CN107636011A

CN107636011A - 特别在皮肤炎性疾病中用作药物的来自血纤蛋白原的分离的肽及其片段

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Publication number: CN107636011A
Application number: CN201680026130.XA
Authority: CN
Inventors: N·迪潘; P·格兰斯; V·卡尔韦; J·瑞恩若
Original assignee: Gustaf - Luxi Institute; National Institute Of Health And Medical Research France; Paris Public Aid Hospital; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie; Universite Paris Descartes; Universite Paris Sud
Current assignee: INST GUSTAVE-ROUSSY; Paris Thackeray, University of; Western Dais Paris, University of; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite Paris Cite
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2036-03-21
Also published as: US10323078B2; EP3270950A1; JP2018512844A; CA2979812C; DK3270950T3; CA2979812A1; AU2016236297A1; ES2880795T3; CN107636011B; AU2016236297B2; BR112017020008A8; WO2016150926A1; EP3270950B1; BR112017020008A2; US20180105574A1; JP6840086B2

Abstract

本发明涉及从人血纤蛋白原获得的分离的肽，用于其作为药物的用途，特别用于预防和/或治疗炎性皮肤疾病，更特别地痤疮。本发明还涉及这些多肽的片段、编码它们的核酸分子、表达载体、宿主细胞、含有它们的药物组合物和组合产品、以及其用于治疗和/或预防炎性皮肤疾病，特别地痤疮的用途。

Description

特别在皮肤炎性疾病中用作药物的来自血纤蛋白原的分离的肽及其片段

发明领域

本发明在医学领域中，特别是在炎性皮肤疾病领域中，更具体地，本发明涉及从人血纤蛋白原获得的分离的肽，用于其作为药物的用途，特别是用于预防和/或治疗的炎性皮肤疾病，更特别是痤疮。本发明还涉及这些多肽的片段、编码它们的核酸分子、表达载体、宿主细胞、含有它们的药物组合物和组合产物、以及它们用于治疗和/或预防炎性皮肤疾病，特别是痤疮的用途。

发明背景

炎性皮肤疾病包括广泛的类别，其包括严重性范围为轻度瘙痒到严重的医学健康并发症的许多状况。这些病症在所有年龄和种族的人中是常见的。它们以皮肤的刺激和炎症为特征。这些疾病有时可以是毁损面容的，并且可以对受影响的个体造成极大的不适。炎性皮肤病症的公知的例子是痤疮。

痤疮是一种多因素的皮肤疾病，影响80％以上的年轻人。此类疾病局限于毛皮脂腺囊，并且以炎性和非炎性损伤两者为特征。患者可以呈现非炎性粉刺和炎性丘疹、脓疱和结节的混合物。促进炎性痤疮形成的因素之一是通过厌氧性痤疮丙酸杆菌(Proprionibacterium acnes)菌株对皮脂腺管道的细菌定殖。

事实上，痤疮丙酸杆菌能够诱导角质形成细胞、皮脂腺细胞(sebocytes)和单核细胞的促炎性分子(白介素IL-1α/β、IL-8、IL-12、TNF-α、β-防御素)的体外产生，而且还在痤疮病变中诱导体内产生。此产生涉及TLR2受体和NF-κB和MAPK信号传导途径以及NLRP3炎性小体途径的激活。痤疮丙酸杆菌还诱导角质形成细胞的活性氧(ROS)的大量产生，有助于炎症反应的启动(Graham 2004；Grange 2009a；Grange 2009b；Kang 2005；Nagy 2005；Trivedi2006；Qin 2014；Kistowska 2014,Jugeau 2005)。

目前，有几种抗痤疮治疗如类视色素(维生素A衍生物)、壬二酸、水杨酸、过氧化苯甲酰、局部(topical)和口服抗生素等。

这些治疗以不同方式起作用，并且具有不同的效果。一般地，抗生素杀死细菌，类视色素和壬二酸防止微粉刺的发生并且具有抗微生物和抗炎特性等等。

其它化学化合物靶向与细菌侵入有关的具体机制。

痤疮丙酸杆菌粘附于人皮肤(Grice 2009)，但也可以通过使用非特异性相互作用从其接种区域行进到感染部位，然后通过特异性结合进行不可逆的粘附过程来引起更深的感染(Gristina 1988)。此外，以前的研究已经显示了痤疮丙酸杆菌结合作为纤连蛋白的胞外基质蛋白(ECM)(Yu 1997)以及人上皮细胞(Romero-Steiner 1990)的能力。

