨关节炎的滑膜细胞分泌的细胞因子水平的作用

从正常和骨关节炎(OA)患者获得滑液细胞并且在免疫细胞耗尽后用CD90+纯化。细胞以每孔10,000个铺板并且在包含DMEM、热灭活的Hyclone FBS(10％)、以及抗抗(Anti-Anti)(1％)的介质中悬浮。试验包含180μL细胞悬液和20μL的配体，总体积200μL。重组润滑素(rhPRG4)随后以90μg/mL的浓度引入细胞并且负对照为PBS。然后在37℃在5％CO₂中培育板24小时，其后收集上清液用于经由Luminex多路传输平台进行细胞因子分析。如图14A-B所示，当比较润滑素与PBS条件时，正常细胞不显示任何细胞因子反应的变化。然而，OA细胞在暴露于润滑素时显示FGF-2和IL-1Ra细胞因子的下调。因此，在已经展现炎症反应的细胞中，诸如本文提到的骨关节炎细胞，润滑素的施用能够减少由这些细胞表达的促炎性细胞因子的水平。

实施例5脑损伤的治疗

在头部创伤期间，常有脑组织瘀伤和血管完整性的破坏，导致蛛网膜下出血和/或硬脑膜下血肿。因此，神经元丢失，导致受损的脑功能。此外，在CVA和TIA中，一个以上血管内血栓形成，在堵塞的下游的脑容量中阻断氧和营养输送至包括神经元的脑细胞。这也导致神经元的破坏，从而使脑功能受损。对损伤的脑免疫反应涉及促炎症中介物的生产增加和白细胞向损伤区域聚集。这导致损伤部位周围的脑区域中神经元受损，术语称为“半影(penumbra)”，并且加剧脑损伤。神经炎症是二次损伤的关键机制之一，并且已经良好建立的是，创伤后神经炎症显著地导致创伤性脑损伤后发生的神经元受损。限制这样的脑损伤的一种方法是通过在伤害后短间隔(数小时)期间施用试剂从而降低神经炎症和产生的神经元受损。因此，在本发明的实施例中，rhPRG4，也已知为润滑素，能够通过脉管系统或者在手术期间全身地施用以缓解脑内压力，作为限制脑损伤的方法。这样的治疗的依据由下列公开的结果支持。

大鼠创伤性脑损伤之后大约一小时，使用建立的涉及控制性皮质撞击损伤的脑损伤模型，向受试大鼠静脉地施用约2.5mg/Kg剂量的rhPRG4。向对照大鼠静脉地施用生理盐水(0.9％NaCl)。一天后，收获脑并使用免疫印迹法分析创伤后病变周围的大脑皮层的样本。分析证明，与对照组相比，rhPRG4减少创伤后促炎症中介物的生产。

在创伤性脑损伤后脑表达快速增加并在延长周期内维持高水平的半乳糖凝集素3下调74％。与用生理盐水处理的大鼠相比，在rhPRG4处理的大鼠中观察到创伤后流入受伤的脑实质中的单核细胞的量减少60％，并且rhPRG4也实质减弱(94％)基质金属蛋白酶9的创伤后合成并抑制(64％)促基质金属蛋白酶2向其酶活性式的转变。此外，rhPRG4减少80％的血脑屏障渗透，其通过评估创伤性脑组织中蛋白素的水平而评价。

荧光标记的rhPRG4注射显示其进入脑受损区域的脑实质，并且在脑未损伤区域中完全不存在。结合关于单核细胞系THP-1的体外研究的结果，这些观察表示rhPRG4通过直接地抑制侵入炎性细胞的趋化反应活性并且通过削减促炎症中介物的生产和信号而限制创伤后神经炎症的规模。

因此，rhPRG4选择性地靶向脑的受损区域，降低药理作用脱靶的可能性。重组hPRG4通过减少促炎症中介物的创伤后生产和炎性细胞流入而高效地限制创伤性脑损伤导致的神经炎症的规模。另外，rhPRG4展现稳定血脑屏障的独特能力。这些新颖的rhPRG4性质的发现对脑损伤的治疗具有重大意义，因为脑损伤中观察到的血脑屏障官能不良不仅导致损伤的急性期的神经元死亡，并且也导致受损脑部中的进行性神经退行性病变，并且因此导致不良的神经学结果。

