CN107810015A - 薄片形式的细胞生长支架颗粒和移植物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了薄片形式的细胞生长支架颗粒，及其制备和使用方法。可使用冲孔或其它切割操作来制备颗粒，以提供在形状和尺寸方面相对均一的颗粒群体，理想地使用一叠多个薄片的起始材料和多个冲头。细胞化移植物和/或细胞条件培养基可使用所述薄片形式的细胞生长支架颗粒来制备。

Description

薄片形式的细胞生长支架颗粒和移植物及其方法

相关申请的引用

本申请要求2015年5月27日提交的美国临时申请第62/167,263的权益，其通过引用并入本文。

背景

本发明的方面涉及基于生物制剂的材料和方法，在具体方面涉及医疗移植物(呈某些含有细胞的形式)，以及涉及用于其制备或使用的材料和方法。

包括细胞外基质和/或活细胞的可植入移植材料是已知的。在某些实践中，可将待引入患者体内的细胞与基底组合以形成含有细胞的可植入移植物。有时，这些应用涉及其中在施加至支架材料之后扩增细胞的数量的培养期。其它使用模式不涉及这种扩增。相反，将细胞施加至基底上并植入而不扩增细胞的数量。在其它实践中，将其中已经培养过细胞的培养基与细胞分离，然后向患者施用。这种“细胞条件化的”培养基含有由细胞产生并分泌至培养基中的生物物质，其可具有治疗益处。再进一步地，将细胞外基质移植物以其它形式向患者施用而不添加细胞。

尽管表现出了有前景，但基于生物制剂的医疗技术的临床实施一直相对缓慢。需要有改进的和/或替代的材料和方法，所述材料和方法在基于生物制剂的医学或研究技术的实践中是有用的。在其某些方面，本发明针对这些需要。

概要

本发明的某些方面涉及薄片形式的细胞生长支架颗粒，用于其制备和使用的方法以及包含它们的组合物。根据一个实施方案，提供了制备细胞生长支架颗粒的方法。该方法包括迫使至少一个冲头穿过至少一片细胞生长支架材料以从该薄片取出薄片形式的支架颗粒，以及在加压步骤中收集从所述薄片取出的薄片形式的支架颗粒。这种方法还可包括在施加力的过程中对所述至少一张薄片施加张力，以及可通过将弹性构件靠在所述至少一个薄片上挤压来施加张力。这种挤压可在施力期间发生，并且可在冲头移动期间释放所述挤压，以从所述至少一个薄片中撤出冲头。弹性构件可包含具有限定周界的前端的弹性管状壁，并且所述挤压可包括将管状壁的前端靠在至少一个层上挤压。在优选形式中，此类方法包括使用多个冲头(诸如2至20个冲头)，以同时冲穿多片细胞生长支架材料，诸如2至10片。另外或可选择地，冲头可在起始薄片中产生间隔孔的图案，各孔彼此间隔开，使得薄片的整体冲孔残留物保留。

在另一个实施方案中，提供了包括一群薄片形式的细胞生长支架颗粒的颗粒细胞生长支架组合物，其中所述颗粒具有由切割边缘限定的周界。切割边缘优选为机械切割边缘，并且可以不含热变性的胶原，呈现胶原纤维的暴露切割端。优选细胞生长支架颗粒包括细胞外基质组织材料，并且优选地，其中所述组织材料保留对于细胞外基质组织材料的来源组织是天然的一种或多种生物活性剂，更优选其中所述一种或多种生物活性剂包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、软骨衍生生长因子(CDGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、糖蛋白、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖。还提供了包括这种支架颗粒和细胞的组合物。

在另一个实施方案中提供了用于制备组合物的方法，其包括在包含如本文所述的薄片形式的细胞生长支架颗粒的组合物存在的情况下悬浮温育细胞。所述温育可包括充分培养细胞以形成细胞化小体(cellularized body)，其中细胞已在薄片形式的支架颗粒内和/或上沉积了对于所述细胞是内源性的细胞外基质蛋白。在一些形式中，充分进行培养以使所述细胞化小体中的至少1％的胶原蛋白对于该细胞是内源性的。在一些形式中，该方法还包括将细胞从支架颗粒或细胞化小体上脱离下来，例如以形成细胞的单细胞悬液。另外或可选地，所述方法还可包括收集在培养过程中已经条件化的液体培养基，以提供可用于治疗用途的“细胞条件培养基”。

在又一些实施方案中提供了治疗患者的方法，其包括向患者施用如本文所述的薄片形式的细胞生长支架颗粒、如本文所述的细胞移植物或如本文所述的条件培养基。

根据本文中的描述，另外的实施方式以及其特性和有利方面将是显而易见的。

附图简述

图1提供薄片形式的细胞生长支架颗粒的说明性实施方案的数字图像。

图2提供用于制备薄片形式的细胞生长支架颗粒的冲头排布的图示。

图3提供用于制备薄片形式的细胞生长支架颗粒的另一种冲头排布的图示。

图4提供细胞移植组合物的说明性实施方案的图示。

图5提供数字图像，显示Calcien AM活-死染色的附着于ECM盘状颗粒的第11天Canine URC如以下实验中所述的。

图6显示代表如以下实验中所述的从单独培养基，单独ECM盘状颗粒或在SIS盘状颗粒上培养的细胞评估的MCP-1、KC样和IL-8的细胞因子分析的图。

图7提供了数字图像，证明了ECM盘状颗粒在注射时维持和保护细胞的能力，如通过(a)在第0天于具有23G针的1cc注射器中IVISLumina成像的、(b)将100μL肌内注射至NODSCID小鼠中并在约48小时后成像的1000万个RFP-HeLa细胞+可注射ECM盘状颗粒证明的，如下面的实验中所述的。

详述

为了促进对本发明原理的理解，现在将参考实施方案，其中的一些实施方案参考附图进行说明，并且将使用特定的语言来描述所述实施方案。然而应该理解的是，并不由此意图限制本发明的范围。如本发明所属领域的技术人员通常会想到的，所描述的实施方案中的任何改变和进一步的修改，以及如本文所述的本发明的原理的任何进一步的应用均涵盖在内。另外，在下面的详细描述中，针对与材料的组成或尺寸相关的各种特征或实施方法的模式给出了许多替代方案。应理解的是，可将每个这样的公开的替代方案或者这样的公开的替代方案的组合与上面概述中讨论的或者在下面的权利要求中阐述的更一般化的特征相结合，以提供本文额外公开的实施方案。