在具有抗粘附剂的化学药物中，百倍丽是公知的。

然而，上文提及的治疗具有许多副作用。例如，抗生素过程应该在时间上受到限制，并且经常观察到脱敏或丧失响应。此外，化学化合物的使用对患者诱导几种风险，如深肤色患者中色素沉着不足或由于治疗不耐受所致的其它副作用。使用化学化合物治疗痤疮的另一个缺点是其成本高(Dawson等，2013)。

由于这些原因，应当开发其它手段，优选用于治疗和预防痤疮的生物学手段，从而允许无副作用情况下的良好治疗效率和低的生产成本。

发明概述

在本发明的背景中，本发明人现在已经鉴定处人血纤蛋白原特异性识别的58-kDa的痤疮丙酸杆菌表面蛋白，并且将其命名为Pfg。更具体地，本发明人已经发现人血纤蛋白原的亚基能够特异性结合粘附蛋白Pfg，从而抑制其与痤疮丙酸杆菌的粘附。

此发现并不是期望的，因为发明人知道，这是首次表征具有识别人血纤蛋白原的能力的痤疮丙酸杆菌表面糖蛋白。

此发现是非常重要的，因为它允许开发用于通过抑制细菌粘附于皮肤细胞并因此预防和/或治疗由细菌粘附引起的皮肤感染和炎症来治疗痤疮的备选手段。此外，本发明人发现所述血纤蛋白原亚基具有更一般的抗炎特性，因此可以更一般地用于预防和/或治疗其它炎性皮肤疾病，优选银屑病。

因此，在第一方面，本发明涉及用于作为药物的用途的分离的多肽或其片段，所述分离的多肽包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述片段包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1对应于血纤蛋白原的人Bβ亚基，而SEQ ID NO:2、5和7至13和47对应于此序列的片段。

根据本发明的多肽能够识别并且结合痤疮丙酸杆菌，并且还抑制痤疮丙酸杆菌对其配体血纤蛋白原和皮肤细胞的粘附。

因此，用于根据本发明的治疗用途的多肽可优选用于预防和/或治疗痤疮。

本发明人还发现用于根据本发明的治疗用途的分离的多肽可以用于治疗和/或预防其它炎性皮肤疾病，优选银屑病。

发明人还分离出人血纤蛋白原Bβ亚基的片段，其识别并结合痤疮丙酸杆菌的粘附蛋白，并抑制痤疮丙酸杆菌对其配体血纤蛋白原和皮肤细胞的粘附。

在第二方面，本发明因此涉及包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的片段，所述片段包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47之任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在第三方面，本发明还涉及编码本发明片段的分离的核酸分子、包含本发明的核酸的载体、和包含根据本发明的核酸分子或根据本发明的载体的宿主细胞。

本发明的片段能够识别和结合痤疮丙酸杆菌，并且还抑制痤疮丙酸杆菌对其配体血纤蛋白原和皮肤细胞的粘附。因此，这些片段在用于预防和/或治疗炎性疾病，特别是痤疮的药物中作为抗粘附剂可具有极大的潜力。

因此，在第四方面，本发明涉及包含至少一种选自本发明的片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。

本发明还涉及根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物，其用作药物。

优选地，根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物用于治疗和/或预防痤疮。

本发明人还发现，根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物可用于治疗和/或预防其它炎性皮肤疾病，优选银屑病。

本发明的片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物可单独使用或与另外的治疗剂组合使用，所述另外的治疗剂涉及预防和/或治疗痤疮，和/或预防和/或治疗其它炎性疾病，优选银屑病。

