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CN107669695B - 淫羊藿次苷ⅱ在制备抗乙型肝炎病毒产品中的应用 - Google Patents

淫羊藿次苷ⅱ在制备抗乙型肝炎病毒产品中的应用 Download PDF

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CN107669695B
CN107669695B CN201711139054.6A CN201711139054A CN107669695B CN 107669695 B CN107669695 B CN 107669695B CN 201711139054 A CN201711139054 A CN 201711139054A CN 107669695 B CN107669695 B CN 107669695B
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刘正芸
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Zunyi Medical University
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Abstract

本专利申请公开了淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗乙型肝炎病毒产品中的应用，通过体外乙型肝炎病毒感染细胞模型实验进行研究，结果显示了所述的淫羊藿次苷Ⅱ能抑制乙肝病毒表面抗原、e抗原的表达，能抑制乙肝病毒DNA的复制；通过HBV感染小鼠模型从体内进行研究，显示所述的淫羊藿次苷Ⅱ能够降低HBV感染小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平。证明淫羊藿次苷Ⅱ有明显的抗乙肝病毒的作用，可用于制备抗乙肝病毒感染所致相关疾病的药物。

Description

淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗乙型肝炎病毒产品中的应用
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及中草药淫羊藿中的特异单体淫羊藿次苷Ⅱ在制备药物组合物中的应用，尤其是淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗乙型肝炎病毒产品中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相关性疾病已成为当今威胁人类健康的主要疾病之一。目前针对乙肝的抗病毒治疗药物主要有核苷类似物及干扰素。这些药物虽有一定疗效，但也存在不良反应，而且针对核苷类似物的耐药性也逐渐增加。因此，新型抗HBV药物的研究具有更重要的意义。
中药淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)别名仙灵脾、千两金、放杖草等，为小檗科淫羊藿属植物，普遍分布于我国贵州、四川、辽宁、江西、陕西、湖南、湖北等地。淫羊藿最早记载见于《神农本草经》，具有极高的药用价值，其应用历史悠久，据记载，淫羊藿的主要功效有补肾壮阳、祛风除湿等。现代研究表明，淫羊藿在临床上可用于治疗乳房肿块、高血压等疾病，还有增强人体免疫功能、延缓衰老、防治神经性疾病等作用。现有技术如CN201510620180.8公开的一种治疗肝郁脾虚型慢性肝炎的中药组合物，其中药原料及重量份配比为：茯苓10-40份、当归5-20份、白芍5-25份、柴胡5-20份、薄荷5-20份、炒白术10-30份、香附5-20份、炒栀子5-25份、肉桂5-20份、炒苍术5-20份、炒薏苡仁10-30份、白扁豆5-25份、黄柏5-20份、女贞子10-40份、淫羊藿5-25份、仙茅5-20份、山药5-25份、芡实5-20份、车前子5-20份、垂盆草10-30份、泽泻5-20份、刺五加5-25份、小茴香5-20份、柿蒂5-25份、川楝子5-20份、甘草5-15份。该发明的中药组合物治疗肝郁脾虚型慢性肝炎疗效显著，作用可靠。又如CN201510594657.X公开的一种治疗慢性肝炎的中药汤剂，其组成原料的重量份为：虎杖8-10、郁金3-4、白茅根2-3、芹菜根5-6、黄芩9-10、制何首乌2-4、菊苣4-6、荜拨8-10、车前草3-4、厚朴花2-4、淫羊藿5-8、黄花菜15-20、石榴皮10-15、苎麻根2-4、青葙子3-4、牡丹皮10-15、菊花苗4-6、三叉虎根1-3；该发明中药配伍符合传统中医药学和现代医药学研究理论；具有活血通络、软坚散结、清热解毒、益气养阴、健胃消食的功效，该发明的中药汤剂疗效好、见效快、服用方便、无副作用，对慢性肝炎有很好的治疗效果。再如CN201210076981.9公开的一种治疗慢性乙型肝炎的药剂，它是由下列原料药制成的：半枝莲、焦三仙、党参、泽泻、酸枣仁、板蓝根、桔梗、黄芪、当归、茵陈、金钱草、淫羊藿。该发明所述的药剂以纯中药配制，采用传统的制作方法，保留了药物的药性，疗效明确，可有效地治疗慢性乙型肝炎。但是这些技术均是将中药淫羊藿和其他中药成分组合在一起来治疗慢性肝炎，上述中药组合物除了淫羊藿还具有其他成分，因此具体是什么成分起作用也未见披露。
现有技术CN201580055424.0还公开了一种含有朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分的抗病毒组合物，其包含朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum)提取物作为活性成分。发现朝鲜淫羊藿提取物增加了被病毒感染的细胞(例如水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒)的细胞存活率，并减少了细胞中的病毒数量。上述发明的朝鲜淫羊藿提取物抑制细胞中的病毒增殖，因此可以有效地用作用于预防和治疗关于水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒的病毒性疾病的药物组合物，同时，发明人指出其在治疗由病毒引起的急性肝炎的应用，但在整个说明书中并无该病毒组合物能用于预防和治疗急性肝炎的相关证据，加之淫羊藿提取物中的活性成分未知，因此现有技术缺乏一种具体的从淫羊藿中提取的成分用以治疗慢性肝炎。
淫羊藿次苷Ⅱ(icarisid Ⅱ，IcsⅡ)是从淫羊藿中提取的一种多羟基黄酮类单体成分，是淫羊藿的有效成分之一，文献报道其具有治疗勃起功能障碍、抗缺血性脑损伤、抗肿瘤等作用，目前未见有关淫羊藿次苷Ⅱ抗乙肝病毒作用的报道。
发明内容
本发明意在提供一种淫羊藿次苷Ⅱ的新用途，以治疗乙型肝炎病毒感染所致的相关疾病。
淫羊藿次苷Ⅱ或它们药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备用于预防和/或治疗由乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的产品中的应用
所述肝脏疾病为乙型肝炎病毒感染所致的相关疾病。。
所述相关疾病包括乙型肝炎、肝硬化或者肝癌。