如上所公开的，本发明的各方面涉及例如在与医学或研究相关的实践中有用的材料和方法。在某些实施方案中，提供了薄片形式的细胞生长支架颗粒及其制备和使用的方法，例如它们在制备可用作组织移植物的细胞化组合物中的用途以及它们在制备可有益地用于疗法的细胞条件培养基中的用途。

在本文的一些实施方案中，薄片形式的细胞生长支架颗粒可具有约20微米至约2000微米，或约100至约1000微米，或约100至500微米的最大横截面尺寸。薄片形式的支架颗粒在尺寸上彼此可以是基本上均一的，例如，最大横截面尺寸在彼此的约20％或10％内，或者可以相对于彼此在尺寸上有变化(例如，具有一些较小的颗粒和一些较大的颗粒，潜在地通过混合两种或更多种基本一致的颗粒群体产生的受控总群体，其中所述群体具有彼此不同的尺寸)。在有利的形式中，颗粒呈薄片形式的，并且可具有约20至约1000微米，或约20至约500微米，或约20至约300微米的薄片厚度。另外或可选地，薄片形式的颗粒在薄片平面中考虑时的最大横截面轴线长度(例如高度或宽度)可大于薄片厚度。薄片形式的支架颗粒可具有相对于彼此而言规则的形状或相对于彼此而言不规则的形状。在某些实施方案中，薄片形式的支架颗粒可具有由连续曲线(例如如在通常圆形或卵圆形或环形(例如“垫圈”)形状的薄片形式的颗粒中)限定的周界边缘，在其它形式中可具有多边形周界边缘(例如，具有3至10边，例如三角形、正方形或其它矩形、五边形、六边形、星形等)形状。例如，当在薄片的平面中考虑时，支架颗粒或其在组合物中的相当大比例(例如高于约25％)具有的最大横截面尺寸轴线不大于在与最大横截面尺寸轴线垂直并以其为中心的线上截取的横截面尺寸轴线的长度的约2倍；优选地，至少约50％的基底颗粒将具有该特征，更优选至少约70％的基底颗粒将具有该特征。这种颗粒状支架材料构成了本发明的一个实施方案，其可单独(例如作为无细胞组织移植物材料)使用或与本文所论述的细胞组合使用。

可从更大片的细胞生长支架材料上切下如上论述的小的薄片形式的细胞生长支架颗粒。在某些实施方案中，如本文所述，所述的较大片的材料将是从组织来源收获并去细胞化的细胞外基质薄片材料。在某些实施方案中使用机械工具诸如冲头和/或模具从较大的ECM薄片机械切割具有上述特征的薄片形式的颗粒。在所希望的实施方案中，如本文更详细讨论的，当该特征或这些分子驻留在正被处理的较大的起始ECM薄片中时，所使用的切割方法不会消除天然的生物活性ECM特征或天然的生物活性ECM分子。另外，处理ECM薄片，所得的ECM薄片颗粒可在薄片材料的一侧或两侧上保留有天然的上皮基底膜，和/或在薄片的一侧或两侧上具有生物合成地沉积的基底膜组分。为了用生物合成地沉积的非天然基底膜组分制备颗粒，可通过在薄片的一侧或两侧生长上皮细胞、内皮细胞、干细胞或其它细胞来使去细胞化的ECM薄片条件化，以沉积基底膜组分。然后可除去细胞，同时留下基底膜组分，然后处理该薄片以制备如本文所述的薄片形式的颗粒。

图1提供了一种说明性的小型ECM盘的数字图像，该盘是由冲头从较大的ECM薄片切割而成。可以看出，所示的薄片形式的支架颗粒在形状上是大体圆形的，具有约250微米的直径。同样，薄片形式的支架颗粒具有切割的周界边缘，其呈现胶原纤维的暴露切割端，这可有利于细胞附着至颗粒。当使用机械切割工具诸如冲头或冲头和模具切割这样的颗粒、同时避免通过摩擦或其它方式产生显著的热量时，切割的周界边缘在一些实施方案中可以不含或基本上不含热变性胶原。类似地，从其它纤维支架薄片材料切割的薄片形式的颗粒可具有形成薄片的纤维的暴露切割端。

现在参考图2，显示了用于使用冲头和模具系统来产生薄片形式的支架颗粒的排布的一个说明性实施方案。具体地，显示了细胞生长支架材料的三个薄片110、112和114的堆叠。如本文所论述的，薄片110、112和114通常位于X-Y轴(在图2中，X轴从左到右，Y轴出入页面)，而Z轴垂直于薄片的平面(在图2中显示为上下)。尽管所示的排布包括细胞生长支架材料的三个薄片，但应该理解的是，可使用其它数量的薄片，包括一片薄片、两片或更多片薄片，或者以某些形式使用2-10片薄片。冲孔头116包括多个冲头，诸如两个冲头118和120。在其它实施例中，例如可以以这样的排布使用例如2至20个冲头如冲头118和120。装在冲头118和120周围的是弹性套筒或管122和124(用虚线表示)。套筒122和124具有各自的远端126和128，它们延伸超过冲头118和120的前端130和132。位于ECM薄片110、112和114的堆叠之下的是模件134，其具有第一孔136和第二孔138，所述孔的尺寸被制定成在冲头和模具切割操作中分别接收冲头118和120的一部分。在使用中，冲孔头116被指向ECM薄片110、112和114的堆叠(在Z轴上)，使得弹性套筒122和124在与冲头前端130和132接触之前压入堆叠。这样，套筒122和124可稳定待被冲头118和120以及其各自的模具孔136和138切掉的薄片110、112和114的区域并优选向其施加张力。冲孔头116在薄片110、112和114的堆叠方向上(在Z轴中)的连续移动使得冲头118和120压入薄片110、112和114中，并继续进入模具134的孔136和138中，从而导致薄片形式的支架颗粒从薄片110、112和114上切离。在从薄片110、112和114分离之后，薄片形式的支架颗粒可以穿过孔136和138(例如由重力辅助)，并被收集在收集容器140，诸如小瓶或其它腔室中。在所示的实施方案中，冲头118和120及其各自的孔136和138通常是圆形的，从而形成大致圆形的薄片形式的支架颗粒。如上所论述的，应理解的是，可使用冲头和可选的具有相应形状的模具孔的模具来形成其它规则形状。在冲孔操作涉及使冲孔头116在X和/或Y轴移动的情况下，模具134可以与冲孔头116对准移动以保持冲头118和120及其各自模具孔136和138的对准；可选地，可为固定模具134提供比冲孔头116上的冲头更多的孔，并且冲孔头116可在X和/或Y轴上移动，以在每次移动其时将其冲头定位在模具中的一组新的孔上方。同样，应理解的是，在其它操作中，可将冲孔头116和冲模134在X和Y轴上保持静止，并将薄片110、112和114的堆叠在冲孔冲程之间在X和/或Y轴上移动，以对薄片110、112和114的新区域进行冲孔。应理解的是，在优选实施方案中，薄片110、112和114(或存在的任何数量的薄片)彼此不结合或以其它方式彼此粘附。这样，通过冲孔操作从各自薄片110、112和114产生的薄片形式的颗粒在冲孔操作期间和/或之后容易彼此分开。在其它实施方案中，可将堆叠中的一些或全部薄片彼此结合，从而导致形成多层薄片形式的细胞生长支架颗粒。

