CN107699486A - 用于染色观察的细胞培养皿及细胞培养染色、观察方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于染色观察的细胞培养皿及细胞培养染色及观察方法，包括培养皿体、培养皿盖，在培养皿体一侧设有手柄，所述培养皿体包括底板，底板上设有若干底板凹槽，底板上部周边设有封闭的垂直密封板，手柄与底板连接，培养皿盖下端面与垂直密封板上端面配合。包括以下步骤：1)培养液配制；2)细胞培养；3)染色；4)显微镜观察。本发明不需要在培养孔内放置玻片，直接将细胞悬液加到本发明的特制的细胞培养皿内，不存在玻片漂起以及夹取玻片遇到的问题；染色完成后在倒置显微镜下放置培养皿的底壁直接观察，或者在正置显微镜下将培养皿的底壁反过来放置观察，使细胞层与显微镜镜头能以非常近的距离靠近，特别适于高倍数油镜观察。

Description

用于染色观察的细胞培养皿及细胞培养染色、观察方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术领域，具体是一种用于染色观察的细胞培养皿及细胞培养染色、观察方法。

背景技术

细胞培养作为一种重要的研究手段，广泛应用于营养学、病理学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面，成为科研中不可或缺的技术手段。在试验中，观察细胞形态结构多数情况下需要进行染色(如免疫化学、免疫荧光、苏木精-伊红等染色方法)，因此有必要将细胞培养在合适的载体上以方便在显微镜下观察。

目前通常采用细胞“爬片”的方法进行染色观察，就是先将盖玻片冲洗干净，灭菌处理后放在培养板或培养皿的孔内，加入细胞悬液，然后细胞开始在盖玻片上贴壁生长，待贴壁程度达到试验要求时立即在培养孔内进行染色处理，最后将盖玻片取出并放在载玻片上，在显微镜下观察和拍照。也有实验室采用市售的专用玻片，不用进行前期的清洗和灭菌处理，直接放在在培养板或培养皿的孔内接种细胞。然而在试验中发现，不论采用盖玻片还是专用的玻片，都存在以下三个问题：(1)将玻片放在培养孔内，加入细胞悬液后发现玻片会漂起，造成细胞在玻片上下两面都贴壁生长，不利于在显微镜下观察细胞形态。即使在培养孔准备放玻片的位置处先滴少量培养液，然后轻轻放上玻片，使玻片与培养孔看似粘在一起，但也有部分玻片在加入细胞悬液后漂起。(2)玻片上贴壁生长的细胞与培养孔内培养的细胞在形态和功能上有少许差别，玻片上生长的细胞偏离正常细胞形态，分泌功能降低，比如脂肪细胞内脂滴形成速度变慢。(3)染色处理完成后用镊子将玻片取出，由于玻片较薄，夹取时力度不好控制，力量大时会将玻片夹碎，力量轻时玻片会滑落。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺点，本发明提供了一种专门用于染色观察的细胞培养皿。本发明结构紧凑、方便握持，不需要在培养孔内放置玻片，而是直接将细胞悬液加到本发明的特制的细胞培养皿内，因此不会存在加入细胞悬液后玻片漂起以及夹取玻片遇到的问题；染色完成后，将培养皿侧壁掰掉，用透明封口胶封片；在倒置显微镜下将特制培养皿的底壁直接放置观察，在正置显微镜下将特制培养皿的底壁反过来放置并观察，这样使细胞层与显微镜镜头能以非常近的距离靠近，特别适于高倍数油镜观察。

本发明还提供一种细胞培养染色及观察方法。

本发明的技术方案是：

一种细胞培养皿，包括培养皿体、培养皿盖，在培养皿体一侧设有手柄，所述培养皿体包括底板，底板上设有若干底板凹槽，底板上部周边设有封闭的垂直密封板，所述手柄与底板连接，培养皿盖下端面与垂直密封板上端面配合。

