CN107814846A - 针对EpCAM和Cytokeratin5的特异性抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及EpCAM和Cytokeratin 5特异性抗体，所述EpCAM特异性抗体针对的抗原表位氨基酸序列为：REKPYDSKSLRTALQ，所述Cytokeratin 5特异性抗体针对的抗原表位氨基酸序列为：IQRLRAEIDNVKKQ。本发明还涉及以上抗体的制备方法，制备步骤包括：分析抗原表位、制备多肽、制备偶联产物、免疫Balb/c小鼠、筛选融合细胞，最后得到EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体。本发明优选了两种循环肿瘤细胞的抗原，并分别筛选出优势抗原表位，单抗所识别的抗原表位准确无误，从源头上避免表位交叉，得到的抗体特异性好；一次融合可得到分别针对两种抗原的单抗，效率高。
Description
技术领域
本发明涉及EpCAM和Cytokeratin 5特异性抗体及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞的发现最早在1869 年，被定义为起源于原位肿瘤病灶或肿瘤转移病灶，并能够在病人的外周血中循环而在正常人的外周血中极少存在的一类肿瘤细胞。肿瘤诱发的血管生成通常伴随着肿瘤的侵袭，其结果是增加原位肿瘤释放高侵袭性肿瘤细胞进入外周循环的可能性。而高侵袭能力的循环肿瘤细胞不仅可以在远端器官内建立新的肿瘤病灶，也能够以肿瘤自播的形式回到原位肿瘤所在的器官内建立新的肿瘤病灶。临床癌症患者死亡率高的一个重要因素就是转移后肿瘤细胞的存在，另外循环肿瘤细胞的存在也是肿瘤手术切除后复发的主要原因。目前可行的几种循环肿瘤细胞检测平台已经通过多项临床研究证实，对于循环肿瘤细胞的检测有助于对恶性肿瘤的诊断和预后评估以及对肿瘤复发和抗癌治疗效果的监测。
上皮细胞粘附分子(EpCAM：epithelial cell adhesion molecule)，是一种由GA-733-2基因编码的分子量为40kDa的跨膜糖蛋白，作为嗜同种的钙非依赖性的上皮细胞间粘附分子在上皮癌变过程中发挥着作用。EpCAM表达于所有正常的上皮细胞，在肿瘤细胞和增殖活跃的细胞上则呈现不同程度的表达上升，是最早被鉴定出与肿瘤相关的抗原之一。研究表明EpCAM 也在肿瘤干细胞表面表达，它是wnt 通路的信号受体和激活蛋白，而wnt 通路调节着癌基因( 比如 c-myc) 的表达。因此，EpCAM 分子的表达从基础上关系到肿瘤的发生和发展。由于EpCAM 分子表达于多种肿瘤细胞的表面，将抗EpCAM 的抗体用于循环肿瘤细胞的诊断和治疗会获得更广泛的应用。同时通过鉴定该抗体的功能，探讨以EpCAM 分子作为靶标的生物治疗也具有重要的临床意义。
细胞角蛋白(Cytokeratin，CK) 主要分布于上皮细胞，是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。研究发现细胞角蛋白（CK）具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。目前已得到证实的细胞角蛋白有20多种，其中Cytokeratin 5是临床上肿瘤检测较常使用的一种标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供具有良好特异性EpCAM和Cytokeratin 5的抗体和一种步骤设计合理并能高效制备得到上述抗体的方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体，其特征在于：所述EpCAM特异性抗体针对的抗原表位为A，所述Cytokeratin 5特异性抗体针对的抗原表位为B，所述的抗原表位A和B的氨基酸序列如下：
A：REKPYDSKSLRTALQ；
B：IQRLRAEIDNVKKQ；
本发明还提供一种所述针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
a.选择EpCAM和Cytokeratin 5的两个抗原表位，分别命名为A和B，序列如下：
A：REKPYDSKSLRTALQ；
B：IQRLRAEIDNVKKQ；
b.分别在A和B序列N端添加半胱氨酸，分别命名为C和D，序列如下：
C：CREKPYDSKSLRTALQ；
D：CIQRLRAEIDNVKKQ；
c.将A和B表位串联，中间加柔性连接片段，并在其N端加半胱氨酸，命名为E，序列如下：
CREKPYDSKSLRTALQGGGGIQRLRAEIDNVKKQ；
d.合成E序列多肽，并偶联KLH，偶联产物命名为KLH-E；
e. 合成C和D序列多肽，并分别偶联BSA，偶联产物命名为BSA-C和BSA-D；
f.采用KLH-E免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；
g.采用BSA-C来筛选融合细胞，得到针对A表位的单克隆细胞株；采用BSA-D来筛选融合细胞，得到针对B表位的单克隆细胞株；
h.采用步骤g得到的单克隆细胞株制备EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体。
本发明所述制备方法的步骤a中EpCAM和Cytokeratin 5的抗原表位是采用生物信息学软件分析出来的，优选所述的生物信息学软件为DNAssist 2.0。
本发明所述制备方法的步骤h制备EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的方法是：采用步骤g得到的单克隆细胞株注射Balb/c小鼠，制备腹水，使用辛酸-硫酸铵法提取单抗并透析，再用Protein G吸附纯化，最后得到纯化的抗体。
本发明所述的抗原表位A和B经软件分析其亲水性和抗原性，分析结果表明所选择的抗原表位序列特异性高，与其他蛋白序列无明显同源性；抗原表位A和B串联后偶联KLH，可一次融合得到两种单抗，效率更高。