因此，在第五方面，本发明涉及组合产品，其包含：

-选自以下的至少一种化合物：根据本发明的片段、分离的核酸分子、载体和宿主细胞；和

-另外的药剂，优选用于治疗和/或预防皮肤炎性疾病，所述皮肤炎性疾病选自银屑病和/或痤疮，优选痤疮；

其用作药物同时、分开或序贯使用。

根据本发明的组合产品的目的是增强根据本发明的片段的治疗效果。

附图简述

图1：血纤蛋白原识别的58-kDa痤疮丙酸杆菌表面蛋白的鉴定。在37℃在厌氧条件下在RCM、补充有0.1％Tween-80的RCM和补充有5％绵羊血液的Columbia上培养痤疮丙酸杆菌6919菌株。(A)将痤疮丙酸杆菌表面蛋白(75μg)在60℃在PBS(泳道2)和45℃在1M LiCl(泳道3)中热提取，并分离到12.5％SDS-PAGE上，转移到硝酸纤维素膜上，并与生物素化的血纤蛋白原、胶原I、IV、VI和VIII(0.1μg/ml)在室温温育2小时。通过仅使用HRP-链霉亲合素进行对照实验。泳道1：分子量标准品。

图2：痤疮丙酸杆菌表面蛋白对纯化的人血纤蛋白原的结合。(A)将痤疮丙酸杆菌表面蛋白(0.8-50μg/ml)固定到96孔聚苯乙烯板上，并在室温用生物素化的血纤蛋白原(0.1μg/ml)探测2小时。(B)将痤疮丙酸杆菌表面蛋白(25μg/ml)固定到96孔聚苯乙烯板上，并在室温用范围为0.1至16μg/ml的各种浓度的生物素化血纤蛋白原探测2小时。用HRP-链霉亲合素检测结合的生物素化血纤蛋白原，如材料和方法中所述。

图3：Pfg的鉴定。通过2D电泳分离cPAHE(200μg)。(A)通过银染检测蛋白质。(B)通过使用western配体印迹测定法，用生物素化的血纤蛋白原测定血纤蛋白原结合活性。泳道1，分子量标准品；泳道2，仅通过10％SDS-PAGE(1DE)分离的样品(50μg蛋白质)；泳道3，2DE后的样品，如材料和方法中所述。箭头指示切割的点，用于通过MALDI-ToF鉴定。(C)对感兴趣的点获得的MALDI-ToF谱。使用单同位素肽质量以搜索蛋白质数据库以匹配并随后鉴定蛋白质点。

图4：Pfg的纯化。通过1％LiCl在42℃提取痤疮丙酸杆菌表面蛋白2小时，然后通过以80％饱和的硫酸铵沉淀浓缩。(A)将cPAHE(85mg)以24ml/h加载到UNOsphere Q柱上。用0至160mM持续60分钟和160至200mM NaCl，25mM Tris,pH 8.0持续90分钟的线性梯度洗脱在25mM Tris,pH8.0中平衡的蛋白质(●)。将含有Pfg的合并级分进行脱盐，并在0.1MNH₄HCO₃，pH 8.0中平衡。(B)通过凝胶过滤层析将蛋白质以6ml/h分级到Sephacryl HR S300柱上。用甲状腺球蛋白(669kDa)测定孔隙体积(Vo)，并且通过箭头标示牛球蛋白(158kDa)、鸡卵白蛋白(44kDa)、马肌球蛋白(17kDa)和维生素B12(1.3kDa)的洗脱位置。在280nm处监测蛋白质浓度(●)。用生物素化血纤蛋白原测定血纤蛋白原结合活性(■)，如材料和方法中所述。标记为F2，F2.2的水平线标示含有血纤蛋白原结合活性的合并级分。(C)通过10％SDS-PAGE分离蛋白质，并通过考马斯蓝染色检测。(D)电泳分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并且用生物素化血纤蛋白原检测血纤蛋白原结合活性。泳道1a/b分别含有未染色的和生物素化的分子量标记物。泳道2：痤疮丙酸杆菌表面锂总蛋白提取物(10μg)。泳道3：浓缩表面蛋白质提取物(10μg)。泳道4和5：分别为10μg的合并的F2和F2.2级分。