本发明的淫羊藿次苷Ⅱ的分子式为：C27H30O10，对上述分子式为C27H30O10的淫羊藿次苷Ⅱ进行了下述体内、外实验：
通过对稳定转染HBV全基因组的肝癌细胞HepG2.2.15模型进行体外研究，检测淫羊藿次苷Ⅱ对乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)的影响、对e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)表达的影响，对乙肝病毒DNA复制的影响。检测结果显示，所述的淫羊藿次苷Ⅱ能够抑制HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg；能够抑制HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg；能够抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA的复制。
通过高压尾静脉注射pAAV HBV 1.2质粒所建立的HBV感染小鼠模型，研究淫羊藿次苷Ⅱ对小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的影响。检测结果显示，所述的淫羊藿次苷Ⅱ能够降低HBV感染小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平。
实验结果证明，所述的淫羊藿次苷Ⅱ具有明显的抗乙型肝炎病毒作用，可用于制备抗乙型肝炎及相关肝脏疾病的药物。
附图说明
图1为CCK8法检测淫羊藿次苷Ⅱ对细胞生长的影响示意图；*：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.05，**：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.01。
图2为用ELISA法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HepG2.2.15细胞HBsAg分泌的影响示意图，*：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.05，**：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.01。
图3为用ELISA法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HepG2.2.15细胞HBeAg分泌的影响示意图，*：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.05，**：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.01。
图4为用荧光定量PCR法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HepG2.2.15细胞HBV DNA分泌的影响示意图，*：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.05，**：和0μg/ml组的ICSⅡ相比p<0.01。
图5为用ELISA法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HBV感染小鼠血清中HBsAg分泌的影响示意图，*：和10天模型组相比p<0.05，#：和20天模型组相比p<0.05。
图6为用ELISA法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HBV感染小鼠血清中HBeAg分泌的影响示意图，*：和10天模型组相比p<0.05，#：和20天模型组相比p<0.05。
图7为用荧光定量PCR法检测淫羊藿次苷Ⅱ对HBV感染小鼠血清中HBV DNA分泌的影响示意图，*：和10天模型组相比p<0.05，#：和20天模型组相比p<0.05。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
实施例1：淫羊藿次苷Ⅱ的体外细胞模型实验
本发明用CCK8分析的方法检测药物对细胞生长的影响，如图1所示，采用本领域实验公认的HBV感染细胞模型HepG2.2.15，选用的淫羊藿次苷Ⅱ浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml和20μg/ml，实验数据进行T检验分析，结果显示浓度大于15μg/ml的淫羊藿次苷Ⅱ对HepG2.2.15细胞的生长有明显的影响(p<0.05)。
乙肝病毒表面抗原(HBsAg)是HBV感染的主要指标。如图2所示，通过检测分析细胞上清中HBsAg的量，结果显示，当淫羊藿次苷Ⅱ的浓度大于6.25μg/ml时能明显抑制HBsAg的分泌(p<0.01)。
乙肝病毒e抗原(HBeAg)是HBV复制的指标。通过检测分析细胞上清中HBeAg的量，如图3所示，淫羊藿次苷Ⅱ能明显抑制HBeAg的分泌(p<0.01)。
HBV DNA的拷贝数是直接反映病毒在体内量多少的指标。通过检测分析细胞上清中HBVDNA的拷贝数，如图4所示，淫羊藿次苷Ⅱ能明显降低HBV DNA的拷贝数(p<0.01)。
实验结果证明，所述的淫羊藿次苷Ⅱ有明显的抗HBV作用，可用于制备防治乙型肝炎病毒感染所致相关疾病的药物。
实施例2：淫羊藿次苷Ⅱ的HBV感染小鼠体内模型实验
采用本领域成熟的HBV质粒pAAV HBV 1.2通过尾静脉注射建立HBV感染小鼠模型，用腹腔注射给药的方法，在给药10天和20天后分别采血分离血清进行检测。
机体感染HBV后，外周血中最先表现为HBsAg的增高。通过检测分析小鼠血清中HBsAg的量，如图5所示：给药10天后，淫羊藿次苷Ⅱ能明显抑制HBsAg的分泌(p<0.05)，给药20天后，该抑制效应进一步增强(p<0.05)。
HBeAg是一种可溶性蛋白，可游离于血清中，其消长与病毒体和DNA多聚酶的消长基本一致，是HBV复制的指标。通过检测分析小鼠血清中HBeAg的量，如图6所示：给药10天后，淫羊藿次苷Ⅱ能明显抑制HBeAg的分泌(p<0.05)，给药20天后，该抑制效应进一步增强(p<0.05)。
通过检测分析小鼠血清中HBV DNA的拷贝数，如图7所示：给药10天后，淫羊藿次苷Ⅱ能明显降低HBV DNA的拷贝数(p<0.05)。
实验结果证明，所述的淫羊藿次苷Ⅱ有明显的抗HBV作用，可用于制备防治乙型肝炎病毒感染所致相关疾病的药物。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (3)

1.淫羊藿次苷Ⅱ或它们药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备用于预防和/或治疗由乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝脏疾病为乙型肝炎病毒感染所致的相关疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述相关疾病包括乙型肝炎、肝硬化或者肝癌。
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