CN107815458A - 一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶技术领域。本发明的ALDH2基因高效表达组件Trp1L‑URA3‑TPIp‑ALDH2‑TPIt‑Trp1R是整合到了酿酒酵母W303‑1A的基因组上，与游离质粒表达相比，提高了基因表达的稳定性，并且采用的组成型启动子，在发酵过程中没有诱导剂的加入，产物相对来说比较安全。在发酵96h时，产乙醛脱氢酶的比活达到0.97U/mg。在250mg/100mL浓度的乙醇中，产乙醛脱氢酶的比酶活达到6.256U/mg，在pH 3缓冲液中，产乙醛脱氢酶的比活达到0.301U/mg。本发明选用酿酒酵母作为宿主菌，一方面保持了酶的活性，另一方面提高了产品的安全性，为解酒药的研发提供了一条新的途径和理论基础。

Description

一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶技术领域。

背景技术

酒文化在我国有着悠久的历史，相当多的中国人有饮酒的爱好，然而长期饮酒、饮酒过度引发的健康问题也越来越受到人们的关注。人体中的乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)和乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10，Aldehyde dehydrogenase)在乙醇的代谢中发挥着重要作用。乙醇在乙醇脱氢酶的作用下氧化成乙醛，之后在乙醛脱氢酶的作用下氧化成乙酸，当人体中两种酶能够充分表达，乙醇就会在短时间内充分代谢，减少酒精对中枢神经的影响。然而，一般情况下，乙醇脱氢酶可充分表达，缺乏乙醛脱氢酶的个体比较多，导致乙醛在体内大量积累，产生醉酒症状。在人体内，已经获得鉴定的乙醛脱氢酶基因共有12种，其中乙醛脱氢酶Ⅰ、乙醛脱氢酶Ⅱ、乙醛脱氢酶Ⅲ和乙醛脱氢酶Ⅳ是四种常见的类型。参与乙醛氧化的乙醛脱氢酶主要有两种，即与乙醛有最低Km值的线粒体乙醛脱氢酶Ⅱ和与乙醛有中等程度亲和力的胞浆乙醛脱氢酶Ⅰ，所以乙醛脱氢酶Ⅱ是人体酒精代谢的关键酶，近年来，随着人们对获得全新的、更有效的解酒保肝药物的需求日益迫切，关于乙醛脱氢酶Ⅱ编码基因ALDH2的研究工作更显其深远意义。

基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效表达。很多科研工作者将乙醛脱氢酶基因导入适宜的表达体系中，以构建高产乙醛脱氢酶的工程菌。2005年，裘丽珍在大肠杆菌BL21中实现了乙醛脱氢酶基因的异源高效表达，重组乙醛脱氢酶的比活达到331.7U/mg(参考文献：裘丽珍.人乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达[D].浙江大学2005.)。2010年，黄锟等将乙醛脱氢酶基因导入毕赤酵母SMD1168中，分泌表达的重组乙醛脱氢酶的比活达到4.87U/mg(参考文献：黄锟等.人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究[J].中国医药生物技术,2010,5:10-48.)。现有技术中有多种对酶活的定义方式，因而造成了不同酶活定义下获得的重组酶比活差异明显，难以在同一水平下衡量重组菌的产酶能力。此外，大肠杆菌是一种致病菌，并且现如今报道的用毕赤酵母表达乙醛脱氢酶都需要用甲醇诱导，所以，大肠杆菌和毕赤酵母菌作为宿主菌对目的蛋白的安全性都有一定的影响，解酒药物的研究也受到了限制。

发明内容

为了解决现有技术中目的蛋白因为不能正确折叠而丧失一些功能，且在真核细胞中表达常需要诱导剂导致产品缺乏食品安全性的问题，本发明提供了一种人员的乙醛脱氢酶基因及生产该乙醛脱氢酶的酿酒酵母工程菌。

本发明的第一个目的是提供一种人源的乙醛脱氢酶ALDH2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供携带所述基因的载体或细胞系。

