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CN107641150A - 一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法 - Google Patents

一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法 Download PDF

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CN107641150A
CN107641150A CN201710995599.0A CN201710995599A CN107641150A CN 107641150 A CN107641150 A CN 107641150A CN 201710995599 A CN201710995599 A CN 201710995599A CN 107641150 A CN107641150 A CN 107641150A
Authority
CN
China
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antimicrobial peptide
protein
peptide
recombinant
helicobacter pylori
Prior art date
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Pending
Application number
CN201710995599.0A
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English (en)
Inventor
张孝林
汪建飞
蒋安民
贡成良
范涛
张钦元
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui University of Science and Technology
Original Assignee
Anhui University of Science and Technology
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Application filed by Anhui University of Science and Technology filed Critical Anhui University of Science and Technology
Priority to CN201710995599.0A priority Critical patent/CN107641150A/zh
Publication of CN107641150A publication Critical patent/CN107641150A/zh
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Abstract

本发明提供了一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，属于制药领域。该方法包括：构建编码包含SEQ ID NO:1所示的抗菌肽的融合蛋白的核苷酸序列；构建包含核苷酸序列的重组载体；将重组载体用于转化或转染宿主细胞，并使核苷酸序列在宿主细胞中表达。该方法采用基因工程方法表达包含有抗菌肽的融合蛋白，从而降低抗菌肽的等电点，使其达到高水平的表达，降低生产成本。所制得的这种抗菌肽具有抗幽门螺旋杆菌活性，且在胃环境中具有较强的稳定性和抗菌活性。

Description

一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体而言，涉及一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌是上世纪80年代由澳大利亚两位科学家发现并于2005年获得诺贝尔生理学奖。目前，世界上有50％以上的人口感染有这种病原菌，其中20％的感染者将会引起慢性胃炎、消化性和十二指肠溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织瘤的临床症状。世界卫生组织已把它列为Ⅰ类致癌原。在发展中国家更加广泛流行，我国有些地区人口感染率高达60％以上。
抗生素是治疗幽门螺旋杆菌感染的有效方法，但幽门螺旋杆菌对多种抗生素产生耐药性，甚至同一感染病人对7种抗生素抵抗。目前，对有这种明显疾病症状个体治疗方法主要是用一种质子泵结合二种或三种抗生素的联合疗法，其有80％的根除率和随后的临床症状的改善，已经成为标准的治疗方法。但是，随着抗生素耐药菌株的增加、重新感染、并发症和高治疗费用及治疗依从性差等因素限制了抗生素对幽门螺旋杆菌感染的根治，其中最主要的原因就是细菌的耐药性。鉴于此，目前急需对幽门螺旋杆菌感染疾病，提出一种不依赖于抗生素的治疗方案。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽以及包含该抗菌肽的融合蛋白。这种抗菌肽具有抗幽门螺旋杆菌活性，且在胃环境中具有较强的稳定性和抗菌活性，其通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到抗幽门螺旋杆菌的效果，在使用过程中不容易使幽门螺旋杆菌产生耐药性。
本发明的第二目的在于提供一种上述抗菌肽以及融合蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中应用，由于该抗菌肽在胃环境中不会被胃蛋白酶破坏，且在胃酸环境下依然能保持较强的抗菌活性，可作为活性成分用于制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物。