图5：痤疮丙酸杆菌表面蛋白与血纤蛋白原的结合。(A)于4℃将各种量的人血纤蛋白原(hFg)和牛血纤蛋白原(bFg)固定到96孔聚苯乙烯板上18小时，并在23℃与0.1μg/ml生物素化的Pfg温育2小时。牛血清白蛋白(BSA)用作阴性对照。通过使用HRP-链霉亲合素缀合物检测结合材料。通过使用ABTS底物在405nm处测量过氧化物酶活性。通过10％SDS-PAGE分离蛋白质(10μg/泳道)，并且通过(B)考马斯蓝染色检测，并且转移到硝酸纤维素膜，与(C)单独的HRP-链霉亲合素，和(D)生物素化的Pfg(0.1μg/ml)一起温育。泳道1：分子量标准品。泳道2：BSA。泳道3：hFg。泳道4：bFg。

图6：N-脱糖基化的血纤蛋白原上的Pfg识别。将纯化的人血纤蛋白原(hFg)和牛血纤蛋白原(bFg)用N-糖苷酶F(PNGAse F)进行处理，如材料和方法中所述。未处理的(泳道2和4)和处理的(泳道3和5)样品(每泳道10μg蛋白质)分离到10％SDS-PAGE上，然后转移到硝酸纤维素膜上。(A)通过考马斯蓝染色检测蛋白质。(B)与生物素化Pfg(0.1μg/ml)的结合活性。(C)使用生物素化的RCA-1凝集素结合活性作为脱糖基化对照。泳道1：分子量标准品。

图7：O-脱糖基化血纤蛋白原上的Pfg识别。将纯化的人血纤蛋白原用O-糖苷酶进行处理，如材料和方法中所述。未处理的(泳道2)和处理的(泳道3)样品(每泳道10μg蛋白质)分离到10％SDS-PAGE上，然后转移到硝酸纤维素膜上。(A)通过考马斯蓝染色检测蛋白质。(B)与生物素化Pfg(0.1μg/ml)的结合活性。(C)使用生物素化的Jacalin凝集素结合活性作为脱糖基化对照。泳道1a和1b对应于分子量标准品。

图8：Bβ人血纤蛋白原片段的克隆和与Pfg的结合。(A)重组人Bβ血纤蛋白原片段Fg1、Fg2、Fg3和Fg4的克隆和表达。通过RT-PCR获得血纤蛋白原片段，并构建表达质粒，如材料和方法中描述。(B)在大肠杆菌中表达GST融合蛋白，通过12.5％SDS-PAGE分级，并通过考马斯蓝染色(B)检测，并与生物素化的Pfg(0.1μg/ml)一起温育，如材料和方法中所述(C)。

图9：通过血纤蛋白原衍生肽对生物素化Pfg与血纤蛋白原结合的剂量依赖性抑制。用增加量的重组肽Fg1(◆)、Fg2(■)或BSA作为对照(●)在37℃预处理生物素化PFg(0.4mg)达1小时，并且评价对聚苯乙烯板上包被的血纤蛋白原(25μg/孔)的结合活性。结果表示为平均值±SD。一式四份完成每个点。

图10：用Fg1和Fg2重组肽处理后细胞活力的评价。于37℃将人永生化和原代角质形成细胞系HaCaT和NHDK；永生化单核细胞系ThP1、和永生化和原代成纤维细胞系MRC5和HDF与范围为0.22至7mM的浓度的Fg1和Fg2重组肽一起温育18小时。如材料和方法中所述，使用MTT测定来评估细胞活力。