所述垂直密封板在与底板连接位置的上部外侧设有密封板凹槽，所述密封板凹槽为弧形槽或者由从上向下向内的倾斜面。

所述培养皿盖包括上部盖板、与盖板连接的下部凸起一，上部盖板的下端面与垂直密封板上端面配合，所述凸起一位于垂直密封板的内侧、与垂直密封板的上端内侧配合、向下伸入垂直密封板上端面以下，通过凸起一与垂直密封板的上端内侧配合实现培养皿盖的定位。

所述培养皿体采用上部开口的长方体空腔结构，在远离手柄一侧的两个垂直边设有培养皿体过渡圆角，下部凸起一的对应位置设有突起过渡圆角。

上部盖板的外缘大于垂直密封板上端面外缘。

在上部盖板的下端面上与垂直密封板上端面配合的位置设有多个薄的下部凸起二。

所述底板凹槽设有多个，多个底板凹槽之间通过中间隔板分开。

所述培养皿采用适合细胞贴壁生长的高透明度的聚苯乙烯材料制成。

一种细胞培养染色及观察方法，具体包括以下步骤：

1)培养液配制

每450-500毫升细胞培养液中加入50-60毫升胎牛血清(FBS)、3-5毫升青链霉素混合液、0.01-0.02克Ⅰ型胶原蛋白，根据细胞生长特性、添加合适种类和浓度的生长因子或能量物质，然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，两周内用完；细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热；

2)细胞培养

待体外培养的细胞贴壁80-90％后，在培养瓶内加入PBS液冲洗1遍，然后加入含0.05％EDTA的0.25％胰酶放在37℃培养箱内消化3-5分钟，之后加入培养液轻轻吹打成单个游离细胞，调整细胞密度为2-5×10⁴个/ml，在细胞培养皿中加入4-6毫升细胞悬液，最后放在含5％CO₂、100％湿度的37℃培养箱内培养；

3)染色

待底板凹槽31凹槽内细胞80-90％贴壁时进行染色处理，染色处理根据具体的实验目的按照说明书步骤进行，染色完成后将培养皿的周边垂直密封板直接掰掉，在每个底板凹槽31内加入100微升PBS液，用透明封口胶将底板凹槽31封住；

(4)显微镜观察

在倒置显微镜下将细胞培养皿的底壁放在载物台上，视野对准底板凹槽31，仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照；在正置显微镜下将细胞培养皿的底壁反过来放在载物台上，即将透明封口胶封口的面朝下，同样仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照。

本发明的有益效果是：

1)本发明本发明结构紧凑、方便握持，不需要在培养孔内放置玻片，而是直接将细胞悬液加到本发明的特制的细胞培养皿内，因此不会存在加入细胞悬液后玻片漂起以及夹取玻片遇到的问题；染色完成后，将培养皿侧壁掰掉，用透明封口胶封片，在倒置显微镜下将特制培养皿的底壁直接放置观察，在正置显微镜下将特制培养皿的底壁反过来放置并观察，这样使细胞层与显微镜镜头能以非常近的距离靠近，特别适于高倍数油镜观察。采用透明封口胶封片，一是避免细胞因蒸发而干燥变形或污染侵蚀镜头，同时可使标本表面平整，有利于观察和拍照；二是在正置显微镜下观察，可以将特制培养皿的底壁反过来放置，使镜头与细胞层能近距离靠近，利于高倍数油镜镜头观察。

2)培养液中添加促进细胞贴壁的Ⅰ型胶原蛋白，有利于细胞生长。在细胞培养前，将细胞悬液密度调整为2-5×10⁴个/ml，并且在特制培养皿内加入4-6毫升细胞悬液，这样既有利于细胞贴壁生长和培养液中能量物质充分吸收，又有利于气体交换。