本发明的第三目的在于提供一种用于编码上述抗菌肽的基因、以及用于编码上述融合蛋白的基因。
本发明的第四目的在于提供一种编码抗菌肽的基因以及编码融合蛋白的基因在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，该方法采用基因工程方法表达包含有抗菌肽的融合蛋白，从而降低抗菌肽的等电点，使其达到高水平的表达，降低生产成本。
本发明的第六目的在于提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的蚕血淋巴及其制备方法和用途。这种蚕血淋巴中同时含有融合蛋白和肠激酶，该融合蛋白经肠激酶的特异性酶切后，获得具有天然结构的抗菌肽，因此，该蚕血淋巴具有了抗幽门螺旋杆菌的活性、且该蚕血淋巴可以直接口服或冷冻干燥就可用于治疗幽门螺旋杆菌感染，极大的降低抗菌肽的生产成本。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽、融合蛋白，具体为：
一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为(1)或(2)：
(1)SEQ ID NO:1所示的序列；
(2)由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。
一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为(1)或(2)：
(1)SEQ ID NO:1所示的序列；
(2)由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。
一种包含有上述抗菌肽的融合蛋白，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
进一步地，上述家蚕杆状病毒核多角体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
进一步地，上述连接肽包括(GGGGS)n,其中n＝1～4。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素样小蛋白酶。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段包括LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白三级结构。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为DDDDK，DDDDK为肠激酶的作用位点。
进一步地，上述肠激酶为牛肠激酶，牛肠激酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
进一步地，上述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
第二方面，本发明提供一种抗菌肽、融合蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，具体为：
一种抗菌肽在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种用于治疗幽门螺旋杆菌的药物或保健品，其包括如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽、以及医药学上可接受的载体或辅料。
一种融合蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素样小蛋白酶。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段包括DDDDK、LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白三级结构。
进一步地，上述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
进一步地，上述幽门螺旋杆菌病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌。
一种用于治疗幽门螺旋杆菌的药物或保健品，其包括融合蛋白、以及医药学上可接受的载体或辅料，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，还包括肠激酶，融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
第三方面，本发明提供一种用于编码具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的基因、融合蛋白的基因，具体为：
一种用于编码具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的基因，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种用于编码包含上述抗菌肽的融合蛋白的基因，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素样小蛋白酶。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段包括DDDDK、LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白三级结构。
进一步地，上述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
一种包含上述基因的重组载体。
一种包含上述重组载体的宿主细胞。
进一步地，上述宿主细胞包括细菌、动物细胞、或植物细胞。