本发明的第三个目的是提供一种酿酒酵母工程菌，是表达所述人源乙醛脱氢酶基因的酿酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述的酿酒酵母工程菌是以尿嘧啶营养缺陷型单倍体Saccharomyces cerevisiae W303-1A为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第四个目的是提供构建所述酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括：(1)构建含SEQ ID NO.1所示基因的基因表达组件：(2)将所述基因表达组件转化至酿酒酵母细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述基因表达组件按如下方法构建：(1)将SEQ IDNO.1所示的序列与质粒pYX212连接，构建重组质粒pYX212-ALDH2,；(2)以pYX212-ALDH2为模板，构建含有Trp1基因启动子和终止子的基因片段TPIp-ALDH2-TPIt；(3)分别扩增Trp1基因的上游同源臂Trp1L和下游同源臂Trp1R，并将Trp1L、Trp1R、TPIp-ALDH2-TPIt片段以及URA3基因通过融合PCR连接，构建表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R。

在本发明的一种实施方式中，所述的酿酒酵母是营养缺陷型酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述的酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiaeW303-1A。

在本发明的一种实施方式中，所用的转化方法是电转化法。

在本发明的一种实施方式中，所述电转化条件如下：电压：1.8kV，电容：25μF，电阻：186Ω。

本发明的第五个目的是提供一种乙醛脱氢酶的生产方法，是将所述工程菌接种至YPD培养基中，28～30℃培养72～96h。

本发明的第六个目的是提供所述基因在制备含乙醛脱氢酶的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括发酵制备酒精饮品。

本发明的第七个目的是提供一种可食性组合物，含有所述酿酒酵母工程菌的活性产物。

在本发明的一种实施方式中，所述活性产物含有表达SEQ ID NO.1所示基因获得的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述活性产物为SEQ ID NO.1所示基因编码的酶。

本发明还要求保护应用所述酿酒酵母工程菌生产获得的酒精饮品。

有益效果：本发明提供了一种可以高效表达人乙醛脱氢酶基因的工程菌以及构建方法，本发明的ALDH2基因高效表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R是整合到了酿酒酵母W303-1A的基因组上，与游离质粒表达相比，提高了基因表达的稳定性，不会使目的基因因为传代培养而丢失，并且采用的组成型启动子，在发酵过程中没有诱导剂的加入，产物相对来说比较安全。在发酵96h时，产乙醛脱氢酶的比活达到0.97U/mg。在250mg/100mL浓度的乙醇中，产乙醛脱氢酶的比酶活达到6.256U/mg，在pH 3缓冲液中，产乙醛脱氢酶的比活达到0.301U/mg，具有较好的耐酸耐乙醇特性。本发明选用酿酒酵母作为宿主菌，一方面保持了酶的活性，另一方面提高了产品的安全性，为解酒药的研发提供了一条新的途径和理论基础。

附图说明

图1为ALDH2基因高效表达组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)的构建示意图；

图2为阳性菌落的琼脂糖电泳检测；M，marker DL 2000；1，阴性对照；2，阳性对照pUC57-ALDH2质粒PCR产物；3，阳性菌落的PCR产物；

图3为重组质粒pYX212-ALDH2双酶切的琼脂糖电泳检测；M，marker DL 10000；1，pYX212-ALDH2双酶切产物；

图4为Trp1上、下游同源臂的PCR电泳图；M，marker DL 2000；1-6，上游同源臂Trp1L的PCR扩增结果(269bp)；7-12，下游同源臂Trp1R的PCR扩增结果(255bp)；

图5为URA3和TPIp-ALDH2-TPIt的PCR电泳图；M，marker DL 10000；1-6，URA3的PCR扩增结果(1235bp)；7-12，TPIp-ALDH2-TPIt的PCR扩增结果(2614bp)；

图6为ALDH2基因表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R融合的琼脂糖电泳检测；M，marker DL5000；1-3，表达组件融合的结果(4373bp)；

图7为酵母转化子的PCR鉴定电泳图；M，Marker DL 5000；1，阴性对照；2，出发菌株PCR结果(600bp)；3，阳性对照pMD19-Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R的PCR的结果(4373bp)；4-5，酵母转化子PCR结果(4373bp)；

图8为不同酵母发酵产乙醛脱氢酶的比酶活曲线；

图9为酵母发酵在不同乙醇浓度下的比酶活曲线；

图10为酵母发酵在不同酸碱度下的比酶活曲线。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1～5所涉及的材料如下：

1、基因、载体及引物序列：

SEQ ID NO.1为ALDH2基因的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2为同源臂Trp1L的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3为基因URA3的核苷酸序列；