3)染色处理时，培养凹槽内细胞培养至80-90％贴壁，这样细胞能均匀分布呈现细胞正常的形态。因为如果细胞贴壁太满，势必细胞生长会太挤，造成细胞变形和单个细胞界限不清晰从而影响观察；如果细胞贴壁太疏松，那么视野中细胞数目较少，影响观察结果的准确性。

4)培养皿材料由高透明度的聚苯乙烯为原料制成，适合细胞贴壁生长。

5)垂直密封板在与底板连接位置的上部外侧设有密封板凹槽，密封板凹槽为弧形槽或者由从上向下向内的倾斜面。通过在垂直密封板外侧设有密封板凹槽，使得密封板凹槽部位的厚度变小，垂直密封板容易从该处向外直接掰开、与底板及其他相邻接的垂直密封板部位脱离、掰掉，便于细胞染色和后续观察。

6)上部盖板的下端面与垂直密封板上端面配合，凸起一位于垂直密封板的内侧、与垂直密封板的上端内侧配合、向下伸入垂直密封板上端面以下，通过凸起一与垂直密封板的上端内侧配合实现培养皿盖的定位，保证上部盖板能够可靠牢固地覆盖固定在下部培养皿的开口处，起到保护作用。

7)在上部盖板的下端面上与垂直密封板上端面配合的位置设有多个薄的下部凸起二，通过多个薄的凸起二与垂直密封板上端面接触，使得上部盖板的下端面与垂直密封板上端面留有预定的空隙，便于培养皿体内腔与外界保持一定的空气循环接触，满足细胞培养的条件，保证细胞生长良好。

附图说明

图1为本发明专用的培养皿结构示意图。

图2为图1去掉培养皿盖后的俯视图；

图3为图1的弧形槽结构的剖视图；

图4为图1的倾斜面结构的剖视图；

图5为培养皿盖的仰视图；

图6为牛脂肪细胞采用实施例1的方法培养并进行油红O染色的油镜观察(1000×)照片；

图7为牛卵巢颗粒细胞采用实施例2的方法培养并进行Hoechst 33342荧光染色的观察(400×)照片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图来详细解释本发明的实施方式。

实施例1

结合图1至图5，一种细胞培养皿，包括培养皿体3、培养皿盖2，在培养皿体3一侧设有手柄1，所述培养皿体3包括底板33，底板33上设有若干底板凹槽31，底板33上部周边设有封闭的垂直密封板32，所述手柄1与底板33连接，培养皿盖2下端面与垂直密封板32上端面配合。

所述垂直密封板32在与底板33连接位置的上部外侧设有密封板凹槽，所述密封板凹槽为弧形槽34或者由从上向下向内的倾斜面35。通过在垂直密封板32外侧设有密封板凹槽，使得密封板凹槽部位的厚度变小，垂直密封板32容易从该处向外掰开、与底板及其他相邻接的垂直密封板32部位脱离、掰掉。

所述培养皿盖2包括上部盖板21、与盖板21连接的下部凸起一22，上部盖板21的下端面与垂直密封板32上端面配合，所述凸起一22位于垂直密封板32的内侧、与垂直密封板32的上端内侧配合、向下伸入垂直密封板32上端面以下，通过凸起一22与垂直密封板32的上端内侧配合实现培养皿盖2的定位。下部凸起一22可周边连续设置，也可间断设置。

所述培养皿体3采用上部开口的长方体空腔结构，在远离手柄一侧的两个垂直边设有培养皿体3过渡圆角36，下部凸起一22的对应位置设有突起过渡圆角24。

上部盖板21的外缘大于垂直密封板32上端面外缘。

在上部盖板21的下端面上与垂直密封板32上端面配合的位置设有多个薄的下部凸起二23。下部凸起二23的壁厚与垂直密封板32壁厚一致。通过多个薄的凸起二与垂直密封板32上端面接触，使得上部盖板21的下端面与垂直密封板32上端面留有预定的空隙4，便于培养皿体3内腔与外界保持一定的空气循环接触，满足细胞培养的条件。