一种包含上述基因的重组病毒。
第四方面，本发明提供一种编码抗菌肽的基因、融合蛋白的基因在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，具体为：
一种编码抗菌肽的基因在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种编码融合蛋白的基因在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素样小蛋白酶。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段包括DDDDK、LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白的三级结构。
进一步地，上述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
一种重组载体在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，重组载体包含编码SEQ ID NO:1所示抗菌肽的基因序列；或者，包含融合蛋白的基因序列，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
一种重组病毒在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，重组载体包含编码SEQ ID NO:1所示抗菌肽的基因序列；或者，包含融合蛋白的基因序列，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
一种宿主细胞在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用，重组载体包含编码SEQ ID NO:1所示抗菌肽的基因序列；或者，包含融合蛋白的基因序列，融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述幽门螺旋杆菌病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌。
第五方面，本发明提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，具体为：
一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，其包括：
构建编码包含SEQ ID NO:1所示的抗菌肽的融合蛋白的核苷酸序列；
构建包含核苷酸序列的重组载体；
将重组载体用于转化或转染宿主细胞，并使核苷酸序列在宿主细胞中表达。
进一步地，上述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步地，上述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素样小蛋白酶。
进一步地，上述蛋白酶作用位点肽段包括DDDDK、LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白三级结构。
进一步地，上述重组载体包括重组质粒，重组质粒的表达载体为pFastDual载体。
进一步地，上述重组载体还包括重组穿梭载体，重组穿梭载体是将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在重组酶的作用下发生重组所制得的重组Bacmid。
进一步地，上述重组载体还包括重组病毒，重组病毒是通过将重组穿梭载体转染到蚕BmN细胞中制得。
进一步地，上述宿主细胞为蚕蛹细胞。
进一步地，在使核苷酸序列在宿主细胞中表达，得到融合蛋白后，还包括：用特异性蛋白内切酶对融合蛋白进行酶切。
第六方面，本发明提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的蚕血淋巴及其制备方法和用途，具体为：
一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的蚕血淋巴的制备方法，其包括：利用家蚕杆状病毒双启动子表达系统共表达融合蛋白和肠激酶，融合蛋白中包含如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽、以及肠激酶的特异性蛋白作用位点。
进一步地，上述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，上述利用家蚕杆状病毒双启动子表达系统共表达融合蛋白和肠激酶的方法包括：
构建编码如SEQ ID NO:4所示的融合蛋白的氨基酸序列；
构建如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、以及编码如SEQ ID NO:3所示的牛肠激酶的氨基酸序列的重组载体；
将重组载体用于转染蚕BmN细胞，得到重组病毒后，再使重组病毒在蚕蛹中表达，得到包含有融合蛋白和肠激酶的蚕血淋巴。
进一步地，上述重组载体包括重组质粒，重组质粒的表达载体为pFastDual载体。
进一步地，上述表达载体还包括重组穿梭载体，重组穿梭载体是将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在重组酶的作用下发生重组所制得的重组Bacmid。
一种如上述制备方法制得的蚕血淋巴。
一种用于治疗幽门螺旋杆菌病的药物或保健品，其包括蚕血淋巴、以及医药学可接受的辅料或载体。
一种用于治疗幽门螺旋杆菌病的药物或保健品的制备方法，其包括将蚕血淋巴冻干成粉末。
一种蚕血淋巴在制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物中的应用。