除了如上所述的冲孔操作以外，应理解的是，也可以使用其它冲孔或切割操作来产生薄片形式的支架颗粒。例如，参考图3，显示的是用于使用冲孔系统产生薄片形式的支架颗粒的另一种说明性排布。具体地，再次显示了细胞生长支架材料的三个薄片150、152和154的堆叠。同样地，虽然所示的排布包括三片细胞生长支架材料，但应该理解的是，可以使用其它数量的薄片，包括一张薄片、两张或更多张薄片，或者在某些形式中2至10张薄片。冲孔头156包括多个冲头，诸如两个冲头158和160。在其它实施方案中，例如可在这样的排布中使用例如2至20个冲头，如冲头158和160。装在冲头158和160周围的是弹性套筒或管162和164(以虚线显示的)。套管162和164具有各自的远端166和168，它们延伸超过冲头158和160的前端170和172。位于ECM薄片150、152和154的叠层下面的是冲孔背衬174。冲孔背衬174具有足够的顺应性以避免损坏冲头，但又足够坚韧以至于背衬的碎片不会被冲头切出。冲头158和160具有纵向延伸穿过它们的各自的通道176和178。通道176具有从前端170延伸并具有第一直径的第一部分180和具有第二直径的第二部分182，其中第二直径大于第一直径。类似地，通道178具有从前端172延伸并具有第一直径的第一部分184和具有第二直径的第二部分186，其中第二直径大于第一直径。第一部分180和184的直径对应于要形成的薄片形式的颗粒的直径。通道176和178与冲孔头156的壁192中的开口188和190流体连通。在使用中，冲孔头156被指向ECM薄片150、152和154的堆叠，使弹性套筒162和164在与冲头前端170和172接触之前压入堆叠。这样，套筒162和164可以稳定待被冲头158和160切掉的薄片150、152和154的区域，优选向其施加张力。冲孔头156在薄片110、112和114的堆叠的方向上的连续移动导致冲头158和160压入并切割薄片150、152和154，从而使薄片形式的支架颗粒从薄片150、152和154切离。在冲孔操作期间，将薄片形式的支架颗粒收集在通道176和178中，首先收集在第一部分180和184内，之后在多次冲孔实施期间第一部分被填满后将收集在部分182和186内。通过足够数量的冲孔实施，通道176和178被薄片形式的颗粒充满，在此之后，继续的冲孔迫使最上面的颗粒通过开口188和190，可将所述颗粒收集在冲孔头156的腔室中或以其它方式收集所述颗粒。如果需要的话，可通过对通道176和178施加真空以将颗粒吸向并可能地吸入冲孔头来辅助在通道176和178中以及通过所述通道收集颗粒。在其中冲头具有内部通道(诸如通道176和178)或在冲头有一致尺寸的通道的其它实施方案中，在已通过一个或多个冲孔实施而将颗粒收集在通道中后，可迫使推杆例如在自动操作中以从冲孔头156至前端172和178的方向通过通道，以将颗粒从通道中射出并从前端172和178中排出。这样的喷射颗粒可以例如被喷射至小瓶、小箱或其它收集腔室中以进行收集。

采用图3所示的排布的冲孔操作可涉及在一个向下的冲孔冲击期间在X和/或Y轴以及Z轴上移动冲孔头156；或者，可将冲孔头156在X轴和Y轴上保持静止，并在于Z轴上进行的冲孔冲击期间在X和/或Y轴上移动薄片150、152和154的堆叠以及背衬174，以对薄片110、112和114的新区域进行冲孔。同样地，应理解的是，在优选实施方案中，薄片150、152和154(或存在的任何数量的薄片)彼此不结合或以其它方式粘合。这样，在冲孔操作期间和/或之后，通过冲孔操作从各自薄片150、152和154产生的薄片形式的颗粒容易彼此分离。在其它实施方案中，堆叠中的一些或全部薄片可彼此结合，从而导致形成多层薄片形式的细胞生长支架颗粒。

视情况而定，优选地使用计算机化数字控制(CNC)以自动化方式移动和操作冲孔头、模具、薄片的堆叠和/或冲孔背衬，进行如本文所述的用于制备薄片形式的支架颗粒的冲孔操作。可在CNC控制下使用多个电动线性执行器来实现冲孔所需的操作。在优选操作中，获得至少约50％的冲孔效率(意味着按重量计至少约40％的经受冲孔操作的原始薄片作为薄片形式的支架颗粒被回收)，通常在范围为40％至60％的范围内，优选在50％至60％的范围内。冲头优选由碳化钨或另一类似的硬金属制成。

尽管已结合上面的图2和图3描述了冲孔排布和操作，但是应当理解，根据本文中的描述，适合于制备薄片形式的支架颗粒的其它合适的机械切割和其它切割操作对于本领域技术人员将是显而易见的。

如上所述，用于制备薄片形式的支架颗粒的薄片材料可包含细胞外基质(ECM)组织。ECM组织可以从温血脊椎动物诸如羊、牛或猪的动物获得。例如，合适的ECM组织包括包含粘膜下层、肾囊膜、真皮胶原蛋白、硬膜、心包膜、阔筋膜、浆膜、腹膜或基膜层(包括肝基膜)的组织。用于这些目的的合适的粘膜下层材料包括例如肠粘膜下层(包括小肠粘膜下层)、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。可用于本发明的包含粘膜下层的ECM组织(可能与其它相关组织一起)可通过收集这样的组织来源并将含粘膜下层的基质与平滑肌层、粘膜层和/或组织来源中存在的其它层分层来获得。猪组织来源是收集ECM组织(包括含有粘膜下层的ECM组织)的优选来源。