SEQ ID NO.4为TPIp-ALDH2-TPIt的核苷酸序列；

SEQ ID NO.5为同源臂Trp1R的核苷酸序列；

SEQ ID NO.6为基因Trp1的核苷酸序列；

实施例所使用引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1本发明所用到的引物序列

注：下划线为用于融合PCR的重叠序列，蓝色为保护碱基，红色为酶切位点。

2、培养基：

(1)LB培养基(每升含有)：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g。

(2)YPD培养基(每升含有)：蛋白胨20g，酵母浸出粉10g，葡萄糖20g。

(3)SC培养基：用于培养尿嘧啶营养缺陷型菌株，(每100mL含有)：1×AA储液10mL，1×YNB储液10mL，葡萄糖2g，琼脂2g；其中：1×AA储液由10×AA储液稀释10倍获得；1×YNB储液由10×YNB储液稀释10倍获得；10×AA储液(每100mL)成分为：L-亮氨酸0.07g，L-色氨酸0.1g，L-组氨酸0.08g，腺嘌呤0.02g(无菌过滤除菌，4℃保存)；10×YNB储液(每100mL)成分为：YNB 1.7g，硫酸铵5g，(无菌过滤除菌，4℃保存)。

实施例1人ALDH2基因的合成及重组质粒pUC57-ALDH2的构建

人的ALDH2基因(SEQ ID NO.1所示)和重组质粒pUC57-ALDH2由生工生物工程(上海)股份有限公司合成及构建。

实施例2表达质粒pYX212-ALDH2的构建

将重组质粒pUC57-ALDH2用EcoR I和BamH I双酶切后，与经相同酶双酶切的pYX212载体连接。酶切体系如表2：

表2酶切体系

将酶切体系在37℃水浴20-30min，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果后，胶回收ALDH2目的基因片段及载体pYX212片段，按表3的连接体系进行连接：

表3 T4连接酶的连接体系

16℃保温过夜，转化至E.coli JM109中，挑选阳性转化子，经PCR扩增和送样测序验证，获得重组质粒pYX212-ALDH2。

PCR扩增程序：

F5/R5：95℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸93s)进行30个循环，72℃再延伸5min；

实施例3ALDH2基因表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R的构建

提取酿酒酵母W303-1A的基因组(具体操作方法参见MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit试剂盒使用说明书)作为PCR的模板，利用Prime STARDNAPolymerase分别使用表3中的引物对F1/R1和F4/R4分别扩增上游同源臂Trp1L(序列如SEQ ID NO.2所示)和下游同源臂Trp1R(序列如SEQ ID NO.5所示)；提取酿酒酵母N85的基因组(具体操作方法参见MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit试剂盒使用说明书)作为PCR的模板，使用表3中的引物对F2/R2扩增完整的筛选标记基因URA3(序列如SEQID NO.3)；提取E.coli JM109中的重组质粒pYX212-ALDH2(具体操作方法参见SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书)作为PCR的模板，使用引物对F3/R3扩增含有pYX212质粒上TPI的启动子和终止子的目的基因片段TPIp-ALDH2-TPIt(序列如SEQ ID NO.4)。然后利用引物对F1/R4，通过融合PCR将Trp1L、URA3、TPIp-ALDH2-TPIt和Trp1R融合获得表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R。(PCR具体操作方法及反应体系配制参见PrimeSTAR DNAPolymerase说明书)。

各引物对的扩增程序如下：

(1)F1/R1和F4/R4：95℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)进行30个循环，72℃再延伸5min；

(2)F2/R2：95℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s)进行30个循环，72℃再延伸5min；

(3)F3/R3：95℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸150s)进行30个循环，72℃再延伸5min；

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收表达组件的四个目的片段，利用touchdown PCR将回收的四个片段融合，融合的步骤如下：

以等摩尔的Trp1L、URA3、TPIp-ALDH2-TPIt和Trp1R为模板，不加引物进行touchdown PCR将上述四个片段进行融合，PCR反应体系见表4：

表4 25μLPCR反应体系

融合PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，然后进入PCR扩增程序，94℃变性30s，63℃退火15s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，72℃延伸260s，然后55℃退火再循环一次，最后72℃再延伸5min，反应完毕，得到Trp1L、URA3、TPIp-ALDH2-TPIt和Trp1R四个扩增片段的融合片段。以得到的融合片段为模板，使用引物对P1/P4对该融合片段进行特异性扩增，PCR反应体系的配制如表5所示：

PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸260s)进行15个循环，72℃再延伸5min，得到表达组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)。

PCR扩增结果如图3所示。

表5 50μLPCR反应体系

由图3可知，利用touchdown PCR融合四个片段所得到的片段大小为4373bp左右，与预期的基因组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)大小相符，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序结果正确，说明表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R构建成功。

实施例4基因表达组件电转入酿酒酵母W303-1A及转化子的鉴定

利用电转化的方法将上述获得的表达组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)转入到尿嘧啶营养缺陷型的酿酒酵母W303-1A中，将表达组件整合到酵母的基因组上，具体步骤如下：

(1)挑取酿酒酵母W303-1A单菌落接种于3mLYPD液体培养基，于30℃200r/min过夜培养，得活化种子液；

(2)按照体积比10％的接种比例，将种子液转接至50mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃200r/min继续培养至菌液OD₆₀₀在0.8-1.0之间；

(3)5000r/min离心5min收集菌体，用25mL无菌水离心洗涤菌体两次；

(4)用8mL 10mM二硫苏糖醇溶液重悬菌体，于30℃水浴振荡60min，5000r/min离心5min收集菌体；

(5)用15mL 4℃预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，于5000r/min 4℃离心5min收集菌体；

(6)重复步骤(5)3次；

(7)用与菌体等体积的1M山梨醇重悬菌体，取80μL菌液，加入10μL转化片段以及20μL 1mg/mL鲑鱼精DNA，混合后转入电击杯，冰上放置5min后，1.8kv电击；

(8)加入890μLYPD培养基将电转液洗出转移到1.5mL离心管内，于30℃150r/min复苏2h，涂布于SC培养基平板，于30℃培养至菌落长出；

(9)挑取转化子并提取基因组作为模板，使用引物对F1/R4进行PCR扩增以鉴定表达组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)整合到酵母Trp1基因的阳性转化子。

PCR鉴定结果如图7所示：泳道1为空白对照；泳道2为出发菌株PCR扩增结果(600bp)；泳道3为阳性对照的PCR扩增结果(4373bp)；泳道4和5为阳性转化子PCR扩增结果(4373bp)。说明ALDH2基因表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R成功的整合到了酿酒酵母W303-1A的Trp1基因中，将工程菌命名为W303-ALDH2。

实施例5出发菌株(W303-1A)和工程菌株(W303-ALDH2)发酵及不同条件下的比活

将原始菌W303-1A和上述得到的工程菌W303-ALDH2分别接种于YPD培养基，于30℃进行活化培养，然后将两个菌液同时转接于新鲜的YPD培养基进行培养，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

分别取甘油管保存的原始菌和整合菌30μL加入3mL的YPD试管中，在30℃、200rpm条件下过夜培养，获得种子液。

(2)菌种发酵

分别取活化的种子液2mL加入到200mL的YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵一段时间，在发酵48h、72h、96h和120h时分别取5mL的发酵液用于比活的测定。

(3)发酵液的处理

5mL的发酵液在8000rpm条件下离心5min，用无菌水洗涤菌体一次，再用液氮冷冻菌体，最后加入和菌体等体积的酸洗玻璃珠和600μL的PEB溶液，在涡旋振荡器上震30s，之后在冰上放置1min，整个过程持续30～40min，离心，留上清用来测定酶活和蛋白含量。

酶活和蛋白含量的测定：由于NAD⁺、NADH分别在260nm、340nm处有最大的吸收峰，故酶、辅酶NAD⁺和底物在一定条件下反应，通过测定一定时间340nm吸光度的变化值，可以计算出NAD⁺转化为NADH的量，根据酶活的定义计算得到该酶的酶活。

酶活的定义：最适条件下，每分钟转化1μmol底物为1个活力(U)，可得到反应体系里ALDH2的酶活计算公式为：

表6酶活测定反应体系

加水补充到3mL，在37℃温浴5min，酶液在温浴5min后加入，然后迅速倒入比色皿中，每分钟测定一次吸光度值，测5min。

蛋白含量的测定：考马斯亮蓝法。酶活测定结果见图8。

由图8可知，工程菌的乙醛脱氢酶的比活略高于原始菌的比活，在发酵96h时，工程菌株产乙醛脱氢酶的比活最高，达到0.97U/mg。(注：比活按每mg蛋白含有的酶活单位来表示)