进一步地，上述幽门螺旋杆菌病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌。
与现有技术相比，本公开内容的有益效果例如包括：
目前，采用抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染的方法中，细菌容易通过变异对抗生素产生抗性，即出现耐药菌。随着抗生素耐药菌株的增加、重新感染、并发症和高治疗费用及治疗依从性差等因素，使得抗生素无法对幽门螺旋杆菌感染进行根治。
而本公开内容提供的如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽，其对幽门螺旋杆菌具有较强的杀伤作用。这种抗菌肽不会像抗生素一样使幽门螺旋杆菌的抗药性随抗菌肽的使用而有所增加，这主要是因为抗生素的抗菌作用一般是作用于特殊的受体或酶，细菌容易通过变异对抗生素产生抗性；而抗菌肽在抗菌时一般没有特殊的受体，其主要是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到抗菌效果的，所以该抗菌肽的使用不容易产生抗性菌和交叉抗性。
同时，在幽门螺旋杆菌感染时，用抗生素治疗会对机体产生有害的副作用，这主要是因为抗生素能刺激内毒素的释放，还会造成脓毒休克甚至导致死亡，但使用本公开内容提供的该抗菌肽则无此现象，且该抗菌肽还具有抑制幽门螺旋杆菌诱导产生对人体有害的细胞因子的作用。
本公开内容提供的这种抗菌肽是从抗菌肽库中筛选出的具有强抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽。实验表明，该抗菌肽不但在胃环境中具有稳定性，没有被胃蛋白酶破坏，同时在胃液的酸性环境下(pH为1.3～1.8)依然能够保持较强的抗菌活性，其对幽门螺旋杆菌感染所致的疾病具有较好的疗效，有利于解决幽门螺旋杆菌感染治疗中出现的抗生素耐药及其副作用的巨大医学难题。
然而，由于胃的特殊环境，用该抗菌肽治疗幽门螺旋杆菌时，由于存在胃黏膜屏障作用(即幽门螺旋杆菌定植于胃黏膜粘液层下的表皮细胞表面，抗菌肽需要抵达幽门螺旋杆菌的定植位置才能发挥抗菌活性。)，导致治疗时需口服大量的抗菌肽类药物，利用现有的化学合成技术生产的抗菌肽成本高昂，在长期治疗过程中会增加患者的经济负担。鉴于此，本公开内容还提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，该方法采用基因工程方法表达包含有抗菌肽的融合蛋白，从而降低抗菌肽的等电点，使其达到高水平的表达，降低生产成本。
此外，利用基因工程技术表达得到的融合蛋白中，含有如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽。该融合蛋白经蛋白酶特异性酶切后，即可得到具有天然结构的上述抗菌肽，发挥抗幽门螺旋杆菌感染的活性。
本公开内容提供的具有抗幽门螺旋杆菌活性的蚕血淋巴及其制备方法中，采用家蚕作为表达载体利用杆状病毒同时表达融合蛋白(含有抗菌肽)和肠激酶。由于融合蛋白中含有肠激酶的特异性酶切位点，该融合蛋白经肠激酶的特异性酶切后，即可获得具有天然结构的抗菌肽，从而使得收集的蚕血淋巴具有抗幽门螺旋杆菌活性。由于肠激酶是人类肠道中存在的酶，具有口服安全性，因此该蚕血淋巴无需纯化即可直接口服，从而解决治疗幽门螺旋杆菌时需口服大剂量抗菌肽、费用高这一重大难题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例3中提供的含抗菌肽PGQ的融合蛋白FAMP的氨基酸序列；
图2为本发明实施例3中提供的融合蛋白FAMP的蛋白空间结构图；
图3为本发明实施例4中提供的含双启动子的pFastDual质粒图谱；
图4为本发明实施例5中三种蚕血淋巴的抗幽门螺旋杆菌活性抑菌圈；
图5Tricine-SDS-PAGE分析蚕血淋巴中纯化获得的多肽的电泳图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
该抗菌肽的筛选和实验过程如下：
a.抗菌肽的筛选：抗菌肽如同抗生素具有自己独特的抗菌谱，不是所有的抗菌肽对幽门螺旋杆菌都具有抗菌活性，发明人通过实验研究，从数以万计的抗菌肽库中筛选具有抗革兰氏阴性菌的抗菌肽25种，并通过化学方法合成得到。
b.抗菌肽供试品的配制：根据最小抑菌浓度实验方法把上述化学合成的抗菌肽以倍比稀释为64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。
c.检测最小抑菌浓度：在每只试管中加入对数期的幽门螺旋杆菌ATCC34504标准菌株达到106CFU/mL，在微需氧的条件下37℃培养36h，没有见到明显细菌生长的抗菌肽浓度为该抗菌肽的最小抑菌浓度。
实验结果显示，在所有的合成抗菌肽中，最终获得的抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)是1μg/mL的抗菌肽序列为：GVLSNVIGYLKKLGTGALNAVLKQ，即SEQ ID NO:1所示的抗菌肽，记为PGQ，pI/Mw:10.00/2.5KDa。
实施例2
本实施例模拟胃环境对实施例1提供的抗菌肽PGQ进行抑菌作用试验：
a.配制人工胃液(含胃蛋白酶和胃酸性物质，pH为1.3～1.8)；
b.进行不同菌株幽门螺旋杆菌的培养，菌株包括：ATCC34504标准菌株和分离于胃溃疡和胃癌患者的胃中的临床菌株。
c.在人工胃液中加入对数期的幽门螺旋杆菌106CFU/mL，然后加抗菌肽PGQ达到浓度为4μg/mL(4×MIC)和没有加抗菌肽作为对照各三组，分别在15min、30min、60min和120min取10μL的混合液稀释成50μL，涂在固体培养基，培养36h后数每平板上的菌落。按下式计算杀菌率：
杀菌率＝(1-加抗菌肽的菌液平板菌落数/没有加抗菌肽的菌液平板菌落数)×100％