当用于本发明时，优选对ECM组织进行去细胞化和高度纯化，例如如授予Cook等的美国专利第6,206,931号或2008年11月20日公开的美国专利申请公开第US2008286268号(公布了2008年7月23日提交的美国专利申请序列第12/178,321号)(其全部由此通过引用整体并入本文)中所述。优选的ECM组织材料将显示低于每克约12个内毒素单位(EU)，更优选低于每克约5EU，最优选低于每克约1EU的内毒素水平。作为另外的优选，粘膜下层或其它ECM材料可具有小于每克约1个集落形成单位(CFU)，更优选小于每克约0.5CFU的生物负荷。理想的是真菌水平同样低，例如低于每克约1CFU，更优选低于每克约0.5CFU。核酸水平优选低于约5μg/mg，更优选低于约2μg/mg，病毒水平优选低于每克约50个噬菌斑形成单位(PFU)，更优选低于每克约5PFU。美国专利第6,206,931号或美国专利申请公开第US2008286268号中教导的粘膜下层或其它ECM组织的这些和另外的性质可能是用于本发明的任何ECM组织的特征。

在某些实施方案中，用作薄片材料或用于薄片材料的ECM组织材料将是具有从组织来源分离的片状结构的膜状组织。当完全水化时，ECM组织可以如分离的那样具有在约50至约250微米范围内的层厚度，更常见地当完全水化时具有约50至约200微米的层厚度，尽管也可以获得并使用具有其它厚度的分离的层。这些层厚度可随用作组织来源的动物的类型和年龄而变化。同样地，这些层厚度可随从动物来源获得的组织的来源而变化。

所使用的ECM组织材料理想地保持来自源组织的结构性微结构，包括非随机取向的结构纤维蛋白诸如胶原蛋白和/或弹性蛋白。这种非随机的胶原蛋白和/或其它结构蛋白纤维在某些实施方案中可提供在拉伸强度方面并非各向同性的ECM组织，因此在一个方向上的拉伸强度不同于在至少一个其它方向上的拉伸强度。

ECM组织材料可包括所述ECM组织材料的来源中天然存在的并通过处理仍保留在所述ECM组织材料中的一种或多种生物活性剂。例如，粘膜下层或其它可重塑ECM组织材料可保留一种或多种天然生长因子，诸如但不限于碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF))、软骨衍生生长因子(CDGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。同样，当用于本发明时，粘膜下层或其它ECM材料可以保留其它天然生物活性剂，诸如但不限于蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖。例如，ECM材料可以包括肝素、硫酸肝素、透明质酸、纤连蛋白、细胞因子等。因此，一般而言，粘膜下层或其它ECM材料可从源组织保留一种或多种直接或间接诱导细胞响应(诸如细胞形态、增殖、生长、蛋白质或基因表达的变化)的生物活性组分。

用于本发明的含粘膜下层ECM材料或其它ECM材料可以衍生自任何合适的器官或其它组织来源，通常是含有结缔组织的来源。经处理用于本发明的ECM材料通常包括丰富的胶原蛋白，最常见地构成按重量计(基于干重)至少约80％的胶原蛋白。这种天然来源的ECM材料大部分将包括非随机取向的(例如通常作为单轴或多轴但规则取向的纤维存在的)的胶原纤维。当处理以保留天然生物活性因子时，ECM材料可保留这些因子，作为固体散布在胶原纤维之间、之上和/或之内。用于本发明的特别理想的天然来源的ECM材料将包括显著量的这种散布的非胶原固体，其在光学显微镜检查下可容易地通过适当的染色来确定。在某些本发明的实施方案中，这种非胶原固体可构成ECM材料的干重的显著百分比，例如在本发明的各种实施方案中按重量计至少约1％、至少约3％和至少约5％。

本发明中使用的含有粘膜下层ECM材料或其它ECM材料还可表现出血管生成特性，因此可在植入该材料的宿主中有效诱导血管生成。在这一点上，血管生成是身体籍以生成新血管以增加对组织的血液供应的过程。因此，当与宿主组织接触时，血管生成材料增进或促进新血管至材料中的形成。近来已经开发了用于测量响应于生物材料植入的体内血管生成的方法。例如，一种这样的方法使用皮下植入物模型来确定材料的血管生成特性。参见C.Heeschen等，Nature Medicine7(2001)，No.7,833-839。当与荧光微血管造影技术结合时，该模型可提供生物材料中血管生成的定量和定性测量。C.Johnson等，CirculationResearch 94(2004),No.2,262-268。

另外，除了包含这样的天然生物活性组分以外或作为其替代，还可将非天然的生物活性组分(诸如通过重组技术或其它方法合成产生的那些组分(例如，遗传物质诸如DNA)掺入至本发明中使用的ECM材料中。这些非天然的生物活性组分可以是天然来源的或重组产生的蛋白质，其对应于天然存在于ECM组织(但可能是不同物种)中的蛋白质。这些非天然的生物活性组分也可以是药物物质。可被添加至材料中的示例性药物物质包括例如抗凝血剂(例如肝素)、抗生素、抗炎剂、血栓促进物质诸如凝血因子(例如凝血酶、血纤蛋白原等)和抗增殖剂(例如紫杉醇衍生物诸如紫杉酚)。可将这样的非天然生物活性组分以任何合适的方式(例如，通过表面处理(例如，喷雾)和/或浸渍(例如，浸泡))掺入至ECM材料中和/或ECM材料上(仅举几例)。同样地，可将这些物质在预制造步骤中，在即将进行所述方法之前(例如，通过将材料浸泡在含有合适的抗生素诸如头孢唑林的溶液中)或在患者中植入材料期间或之后施加至ECM材料。

