CN107817307B - Hplc法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法。所述方法中采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质包括异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质；所述相关杂质为A‑E中的一种或多种；所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述的流动相B为甲醇。本发明的方法能同时分离测定帕司烟肼中异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质A‑E，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；能更精准的确保帕司烟肼原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法。
背景技术
帕司烟肼为处方类药物，是一种人工合成的抗结核药物，用于治疗各型肺结核、支气管内膜结核及肺外结核。并可作为与结核病相关手术的保护药，也可用于预防长期或大剂量皮质激素、免疫抑制治疗的结核感染及复发。
帕司烟肼的抗结核的成分主要为异烟肼，帕司烟肼是由氨基水杨酸和异烟肼松散结合而成，理论上氨基水杨酸和异烟肼之比应为l：0.8957(相对分子质量之比)。分子中的对氨基水杨酸可避免异烟肼在体内乙酰化，药物口服后在胃肠道迅速分解为对氨基水杨酸和异烟肼，分子中的对氨基水杨酸可阻止异烟肼在体内的乙酰化，从而加强异烟肼的抗结核作用，比单纯的异烟肼或异烟肼加高剂量的对氨基水杨酸混合治疗效果优越。但过量的对氨基水杨酸会影响测定结果，且其不良反应越来越受到临床关注。帕司烟肼中所含间氨基酚对呼吸、中枢神经、消化及内分泌系统均有不同程度的毒性作用，长期服用可能导致肝肾功能衰竭、内分泌紊乱等严重后果。
目前帕司烟肼片剂的含量测定方法有溴液滴定或高氯酸滴定，这种测定方法，不能有效地控制本品的质量。还有报道采用HPLC测定对氨基水杨酸和异烟肼的含量；还有采用毛细管气相色谱法分离帕司烟肼中的对氨基水杨酸和异烟肼并以烟酰胺为内标测定其含量。但这些方法只是测定了其中的异烟肼对氨基水杨酸，并没有对帕司烟肼药物的其他杂质进行有效的分离和测定。国家药品标准[WS-10001-(HD-0322)-2002]收载有本品质量标准，但也未对有关物质进行控制。
所以需要开发一种能够有效分离和测定帕司烟肼及其相关杂质的方法，有效地控制帕司烟肼药品的质量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法。本发明的方法能同时分离测定帕司烟肼中异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质A-E，提高了分离检测的效率，确保帕司烟肼原料药及其制剂的质量可控。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法，所述方法中采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质包括异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质；所述相关杂质为A-E中的一种或多种，具体结构式如下所示：
所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述的流动相B为甲醇。
进一步，所述磷酸盐缓冲液为包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和四丁基硫酸氢铵的溶液。
本发明的方法经流动相A磷酸盐缓冲液和流动相B甲醇梯度洗脱能同时使帕司烟肼中异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质A-E主峰有效分离和检出，提高了分离检测的效率；能更精准的确保帕司烟肼原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
现行标准中国药典2015年版流动相中缓冲盐中离子对试剂采用四丁基氢氧化铵，本发明方法将其替换为四丁基硫酸氢铵，因发现市售的10％四丁基氢氧化铵溶液纯度较差，使得色谱图的基线噪音较大，基线不平，存在干扰，而且市售四丁基氢氧化铵溶液的实际浓度不是一个固定的浓度(其试剂瓶上标明为不小于10％或不小于20％)，不同批次的四丁基氢氧化铵溶液浓度也有较大差异，无法准确控制加入四丁基氢氧化铵的量，而在该液相色谱体系中的离子对四丁基铵根离子对主峰及各杂质的分离情况及出峰时间影响较大，使得方法耐用性较差。为避免上述情况，本发明的方法采用具有相同碱基部分的四丁基硫酸氢铵固体(市场上容易得到的化学试剂)代替四丁基氢氧化铵溶液。
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和四丁基硫酸氢铵的溶液。
进一步，所述磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.1％～0.3％(W/V)。
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.15％～0.25％(W/V)。
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为0.024mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.022mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.2％(W/V)。
进一步，所述梯度洗脱设置如下：
作为一种优选，所述梯度洗脱设置如下：
进一步，HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法，具体包括以下步骤：
1)配制系统适用性溶液：取帕司烟肼对照品和杂质A-E经甲醇溶解后用溶剂稀释，得系统适用性溶液；
2)配制供试品溶液和对照溶液：取供试帕司烟肼加溶剂溶解后经滤膜滤过，得供试品溶液；将配制得到的供试品溶液加溶剂稀释，得对照溶液；
3)配制对照品溶液：取杂质A对照品适量，加溶剂溶解并稀释，得杂质A对照品溶液；
4)取系统适用性溶液进样，记录色谱图；取空白溶液(溶剂)、杂质A对照品溶液、对照溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，记录色谱图，按外标法计算杂质A的含量；按加校正因子的主成分自身稀释法计算供试品中其它各杂质的含量。
步骤4)中计算公式为：
式中：AA——供试品溶液中杂质A峰峰面积；
Ar——对照品溶液中杂质A峰峰面积；
Cr——杂质A对照品浓度，g/ml；
W——供试品称重，g；
S——供试品的绝对含量；
Ax——供试品溶液中其他各杂质峰峰面积；
As——对照溶液中归属主峰峰面积；
Fx——杂质校正因子。
进一步，步骤1)至步骤4)中的溶剂为缓冲盐与甲醇的混合物，缓冲盐与甲醇的体积比为9:1；所述缓冲盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的溶液；所述缓冲盐中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l。
作为一种优选，所述缓冲盐中磷酸氢二钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l。
作为一种优选，所述缓冲盐中磷酸氢二钠的浓度为0.024mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.022mol/l。
进一步，步骤2)中供试品溶液的浓度为0.7mg/ml-1.2mg/ml。
作为一种优选，步骤2)中供试品溶液的浓度为1mg/ml。
进一步，所述高效液相色谱仪的色谱柱的规格为250×4.6mm，5.0μm。
进一步，所述检测器的检测波长为280nm。
