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CN107699517A - 一种青春双歧杆菌及其用途 - Google Patents

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CN107699517A CN201710963441.5A CN201710963441A CN107699517A CN 107699517 A CN107699517 A CN 107699517A CN 201710963441 A CN201710963441 A CN 201710963441A CN 107699517 A CN107699517 A CN 107699517A
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种青春双歧杆菌及其用途。本发明所述青春双歧杆菌CCFM8630保藏编号为CGMCC No.14395。本发明所述青春双歧杆菌CCFM8630可显著提高大鼠外周血神经递质5‑羟色胺的水平；恢复由高糖高脂饮食导致的大鼠外周血睾酮等激素水平的升高和大鼠肠道菌群中Blautia属和Turicibacter属丰度的异常；耐受模拟胃肠液，在肠道内快速定植，显著改善高糖高脂饮食导致的代谢综合征大鼠肝脏、十二指肠的病理损伤以及血清中甘油三酯和总胆固醇含量升高和口服糖耐量，用于预防、减缓或治疗代谢失调如代谢综合征，肠易激综合征以及与代谢综合征相关的焦虑、抑郁等心理疾病。

Description

一种青春双歧杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种青春双歧杆菌及其用途，尤其是一种能够调节肠道菌群、调节脑肠轴、显著缓解代谢综合征的青春双歧杆菌及其用途。
背景技术
近年来，随着经济的发展，我国人民生活方式发生了明显改变，活动量减少，肥胖的比例明显增加，糖尿病和代谢综合征(Metabolic Syndrome)患病率大幅度增高。流行病学调查显示，全球约有20％-30％成年人患有代谢综合征。2013年，中华医学会糖尿病学分会组织的一项多中心、多级分层大规模抽样调查结果显示，我国大中城市、乡镇和农村20岁以上人群，代谢综合征的患病率在男性和女性分别是16.7％和11.7％，总体患病率为13.7％，且这一比例还在继续上升。通过分析发现，年龄、血压、糖尿病家族史、肥胖、高血脂、男性、低收入、锻炼少是代谢综合征的主要相关危险因素。调查还发现，人群中超重和肥胖的比例大幅度上升，同时中年人群男性代谢综合征的患病率显著高于同龄女性。
代谢综合征是以中心型肥胖、空腹血糖升高、高血压、高密度脂蛋白胆固醇降低和甘油三酯升高等表现同时存在，以糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢异常为病理改变基础的多种危险因素聚集，促发Ⅱ型糖尿病和动脉粥样硬化等各种心脑血管疾病发生发展的临床综合征。由于代谢综合征是多种代谢成分异常聚集的病理状态，其集簇发生与胰岛素抵抗有关，目前已成为心血管疾病和糖尿病研究领域共同关注的热点，国内外至今对它的认识争议颇多。此外，代谢综合征均伴随着肠道微生态的紊乱。肠道微生态的紊乱可进一步导致肠道功能及中枢神经、外周神经功能紊乱。如导致肠道炎症、炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)，导致神经递质5-羟色胺水平及部分激素水平的异常等。很多研究表明，部分种属的肠道微生物的丰度与肠道疾病具有密切的相关性，如Blautia属在IBS患者的肠道菌群中的丰度会升高。同时，研究调查也表明抑郁、焦虑等精神性疾病与代谢综合征、肠道菌群紊乱及体内5-羟色胺水平低紧密相关，提高外周血中的5-羟色胺水平有助于提高中枢神经中神经递质的水平，进而缓解焦虑、抑郁等症状。
目前针对代谢综合征的药物治疗均围绕降低各种危险因素，包括有效减轻体重的减肥药物；减轻胰岛素抵抗的二甲双胍、噻唑烷二酮类；良好控制血糖的磺脲类、罗格列酮；改善脂代谢紊乱的贝特类、他汀类；控制血压的卡托普利、氨氯地平等；针对IBD和IBS等肠道疾病使用的药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、精神类药物等；针对焦虑、抑郁等精神类疾病则使用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀、去甲肾上腺素和特异性5-羟色胺能抗抑郁药米氮平等。以上这些药物均有一定的治疗作用，但随着病情加重，用药量增大、药物间相互作用、药物毒副作用等也显著增加，导致消化道出现不良反应，并表现出一定的肝肾毒性。鉴于药物存在的各种问题，对代谢综合征、肠道疾病及精神类疾病进行早期干预可有效降低心脑血管疾病、糖尿病、炎症性肠病及抑郁症等的发病风险。
益生菌是可食用的对人体健康有益的微生物，具有潜在的缓解血糖、血脂代谢异常、调节肠道菌群结构及脑肠轴的功能。因此，研发能有效干预代谢综合征、肠道疾病及精神类疾病发生发展的益生菌制品，具有重要的社会和经济价值。