实验结果：该抗菌肽PGQ在15min时，对幽门螺旋杆菌的杀菌率不低于50％；在30min时，对幽门螺旋杆菌的杀菌率不低于80％；在60min时，对幽门螺旋杆菌杀菌率不低于90％；在120min时，对幽门螺旋杆菌的杀菌率几乎达到100％。由此说明，抗菌肽PGQ不但在胃环境中具有稳定性没有被胃蛋白酶破坏，同时在胃酸环境下保持抗幽门螺旋杆菌的活性。
实施例3
实施例1提供的具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽PGQ，是带有3个正净电荷且为小分子量的短肽，该抗菌肽PGQ的等电点(PI)是：10.0，该抗菌肽如果直接在宿主细胞大量表达，对宿主细胞的生理pH有较大影响，进而影响宿主细胞的存活，不利于抗菌肽PGQ的高水平表达。实际上，发明人在试验中发现：不融合而直接表达抗菌肽，抗菌肽在宿主细胞中根本不能获得表达。
鉴于此，本实施例提供一种用于表达抗菌肽PGQ的融合蛋白，该融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
其中，载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。可选的，载体蛋白为家蚕杆状病毒核多角体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2(GenBank:AFJ06818.1)。这种家蚕核多角体蛋白可形成晶体结构，易于暴露融合蛋白中的特异性蛋白内切酶的酶切位点，从而避免载体蛋白对抗菌肽PGQ的影响。
其中，连接肽包括(GGGGS)n,其中n＝1～4。可选的，n＝2～3，或者n＝3。(GGGGS)n通常为连接肽的连接接头，GGGGS的个数不能太多也不能太少，否则会影响融合蛋白的合成效率。GGGGS的个数以2～3个更佳，这种连接肽使得蛋白质酶切位点相对暴露，有利于酶切。
其中，蛋白酶作用位点肽段、对应的特异性蛋白内切酶选自表1中1～8中的任意一组。由此，这种融合蛋白经特异性蛋白内切酶酶切后，即可得到天然结构的抗菌肽PGQ，发挥抗幽门螺旋杆菌活性。
表1.融合蛋白中的蛋白酶作用位点肽段
标号 蛋白酶作用位点肽段 特异性蛋白内切酶
1 DDDDK 肠激酶
2 LVPRGS 凝血酶
3 IEGR 凝血因子Xa
4 IDGR 凝血因子Xa
5 LEVLFQ PreScission蛋白酶
6 ENLYFQG 烟草花叶病毒蛋白酶
7 LEVLFQG 人鼻病毒蛋白酶
8 识别泛素样蛋白的三级结 构泛素样小蛋白酶
具体地，本实施例中构建了如SEQ ID NO:4所示的融合蛋白，记为融合蛋白FAMP，pI/Mw:6.27/34.5Kda，其氨基酸序列如图1所示。
该融合蛋白FAMP，以家蚕杆状病毒核多角体蛋白为载体蛋白，其等电点为6.27，接近家蚕细胞的生理pH，有利于在家蚕中的高水平表达。同时，该融合蛋白FAMP，在抗菌肽PEG前加了序列DDDDK，其为牛肠激酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:3，pI/Mw:5.97/27.3Kda，GenBank:ABB82940.1)的特异性酶切位点氨基端序列。由此，表达得到的融合蛋白FAMP经牛肠激酶特异性酶切后，即可得到天然结构的抗菌肽PGQ，发挥抗幽门螺旋杆菌活性。
融合蛋白FAMP中的蛋白酶作用位点肽段，选用牛肠激酶的特异性酶切位点氨基端序列，其优点在于：肠激酶是人体消化系统中的正常酶，对人体健康有益，重组表达后无需纯化，可直接口服。
融合蛋白FAMP的蛋白空间结构图如图2所示，由图2可见，融合蛋白FAMP中的酶切位点暴露在家蚕杆状病毒核多角体蛋白外，抗菌肽PGQ伸展在外，易于对其进行特异性酶切，得到天然结构的抗菌肽PGQ。
实施例4
本实施例提供一种特异性表达实施例3中提供的融合蛋白FAMP的方法：
利用基因工程技术能够低成本生产的抗菌肽，是解决抗菌肽治疗高成本这一问题的有效途径。国内外有关抗菌肽基因工程的报道较多的是在大肠杆菌和毕赤酵母中表达，这些文献虽然对抗菌肽的探究提供了技术方法和指导作用，但这类方法有如下缺陷：①其表达的产物是在非特异性蛋白酶酶切后得到的产物，所得的抗菌肽不能保留原先的天然结构。这将导致抗菌肽很难保持原有的抗菌活性。②采用大肠杆菌表达系统表达的蛋白多数是以包涵体的形式存在，必须要严格的复性纯化才具有生物活性。另外，大肠杆菌含有内毒素，同时含有培养基，这就使得所表达的蛋白必须经过严格的纯化后才能药用。③采用毕赤酵母表达时以甲醇为培养基的碳源，甲醇对人体是有剧毒，合成产物必须对培养基进过严格的纯化才能服用。这些都大大增加了抗菌肽的生产成本，在幽门螺旋杆菌口服大剂量时仍然达不到低成本的效果。
本实施例中，采用家蚕作为表达载体，利用杆状病毒来表达融合蛋白FAMP(包括抗菌肽PEG)。病毒的严格宿主寄生性，无脊椎动物病毒对脊椎动物人是安全的。家蚕，是一种药食两用的昆虫(见《中国药典》，2015版)。采用这一表达系统的优势如下：
①家蚕个体较大，大小适中，易于操作、控制，且生长期短，蛋白合成能力强。蚕丝成分主要就是蛋白质。在家蚕幼虫和蛹，重组表达的蛋白量高出培养细胞表达量的10-100倍，能够极大的提高药用蛋白生产的量。
②蚕幼虫或者蛹的脂肪体组织具有合成和分泌脂蛋白和糖蛋白的功能，对外源蛋白可进行糖基化、磷酸化、精确的蛋白折叠及形成正确的二硫键，所表达的蛋白表现出良好的生物学活性，发挥固有免疫作用的防御素(就是一种抗菌肽其中含有较多二硫键)。
③家蚕在我国的驯养已有几千年的历史，饲养经验丰富。原料成本低，用桑叶喂养的蚕仅0.05元/条左右。正在向人工饲料进行无菌化、低成本、大规模全年连续饲养的方向发展。
④蚕蛹本身可以食用，中国古代养蚕并非取丝而是为了食用。蚕血淋巴中含有蛋白酶抑制物，对表达产物有稳定作用。表达的蛋白质可不需纯化，将蚕晒干或冷冻干燥后磨碎成粉，可直接添食，特别适于作为口服药物的生产。
⑤家蚕杆状病毒表达系统表达蛋白质，生产工艺流程不复杂，适合多种基因表达，产品更换容易最快在15天就可以完成，同时产品的保密性强。