本文中的本发明的移植组合物可包含异种移植物ECM材料(即，跨物种材料，诸如对于人受者，来自非人供体的组织材料)、同种异体移植ECM材料(即，种间材料，组织材料来自与受者属于相同物种的供体)，和/或自体ECM材料(即，当供体和受体是相同的个体时)。另外，掺入ECM材料中的任何外源性生物活性物质可来自ECM材料所源自的动物的相同种类(例如，相对于ECM材料是自体的或同种异体的)，或者可来自与ECM材料来源不同的物种(相对于ECM材料是异种的)。在某些实施方案中，ECM组织材料对于接受移植物的患者将是异种的，并且任何添加的细胞或其它外源性材料将来自与接受移植物的患者相同的物种(例如，自体或同种异体的)。示例性地，可用已经用本文所述的外源人细胞和/或血清蛋白和/或其它材料修饰的异种ECM材料(例如，猪、牛或羊来源的)来处理人类患者，那些外源性材料是天然来源的和/或重组产生的。

当用于本发明时，ECM材料可以不含或基本上不含另外的非天然交联，或可含有另外的交联。这种另外的交联可通过光交联技术，通过化学交联剂，或通过脱水或其它手段诱导的蛋白质交联来实现。然而，由于某些交联技术、某些交联剂和/或一定程度的交联会破坏可重塑材料的可重塑性能，当需要保持可重塑性质时，可重塑性ECM材料的任何交联可以允许所述材料保留其至少一部分可重塑性的程度或方式进行。可使用的化学交联剂包括例如醛(诸如戊二醛)、二酰亚胺(诸如碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、核糖或其它糖、酰基叠氮化物、磺基-N-羟基琥珀酰胺，或聚环氧化物化合物，包括例如聚缩水甘油醚诸如乙二醇二缩水甘油醚(可以商品名DENACOL EX810从NageseChemical Co.,Osaka,Japan购得)；以及也可以以商品名DENACOL EX 313商品名从NageseChemical Co.购得的甘油聚甘油醚。通常，当使用时，聚甘油醚或其它聚环氧化物化合物将每分子具有2至约10个环氧基团。

除了ECM材料以外或作为ECM材料的替代品，用于本发明的支架材料还可由其它合适的材料组成。示例性的材料包括例如合成产生的由天然或合成的聚合物组成的基质。示例性的合成聚合物可包括不可吸收的合成生物相容性聚合物，诸如乙酸纤维素、硝酸纤维素、硅酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚醚砜、聚碳酸酯、聚丙烯、高分子量聚乙烯、聚四氟乙烯或其混合物或共聚物；或可再吸收的合成聚合物材料诸如聚乳酸、聚乙醇酸或其共聚物、聚酸酐、聚己内酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基脂肪酸酯或另一种生物可降解聚合物或其混合物。由这些或其它材料组成的优选支架材料将为被构造来允许细胞侵入并向内生长至基质中的多孔基质材料。

在优选模式中，在冲孔或其它切割操作期间，细胞生长支架材料的薄片或多个薄片处于干燥状态。例如，可将本文所述的细胞外基质组织材料或其它材料冻干、风干、烘箱干燥、真空干燥或以其它方式干燥，以提供用于冲孔或切割操作的起始材料。在一些实施方案中，在冲孔/切割操作期间，细胞外基质组织材料或其它薄片材料可具有小于按重量计约15％或小于按重量计约10％的水含量。

在某些形式中，用于本发明的薄片形式的支架材料可在与细胞接触之前用细胞培养基和/或血液或血液级分处理。例如，用于制备如本文所述的薄片形式的细胞生长支架颗粒的细胞生长支架材料薄片可用细胞培养基和/或血液或血液级分预处理，并且可在冲孔或其它切割操作期间(例如，如干燥成一片支架材料时，之后在干燥状态下对其进行冲孔或切割)掺入一种或多种这样的物质，以产生所述薄片形式的颗粒。另外或可选地，形成的薄片形式的颗粒可在与细胞接触之前用这样的物质处理。

为了制备接种了细胞的移植组合物，可将薄片形式的支架颗粒或包含如本文所述的这样的颗粒群体的组合物与细胞制剂组合。对于可流动的移植物，可将支架颗粒悬浮在液体介质诸如含水介质中。在施用之前，在一些实践中可将细胞和颗粒在细胞附着期间进行温育，使得细胞附着至颗粒上。颗粒的尺寸和薄片形式提供了有利的悬浮和细胞附着特性，当使用柔性基底材料诸如细胞外基质薄片村料时，所述特性得到增强。为了向患者施用，可将接种了细胞的颗粒装载在注射器或其它递送装置中，并将移植物递送至作为移植目标的组织。示例性地，参照图4，显示了包括装载在注射器302中的可流动的细胞移植物组合物301的医疗装置300。细胞移植物组合物301包括包含薄片形式支架颗粒304以及附着于每个颗粒304上的细胞群体305的多个细胞化小体303(如本文中所论述的)。在某些实施方案中，细胞305可形成覆盖基质颗粒304的通常汇合的细胞层。将细胞化小体303悬浮在液体介质306诸如含水培养基(其任选地含有用于细胞的营养物，并且与人或其它患者生理相容)中。细胞移植物组合物301是可流动的并且容纳在注射器302的筒307内。柱塞308容纳在筒307内，并且在线性致动时是可操作的，以驱动组合物301通过流体式耦合的针309并离开其开口310。因此可使用医疗装置300来将组合物301施用至患者的组织中。在某些优选的实施方案中，靶组织需要重血管化，并且细胞移植体303包括能够形成血管的细胞305，例如内皮细胞或内皮祖细胞，在某些实施方案中包括本文论述的内皮细胞集落形成细胞。一旦注射到目标组织中，基质颗粒304将有助于将细胞305保留在被靶向区域中。在特别优选的实施方案中，颗粒304是如本文所述的细胞外基质颗粒。

如上所公开的，在某些实施方案中，细胞移植物可通过在薄片形式的颗粒存在下温育细胞持续足以使细胞附着至颗粒的时间来制备。在另外的实施方案中，可将细胞与颗粒一起在培养物中温育比细胞附着所需的更长的时间。在这些实施方案中，细胞可以重塑支架颗粒，例如沉积细胞内源性的细胞外基质蛋白诸如胶原蛋白，并且还可能吸收支架颗粒的细胞外基质蛋白诸如胶原蛋白。在一些形式中，在支架颗粒存在的情况下细胞的培养持续一段时间，使得存在于细胞化小体310中的胶原蛋白的至少1％、至少5％或至少10％对于细胞是内源性的。在其它形式中，细胞化小体中更高百分比的胶原蛋白对于细胞可以是内源性的，例如至少50％，或者在一些情况下，存在于细胞化小体310中的全部或基本上全部(高于99.5％)胶原蛋白对于细胞可以是内源性的。在这样的培养期过程中，细胞的数量可被扩增和/或在能够分化的细胞的情况下，至少一些细胞可以进行分化。示例性的培养期可以例如长于2小时，长于6小时或长于12小时；在一些实施方案中，培养期将在约12小时至72小时的范围内。在如上所述的培养期之后，可向患者施用包含该细胞化小体的组合物，例如，以治疗如本文所述的病况。