(4)耐乙醇性能的研究

分别配制510152025(mg/100mL)浓度的乙醇，最终使酶活体系中的乙醇终浓度为50100150200250(mg/100mL)。

表7酶活测定反应体系

加水补充到3mL，在37℃温浴5min，酶液在温浴5min后加入，然后迅速倒入比色皿中，每分钟测定一次吸光度值，测5min。

蛋白含量的测定：考马斯亮蓝法。酶活测定结果见图9。

由图9可知，工程菌和原始菌的乙醛脱氢酶的比活均随着酶活体系中乙醇含量的增加而增加；且在相同的乙醇浓度下，工程菌的乙醛脱氢酶的比活大约比原始菌的乙醛脱氢酶的比活高了1U/mg左右，其中在50mg/100mL的乙醇浓度下，工程菌的乙醛脱氢酶的比活(5.855U/mg)比工程菌高出1.332U/mg，在250mg/100mL的高乙醇浓度下工程菌的乙醛脱氢酶的比活(6.256U/mg)比工程菌高出0.957U/mg

(4)耐酸性能的研究

分别配置pH为3,5,7,9,11的广泛缓冲液；

缓冲液的配置方法为：称取6.008g柠檬酸，3.893g磷酸二氢钾，1.769g硼酸和5.266g巴比妥酸，定容到1L。

表8广泛缓冲液的配置

按表9所示配制不同pH条件下的酶反应体系，分别将各反应体系于37℃温浴5min，酶液在温浴5min后加入，然后迅速倒入比色皿中，每分钟测定一次吸光度值，测5min。

表9酶活测定反应体系

蛋白含量的测定：考马斯亮蓝法。酶活测定结果见图10。

由图10所示，在pH小于9时，工程菌的乙醛脱氢酶比活均高于原始菌的乙醛脱氢酶的比活，在pH 5时，工程菌的乙醛脱氢酶比活达到0.35U/mg，在pH 3时，工程菌的比活(0.301U/mg)比原始菌高出了0.13U/mg。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggaattca tgagcgctgc cgcgacacaa gctgtacctg cacctaacca acagcctgaa 60

gtattttgta accaaatttt cataaacaac gagtggcatg acgctgtaag cagaaagacg 120

ttccctacag taaacccatc tactggagaa gtaatctgtc aagtagcaga gggtgacaaa 180

gaagacgtag ataaagcagt taaagcagct agagctgcat tccaacttgg ttcaccttgg 240

aggagaatgg atgcatcaca tagaggtaga cttctaaaca gacttgcaga tcttatcgag 300

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cagaagaata gtcaccatca tcaccaccat taaggatccg cg 1542

<210> 2

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 1235

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttcagggt ccataaagct tttcaattca tctttttttt ttttgttctt ttttttgatt 60

ccggtttctt tgaaattttt ttgattcggt aatctccgag cagaaggaag aacgaaggaa 120

ggagcacaga cttagattgg tatatatacg catatgtggt gttgaagaaa catgaaattg 180

cccagtattc ttaacccaac tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat 240

gtcgaaagct acatataagg aacgtgctgc tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct 300

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tgtggatatc ttgactgatt tttccatgga gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc 480

cgccaagtac aattttttac tcttcgaaga cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt 540

caaattgcag tactctgcgg gtgtatacag aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc 600

acacggtgtg gtgggcccag gtattgttag cggtttgaag caggcggcgg aagaagtaac 660

aaaggaacct agaggccttt tgatgttagc agaattgtca tgcaagggct ccctagctac 720

tggagaatat actaagggta ctgttgacat tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg 780

ctttattgct caaagagaca tgggtggaag agatgaaggt tacgattggt tgattatgac 840

acccggtgtg ggtttagatg acaagggaga cgcattgggt caacagtata gaaccgtgga 900

tgatgtggtc tctacaggat ctgacattat tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg 960

aagggatgct aaggtagagg gtgaacgtta cagaaaagca ggctgggaag catatttgag 1020

aagatgcggc cagcaaaact aaaaaactgt attataagta aatgcatgta tactaaactc 1080

acaaattaga gcttcaattt aattatatca gttattaccc gggaatctcg gtcgtaatga 1140

tttctataat gacgaaaaaa aaaaaattgg aaagaaaaag cttcatggcc tttataaaaa 1200

ggaactatcc aatacctcgc cagaaccaag taaca 1235

<210> 4

<211> 2614

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttcaagaa ttggggatct acgtatggtc attcttcttc agattccctc atggagaagt 60