图11：痤疮丙酸杆菌RON菌株对各种细胞系的结合活性的剂量依赖性。在37℃将调节至600nm处吸光度为0.01、0.1和0.5的浓度的生物素化痤疮丙酸杆菌RON菌株与人永生化和原代角质形成细胞细胞系HaCaT和NHDK；与永生化单核细胞系ThP1、以及与永生化和原代成纤维细胞系MRC5和HDF一起温育1小时。除去未结合的细菌后，在410nm处检测到粘附活性。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图12：对痤疮丙酸杆菌与角质形成细胞的结合的剂量依赖性抑制。用范围为0.01至0.5mM的浓度的完全人(深灰色条形)和牛(浅灰色条形)血纤蛋白原预处理调节至600nm处吸光度0.1的浓度的生物素化痤疮丙酸杆菌6919菌株，并在37℃与人HaCaT角质形成细胞细胞系一起温育1小时。除去未结合的细菌后，在410nm处检测到粘附活性。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图13：对痤疮丙酸杆菌RON与单核细胞系的结合的剂量依赖性抑制。用重组肽Fg1和Fg2预处理调节至600nm处吸光度0.1的浓度的生物素化痤疮丙酸杆菌RON菌株，并在37℃与人永生化单核细胞系ThP1一起温育1小时。除去未结合的细菌后，在410nm处检测到粘附活性。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图14：通过由重组肽预处理的痤疮丙酸杆菌刺激的角质形成细胞的O₂°-产生的剂量依赖性抑制。将HaCaT细胞与调节至600nm处吸光度0.2的浓度的痤疮丙酸杆菌PIE菌株(蓝色条形)以及与用重组肽Fg1(浅灰色条形)和Fg2(深灰色条形)预处理的痤疮丙酸杆菌一起温育18小时。通过分光荧光术实现超氧化物阴离子产生的测量，如材料和方法中所述。对未刺激的HaCaT细胞(红色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图15：通过重组肽预处理的痤疮丙酸杆菌刺激的成纤维细胞的IL-8产生的剂量依赖性抑制。将MRC5细胞与调节至600nm处吸光度0.2的浓度的痤疮丙酸杆菌RON菌株(蓝色条形)以及与用重组肽Fg1(浅灰色条形)和Fg2(深灰色条形)预处理的痤疮丙酸杆菌一起温育18小时。如材料和方法所述，通过ELISA测量IL-8浓度。对未刺激的HaCaT细胞(红色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图16：在角质形成细胞上用Fg1-产生的小肽处理后细胞活力的评估。将HaCaT细胞与范围为2.5至20μM的浓度的小肽Fg1.1(浅灰色条形)、Fg1.2(水平线条形)、Fg1.3(阴影线条形)、Fg1.4(深灰色条形)、Fg1.5(点状条形)一起温育24小时。如材料和方法中所述，通过MTT测定法测定细胞毒性。用与PBS(对应于活细胞)；和与0.2％triton X100(对应于死细胞)一起温育的HaCaT细胞完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。

图17：通过Fg1-产生的小肽预处理并且通过痤疮丙酸杆菌刺激的成纤维细胞的H₂O₂产生的剂量依赖性抑制。将MRC5细胞与范围为2.5至20μM的浓度的小肽Fg1.1(浅灰色条形)、Fg1.2(水平线条形)、Fg1.3(阴影线条形)、Fg1.4(深灰色条形)、Fg1.5(点状条形)一起温育24小时。通过荧光分光光度法实现过氧化氢产生的测量，如材料和方法中所述。用未刺激的MRC5细胞(白色条形)完成对照实验，并用痤疮丙酸杆菌(黑色条形)刺激MRC5。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图18：通过Fg1-产生的小肽预处理并通过脂磷壁酸(LTA)刺激的角质形成细胞的H₂O₂产生的剂量依赖性抑制。将NHDK细胞与范围为1.75-7μM的浓度的重组肽Fg1(浅灰色条形)和Fg2(深灰色条形)一起温育24小时。通过荧光分光光度法实现过氧化氢产生的测量，如材料和方法中所述。用未刺激的NHDK细胞(白色条形)和用10μg/ml的LTA刺激的HDF(黑色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图19：通过Fg1-产生的小肽预处理并通过肽聚糖(PGN)刺激的角质形成细胞的IL-8产生的剂量依赖性抑制。将NHDK细胞与范围为1.75-7μM的浓度的重组肽Fg1(浅灰色条形)和Fg2(深灰色条形)一起温育24小时。如材料和方法中所述，通过ELISA实现IL-8产生的测量。用未刺激的NHDK细胞(白色条形)和用10μg/ml的PGN刺激的HDF(黑色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图20：在角质形成细胞上用Fg1.1-产生的小肽处理后细胞活力的评估。将HaCaT细胞与范围为2.5至20μM的浓度的小肽Fg1.1.1(浅灰色条形)、Fg1.1.2(水平线条形)、Fg1.1.3(阴影线条形)、Fg1.1.4(深灰色条形)、Fg1.1.6(点状条形)一起温育24小时。如材料和方法中所述，通过MTT测定法测定细胞毒性的测量。用与PBS(对应于活细胞)；和与0.2％triton X100(对应于死细胞)一起温育的HaCaT细胞完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。