在更进一步的实施方案中，在如本文所述的温育和/或培养期之后，可将细胞从细胞化小体中脱离下来，例如以产生细胞的单细胞悬浮液。脱落可以例如通过酶促(例如利用酶诸如胰蛋白酶和/或胶原酶)处理细胞化小体来实现。然后可将细胞以单细胞悬浮液的形式向患者施用，或者可将其处理成其它移植物形式(例如接种至另一种支架或多种支架上)以向患者施用，例如以治疗如本文所述的病况。如果需要的话，在细胞已经脱离后，可通过过滤或者以其它方式在施用单细胞悬液或细胞的其它用途之前将初始的薄片形式支架颗粒(当存在时)的剩余部分与细胞分离。

在另外的实施方案中，如本文所述的薄片形式的支架颗粒可以用作悬浮培养中的细胞生长支持物，以制备可从细胞中分离出来用于医学、研究或其它目的的细胞条件培养基。已经发现，在薄片形式的支架颗粒存在的情况下的培养可用于修饰细胞的分泌蛋白质组，例如通过使细胞分泌化学引诱物和/或炎性介质细胞因子的量大于它们在薄片形式的支架颗粒不存在的情况下在对应的培养物中分泌的量来进行所述修饰。因此，本发明的实施方案包括其中将细胞在培养基中在包含薄片形式支架颗粒的细胞生长支持物上培养的过程，以及将培养基与细胞分离。如果需要，可处理培养基以确保其不含病原体，并将其向患者施用，例如治疗如本文所述的病况。

本发明的细胞移植物相关组合物和方法中可使用多种细胞类型中的任一种或任何组合。例如，细胞可以是皮肤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肺细胞、肠系膜细胞或脂肪细胞。脂肪细胞可以来自网膜脂肪、腹膜脂肪、肾周脂肪、心包脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪或附睾脂肪。在某些实施方案中，细胞包含基质细胞、干细胞或其组合。如本文所用，术语“干细胞”以广义使用，并且包括常规干细胞、脂肪来源的干细胞、祖细胞、前祖细胞(preprogenitor cell)、贮藏细胞等。示例性干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、多能干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞(例如来源于血液、牙组织、皮肤、子宫组织、脐带组织、胎盘组织等)、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系统干细胞等。可使用的另外的示意性细胞包括肝细胞、上皮细胞、枯否细胞、成纤维细胞、神经元、心肌细胞、肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、朗格汉斯胰岛、骨细胞、成肌细胞、卫星细胞、内皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胆道上皮细胞、再生细胞和任何这些细胞类型的祖细胞。

在一些实施方案中，细胞移植物中掺入的细胞是内皮祖细胞(EPC)或包括所述细胞。用于本发明的优选EPC是内皮集落形成细胞(ECFC)，尤其是具有高增殖潜力的ECFC。在例如2005年12月1日公开的美国专利申请公开第20050266556号(公开了2005年2月9日提交的美国专利申请序列第11/055,182号)和2008年1月1日公开的美国专利申请公开第20080025956号(公开了2007年8月13日提交的美国专利申请第11/837,999号)(其各自通过引用整体并入本文)中描述了合适的这样的细胞。这样的ECFC细胞可以是克隆群体，和/或可以从人或其它动物的脐带血获得。另外或可选地，内皮集落形成细胞具有以下特征：(a)表达细胞表面抗原CD31、CD105、CD146和CD144；和/或(b)不表达CD45和CD14；和/或(c)摄取乙酰化的LDL；和/或(d)当从单细胞铺板时重新铺板成至少2000个细胞的至少次级集落；和/或(e)表达高水平的端粒酶，至少为HeLa细胞表达的34％；和/或(f)显示大于0.8的细胞核对细胞质的比率；和/或(g)具有小于约22微米的细胞直径。这些特征(a)-(g)中的一些或全部的任意组合可以表征本发明中使用的ECFC。

在其它实施方案中，掺入细胞移植物中的细胞是或包括肌肉来源的细胞，包括肌肉来源的成肌细胞和/或肌肉来源的干细胞。例如，在美国专利第6,866,842号和美国专利第7,155,417号中描述了合适的这种干细胞及其获得方法，这些专利的每一篇通过引用整体并入本文。肌肉来源的细胞可表达结蛋白、M-钙粘蛋白，MyoD、肌形成蛋白、CD34和/或Bcl-2，并且可以缺乏CD45或c-Kit细胞标志物的表达。

在其它实施方案中，掺入细胞移植物中的细胞是或包括源自脂肪组织的干细胞。例如在美国专利第6,777,231号和美国专利第7,595,043号中描述了合适的这种细胞和其获得方法，这些专利中的每一篇由此通过引用整体并入本文。细胞群体可包括脂肪来源的干细胞和再生细胞，有时也称为基质血管级分细胞，其可以是包括干细胞、内皮祖细胞、白细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的混合群体，其可以是成体来源的。在某些形式中，本发明的细胞移植物可用可以分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或肌细胞中的两种或更多种的脂肪来源的细胞来制备，以及可包括这样的细胞。

根据本发明方面的和根据本发明方面制备的移植材料和/或细胞条件培养基可用于各种临床应用以治疗受损、患病或不足的组织，并可用于人或非人类动物。例如，待治疗的这类组织可以是肌肉组织、神经组织、脑组织、血液、心肌组织、软骨组织、器官组织诸如肺、肾或肝组织、骨组织、动脉或静脉血管组织、皮肤组织、眼组织等。

在某些实施方案中，移植物或条件培养基可用于增强患者血管的形成，例如以缓解组织中的局部缺血。将血管形成性的细胞移植物(例如含有内皮细胞集落形成细胞或其它内皮祖细胞的移植物)直接施用至缺血部位可以增强受影响的区域中新血管的形成并改善血流或其它结果。待治疗的缺血性组织可以例如是缺血性心肌组织(例如在梗塞之后)，或腿或其它肢体中的缺血组织，诸如发生在严重肢体缺血中。向局部缺血组织施用的细胞移植物可以是可流动的移植材料，特别是如本文所公开的可注射的移植材料。