目前，尚无使用益生菌提高机体5-羟色胺水平以调节脑肠轴缓解焦虑及抑郁的发明专利。虽然Blautia菌的添加用于防治仔猪腹泻已有相关专利申请(CN107083339A)，但尚无通过摄入人可食用的微生物(卫生部2014版中国可用于食品、婴幼儿食品、保健品的菌种名单)调节肠道中Blautia属菌的丰度从而缓解肠道疾病的专利。此外，已有一些专利或专利申请涉及防治代谢综合征的组合物及其制备方法，例如CN104906263A公开了一种由茶多酚、原花青素和翻白草提取物组成的用于治疗代谢综合征的复合制剂；CN105796674A公开了一种由车前子和黄连等原料制成的能够防治代谢综合征的中药组合物。另外，少数一些专利涉及了用于改善代谢综合征的包含益生菌的组合物及其制备方法，例如CN105816623A公开了一种治疗和改善代谢综合征的益生菌发酵中药复方组合物，由西洋参、山药、丹皮、茯苓等中药提取后，经益生菌发酵制成。以上专利及专利申请均为应用中药成分或菌与中药混合使用用于缓解代谢综合征，其中的菌株使用及菌的功能均不确定。而CN105567586A则公开了一株具有抗糖尿病功能的植物乳杆菌NCU116，该菌株可通过调节机体血糖、血脂、激素水平及调节机体内代谢途径来达到抗糖尿病的作用。然而该植物乳杆菌筛选自泡菜，而非人体来源，也不能证明该植物乳杆菌能够定植于人类肠道发挥作用。故目前为止，尚没有仅靠人体来源的可定植于人体肠道的单株益生菌(如双歧杆菌)即可缓解代谢综合征，或者缓解高血糖、高血脂、肠道菌群失调、肠道炎症等症状及相关精神性疾病。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种益生菌。所述益生菌可定植于人体肠道，提高外周血中5-羟色胺水平调节脑肠轴，使血清中睾酮含量恢复至正常水平；恢复肠道菌群中Blautia属和Turicibacter属丰度的异常；可改善代谢综合征，缓解高血糖、高血脂以及肝组织、十二指肠组织的炎症和肝组织纤维化等症状。
本发明提供了一种青春双歧杆菌CCFM8630(Bifidobacterium adoltescentis)，于2017年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.14395。
在一个实施方案中，本发明考察了青春双歧杆菌CCFM8630对由高糖高脂饲料导致的肠道菌群失调的影响，结果显示青春双歧杆菌CCFM8630的摄入可使大鼠粪便内紊乱的Bifidobacterium属、Turicibacter属以及Blautia属的肠道微生物的相对丰度显著恢复，其干预效果明显好于动物双歧杆菌BB12。
在一个实施方案中，本发明考察了青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠肝脏、十二指肠等组织损伤的保护作用，结果显示灌胃青春双歧杆菌CCFM8630明显改善了大鼠由高糖高脂导致的肝细胞小泡性脂变、间质炎细胞浸润、肝组织早期纤维化以及十二指肠绒毛增宽、间质水肿、炎细胞数量增多等症状，其干预效果明显好于动物双歧杆菌BB12。
在一个实施方案中，本发明考察了青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠(空腹)血糖水平的影响，结果显示灌胃青春双歧杆菌CCFM8630明显降低了模型大鼠的空腹血糖水平并接近于空白对照组，其降低大鼠空腹血糖水平的能力强于灌胃罗格列酮和动物双歧杆菌BB12。
在一个实施方案中，本发明考察了青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠口服葡萄糖耐量的影响，结果显示青春双歧杆菌CCFM8630能够显著改善口服糖耐量，且作用效果强于动物双歧杆菌BB12。表明青春双歧杆菌CCFM8630可以通过增强葡萄糖耐受能力，进一步降低血糖水平。
在一个实施方案中，本发明分别考察了青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的影响，结果显示灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可降低血清总胆固醇和血清甘油三酯的含量。
进一步，在一个实施方案中，本发明考察了青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠血清5-HT及睾酮水平的影响，结果显示灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可以提高小鼠血清中5羟色胺(5-HT)的水平，且将血清中睾酮的水平降低至正常水平。
因此本发明提供了所述青春双歧杆菌CCFM8630在制备改善代谢综合征、调节肠道菌群或调节脑肠轴的产品中的应用。
其中，所述改善代谢综合征为缓解高血糖、高血脂症状以及缓解肝组织、十二指肠组织的炎症和肝组织纤维化；所述改善肠道菌群为恢复肠道菌群中Blautia属和Turicibacter属丰度的异常；所述调节脑肠轴、缓解焦虑和抑郁症为提高外周血中5-羟色胺水平。
本发明所述产品包括但不限于保健食品或药物。
其中，所述保健食品包括但不限于菌剂或发酵食品。
进一步，本发明提供了含有所述青春双歧杆菌CCFM8630的菌剂。
优选的，所述菌剂中所述青春双歧杆菌CCFM8630的活菌数大于106CFU/g。
本发明所述菌剂可以按常规方法制备。