图21：在角质形成细胞上使用用于制备Fg1.1-产生的肽溶液的媒介物处理后细胞活力的评估。将HaCaT细胞与对应于与Fg1.1.1(浅灰色条形)、Fg1.1.2(水平线条形)、Fg1.1.3(阴影线条形)、Fg1.1.4(深灰色条形)、Fg1.1.6(点状条形)一起使用的条件的媒介物稀释溶液一起温育24小时。如材料和方法中所述，通过MTT测定法测定细胞毒性的测量。用与PBS(对应于活细胞)；和与0.2％triton X100(对应于死细胞)一起温育的HaCaT细胞完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。

图22：通过用Fg1.1-产生的小肽预处理的痤疮丙酸杆菌刺激的角质形成细胞的IL-8产生的剂量依赖性抑制。将HaCaT细胞与范围为2.5至20μM的浓度的小肽Fg1.1.1(浅灰色条形)、Fg1.1.2(水平线条形)、Fg1.1.3(阴影条形)、Fg1.1.4(深灰色条形)、Fg1.1.6(点状条形)一起温育24小时。如材料和方法所述，通过ELISA实现IL-8产生的测量。用未刺激的HaCaT细胞(白色条形)和用痤疮丙酸杆菌刺激的HaCaT(黑色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图23：通过Fg1.1-产生的小肽预处理并通过痤疮丙酸杆菌刺激的成纤维细胞的IL-8产生的剂量依赖性抑制。将MCR5细胞与范围为2.5至20μM的浓度的小肽Fg1.1.1(浅灰条形)、Fg1.1.2(水平条形)、Fg1.1.3(阴影条形)、Fg1.1.4(深灰色条形)、Fg1.1.6(点状条形)一起温育24小时。如材料和方法所述，通过ELISA实现IL-8产生的测量。用未刺激的MCR5细胞(白色条形)和用痤疮丙酸杆菌刺激的MCR5(黑色条形)完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图24：5％Fg1.1.1肽凝胶对痤疮丙酸杆菌诱导的体内炎症的影响。对小鼠的耳皮内注射痤疮丙酸杆菌(OD_620nm＝1.0，对应于在PBS中2.10⁷CFU/20μl)以诱导炎症。随后，每天将5％Fg1.1.1肽凝胶应用于小鼠的耳皮肤表面达3天(箭头)。每天测量对应于耳厚度、起皮和发红的得分达96小时的时段。数据是八个个别实验的平均值±S.D。PBS对应于用PBS注射的未处理组。PA+媒介物局部对应于仅用凡士林处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。PA+肽局部对应于用与凡士林混合的5％Fg1.1.1肽处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图25：Fg1.1.1肽对痤疮丙酸杆菌诱导的体内炎症的影响，其中用Fg1.1.1预处理痤疮丙酸杆菌。在37℃用Fg1.1.1肽(140μM)(PA+肽注射)或用媒介物(PBS中最终1％DMSO)(PA+媒介物注射)将痤疮丙酸杆菌菌株(OD_620nm＝1.5)预处理1小时，然后在小鼠的耳中皮内注射(约2.0⁷CFU/20μl)以诱导炎症。仅用PBS注射对照组。每天测量对应于耳厚度、起皮和发红的得分达96小时的时段。数据是八个个别实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图26：Fg1.1.1肽的皮内注射和局部应用对小鼠中痤疮丙酸杆菌诱导的炎症的影响。(1)仅注射PBS的耳。(2)痤疮丙酸杆菌攻击(PBS中2.10⁷CFU/20μl)的96小时后。(3)与最终1％DMSO混合的痤疮丙酸杆菌的96小时后。(4)在凡士林局部应用的情况下痤疮丙酸杆菌攻击的96小时后。(5)与Fg1.1.1肽混合的痤疮丙酸杆菌的96小时后。(6)在Fg1.1.1肽局部应用的情况下痤疮丙酸杆菌攻击的96小时后。

图27：小鼠耳的组织病理学分析。(1)仅注射PBS的耳。(2)痤疮丙酸杆菌攻击(PBS中2.10⁷CFU/20μl)的96小时后，耳肿胀和浸润炎性细胞。(3和4)尚未分别通过媒介物注射和应用改变耳肿胀和大部分浸润的炎性细胞。(5和6)已经分别通过Fg1.1.1肽注射和局部应用减少耳肿胀和浸润的炎性细胞。数据代表具有类似结果的八个个别实验。