实施例6炎性肠病的治疗

炎性肠病特征在于细胞因子介导的活化T细胞的聚集，其导致肠上皮的氧化性损伤和耗损。估计25％-40％的患有溃疡性结肠炎(UC)或者克罗恩病的人可以进行手术，诸如回肠贮袋肛管吻合术或者移除结肠和直肠的部分的直肠结肠切除术。通用的治疗方法包括诸如皮质类固醇的广谱抗炎药物、抗TNF抗体、或用于防止肠道归巢T细胞迁移的针对性较强的抗整合素抗体。因为伴随这些方法的严重的副作用，诸如感染和癌症，这些方法均不适用于长期疗法。相比之下，重组hPRG4能够选择性地应用于肠，以同时补充缺失的上皮多糖蛋白质复合物(glycocalyx)并且局部性地减少细胞因子表达。近来的主要结肠的炎性肠病的细胞因子谱的特征显示UC中TNF-α、GRO、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、克罗恩病中IL-6、以及UC和克罗恩病两者中IL-8相对于对照组的增加(Korolkova et al.,Clin MedInsights Gastroenerol2015May 6；8:29-44)。润滑素已经显示出显著地减少这些细胞因子的表达。在一个实施例中，rhPRG4经由灌肠地或者口服地施用，无论是通过强饲法、全肠道冲洗、饮用溶液、或通过封装地药片(例如，微粒封装、纳米颗粒封装、聚合体封装等)。以示例的方式，悬浮在肠道可接受的缓冲盐溶液中的浓度在10至200μg/mL范围内的100mL至4L的rhPRG4的灌肠施用，更优选为浓度50μg/mL至150μg/mL的200mL至500mL体积的rhPRG4的灌肠施用，补充多糖蛋白质复合物，防止T细胞归巢并且下调施用润滑素的位置处的细胞因子表达。rhPRG4的施用导致提高的上皮屏障功能，更小的血管通透性，对蛋白酶活性更低的敏感性，以及提高的营养吸收。在某些实施例中，在润滑素施用前，施用柠檬酸镁或者其他的缓泻药24小时，随后适当地禁食。

实施例7痛风的治疗

研究进行尿酸钠晶体注射的大鼠作为痛风的模型。尿酸钠晶体施用24小时后，大鼠发展出关节疼痛。尿酸盐晶体引入24小时后，两只大鼠接受盐水注射而另外两只大鼠接受rhPRG4注射。利用Von Frey方法每12小时一次研究这些大鼠。该方法通过用细丝导线探查患肢的爪而确定传入疼痛敏感度，作为关节炎症的结果。图15中的数据显示接受rhPRG4的大鼠比接受安慰剂的大鼠疼痛更少。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是对本领域技术人员显而易见的是这样的实施例仅以示例的形式提供。本领域技术人员现在将在不背离本发明的情况下想到许多变形、改变以及替代例。应当理解的是，可以在本发明的实践中采用本文描述的本发明的实施例的替代例。本发明意在使随附权利要求限定本发明的范围并且由此覆盖权利要求和其等同物的范围内的方法和结构。

本发明的其他特征和优点通过随附的其优选实施例的说明以及权利要求将更加明显。在参考说明书和实例的情况下，本发明的这些和许多其他变形例和实施例对任一本领域技术人员而言是显而易见的。

Claims (72)

1.一种降低或抑制患者的炎症反应的方法，该方法包括对在非软骨的、非骨骼的、非骨性的、和非关节的、并且不是角膜、膀胱、或口腔组织的部位，向有需要的所述患者施用PRG4。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述PRG4全身地施用至所述患者。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述施用是静脉的、腹膜内的、通过吸入的、肌肉的、皮下的、口服的、直肠的、口颊的、或者舌下的。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述PRG4局部性地施用至所述部位。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述PRG4外敷地或者通过注射或者灌流施用。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述PRG4是重组外源性人PRG4。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述PRG4对干扰CD44信号有效。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述PRG4具有SEQ ID NO:1去掉信号序列的序列。

9.如权利要求1所述的方法，其中PRG4在选自皮肤、肾、肺、肝脏、伤口或手术切口、甲状腺、胰脏、脾、胸腺、卵巢、睾丸、输尿管、子宫、肾上腺、脑垂体、下丘脑、尿道、前列腺、心、动脉或静脉、脑、胃、小肠、大肠、结肠、食管、咽、喉、气管、舌头、后眼、或者肿瘤的位置局部性地施用至所述患者。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述位置是所述患者的炎症部位。