在一些实施方案中，所述菌剂的制备方法为青春双歧杆菌CCFM8630菌种按照2-4wt％的接种量接种到改良MRS培养基中，35-39℃厌氧条件下培养24-48h，收集菌体，保护剂重悬使菌浓度达到1010CFU/mL，然后悬浮液在37℃厌氧条件下培养50-70min，干燥。
其中，本发明所述制备方法中所述改良MRS培养基(mMRS)为含0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。具体配制方法为胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、吐温80 1mL、一水合硫酸锰0.25g、半胱氨酸盐酸盐0.5g，水定容至1000mL，调节pH至6.5，在119-123℃条件下灭菌15-25min。
本发明所述制备方法中所述保护剂为含有100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖的水溶液。即所述保护剂由脱脂奶粉、麦芽糊精、海藻糖和水组成，其中脱脂奶粉的浓度为100g/L-150g/L，麦芽糊精的浓度为100g/L-150g/L，海藻糖的浓度为140g/L-160g/L。
优选的，本发明所述制备方法中改良MRS培养基培养后收集的菌体采用磷酸盐缓冲液清洗2-4次，所述磷酸盐缓冲液pH为6.8-7.2。
本发明所述制备方法中所述干燥可以采用任意一种菌液干燥工艺进行干燥，如真空冷冻干燥。在一些实施例中，本发明所述制备方法中所述干燥为在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥。
本发明还提供了一种发酵食品，以所述青春双歧杆菌CCFM8630作为发酵剂发酵生产的食品。
所述发酵食品为发酵乳制品、发酵豆制品或发酵果蔬制品。
所述发酵乳制品包括但不限于酸奶、酸奶油、干酪。所述的发酵豆制品包括但不限于豆奶、豆豉、豆酱。所述发酵果蔬制品中果蔬包括但不限于黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜。
本发明还提供了一种药物制剂，包括有效剂量的青春双歧杆菌CCFM8630和药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物制剂的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明有益的技术效果在于：
本发明所述青春双歧杆菌CCFM8630可显著提高大鼠外周血神经递质5-羟色胺(5-HT)的水平，具有脑肠轴调节功能，可缓解与代谢综合征相关的焦虑、抑郁等心理疾病；可恢复由高糖高脂饮食导致的大鼠外周血睾酮等激素水平的升高；可恢复由高糖高脂导致的大鼠肠道菌群中Bifidobacterium属、Blautia属和Turicibacter属丰度的异常。此外，青春双歧杆菌CCFM8630能很好的耐受模拟胃肠液，在肠道内快速定植，显著改善高糖高脂饮食导致的代谢综合征大鼠肝脏、十二指肠等组织的病理损伤；显著改善代谢综合征大鼠的口服糖耐量，降低葡萄糖耐量药时曲线下面积；显著改善代谢综合征大鼠由于高糖高脂饮食导致的血清中甘油三酯和总胆固醇含量升高。本发明所述的青春双歧杆菌CCFM8630可用于制备缓解代谢综合征，调节肠道菌群缓解肠易激综合征以及调节脑肠轴缓解焦虑、抑郁等心理疾病的保健食品或药物，具有非常广泛的应用前景。
生物保藏说明
CCFM8630，分类命名：青春双歧杆菌，Bifidobacterium adoltescentis，于2017年07月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14395。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示青春双歧杆菌CCFM8630的菌落形态；
图2示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠肝脏组织结构的影响；
图3示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠十二指肠组织结构的影响；
图4示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠部分肠道微生物丰度的影响；a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)；
图5示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠的口服葡萄糖耐量的影响；a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)；
图6示口服葡萄糖耐量时血糖含量变化曲线；
图7示口服葡萄糖耐药量时曲线下面积(AUCglucose)；
图8示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠血清总胆固醇(TC)的影响；a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)；