图28：Fg1.1.1肽的皮内注射和局部应用对小鼠中痤疮丙酸杆菌诱导的淋巴细胞活化的影响。(A)对小鼠的耳皮内注射痤疮丙酸杆菌(OD_620nm＝1.0，对应于PBS中的2.10⁷CFU/20μl)以诱导炎症。随后，将5％Fg1.1.1肽凝胶每天应用于小鼠的耳皮肤表面达3天(箭头)。PA+媒介物局部对应于单独用凡士林处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。PA+肽局部对应于用凡士林中混合的5％Fg1.1.1肽处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。PBS对应于用PBS注射的未处理组。(B)用Fg1.1.1肽(140μM)(PA+肽注射)或媒介物(PBS中最终1％DMSO)(PA+媒介物注射)在37℃预处理痤疮丙酸杆菌菌株(OD_620nm＝1.5)达1小时，然后在小鼠的耳中皮内注射(约2.0⁷CFU/20μl)以诱导炎症。仅用PBS注射对照组。感染后96小时，对小鼠实施安乐死，并且取出耳神经节以测试其在抗CD3和抗CD28抗体存在下72小时生长后增殖的能力。用Uptiblue试剂完成增殖测量。数据是八个个别实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)，***(P<0.001)和****(P<0.0001)指示统计学显著性。

图29：通过用Fg1或Fg1.1.1肽预处理的痤疮丙酸杆菌刺激的角质形成细胞的IL-8产生的剂量依赖性抑制。将HaCaT细胞在37℃与痤疮丙酸杆菌一起温育24小时，所述痤疮丙酸杆菌在37℃用范围为2.5到10μM的浓度的Fg1肽(浅灰色条)和Fg1.1.1肽(深灰色条)预处理1小时。用未刺激的HaCaT细胞(单独细胞)和用未预处理的痤疮丙酸杆菌刺激的HaCaT细胞(细胞+PA)完成对照实验。如材料和方法所述，通过ELISA实现IL-8产生的测量。数据是三个分开实验的平均值±S.D。

图30：由Il-17、OSM和TNF-α刺激的角质形成细胞的Il-8产生的抑制。用IL-17、OSM和TNF-α(各3ng/ml)的组合刺激NHEK细胞，并以10μM的JAK抑制剂(阳性对照)或范围为1.52-12.2μM的浓度的Fg1.1.1处理48小时。通过ELISA实现IL-8产生的测量，并通过MTT测定法确定细胞毒性，如材料和方法中所述。用未处理且未刺激的NHEK细胞(单独细胞)和用通过Il-17、OSM和TNF-α的组合刺激的未处理的NHEK完成对照实验。数据是三个个别实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)和***(P<0.001)指示统计学显著性。

图31：由Il-17、OSM和TNF-α刺激的角质形成细胞的hBD-2产生的抑制。通过IL-17、OSM和TNF-α(各5ng/ml)的组合刺激NHEK细胞，并以10μM的JAK抑制剂(阳性对照)或范围为1.52-12.2μM的浓度的Fg1.1.1处理72小时。通过ELISA实现hBD-2产生的测量，并通过MTT测定来确定细胞毒性，如材料和方法中所述。用未处理且未刺激的NHEK细胞(单独细胞)和用通过Il-17、OSM和TNF-α的组合刺激的未处理的NHEK完成对照实验。数据是三个分开实验的平均值±S.D。分别通过*(P<0.05)、**(P<0.01)和***(P<0.001)指示统计学显著性。

发明详述

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

在本说明书中，术语“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸的线性聚合物。蛋白质是大的多肽，并且这两个术语通常可互换使用。

在本说明书中，术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”，“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，是指精确的核苷酸序列(经修饰或不然)，其限定含有非天然核苷酸或不然的核酸的片段或区域，并且是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。

本文也应包括本发明与其天然染色体环境，即天然状态中的核苷酸序列或氨基酸序列无关。已经将本发明的序列分离和/或纯化，即将它们直接或间接取样，例如通过拷贝，已经至少部分修饰其环境。本文也应提及通过重组遗传学，例如依靠宿主细胞获得或通过化学合成获得的分离的核酸或氨基酸序列。