本实施例中采用双启动子表达系统，同时表达如SEQ ID NO:4所示的融合蛋白FAMP和如SEQ ID NO:3所示的牛肠激酶(Erk)。其中，融合蛋白FAMP中含有EcoRⅠ和XbaⅠ限制酶切位点，牛肠激酶中含XhoⅠ和KpnⅠ限制酶切位点。将编码融合蛋白FAMP的基因和编码牛肠激酶的基因化学合成后，再将二者同时克隆至pFastDual载体，如图3所示，即可得到一种同时包含融合蛋白FAMP和牛肠激酶的基因的重组质粒，记为pFastDual-(FAMP)(Erk)。同时分别将编码融合蛋白FAMP的基因和编码牛肠激酶的基因分别克隆至pFastDual载体，得到用于对照的重组质粒，分别记为pFastDual-(FAMP)、pFastDual-(Erk)。
将上述得到的重组质粒pFastDual-(FAMP)(Erk)、pFastDual-(FAMP)、pFastDual-(Erk)鉴定后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体为DH10Bac E.coli。在helper质粒合成的重组酶帮助下发生重组，筛选与鉴定获得重组穿梭载体，分别为：Bacmid-(FAMP)(Erk)、Bacmid-(FAMP)、Bacmid-(Erk)。
再将上述得到的重组穿梭载体Bacmid-(FAMP)(Erk)、Bacmid-(FAMP)、Bacmid-(Erk)，转染家蚕BmN细胞获得重组病毒：BmNPV-(FAMP)(Erk)、BmNPV-(FAMP)、BmNPV-(Erk)病毒。
最后使重组病毒BmNPV-(FAMP)(Erk)、BmNPV-(FAMP)和BmNPV-(Erk)分别在家蚕蚕蛹中表达，接种重组病毒96小时后，收集上述三种蚕蛹的蚕血淋巴。
实施例5
本实施例对实施例4获得的三种蚕血淋巴的抗幽门螺旋杆菌活性进行测试：
用对数生长期的幽门螺杆菌菌液(108CFU/mL)用无菌棉球均匀涂在含5％绵羊血的幽门螺杆菌琼脂培养基上，在上面打5mm的小孔，在每个小孔中加25μL的pFastDual-(FAMP)(Erk)蚕血淋巴、正常家蚕蚕血淋巴、pFastDual-(FAMP)蚕血淋巴、pFastDual-(Erk)蚕血淋巴、分离纯化pFastDual-(FAMP)蚕血淋巴和pFastDual-(Erk)蚕血淋巴获得FAMP和Erk后酶切获得的抗菌肽PGQ(2μg/mL)、化学合成的抗菌肽PGQ(2μg/mL)，微需氧条件下37℃培养48h。
三种蚕血淋巴抗幽门螺旋杆菌活性的测试结构如图4所示：
其中，(1)为pFastDual-(FAMP)(Erk)蚕血淋巴；(2)为正常家蚕蚕血淋巴；(3)为pFastDual-(FAMP)蚕血淋巴；(4)为pFastDual-(Erk)蚕血淋巴；(5)为分离纯化pFastDual-(FAMP)蚕血淋巴和pFastDual-(Erk)蚕血淋巴获得FAMP和Erk后酶切获得的抗菌肽PGQ(2μg/mL)；(6)为化学合成的抗菌肽PGQ(2μg/mL)。
由图4可看出，表达BmNPV-(FAMP)、BmNPV-(Erk)的家蚕蚕蛹的蚕血淋巴没有表现出抗幽门螺旋杆菌活性，其主要是因为BmNPV-(FAMP)和BmNPV-(Erk)的表达产物分别为FAMP和Erk，其不能形成天然结构的抗菌肽PGQ。
而表达BmNPV-(FAMP)(Erk)的家蚕蚕蛹的蚕血淋巴具有抗幽门螺旋杆菌活性，这主要是因为BmNPV-(FAMP)(Erk)在蚕蛹中的表达产物既有FAMP又有Erk，所表达的FAMP在Erk蛋白酶的酶切下获得天然结构的抗菌肽PGQ，从而发挥抗幽门螺旋杆菌活性。
为进一步确定Erk酶切FAMP可获得抗菌肽PGQ并具有抗幽门螺旋杆菌活性。对BmNPV-(FAMP)、BmNPV-(Erk)表达的蚕血淋巴利用AKTA蛋白质纯化系统经行纯化，得到纯的融合蛋白FAMP和牛肠激酶Erk。对纯化后的FAMP和Erk在37℃和适宜的缓冲液经行酶切，Tricine-SDS-PAGE分析蚕血淋巴中纯化获得的多肽，结果如图5所示。图5中，化学合成的多肽M为Marker，(1)为pFastDual-(FAMP)蚕血淋巴分离纯化获得的FAMP；(2)为(1)中纯化的FAMP经从pFastDual-(Erk)蚕血淋巴纯化获得的Erk蛋白酶酶酶切图谱；(3)为(2)中酶切后分离纯化获得的抗菌肽PGQ；(4)为化学合成的抗菌肽PGQ。由图5可以看出，FAMP经酶切后确实获得与化学合成的PGQ肽具有相同分子量的抗菌肽，且该抗菌肽经抗幽门螺旋杆菌活性鉴定，其具有与化学合成的PGQ肽相同的抗幽门螺旋杆菌活性(MIC＝1μg/mL)。
为进一步验证所制得的蚕血淋巴的抗幽门螺旋杆菌活性，取100只感染BmNPV-(FAMP)(Erk)的家蚕的蚕血淋巴，测定其抗幽门螺旋杆菌活性，并与化学合成的抗菌肽PGQ比较，蚕血淋巴的抗幽门螺旋杆菌活性与2μg/mL抗菌肽PGQ抗菌活性相当，见图4中的(5)和(6)所示的抑菌圈。由此说明本实施方式提供的蚕血淋巴具有抗幽门螺旋杆菌活性，可用于制备防治幽门螺旋杆菌感染所致的疾病，减少与其相关的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌疾病的发生率。
将蚕血淋巴冷冻干燥后进行稳定性试验，在贮存6个月后，其抗幽门螺旋杆菌的活性没有发生改变。由此可见，通过蚕血淋巴获得的抗菌肽可长期贮存，另外，蚕血淋巴可直接口服。因此，本方法用BmNPV-(FAMP)(Erk)在家蚕中可直接获得抗菌肽PGQ并具有抗幽门螺旋杆菌活性，无需纯化即可直接口服，能够极大的降低抗菌肽的生产成本。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽科技学院
<120> 一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Val Leu Ser Asn Val Ile Gly Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ala Val Leu Lys Gln