图9示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠血清甘油三酯(TG)的影响；a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)；
图10示青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠5羟色胺(5-HT)和睾酮(Testosterone)水平的影响；a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
本发明公开了一种青春双歧杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述青春双歧杆菌CCFM8630具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
(3)生长特性：在37℃恒温厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约24小时达到对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力；
(5)能够显著改善高糖高脂饮食导致的肝脏、十二指肠等组织的病理损伤；
(6)能够显著改善代谢综合征大鼠的口服糖耐量；
(7)降低葡萄糖耐量药时曲线下面积；
(8)可调节血清中甘油三酯和总胆固醇含量，使其降低至正常水平；
(9)可提高外周血5-羟色胺(5-HT)水平，回调睾酮至正常水平；
(10)可显著恢复由高糖高脂饮食导致的肠道内Bifidobacterium属、Turicibacter属、Blautia属等菌群的失调；
本发明所述青春双歧杆菌CCFM8630的提取方法为：
(一)乳酸菌的分离筛选
(1)取1g来自湖北省钟祥市柴湖镇长寿村的95岁男性老人新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时。
(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化。
(3)在mMRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体mMRS培养液中培养24h，然后取lmL培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸盐酸盐的pH6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200μL15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCI；
(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCI，体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，初步断定其为双歧杆菌。
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
(l)单菌基因组提取(按照TIANamp Bacteria DNA kit操作步骤进行)
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取菌悬液lmL于1.5mL离心管，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清；
B.向菌体沉淀中加入180μL缓冲液(20mM Tris,pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton；终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理30min以上；
C.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；
D.加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
E.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
F.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
G.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
H.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；重复操作一次；
I.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
J.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2)全基因组测序
将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，鉴定其为双歧杆菌属下的青春双歧杆菌，且该菌株与已报道的青春双歧杆菌基因均有明显不同，鉴定为新的株。通过blastn的算法，将青春双歧杆菌CCFM8630与青春双歧杆菌标准菌株ATCC15703的基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝683)进行比较，共得到259个差异基因，见表1。