所述培养皿采用高透明度的聚苯乙烯材料制成，适合细胞贴壁生长。

所述底板凹槽31设有多个，多个底板凹槽31之间通过中间隔板5分开形成各自独立密封的细胞培养室。

实施例2

一种细胞培养染色及观察方法，具体包括以下步骤：

1)培养液配制

每450-500毫升细胞培养液中加入50-60毫升胎牛血清(FBS)、3-5毫升青链霉素混合液、0.01-0.02克Ⅰ型胶原蛋白，根据细胞生长特性、添加合适种类和浓度的生长因子或能量物质，然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，两周内用完；细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热；

2)细胞培养

待体外培养的细胞贴壁80-90％后，在培养瓶内加入PBS液冲洗1遍，然后加入含0.05％EDTA的0.25％胰酶放在37℃培养箱内消化3-5分钟，之后加入培养液轻轻吹打成单个游离细胞，调整细胞密度为2-5×10⁴个/ml，在细胞培养皿中加入4-6毫升细胞悬液，最后放在含5％CO₂、100％湿度的37℃培养箱内培养；

3)染色

待底板凹槽31凹槽内细胞80-90％贴壁时进行染色处理，染色处理根据具体的实验目的按照说明书步骤进行，染色完成后将培养皿的周边垂直密封板直接掰掉，在每个底板凹槽31内加入100微升PBS液，用透明封口胶将底板凹槽31封住；

(4)显微镜观察

在倒置显微镜下将细胞培养皿的底壁放在载物台上，视野对准底板凹槽31，仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照；在正置显微镜下将细胞培养皿的底壁反过来放在载物台上，即将透明封口胶封口的面朝下，同样仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照。

实施例3

一种细胞培养染色及观察方法，具体包括以下步骤：

(1)培养液配制

每450毫升DMEM/F12液中加入50毫升FBS、3毫升青链霉素混合液、0.01克Ⅰ型胶原蛋白、0.1克牛磺酸，然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40毫升，放置4℃保存，两周内用完。细胞培养前0.5小时将培养液放在37℃水浴锅中预热。

(2)牛脂肪细胞培养

待体外培养的牛脂肪细胞贴壁80％-90％后，在T25培养瓶内加入2毫升PBS液冲洗1遍，然后加入1毫升0.25％胰酶(含0.05％EDTA)放在37℃培养箱内消化4分钟，之后加入培养液轻轻吹打成单个游离细胞，调整细胞密度为3×104个/ml，在特制细胞培养皿中加入4毫升细胞悬液，最后放在5％CO2、100％湿度的37℃培养箱内培养，48小时后有约90％细胞贴壁。

(3)油红O染色

在特制培养皿内加入2毫升油红O染液，室温放置15分钟，然后用37℃左右温的PBS液洗3次；之后加入2毫升苏木精染液，室温放置5分钟，PBS液洗3次；最后用手掰掉侧壁，在每个皿中孔内加入100微升PBS液，用透明封口胶封片。

(4)显微镜观察

按封口朝下的方向将特制培养皿的底壁放在正置显微镜的载物台上，然后滴香柏油1小滴，将油镜镜头对准培养凹槽内视野，先后旋转显微镜粗调和微调，待细胞图像清晰后拍照，视野内细胞质内脂肪染成鲜红色(实线箭头)，细胞核染成深蓝色(虚线箭头)。如图6所示。

实施例4

一种细胞培养染色及观察方法，具体包括以下步骤：

(1)培养液配制

每500毫升DMEM/F12液中加入60毫升FBS、5毫升青链霉素混合液、0.02克Ⅰ型胶原蛋白、0.01克谷氨酰胺，然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管45毫升，放置4℃保存，两周内用完。细胞培养前1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热。