11.如任意前述权利要求所述的方法，其中患者患有选自由下列所组成的组的炎症状态：痤疮、急性器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾迪生氏病、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应、斑秃、阿尔茨海默病、过敏性反应、阑尾炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自体免疫性脱发、自体免疫疾病、自体免疫性甲亢、自体免疫性垂体机能减退、自体免疫性多腺体疾病、贝赛特氏症、脑损伤、支气管炎、癌症、心肺旁路综合征、心肾综合征、乳糜泻、慢性光化性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾衰竭、结肠炎、接触性皮炎、克罗恩病、皮肌炎、糖尿病、湿疹、肺气肿、异物排斥反应、青光眼、肾小球肾炎、痛风、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、枯草热、肝肾综合征、超敏反应或过敏、包涵体肌炎、由于病毒、真菌、寄生虫或者微生物侵袭引起的感染、炎性肠病、炎性肾病、由于热或化学暴露或照射引起的损伤、肠易激综合征、局部缺血、肺炎症、硬斑病、多发性硬化症、蕈样真菌病、心肌梗塞、坏死、非感染性肺损伤、胰腺炎、恶性贫血、肺炎、多肌炎、前列腺炎、假性痛风、银屑病、掌跖脓疱病、坏疽性脓皮症、呼吸道过敏、硬皮病、败血症、血清病、赛扎里综合征、皮肤过敏、中风、全身炎症反应综合征(SIRS)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、T-细胞介导的超敏反应疾病、移植排斥反应、包括源于枪伤、刀伤、交通事故、坠落、或者战斗的创伤、结核病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、心包炎、以及白癫风。

12.如权利要求2所述的方法，其中所述患者患有选自由下列所组成的组的炎症状态：关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、视网膜炎症、视网膜炎、舍格伦综合征、黄斑变性、痛风、假性痛风、心包炎、以及葡萄膜炎。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述患者的炎症反应与所述患者患有的所述炎症状态相关。

14.如任意前述权利要求所述的方法，其中PRG4以不足以对所述患者提供边界润滑的量施用。

15.如任意前述权利要求所述的方法，其中PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量施用，或者局部性地施用以由PRG4溶液提供PRG4的涂层。

16.如任意前述权利要求所述的方法，其中通过患者的促炎性细胞因子的生产水平可以测量炎症反应的减少或者抑制。

17.如权利要求1所述的方法，包括通过全身地、直肠地、口服地、或者通过以上的结合向患者的肠施用润滑素而治疗炎性肠病。

18.如权利要求1所述的方法，包括通过全身地、手术期间外敷地、或者通过以上的结合向患者的脑施用润滑素而治疗脑损伤。

19.如权利要求1所述的方法，包括对患者的过敏症状的治疗，所述患者患有选自由下列所组成的组的症状：充血、鼻后滴流、咳嗽、气喘、打喷嚏、流鼻涕、喉咙痒、皮肤痒、眼睛痒、以及流眼泪，所述方法包括对展现所述症状或处于发展所述症状的风险中的组织表面外敷地施用足以改善所述症状的一定量的包含PRG4的组合物的步骤。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述组合物鼻内地、口服地或者通过吸入地施用。

21.一种降低或抑制具有炎症状态的患者的炎症反应的方法，所述方法包括对患者施用PRG4，其中所述炎症状态选自由下列所组成的组：痤疮、急性器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾迪生氏病、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应、斑秃、阿尔茨海默病、过敏性反应、阑尾炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自体免疫性脱发、自体免疫疾病、自体免疫性甲亢、自体免疫性垂体机能减退、自体免疫性多腺体疾病、贝赛特氏症、脑损伤、支气管炎、癌症、心肺旁路综合征、心肾综合征、乳糜泻、慢性光化性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾衰竭、结肠炎、接触性皮炎、克罗恩病、皮肌炎、糖尿病、湿疹、肺气肿、异物排斥反应、青光眼、肾小球肾炎、痛风、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、枯草热、肝肾综合征、超敏反应或过敏、包涵体肌炎、由于病毒、真菌、寄生虫或者微生物侵袭引起的感染、炎性肠病、炎性肾病、由于热或化学暴露或照射引起的损伤、肠易激综合征、局部缺血、肺炎症、硬斑病、多发性硬化症、蕈样真菌病、心肌梗塞、坏死、非感染性肺损伤、胰腺炎、恶性贫血、肺炎、多肌炎、前列腺炎、假性痛风、银屑病、掌跖脓疱病、坏疽性脓皮症、呼吸道过敏、硬皮病、败血症、血清病、赛扎里综合征、皮肤过敏、中风、全身炎症反应综合征(SIRS)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、T-细胞介导的超敏反应疾病、移植排斥反应、包括源于枪伤、刀伤、交通事故、坠落、或者战斗的创伤、结核病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、心包炎、以及白癫风。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述PRG4全身地施用至所述患者。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述施用是静脉的、通过吸入的、肌肉的、皮下的、口服的、直肠的、口颊的、或者舌下的。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述PRG4局部性地施用至所述患者。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述PRG4外敷地或者通过注射施用。