gcggcagatg tatatgacag agtcgccagt ttccaagaga ctttattcag gcacttccat 120

gataggcaag agagaagacc cagagatgtt gttgtcctag ttacacatgg tatttattcc 180

agagtattcc tgatgaaatg gtttagatgg acatacgaag agtttgaatc gtttaccaat 240

gttcctaacg ggagcgtaat ggtgatggaa ctggacgaat ccatcaatag atacgtcctg 300

aggaccgtgc tacccaaatg gactgattgt gagggagacc taactacata gtgtttaaag 360

attacggata tttaacttac ttagaataat gccatttttt tgagttataa taatcctacg 420

ttagtgtgag cgggatttaa actgtgagga cctcaataca ttcagacact tctgacggta 480

tcaccctact tattcccttc gagattatat ctaggaaccc atcaggttgg tggaagatta 540

cccgttctaa gacttttcag cttcctctat tgatgttaca ctcggacacc ccttttctgg 600

catccagttt ttaatcttca gtggcatgtg agattctccg aaattaatta aagcaatcac 660

acaattctct cggataccac ctcggttgaa actgacaggt ggtttgttac gcatgctaat 720

gcaaaggagc ctatatacct ttggctcggc tgctgtaaca gggaatataa agggcagcat 780

aatttaggag tttagtgaac ttgcaacatt tactattttc ccttcttacg taaatatttt 840

tctttttaat tctaaatcaa tctttttcaa ttttttgttt gtattctttt cttgcttaaa 900

tctataacta caaaaaacac atacaggaat tcatgagcgc tgccgcgaca caagctgtac 960

ctgcacctaa ccaacagcct gaagtatttt gtaaccaaat tttcataaac aacgagtggc 1020

atgacgctgt aagcagaaag acgttcccta cagtaaaccc atctactgga gaagtaatct 1080

gtcaagtagc agagggtgac aaagaagacg tagataaagc agttaaagca gctagagctg 1140

cattccaact tggttcacct tggaggagaa tggatgcatc acatagaggt agacttctaa 1200

acagacttgc agatcttatc gagagagacc gtacatacct agcagcattg gaaacattgg 1260

ataacggtaa accttacgta atctcctacc tggtggatct ggacatggtt ctgaagtgtc 1320

ttaggtacta cgcaggatgg gctgataaat atcatggaaa gacaatccca attgacggag 1380

atttcttcag ttacaccaga cacgagcctg taggagtatg tggtcaaatt attccgtgga 1440

acttcccact attgatgcaa gcatggaaac tgggaccagc tttggcaact ggaaatgttg 1500

tggtcatgaa agttgcagag caaacaccac taacagcatt gtatgttgca aacttgatca 1560

aagaggctgg attcccaccc ggtgttgtta atatcgttcc aggattcgga ccaactgctg 1620

gtgctgctat tgcttctcat gaagatgttg ataaagttgc ttttaccggt agtaccgaaa 1680

ttggtagagt tatacaggtg gctgctggtt catctaattt gaagagggtt acgttggaat 1740

taggcggtaa atccccaaat ataattatga gcgacgctga catggactgg gctgttgaac 1800

aagctcattt tgccctattc tttaatcagg gccagtgttg ctgcgctggt agtagaacat 1860

ttgttcaaga ggatatatat gacgaatttg tggaacgttc tgtggccaga gccaaatccc 1920

gtgttgtcgg taatccattt gattccaaga ctgaacaagg tccccaagtt gatgaaactc 1980

aattcaagaa gatattaggg tatattaata ccgggaaaca ggaaggggct aaattattat 2040

gtggcggcgg gattgccgcc gatcgtggtt attttattca gccgactgtt tttggtgatg 2100

tgcaagatgg tatgaccata gcgaaagaag aaatttttgg cccggtgatg caaattttaa 2160

agtttaagac gatagaagaa gtcgtgggta gggccaataa ttctacgtac ggtttagccg 2220

cggcggtctt taccaaagat ttggataaag ccaattattt gtcacaggcg ttacaagcgg 2280

gcactgtctg ggtcaattgc tatgatgtct ttggggccca atcacccttt ggtggttata 2340

agatgtctgg ttctggcagg gagttaggcg aatatggctt acaagcctat actgaagtta 2400

agactgtcac tgtgaaagtc ccccagaaga atagtcacca tcatcaccac cattaaggat 2460

cctagggccc acaagcttac gcgtcgaccc gggtatccgt atgatgtgcc tgactacgca 2520

tgatatctcg agctcagcta gctaactgaa taaggaacaa tgaacgtttt tcctttctct 2580

tgttcctagt attaatgact gaccgataca tccc 2614