移植物或条件培养基也可用于增强部分或全层皮肤伤口诸如皮肤溃疡(例如糖尿病性溃疡)和烧伤的愈合。说明性地，向这样的伤口施用含有内皮细胞集落形成细胞或其它内皮祖细胞，或干细胞或细胞条件培养基的移植物可增强伤口的愈合。本文涵盖移植物或条件培养基的这些和其它局部应用。

在其它应用中，移植物或条件培养基可用于例如在骨骼肌组织、平滑肌组织、心肌组织或其它组织的治疗中在靶部位处产生肌肉组织或促进产生肌肉组织。说明性地，可以例如通过注射将包含肌肉衍生的成肌细胞的本发明细胞移植物递送至括约肌诸如尿道膀胱括约肌中以治疗失禁。

在其它应用中，如本文所述的移植物可以用于关节内注射，或用作构建块用于工程化组织。

为了促进对本发明的各方面及其特征和有利方面的进一步理解，提供以下具体实验。应该理解的是，这个实验描述是说明性的，不对本发明的各个方面构成限制。

实验

材料和方法

基质(SIS盘)的产生

以除去所有细胞、但留下基质的天然纤维性质和多孔性质的方式从肠中获得小肠粘膜下层(SIS)材料(Cook Biotech，Inc.，USA)。细心处理留下可用于新细胞向内生长的复杂细胞外基质。从其产生SIS产品的薄而强的小肠层具有允许细胞亲密接触并主要由蛋白质组成的三维结构。使用使天然的细胞外基质组分损失最小化的方法来制造SIS产品。为确保患者安全，SIS材料经过彻底的消毒、去细胞化和病毒灭活过程。作为该过程中的最后一步，所有SIS产品均通过经过确认有效的灭菌方法来进行灭菌。为了产生培养盘基质，使用冲孔系统切割亚毫米的盘，所述系统允许大量盘的连续生成(参见图1)。

C-URC分离和在SIS盘上的原代培养

从当地低成本spay-neuter诊所，从已被呈送以进行卵巢子宫切除术的雌性犬获得完全完整的子宫。本研究中使用的组织原本会作为医疗废物丢弃。一旦样本到达实验室，卵巢被取出并丢弃，然后将子宫分离成约1克的全厚度的切片。

然后用无菌手术刀将1克样品切碎成≤1mm³的碎片。将切碎的组织置于酶浴中，如上所述在37℃下消化30分钟。一旦消化完成，就用培养基(含有10％胎牛血清和0.25mg/mL两性霉素B，100IU/mL青霉素-G和100mg/mL链霉素的DMEM-HG)中和酶，以300×g离心5分钟，并重新悬浮在新鲜的培养基中。然后将内容物通过200μm无菌膜过滤，并置于25cm²烧瓶中。培养14天后，使用TrypZean^TM溶液(除非另有说明，本研究中的所有试剂均获自SigmaChemical,USA)将细胞分成0代(P0)，并使用标准台盼蓝染料排斥测定和血细胞计数器评估细胞计数和活力。所得的细胞被称为犬子宫再生性细胞(C-URC)。

通过在完全培养基中温育过夜来对SIS盘进行条件化。然后将盘以10cm²/ml接种至非附着性24孔板中。然后将犬URC以7700个细胞/cm²添加到实验孔中。还对两个平板中的每一个制备了对照孔。在轻轻摇动的条件下将细胞与URC一起在37℃和6％CO₂下温育9天。

每三天(第3、6和9天)取出150μL消耗过的培养基并在-20℃下保存以用于多重分析(在实验结束时进行)，并用新鲜的完全培养基代替。评估培养基中的GM-CSF、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IP-10、KC-Like、IL-10、IL-18、MCP-1和TNF-α。

注射后细胞完整性的评估

对于这些实验，使用表达红色荧光蛋白的HeLa细胞(RPF-HeLa)。简言之，从培养物中取出经胰蛋白酶处理的HeLa细胞(2x10⁷)，并在22℃下以300-500g离心4分钟。将细胞重悬于含有钙和镁的PBS中。使用luer-to-luer注射器连接器，通过在注射器之间通过20次将1.5ml SIS微粒与500ul PBS(含有钙/镁)混合。随后，将与PBS中的RFP-HeLa细胞相同体积的SIS颗粒转移至1mL注射器中，然后通过在注射器之间通过3-4次，利用双向luer-to-luer连接器(2-wayluer-to-luer connector)与SIS盘混合。将约200μl细胞-SIS组合移入1mL注射器中的一个中，将注射器尖端帽固定在鲁尔(luer)连接器上，并将注射器置于37℃的培养箱中。

在最短30分钟后，从培养箱中取出注射器，连接23G针，并将100μl的SIS盘+RFP-HeLa细胞注射到小鼠的后肢肌肉中。

结果

C-URC很容易附着在SIS ECM盘上，并表现出良好的形态(图2)。所得培养物中促炎和合成代谢细胞因子的测量显示出低于可检测参数的水平，而化学引诱物和炎性介质细胞因子似乎被上调(图3)。与SISBioDiscs组合的HeLa细胞在注射后48小时表现出高活力和稳定性(图4)。

结论

·SIS ECM盘为细胞培养和/或扩增提供了基底，其可为当前的放大治疗系统提供额外的益处。

·促炎细胞因子低于来自SIS ECM盘上培养的细胞的可检测参数，而化学引诱物和炎症介质细胞因子似乎上调。

·SIS ECM盘在注射后似乎保护细胞。

·细胞化ECM盘具有作为独立的基于细胞的疗法(具有增加的生长因子可用性并且无需细胞的胰蛋白酶化)的潜能。

除非在本文中另外指出或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文(尤其是在下面的权利要求的上下文中)中，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“the(该)”以及类似的参考的使用将被解释为涵盖单数和复数两者。除非在此另外指出，否则本文中的数值范围的引述仅仅意在用作单独指代落入该范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独的数值被并入说明书，就好像其在本文中被单独列举一样。除非在本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素是实施本发明所必需的。

虽然已经在附图和前面的描述中详细说明和描述了本发明，但应该认为这是说明性的而不是限制性的，应当理解，只有优选实施方案已经被显示和描述，并且在本发明精神范围内的所有变化和修改均希望得到保护。另外，本文中引用的所有参考文献都是本领域技术水平的指示，并且通过引用整体并入本文。

Claims (41)