20
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Pro Asn Tyr Ser Tyr Asn Pro Thr Ile Gly Arg Thr Tyr Val Tyr
1 5 10 15
Asp Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Gly Leu Ile Lys Asn Ala Lys
20 25 30
Arg Lys Lys His Leu Ile Glu His Glu Lys Glu Glu Lys Gln Trp Asp
35 40 45
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly
50 55 60
Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Val Arg Asn Val Lys Pro
65 70 75 80
Asp Thr Met Lys Leu Ile Val Asn Trp Ser Gly Lys Glu Phe Leu Arg
85 90 95
Glu Thr Trp Thr Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val Asn Asp
100 105 110
Gln Glu Val Met Asp Val Tyr Leu Val Ala Asn Leu Lys Pro Thr Arg
115 120 125
Pro Asn Arg Cys Tyr Lys Phe Leu Ala Gln His Ala Leu Arg Trp Asp
130 135 140
Glu Asp Tyr Val Pro His Glu Val Ile Arg Ile Met Glu Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Val Gly Met Asn Asn Glu Tyr Arg Ile Ser Leu Ala Lys Lys Gly Gly
165 170 175
Gly Cys Pro Ile Met Asn Ile His Ser Glu Tyr Thr Asn Ser Phe Glu
180 185 190
Ser Phe Val Asn Arg Val Ile Trp Glu Asn Phe Tyr Lys Pro Ile Val
195 200 205
Tyr Ile Gly Thr Asp Ser Ala Glu Glu Glu Glu Ile Leu Ile Glu Val
210 215 220
Ser Leu Val Phe Lys Ile Lys Glu Phe Ala Pro Asp Ala Pro Leu Phe
225 230 235 240
Thr Gly Pro Ala Tyr
245
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met His His His His His His Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu
1 5 10 15
Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val
20 25 30
Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His
35 40 45
Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu
50 55 60
Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg
65 70 75 80
Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Arg His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys
85 90 95
Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr
100 105 110
Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro
115 120 125
Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln
130 135 140
Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Met Val Cys Ala Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly
180 185 190
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195 200 205
Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro
210 215 220
Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe
225 230 235 240
Leu His
<210> 4
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Met Pro Asn Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