作为一种优选，所述高效液相色谱仪的色谱柱的柱温为25-30℃；柱温优选30℃。
本发明的目的之二在于提供一种用于固液分离测定帕司烟肼及其相关杂质的试剂，所述相关物质包括异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质；所述相关杂质为A-E中的一种或多种，所述试剂包括：
试剂A：磷酸盐缓冲液；
试剂B：甲醇；
所述磷酸盐缓冲液为包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和四丁基硫酸氢铵的溶液；所述磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.1％～0.3％(W/V)。
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.015mol/l～0.03mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.15％～0.15％(W/V)。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关杂质的方法能同时分离测定帕司烟肼中异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质A-E，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；能更精准的确保帕司烟肼原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
2)本发明提供的用于固液分离测定帕司烟肼及其相关杂质的试剂能同时有效分离帕司烟肼中异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质A-E，对实现帕司烟肼及其有关物质的质量控制有重要意义。
附图说明
图1为溶剂色谱图。
图2为系统适用性溶液色谱图。
图3为供试品溶液色谱图。
图4为杂质A对照品溶液色谱图。
图5为对照溶液色谱图。
图6为ChP方法杂质B色谱图。
图7为ChP方法杂质D色谱图。
图8为ChP方法样品色谱图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
测定仪器：高效液相色谱仪LC20A(SHIMADZU)
实施例1
色谱条件：
色谱柱：岛津VP ODS 250×4.6mm，5.0μm
柱流速：1.0ml/min
检测波长：UV 280nm
柱温：30℃
进样量：20μl
溶剂：缓冲盐(磷酸氢二钠8.7g，磷酸二氢钠3.4g，加水适量使溶解，并稀释至1000ml)-甲醇＝90：10
流动相：A：磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠8.7g，磷酸二氢钠3.4g，四丁基硫酸氢铵2.0g，加水适量使溶解，并稀释至1000ml)
B：甲醇
梯度洗脱：
1.溶液配制
系统适用性溶液：取帕司烟肼对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E各适量，加甲醇溶解后用溶剂稀释制成每1ml中约含1mg帕司烟肼和2ug各杂质的混合溶液。
供试品溶液：取本品研细，精密称取细粉适量(约相当于帕司烟肼50mg)，置50ml量瓶中，加溶剂适量超声振摇使溶解，再加溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，精密取续滤液作为供试品溶液。
对照溶液：精密称取供试品溶液0.5ml，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质A对照品溶液：取杂质A对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每l ml中约含5μg的溶液。
2.测定方法
取系统适用性溶液进样，记录色谱图，出峰顺序为异烟肼、杂质B、杂质A、杂质C、对氨基水杨酸、杂质D、杂质E，各杂质峰之间、两主峰与相邻杂质峰分离度应符合要求。系统适用性色谱图中，异烟肼、杂质B、杂质A、杂质C、对氨基水杨酸、杂质D、杂质E依次出峰，各色谱峰之间的分离度应符合要求，见图2。
取空白溶液(溶剂)、杂质A对照品溶液、对照溶液、供试品溶液各20μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1，图3-5，从图1中可以看出溶剂不干扰有关物质测定。按外标法计算杂质A的含量；按加校正因子的主成分自身稀释法计算供试品中其它各杂质的含量。
实施例2对比例
国家药品标准[WS-10001-(HD-0322)-2002]收载有本品质量标准，未对有关物质进行控制；
按照中国药典2015年版帕司烟肼有关物质项仅对间氨基酚(杂质B)进行控制，采用等度洗脱，流动相为：磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠8.7g，磷酸二氢钠3.4g，加水适量使溶解，10％四丁基氢氧化铵溶液23ml，并稀释至1000ml)-甲醇＝90：10。结果发现此色谱系统条件下杂质B与异烟肼主峰不能有效分离；杂质D(可能的降解杂质)与对氨基水杨酸主峰重合，不能有效检出；等度洗脱条件下杂质E出峰晚灵敏度低，杂质B、杂质D和测试样品的色谱图见图6-8。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.HPLC法分离测定帕司烟肼及其相关物质的方法，其特征在于，所述方法中采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质包括异烟肼、对氨基水杨酸和相关杂质；所述相关杂质为A-E，具体结构式如下所示：
所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述的流动相B为甲醇；所述梯度洗脱设置如下：
所述磷酸盐缓冲液为包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和四丁基硫酸氢铵的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，四丁基硫酸氢铵的浓度为0.1％～0.3％，W/V。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)配制系统适用性溶液：取帕司烟肼对照品和杂质A-E经甲醇溶解后用溶剂稀释，得系统适用性溶液；
2)配制供试品溶液和对照溶液：取供试品帕司烟肼加溶剂溶解后经滤膜滤过，得供试品溶液；将配制得到的供试品溶液加溶剂稀释，得对照溶液；
3)配制对照品溶液：取杂质A对照品适量，加溶剂溶解并稀释，得杂质A对照品溶液；
4)取系统适用性溶液进样，记录色谱图；取空白溶液、杂质A对照品溶液、对照溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，记录色谱图，按外标法计算杂质A的含量；按加校正因子的主成分自身稀释法计算供试品中其它各杂质的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)至步骤4)中的溶剂为缓冲盐与甲醇的混合物，缓冲盐与甲醇的体积比为9:1；所述缓冲盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的溶液；所述缓冲盐中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中供试品溶液的浓度为0.7mg/ml-1.2mg/ml。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的色谱柱的规格为250×4.6mm，5.0μm。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为280nm。
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