本发明具有以下优点和效果：优选了两种循环肿瘤细胞的抗原，并分别筛选出优势抗原表位，单抗所识别的抗原表位准确无误，从源头上避免表位交叉，得到的抗体特异性好；一次融合可得到分别针对两种抗原的单抗，效率高。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例EpCAM和Cytokeratin 5特异性抗体的制备方法步骤如下：
a.采用生物信息学软件DNAssist 2.0分析选择EpCAM和Cytokeratin 5的两个抗原表位，分别命名为A和B，序列如下：
EpCAM抗原表位（A）：REKPYDSKSLRTALQ；
Cytokeratin 5抗原表位（B）：IQRLRAEIDNVKKQ；
b.分别在A和B序列N端添加半胱氨酸，分别命名为C和D，序列如下：
C：CREKPYDSKSLRTALQ；
D：CIQRLRAEIDNVKKQ；
c.将A和B表位串联，中间加柔性连接片段即四个甘氨酸，并在其N端加半胱氨酸，命名为E，序列如下：
CREKPYDSKSLRTALQGGGGIQRLRAEIDNVKKQ；
d.合成E序列多肽，并偶联KLH（钥孔戚血蓝蛋白），偶联产物命名为KLH-E；
e.合成C和D序列多肽，并分别偶联BSA（牛血清白蛋白），偶联产物命名为BSA-C和BSA-D；
f.采用KLH-E免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；
g.采用BSA-C来筛选融合细胞，得到针对A表位的单克隆细胞株；采用BSA-D来筛选融合细胞，得到针对B表位的单克隆细胞株；
h.采用步骤g得到的两种单克隆细胞株分别注射Balb/c小鼠，制备腹水，使用辛酸-硫酸铵法提取单抗并透析，再用Protein G吸附纯化，最后分别得到EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体。
抗体性能评估：
（1）采集上皮源性肿瘤患者外周全血4ml，用样本稀释液1:1稀释，样本稀释液一般是生物性缓冲液，不会破坏血液成分；
（2） 用密度梯度离心液对稀释后的样本进行密度梯度离心，移出单核细胞层部分；
（3）用细胞清洗液（一种细胞液体培养基）对单核细胞层部分进行清洗，再离心；
（4） 最后采用细胞清洗液重悬细胞沉淀，制备成单核细胞悬液；
（5）采用制备得到的EpCAM抗体包被纳米芯片，将单核细胞悬液缓慢注入芯片，孵育、充分反应；然后采用缓冲液清洗芯片；
（6）将多聚甲醛溶液注入芯片，固定细胞；然后采用缓冲液清洗芯片；
（7）采用荧光素标记Cytokeratin 5抗体，制备成染色液，将染色液注入芯片，孵育、染色；然后采用缓冲液清洗芯片；
（8）用荧光显微镜观察，4ml全血中可检测到7个循环肿瘤细胞，说明两种抗体结合使用能成功捕获并检测到循环肿瘤细胞，抗体特异性好。
本说明书中没有详细描述的部分均采用本领域技术人员所公知的方法和原理，均为现有技术。
通过上述描述，本领域的技术人员已能实施。
此外，需要说明的是，本发明并不限于说明书所写的具体方法，也不限于说明书所示和所述的特定实施例，而是可以不脱离由说明书所限定的本发明的精神和范围的情况下作出各种变化和修改。
Claims (5)
1.针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体，其特征在于：所述针对EpCAM特异性抗体的抗原表位为A，所述针对Cytokeratin 5特异性抗体的抗原表位为B，所述的抗原表位A和B的氨基酸序列如下：
A：REKPYDSKSLRTALQ；
B：IQRLRAEIDNVKKQ。
2.一种所述针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
a. 选择EpCAM和Cytokeratin 5的两个抗原表位，分别命名为A和B，序列如下：
A：REKPYDSKSLRTALQ；
B：IQRLRAEIDNVKKQ；
b. 分别在A和B序列N端添加半胱氨酸，分别命名为C和D，序列如下：
C：CREKPYDSKSLRTALQ；
D：CIQRLRAEIDNVKKQ；
c. 将A和B表位串联，中间加柔性连接片段，并在其N端加半胱氨酸，命名为E，序列如下：
CREKPYDSKSLRTALQGGGGIQRLRAEIDNVKKQ；
d. 合成E序列多肽，并偶联KLH，偶联产物命名为KLH-E；
e. 合成C和D序列多肽，并分别偶联BSA，偶联产物命名为BSA-C和BSA-D；
f. 采用KLH-E免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；
g. 采用BSA-C来筛选融合细胞，得到针对A表位的单克隆细胞株；采用BSA-D来筛选融合细胞，得到针对B表位的单克隆细胞株；
h. 采用步骤g得到的单克隆细胞株制备EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体。
3.根据权利要求2所述的针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的步骤a中EpCAM和Cytokeratin 5的抗原表位是采用生物信息学软件分析出来的。
4.根据权利要求3所述的针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的生物信息学软件为DNAssist 2.0。
5.根据权利要求2所述的针对EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤h制备EpCAM和Cytokeratin 5的特异性抗体的方法是：采用步骤g得到的单克隆细胞株注射Balb/c小鼠，制备腹水，使用辛酸-硫酸铵法提取单抗并透析，再用Protein G吸附纯化，最后得到纯化的抗体。
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|---|---|---|---|---|
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2016
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