(2)牛卵巢颗粒细胞培养

待体外培养的牛脂肪细胞贴壁80％-90％后，在T25培养瓶内加入2毫升PBS液冲洗1遍，然后加入1毫升0.25％胰酶(含0.05％EDTA)放在37℃培养箱内消化5分钟，之后加入培养液轻轻吹打成单个游离细胞，调整细胞密度为5×104个/ml，在特制细胞培养皿中加入6毫升细胞悬液，最后放在5％CO2、100％湿度的37℃培养箱内培养，40小时后有约80％细胞贴壁。

(3)Hoechst 33342荧光染色

在特制培养皿内加入2毫升Hoechst 33342荧光染液，室温避光放置5分钟，然后用PBS液洗3次，最后用手掰掉侧壁，在每个皿中孔内加入100微升PBS液，用透明封口胶封片。

(4)显微镜观察

将特制培养皿的底壁放在倒置显微镜的载物台上，然后将400倍镜头对准培养凹槽内视野，先后旋转显微镜粗调和微调，待细胞图像清晰后拍照，视野内细胞核染成蓝色。如图7箭头所示。

上述虽然结合附图对发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种细胞培养皿，包括培养皿体、培养皿盖，其特征是，在培养皿体一侧设有手柄，所述培养皿体包括底板，底板上设有若干底板凹槽，底板上部周边设有封闭的垂直密封板，所述手柄与底板连接，培养皿盖下端面与垂直密封板上端面配合。

2.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征是，所述垂直密封板在与底板连接位置的上部外侧设有密封板凹槽，所述密封板凹槽为弧形槽或者由从上向下向内的倾斜面。

3.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征是，所述培养皿盖包括上部盖板、与盖板连接的下部凸起一，上部盖板的下端面与垂直密封板上端面配合，所述凸起一位于垂直密封板的内侧，与垂直密封板的上端内侧配合、向下伸入垂直密封板上端面以下。

4.如权利要求3所述的细胞培养皿，其特征是，所述培养皿体采用上部开口的长方体空腔结构，在远离手柄一侧的两个垂直边设有培养皿体过渡圆角，凸起一的对应位置设有突起过渡圆角。

5.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征是，上部盖板的外缘大于垂直密封板上端面外缘。

6.如权利要求3所述的细胞培养皿，其特征是，在上部盖板的下端面上与垂直密封板上端面配合的位置设有多个薄的下部凸起二。

7.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征是，所述底板凹槽设有多个，多个底板凹槽之间通过中间隔板分开。

8.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征是，所述培养皿采用适合细胞贴壁生长的高透明度的聚苯乙烯材料制成。

9.利用权利要求1至8任一项所述的细胞培养皿的细胞培养染色及观察方法，具体包括以下步骤：

1)培养液配制

每450-500毫升细胞培养液中加入50-60毫升胎牛血清(FBS)、3-5毫升青链霉素混合液、0.01-0.02克Ⅰ型胶原蛋白，根据细胞生长特性、添加合适种类和浓度的生长因子或能量物质，然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存；细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热；

2)细胞培养

待体外培养的细胞贴壁80-90％后，在培养瓶内加入PBS液冲洗1遍，然后加入含0.05％EDTA的0.25％胰酶放在37℃培养箱内消化3-5分钟，之后加入培养液轻轻吹打成单个游离细胞，调整细胞密度为2-5×10⁴个/ml，在细胞培养皿中加入4-6毫升细胞悬液，最后放在含5％CO₂、100％湿度的37℃培养箱内培养；

3)染色

待底板凹槽凹槽内细胞80-90％贴壁时进行染色处理，染色完成后将培养皿的周边垂直密封板直接掰掉，在每个底板凹槽内加入100微升PBS液，用透明封口胶将底板凹槽封住；

(4)显微镜观察

在倒置显微镜下将细胞培养皿的底壁放在载物台上，视野对准底板凹槽，仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照；在正置显微镜下将细胞培养皿的底壁反过来放在载物台上，即将透明封口胶封口的面朝下，同样仔细旋转显微镜粗调和微调，直至观察到清晰的细胞形态后拍照。