表1青春双歧杆菌CCFM8630与标准菌株青春双歧杆菌ATCC15703的差异基因。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供的青春双歧杆菌CCFM8630可显著提高大鼠外周血神经递质5-羟色胺(5-HT)的水平，具有脑肠轴调节功能，可缓解与代谢综合征相关的焦虑、抑郁等心理疾病；可恢复由高糖高脂饮食导致的大鼠外周血睾酮等激素水平的升高；可恢复由高糖高脂导致的大鼠肠道菌群中Bifidobacterium属、Blautia属和Turicibacter属丰度的异常。此外，青春双歧杆菌CCFM8630能很好的耐受模拟胃肠液，在肠道内快速定植，显著改善高糖高脂饮食导致的代谢综合征大鼠肝脏、十二指肠等组织的病理损伤；显著改善代谢综合征大鼠的口服糖耐量，降低葡萄糖耐量药时曲线下面积；显著改善代谢综合征大鼠由于高糖高脂饮食导致的血清中甘油三酯和总胆固醇含量升高。本发明所述的青春双歧杆菌CCFM8630可用于制备缓解代谢综合征，调节肠道菌群缓解肠易激综合征以及调节脑肠轴缓解焦虑、抑郁等心理疾病的保健食品或药物，具有非常广泛的应用前景。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。以下实施例均由江南大学食品学院食品生物技术中心的益生菌理论与技术研究团队完成。
实施例1：青春双歧杆菌CCFM8630对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将冷冻保存的青春双歧杆菌CCFM8630接种于mMRS培养基(MRS培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，取青春双歧杆菌CCFM8630的培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1：1)pH 2.5的人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)中，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。
取青春双歧杆菌CCFM8630的培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1：1)人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。
实验结果如表2和表3所示。结果表明，青春双歧杆菌CCFM8630对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表2青春双歧杆菌CCFM8630在人工模拟胃液中的耐受性
表3青春双歧杆菌CCFM8630在人工模拟肠液中的耐受性
实施例2：青春双歧杆菌CCFM8630对SD大鼠无毒副作用
将青春双歧杆菌CCFM8630菌体重悬于2％的蔗糖溶液中，制成浓度为3.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重180g-200g左右的健康雄性SD大鼠8只，适应环境一周后，每日给予上述浓度菌悬液灌胃一次，灌胃剂量为2mL/只/天观察一周，记录死亡和体重情况。结果见表4。
表4大鼠体重的变化及死亡情况
时间(天) 1 2 3 4 5 6 7
体重(g) 230.2±1.2 234.8±1.7 240.9±1.4 246.2±1.1 251.1±0.8 257.2±0.6 263.7±0.9
死亡情况 - - - - - - -
注：-：大鼠无死亡
结果显示，喂食浓度3.0×109CFU/mL的青春双歧杆菌CCFM8630菌悬液未对大鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。大鼠外观无明显病理症状。
实施例3：青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠肝脏、十二指肠等组织损伤具有良好的恢复作用
取体重180-200g的健康雄性SD大鼠48只，适应环境1周，随机分为6组：空白对照组(NC)、高糖高脂模型对照组(HFHS)、辛伐他汀对照组(SC)、罗格列酮对照组(RH)、青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)、动物双歧杆菌BB12对照组(BB12)，每组含小鼠8只，灌胃菌悬液的浓度为3.0×109CFU/mL，重悬于2％的蔗糖溶液中。实验动物分组及处理方法见表5。
表5实验动物分组及处理方法
试验结束时，大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，辅以颈椎脱臼法处死。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，-80℃冻存备用。肝脏、十二指肠等收集后迅速置于冰冷的生理盐水中漂洗去血，放入多聚甲醛中固定，另外收集小肠-80℃立即置于液氮中备用。