<210> 5

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgcaacata ctactcagtg cagcttcaca gaaacctcat tcgtttattc ccttgtttga 60

ttcagaagca ggtgggacag gtgaactttt ggattggaac tcgatttctg actgggttgg 120

aaggcaagag agccccgaaa gcttacattt tatgttagct ggtggactga cgccagaaaa 180

tgttggtgat gcgcttagat taaatggcgt tattggtgtt gatgtaagcg gaggtgtgga 240

gacaaatggt gtaaa 255

<210> 6

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtctgtta ttaatttcac aggtagttct ggtccattgg tgaaagtttg cggcttgcag 60

agcacagagg ccgcagaatg tgctctagat tccgatgctg acttgctggg tattatatgt 120

gtgcccaata gaaagagaac aattgacccg gttattgcaa ggaaaatttc aagtcttgta 180

aaagcatata aaaatagttc aggcactccg aaatacttgg ttggcgtgtt tcgtaatcaa 240

cctaaggagg atgttttggc tctggtcaat gattacggca ttgatatcgt ccaactgcat 300

ggagatgagt cgtggcaaga ataccaagag ttcctcggtt tgccagttat taaaagactc 360

gtatttccaa aagactgcaa catactactc agtgcagctt cacagaaacc tcattcgttt 420

attcccttgt ttgattcaga agcaggtggg acaggtgaac ttttggattg gaactcgatt 480

tctgactggg ttggaaggca agagagcccc gaaagcttac attttatgtt agctggtgga 540

ctgacgccag aaaatgttgg tgatgcgctt agattaaatg gcgttattgg tgttgatgta 600

agcggaggtg tggagacaaa tggtgtaaaa gactctaaca aaatagcaaa tttcgtcaaa 660

aatgctaaga aatag 675

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

attggtgaaa gtttgcggct tg 22

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agctttatgg accctgaaac ctccatgcag ttggacgata tcaatg 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cattgatatc gtccaactgc atggaggttt cagggtccat aaagct 46

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtagatccc caattcttga agatgttact tggttctggc gaggt 45

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acctcgccag aaccaagtaa catcttcaag aattggggat ctacg 45

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctgcactgag tagtatgttg caggggatgt atcggtcagt cattaatac 49

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtattaatga ctgaccgata catcccctgc aacatactac tcagtgcag 49

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttacaccat ttgtctccac acctcc 26

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccggaattca tgagcgctgc c 21

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgcggatcct taatggtggt gatga 25

Claims (10)

1.一种DNA分子，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.携带权利要求1所述DNA分子的载体或细胞系。

3.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，以尿嘧啶营养缺陷型单倍体Saccharomyces cerevisiae W303-1A为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的基因。

5.构建权利要求4所述酿酒酵母工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建含SEQ ID NO.1所示基因的基因表达组件：(2)将所述基因表达组件转化至酿酒酵母细胞中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与质粒pYX212连接，构建重组质粒pYX212-ALDH2,；(2)以pYX212-ALDH2为模板，构建含有Trp1基因启动子和终止子的基因片段TPIp-ALDH2-TPIt；(3)分别扩增Trp1基因的上游同源臂Trp1L和下游同源臂Trp1R，并将Trp1L、Trp1R、TPIp-ALDH2-TPIt片段以及URA3基因通过融合PCR连接，构建表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R。

7.权利要求3所述酿酒酵母的工程菌在制备含乙醛脱氢酶的产品中的应用。

8.一种酒精饮品，其特征在于，应用权利要求3所述的酿酒酵母工程菌制备而成。

9.一种可食性组合物，其特征在于，含有权利要求3所述酿酒酵母工程菌的活性产物。

10.一种乙醛脱氢酶的生产方法，其特征在于，将权利要求3所述工程菌接种至YPD培养基中，28～30℃培养72～96h。