Asn Pro Thr Ile Gly Arg Thr Tyr Val Tyr Asp Asn Lys Tyr Tyr Lys
20 25 30
Asn Leu Gly Gly Leu Ile Lys Asn Ala Lys Arg Lys Lys His Leu Ile
35 40 45
Glu His Glu Lys Glu Glu Lys Gln Trp Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Met
50 55 60
Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly Lys Asn Gln Lys Leu Thr
65 70 75 80
Leu Phe Lys Glu Val Arg Asn Val Lys Pro Asp Thr Met Lys Leu Ile
85 90 95
Val Asn Trp Ser Gly Lys Glu Phe Leu Arg Glu Thr Trp Thr Arg Phe
100 105 110
Val Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val Asn Asp Gln Glu Val Met Asp Val
115 120 125
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130 135 140
Phe Leu Ala Gln His Ala Leu Arg Trp Asp Glu Asp Tyr Val Pro His
145 150 155 160
Glu Val Ile Arg Ile Met Glu Pro Ser Tyr Val Gly Met Asn Asn Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ile Trp Glu Asn Phe Tyr Lys Pro Ile Val Tyr Ile Gly Thr Asp Ser
210 215 220
Ala Glu Glu Glu Glu Ile Leu Ile Glu Val Ser Leu Val Phe Lys Ile
225 230 235 240
Lys Glu Phe Ala Pro Asp Ala Pro Leu Phe Thr Gly Pro Ala Tyr Glu
245 250 255
Phe Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Asp Asp Asp Asp Lys Gly Val Leu Ser Asn Val Ile Gly Tyr Leu
275 280 285
Lys Lys Leu Gly Thr Gly Ala Leu Asn Ala Val Leu Lys Gln
290 295 300

Claims (10)

1.一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽的制备方法，其特征在于，其包括：
构建编码包含SEQ ID NO:1所示的抗菌肽的融合蛋白的核苷酸序列；
构建包含所述核苷酸序列的重组载体；
将所述重组载体用于转化或转染宿主细胞，并使所述核苷酸序列在所述宿主细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：
载体蛋白-连接肽-蛋白酶作用位点肽段-抗菌肽；
所述抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白包括家蚕杆状病毒核多角体蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白、或泛素样小蛋白。
4.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶作用位点肽段为特异性蛋白内切酶的作用位点，所述特异性蛋白内切酶包括肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶或泛素样小蛋白。
5.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶作用位点肽段包括DDDDK、LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素样蛋白三级结构。
6.根据权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述重组载体包括重组质粒，所述重组质粒的表达载体为pFastDual载体。
7.根据权利要求6所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述重组载体还包括重组穿梭载体，所述重组穿梭载体是将所述重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在重组酶的作用下发生重组所制得的重组Bacmid。
8.根据权利要求7所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述重组载体还包括重组病毒，所述重组病毒是通过将所述重组穿梭载体转染到蚕BmN细胞中制得。
9.根据权利要求8所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为蚕蛹细胞。
10.根据权利要求5所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，在使所述核苷酸序列在所述宿主细胞中表达，得到融合蛋白后，还包括：用特异性蛋白内切酶对所述融合蛋白进行酶切。
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