取回肠、十二指肠等部分制作石蜡切片，经HE染色后光镜下观察组织形态并拍照，进行病理学评价。实验结果如附图2、3所示。HE染色具体步骤如下：
(1)固定：组织样品用生理盐水洗一下，立即投入中性多聚甲醛固定液(4％)中固定，一般固定时间在72h之内。
(2)洗涤：流水冲洗或浸泡数小时或过夜。
(3)脱水：样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％1次20min、100％2次每次10min。
(4)透明：1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液10min、二甲苯Ⅰ10min、Ⅱ10min(至透明为止)。
(5)浸蜡：将样品放入石蜡(62℃)透蜡2h。
(6)包埋：以最大的面在底层，使切出的面组织面所占最大。
(7)切片：用手动切片机，将蜡块切成5μm厚度的片段。
(8)展片和粘片(捞片)：打开水浴锅，使水温维持在42℃，使切片平整铺展在水面上。
(9)烤片：将载玻片连同载玻片架放入55℃的干燥箱，约2h至蜡熔化。
(10)水化：石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中3min。
(11)初染：切片放入苏木精中染色约20s。
(12)水洗：用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
(13)分化：将切片放入1％盐酸乙醇溶液中褪色，7s。见切片变红，颜色较浅即可。
(14)漂洗：切片再放入自来水流水中冲洗15-20min使其恢复蓝色。
(15)复染：浸入伊红染液，立即取出进行脱水。
(16)脱水：将切片依次过95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、70％乙醇，再放入80％乙醇50s、无水乙醇2min。
(17)透明：切片放入1/2无水乙醇，1/2二甲苯中1min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2min。
(18)封片：切片经二甲苯透明后，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
通过图2可发现，高糖高脂饮食可导致肝细胞小泡性脂变，个别大鼠间质有炎细胞浸润或纤维组织增生，高糖高脂模型对照组(HFHS)肝组织内纤维组织增生明显，有早期纤维化的形态学表现，而青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可明显改善上述病变，且效果明显好于BB12组。图3显示，光学显微镜下，大鼠十二指肠出现的病变类型有绒毛增宽，间质水肿、炎细胞数量增多，少数间质巨噬细胞增多，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可改善上述病变，且效果明显好于BB12组。
实施例4：青春双歧杆菌CCFM8630对由高糖高脂饲料导致的肠道菌群失调具有恢复作用
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。实验结束前取大鼠的新鲜粪便，提取粪便中的宏基因组，并利用二代测序仪对肠道菌群结构进行分析。
实验结果如图4所示。高糖高脂模型对照组(HFHS)大鼠粪便内Bifidobacterium属和Turicibacter属的肠道微生物相对丰度显著降低，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)青春双歧杆菌CCFM8630的摄入可使该两个属的肠道微生物的相对丰度显著回升，而药物及BB12对这两个属的肠道微生物的丰度变化无恢复作用。而这也说明青春双歧杆菌CCFM8630不仅能够在肠道内定植，而且还可以提高肠道内Bifidobacterium属内其他种的含量。此外，高糖高脂模型对照组(HFHS)大鼠粪便内Blautia属的肠道微生物相对丰度显著升高，而青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)青春双歧杆菌CCFM8630的摄入可将Blautia属的丰度回调至正常水平，效果均好于药物及BB12。
实施例5：青春双歧杆菌CCFM8630可降低代谢综合征大鼠(空腹)血糖水平
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
试验结束时，禁食不禁水12h，检测各组大鼠空腹血糖，实验结果如图5所示。
高糖高脂模型对照组(HFHS)大鼠空腹血糖显著升高，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630明显降低了模型大鼠的空腹血糖水平并接近于空白对照组，其降低大鼠空腹血糖水平的能力强于罗格列酮对照组(RH)和动物双歧杆菌BB12对照组(BB12)。
实施例6：青春双歧杆菌CCFM8630可增强代谢综合征大鼠葡萄糖耐受能力
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，禁食不禁水12h，腹腔注射葡萄糖溶液(2g/kg)，分别测量0，30，60，120min的血糖情况。实验结果如图6、7所示。