26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述PRG4是外源性人PRG4。

27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述PRG4是重组人PRG4。

28.如权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述PRG4具有SEQ ID NO:1去掉信号序列的序列。

29.如权利要求24或25所述的方法，其中所述PRG4在选自皮肤、肾、肺、肝脏、伤口或手术切口、甲状腺、胰脏、脾、胸腺、卵巢、睾丸、子宫、肾上腺、脑垂体、下丘脑、尿道、前列腺、心、动脉或静脉、脑、胃、小肠、大肠、结肠、食管、咽、喉、气管、舌头、或者肿瘤的位置施用至所述患者。

30.如权利要求21至29任一项所述的方法，其中PRG4以不足以对所述患者提供边界润滑的量施用。

31.如权利要求21至30任一项所述的方法，其中PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量施用，或者局部性地施用以由PRG4溶液提供PRG4的涂层。

32.如权利要求21至31中任一项所述的方法，其中通过患者促炎性细胞因子的生产水平可以测量炎症反应的减少或者抑制。

33.一种降低或抑制患者在非软骨的、非骨骼的、非骨性的、和非关节的、并且不是角膜、膀胱、或口腔的部位的炎症反应的方法，该方法包括对所述患者施用PRG4，其中所述PRG4

a)结合所述患者的细胞上的CD44受体；

b)降低或者抑制所述患者的促炎性细胞因子的生产；

和/或

d)降低或者抑制所述患者的细胞中NF-κB的易位，

从而降低或抑制所述患者的所述炎症反应。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述患者是人类。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述PRG4是重组人润滑素。

36.如权利要求33所述的方法，其中所述重组体人润滑素具有SEQ ID NO:1去掉信号序列的序列。

37.如权利要求33所述的方法，其中所述PRG4是外源性人润滑素。

38.如权利要求33至37中任一项所述的方法，其中PRG4全身地施用至所述患者。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述全身的施用是肠胃外的或者肠的。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述全身的施用是肌肉的、静脉的、腹膜内的、口服的、直肠的、舌下的、口颊的、唇下的、鼻的或者吸入的。

41.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述PRG4在作为患者的炎症部位的选自皮肤、肾、肺、肝脏、伤口或手术切口、甲状腺、胰脏、脾、胸腺、卵巢、睾丸、子宫、肾上腺、脑垂体、下丘脑、尿道、前列腺、心、心包膜、动脉或静脉、脑、胃、小肠、大肠、结肠、食管、咽、喉、气管、舌头、或者肿瘤的位置局部性地施用至所述患者。

42.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述患者患有炎症状态，并且炎症反应与所述炎症状态相关。

43.如权利要求33所述的方法，其中所述炎症状态选自由下列所组成的组：痤疮、急性器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾迪生氏病、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应、斑秃、阿尔茨海默病、过敏性反应、阑尾炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自体免疫性脱发、自体免疫疾病、自体免疫性甲亢、自体免疫性垂体机能减退、自体免疫性多腺体疾病、贝赛特氏症、脑损伤、支气管炎、癌症、心肺旁路综合征、心肾综合征、乳糜泻、慢性光化性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾衰竭、结肠炎、接触性皮炎、克罗恩病、皮肌炎、皮肌炎、糖尿病、糖尿病视网膜病变、湿疹、肺气肿、异物排斥反应、青光眼、肾小球肾炎、痛风、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、枯草热、肝肾综合征、超敏反应或过敏、包涵体肌炎、由于病毒、真菌、寄生虫或者微生物侵袭引起的感染、炎性肠病、炎性肾病、由于热或化学暴露或照射引起的损伤、肠易激综合征、局部缺血、肺炎症、黄斑变性、硬斑病、多发性硬化症、蕈样真菌病、心肌梗塞、坏死、非感染性肺损伤、骨关节炎、胰腺炎、恶性贫血、肺炎、多肌炎、前列腺炎、假性痛风、银屑病、银屑病性关节炎、掌跖脓疱病、坏疽性脓皮症、呼吸道过敏、视网膜炎症、视网膜炎、风湿性关节炎、硬皮病、败血症、血清病、赛扎里综合征、舍格伦综合征、皮肤过敏、中风、全身炎症反应综合征(SIRS)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、T-细胞介导的超敏反应疾病、移植排斥反应、包括源于枪伤、刀伤、交通事故、坠落、或者战斗的创伤、结核病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、葡萄膜炎、心包炎、或白癫风。