1.一种制备细胞生长支架颗粒的方法，其包括：

迫使至少一个冲头穿过细胞生长支架材料的至少一个薄片以从所述薄片取出薄片形式的支架颗粒；和

收集在所述加压步骤中从所述薄片取出的薄片形式的支架颗粒。

2.权利要求1的方法，其还包括在所述加压过程中向所述至少一张薄片施加张力。

3.权利要求2的方法，其中所述施加张力包括将弹性构件靠在所述至少一张薄片上挤压。

4.权利要求2或3的方法，其中所述挤压在所述加压过程中发生，并且在所述冲头移动期间被释放，以从所述至少一张薄片撤出所述冲头。

5.权利要求3或4的方法，其中所述弹性构件包含具有限定周界的前端的弹性管状壁，并且其中所述挤压包括将所述管状壁的前端靠在所述至少一个层上挤压。

6.权利要求4的方法，其中在所述挤压期间，所述周界围绕所述冲头。

7.前述权利要求中任一项的方法，进行所述方法以使细胞生长支架颗粒构成按重量计所述一张或多张薄片的至少40％，更优选至少50％，更优选50-60％。

8.前述权利要求中任一项的方法，其包括多次进行所述加压步骤以在所述一张或多张薄片中产生多个孔，其中所述细胞生长支架颗粒已被取出以产生所述孔，并且其中所述孔彼此间隔开。

9.权利要求7的方法，其中所述孔的相邻孔彼此间隔开至少约0.1mm。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述收集包括将所述薄片形式的支架收集在所述冲头中的通道中。

11.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述冲头从所述薄片的第一侧进入所述至少一张薄片，并且其中所述收集包括将所述细胞生长支架颗粒释放穿过并超出所述至少一张薄片的第二侧。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一张薄片包括呈堆叠构造的至少两张薄片，并且优选地，其中所述至少一张薄片包括呈堆叠构造的2至10张薄片。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一个冲头包括至少两个冲头，并且优选地，其中所述至少一个冲头包括2至20个冲头。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述加压包括同时迫使所述至少两个冲头，优选地所述2至20个冲头穿过所述细胞生长支架材料的至少一张薄片以从所述薄片取出薄片形式的支架颗粒。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述支架材料的至少一张薄片包含细胞外基质组织材料，并且优选地，其中所述组织材料保留原先存在于所述细胞外基质组织材料的来源中的一种或多种生物活性剂，更优选其中所述一种或多种生物活性剂包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、软骨衍生生长因子(CDGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、糖蛋白、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一张薄片的支架材料包含细胞外基质组织材料，其为具有从组织来源分离的薄片结构的膜组织。

17.一种根据权利要求1至16中任一项的方法制备的薄片形式的细胞生长支架颗粒。

18.一种颗粒细胞生长支架组合物，其包含：

薄片形式的细胞生长支架颗粒的群体，其中所述颗粒具有由切割边缘限定的周界。

19.权利要求18的组合物，其中所述切割边缘是机械切割边缘。

20.权利要求18或19的组合物，其中所述切割边缘不含热变性胶原并且呈现胶原纤维的暴露切割端。

21.权利要求18至20中任一项的组合物，其中所述颗粒具有圆形、卵形或多边形形状。

22.权利要求18至21中任一项的组合物，其中所述支架颗粒包含细胞外基质组织材料，并且优选地，其中所述组织材料保留原先存在于所述细胞外基质组织材料的来源组织中的一种或多种生物活性剂，更优选其中所述一种或多种生物活性剂包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、软骨衍生生长因子(CDGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、糖蛋白、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖。

23.权利要求22的组合物，其中所述支架颗粒包含膜状细胞外基质组织材料。

24.权利要求18至23中任一项的组合物，其中所述支架颗粒掺入了细胞培养基、血液或血液级分。

25.权利要求18至23中任一项的组合物，其中所述支架颗粒处于干燥状态。

26.权利要求18至23中任一项的组合物，其中所述支架颗粒处于冻干状态。

27.权利要求18至24中任一项的组合物，其还包含细胞，并且优选其中所述细胞是上文鉴定的细胞中的任一种或其组合。

28.权利要求18至27中任一项的组合物，其还包含附着于所述支架颗粒的细胞，并且优选地其中所述细胞是上文鉴定的细胞中的任一种或其组合。

29.权利要求18至28中任一项的组合物，其中所述薄片形式的支架颗粒具有约20微米至约2000微米，更优选约100至约1000微米，更优选约100至500微米的最大横截面尺寸；并且还优选地其中所述薄片形式的支架颗粒具有小于所述最大横截面尺寸的薄片厚度。

30.一种用于制备组合物的方法，其包括：

在根据权利要求18至29中任一项的组合物存在的情况下悬浮温育细胞，以使所述细胞附着至所述薄片形式的支架颗粒。

31.权利要求30的方法，其还包括将所述细胞充分培养以形成细胞化小体，其中所述细胞已在所述薄片形式的支架颗粒中和/或其上沉积了对于所述细胞是内源性的细胞外基质蛋白。

32.权利要求31的方法，其中充分进行所述培养，使得所述细胞化小体中胶原蛋白的至少1％，优选至少2％，更优选至少10％对于所述细胞是内源性的。

33.权利要求30至32中任一项的方法，其还包括将所述细胞从所述薄片形式的支架颗粒或从所述细胞化小体脱离下来。

34.权利要求33的方法，其还包括在所述脱离时或之后从所述细胞形成单细胞悬浮液。

35.据权利要求33或34的方法，其中所述脱离包括使所述薄片形式的支架颗粒或细胞化小体与酶接触，优选其中所述酶为胰蛋白酶和/或胶原酶。

36.权利要求33至35中任一项的方法，其还包括在所述脱离之后，将所述薄片形式的支架颗粒的残余物与所述细胞分离。

37.权利要求30至35中任一项的方法，其还包括收集在所述温育和/或所述培养期间已被条件化的液体培养基。

38.权利要求37的方法，其还包括对所述液体培养基进行灭菌。

39.一种用于治疗患者的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求1至16中任一项制备的细胞生长支架颗粒，根据权利要求18至29中任一项的颗粒细胞生长支架组合物或根据权利要求30至38中任一项制备的组合物。

40.权利要求39的方法，其中所述施用是通过注射。

41.权利要求39的方法，其用于治疗受损、患病或不足的组织，包括上文中鉴定的那些组织中的任何一种。