由图6可以看出，高糖高脂模型对照组(HFHS)小鼠对葡萄糖的耐受能力很差，灌胃葡萄糖后，血糖值明显升高，并且下降缓慢。从图7可以看出，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630明显降低了AUCglucose面积，且与罗格列酮对照组(RH)、空白对照组(NC)无显著差异。这就说明，青春双歧杆菌CCFM8630能够显著改善口服糖耐量，且作用效果强于动物双歧杆菌BB12。这些结果与血糖指标结果相一致，提示青春双歧杆菌CCFM8630可以通过增强葡萄糖耐受能力，进一步降低血糖水平。
实施例7：青春双歧杆菌CCFM8630可降低代谢综合征大鼠血清总胆固醇(TC)的水平
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中总胆固醇(TC)的含量。实验结果如图8所示。
由图8可以看出，高糖高脂模型对照组(HFHS)大鼠血清总胆固醇含量明显升高，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可降低血清总胆固醇的含量。
实施例8：青春双歧杆菌CCFM8630可降低代谢综合征大鼠血清甘油三酯(TG)的水平
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中甘油三酯(TG)的含量。实验结果如附图9所示。
由实验结果可以看出，与空白对照组(NC)相比，高糖高脂模型对照组大鼠血清甘油三酯含量显著升高，青春双歧杆菌CCFM8630干预组灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可降低血清甘油三酯的含量，效果与罗格列酮对照组水平相当。而灌胃BB12无显著作用。
实施例9：青春双歧杆菌CCFM8630对代谢综合征大鼠血清5-HT及睾酮水平的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中5-HT及睾酮的含量。实验结果如附图10所示。
由实验结果可以看出，青春双歧杆菌CCFM8630可以提高小鼠血清中5-HT的水平，而BB12对5-HT水平没有显著的提高作用。与空白对照组(NC)相比，高糖高脂模型对照组(HFHS)大鼠血清睾酮含量显著升高，青春双歧杆菌CCFM8630干预组(CCFM8630)灌胃青春双歧杆菌CCFM8630可将血清中睾酮的水平降低至正常水平。

Claims (11)

1.青春双歧杆菌CCFM8630(Bifidobacterium adoltescentis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为保藏编号为CGMCC No.14395。
2.权利要求1所述青春双歧杆菌CCFM8630在制备改善代谢综合征、调节肠道菌群、改善肠易激综合征或调节脑肠轴、缓解焦虑和抑郁的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善代谢综合征为缓解高血糖、高血脂症状以及肝组织、十二指肠组织的炎症和肝组织纤维化；所述改善肠道菌群为恢复肠道菌群中Blautia属和Turicibacter属丰度的异常；所述调节脑肠轴、缓解焦虑和抑郁症为提高外周血中5-羟色胺水平；所述产品为保健食品或药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保健食品为菌剂或发酵食品。
5.含有权利要求1所述青春双歧杆菌CCFM8630的菌剂。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述青春双歧杆菌CCFM8630的活菌数大于106CFU/g。
7.权利要求6所述菌剂的制备方法，其特征在于，青春双歧杆菌CCFM8630菌种按照2-4wt％的接种量接种到改良MRS培养基中，35-39℃厌氧条件下培养24-48h，收集菌体，保护剂重悬使菌浓度达到1010CFU/mL，然后悬浮液在37℃厌氧条件下培养50-70min，干燥。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述改良MRS培养基(mMRS)为含0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基；所述保护剂为含有100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖的水溶液；所述干燥为在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥。
9.一种发酵食品，其特征在于，以权利要求1所述青春双歧杆菌CCFM8630作为发酵剂发酵生产的食品。
10.根据权利要求9所述的发酵食品，其特征在于，为发酵乳制品、发酵豆制品或发酵果蔬制品。
11.一种药物制剂，其特征在于，包括有效剂量的青春双歧杆菌CCFM8630和药学上可接受的辅料。
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