44.如权利要求31所述的方法，其中所述细胞是肥大细胞、脾细胞、肺细胞、肾细胞、脑细胞、心脏细胞、肝细胞、癌细胞、皮肤细胞、上皮细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、尿道细胞、血管细胞、神经细胞、胰细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、直肠细胞、胆囊细胞、干细胞或者甲状腺细胞。

45.如权利要求31所述的方法，其中所述细胞是滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、视网膜细胞、角膜缘细胞、小梁网细胞、角膜细胞、结膜细胞、眼部细胞、或者眼科细胞，并且所述PRG4全身地施用至所述患者。

46.如权利要求31至44任一项所述的方法，其中所述PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量施用。

47.如权利要求31至45任一项所述的方法，其中所述PRG4以不足以提供边界润滑的量施用。

48.如权利要求31所述的方法，其中所述促炎性细胞因子选自由下列所组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17α、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、TNF-α、TNF-β(淋巴毒素-α)、淋巴毒素-β、CXC31L(膜结合型趋化因子)、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ、VEGF、MCP-1、MCP-3、EGF、GMCSF、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、TRAIL、FGF-2、GRO、MDC、Rantes、G-CSF、M-CSF、FGF-2、EPO、MCSF、MIP3α、MG-CSF、以及GCSF。

49.一种抑制配体与在非软骨的、非骨骼的、非骨性的、和非关节的、并且不是角膜、膀胱、或口腔的部位的表面上存在的CD44结合的方法，所述方法包括将所述表面暴露于PRG4，其中PRG4结合至CD44并且抑制所述配体的结合。

50.如权利要求48所述的方法，其中所述PRG4是重组人PRG4。

51.如权利要求48或49所述的方法，其中所述PRG4不以足以提供边界润滑的量存在于所述表面。

52.如权利要求50所述的方法，其中PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg范围内的量全身地施用至人类受试者。

53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述表面是哺乳动物的细胞膜。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述PRG4全身地施用并且所述细胞是具有风湿性关节炎的受试者的滑膜细胞、具有间质性膀胱炎的受试者的肥大细胞、糖尿病患者的脾细胞、哮喘患者的肺细胞、肾细胞、脑细胞、心脏细胞、肝细胞、癌细胞、或者具有败血症的受试者的内皮细胞。

55.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞是T细胞。

56.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞是淋巴细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、癌细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、或者内皮细胞。

57.如权利要求49至56任一项所述的方法，其中所述表面在人类受试者中。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述表面经由对所述人类的全身施用而暴露于PRG4。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述配体是透明质酸(HA)、透明质酸-血清衍生的透明质酸相关蛋白复合物(HA-SHAP)、或者基质金属蛋白酶9。

60.一种降低或抑制血液中促炎性细胞因子水平的方法，所述方法包括以足以减少或抑制促炎性细胞因子水平的量全身地施用PRG4。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述促炎性细胞因子选自由下列所组成的组：IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、IFN-γ、TNF-α、IL-1α、IL-1β、MCP-1、EGF、FGF-2、膜结合型趋化因子、IFN-α2、GRO、MCP-3、MDC、EPO、IL-13、IL-18、MCSF、MIP-3α、MG-CSF、IL-7、IL-5、G-CSF、Rantes、IL-17α或者IL-12p70。

62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述血液是具有败血症或者有败血症风险的受试者的血液。

63.如权利要求60至62中任一项所述的方法，其中PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg的量对人类患者施用。

64.一种抑制在非软骨的、非骨骼的、非骨性的、和非关节的、并且不是角膜、膀胱、或口腔的部位的细胞中的NF-κB易位的方法，所述方法包括将包含NF-κB的细胞与PRG4接触，其中PRG4抑制NF-κB信号通路的激活。

65.如权利要求64所述的方法，其中PRG4抑制细胞表面上的TNF-α受体或者IL-1受体。

66.如权利要求64所述的方法，其中所述细胞在与PRG4接触时在人类中。

67.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中PRG4以少于提供边界润滑所需的量提供。

68.如权利要求67所述的方法，其中PRG4以0.1μg/kg-4000μg/kg的量施用。

69.如权利要求64至68中任一项所述的方法，其中PRG4经由对所述人类的全身施用而接触所述细胞。

70.PRG4用于治疗炎症状态的应用。

71.PRG4作为抗炎药的应用。

72.PRG4在制备用于降低或抑制炎症或者用于治疗炎症状态的药物中的应用。