在本说明书中，术语“细菌菌株”或“菌株”是指与相同物种的其它细菌不同之处在于一些次要但可鉴定的差异的细菌物种的子集。例如，根据本发明，痤疮丙酸杆菌菌株可以是痤疮丙酸杆菌6919、RON和/或PIE菌株。

在本申请中，术语“片段”是指序列，优选氨基酸序列的一部分。

在本说明书中，术语“血纤蛋白原”或“Fg”是指涉及形成血液凝块的糖蛋白，其是含有通过二硫键彼此连接的两组三种不同的链(Aα、Bβ和γ)的六聚体。这三条链的N端部分含有参与链的交联的半胱氨酸。Aα、Bβ和γ链的C端部分含有约225个氨基酸残基的结构域，其可以发挥分子识别单元的功能。此结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用。

在本说明书中，术语“痤疮(acne)”或“寻常痤疮(acne vulgaris)”是指具有多因素发病机制，包括激素、免疫学和微生物学机制的常见病症。此疾病局限于导致炎性和非炎性临床病变的毛皮脂腺囊。大多数患者有非炎性粉刺和炎性丘疹、脓疱和结节的混合物。参与痤疮形成的主要原因之一是皮脂腺的微生物定殖。几种证据线已经暗指在痤疮丙酸杆菌作为痤疮和矫形感染中的病因体的重要作用(Antti-poika，1990)。

根据本发明的治疗用途的分离的多肽

对于许多病原性细菌，宿主细胞的侵入是由鉴定特异性配体的细菌表面蛋白或粘附素介导的。皮肤相关的细菌，如葡萄球菌和链球菌，表达许多细胞表面粘附素，称为MSCRAMM(识别粘合基质分子的微生物表面成分)，其特异性结合宿主胞外基质组分(ECM)以促进它们对靶细胞的粘附，随后启动定殖和感染(Patti 1994)。宿主ECM组分代表许多病原体用于组织定殖和感染起始的理想的微生物粘附靶标。

因此，在本发明中，本发明人首先研究了痤疮丙酸杆菌表面蛋白与ECM组分的相互作用。使用直接结合测定法，本发明人第一次证明58-kDa糖蛋白被人血纤蛋白原特异性识别。该蛋白质已命名为Pfg。内切糖苷酶消化研究显示了Pfg与血纤蛋白原之间的相互作用涉及人血纤蛋白原的非糖基化部分。进一步的经验表明，血纤蛋白原的N端部分被Pfg识别，并且能够抑制Pfg与血纤蛋白原的结合。

可在疗法中使用血纤蛋白原，特别是其亚基Bβ抑制细菌蛋白与其宿主的粘附的此种特性。

在一方面，本发明因此涉及用于作为药物的用途的分离的多肽或其片段，所述分离的多肽包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述片段包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1对应于人血纤蛋白的亚基Bβ，并且SEQ ID NO:2、5和7至13和47对应于此序列的片段。

血纤蛋白原的链Bβ由FGB基因编码，所述FGB基因是具有类似的血液凝固系统的人和大多数脊椎动物中发现的基因。氨基酸序列长约450个氨基酸。

根据一个实施方案，本发明的治疗用途的多肽包含在最佳全局比对后与SEQ IDNO:1具有至少80％、至少85％、优选至少90％、至少95％、更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，或在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47具有至少80％、至少85％、优选至少90％、至少95％、更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，根据本发明用于治疗用途的分离的多肽选自SEQ ID NO:2、5和7至13和47，或在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47具有至少80％、至少85％、优选至少90％、至少95％、更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽。

SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:47对应于具有106个氨基酸并命名为Fg1的人血纤蛋白原Bβ链的特定片段的氨基酸序列。

如本文所用，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”是指在最佳全局比对后获得的两个待比较序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异沿着其长度随机分布。两个核酸或氨基酸序列的比较在传统上通过在其整个长度上将它们整体最佳比对后比较序列进行，所述比较由本领域技术人员熟知的任何软件进行，如Needle软件，使用《缺口开放》参数等于10.0，《缺口延伸》参数等于0.5，和《Blosum 62》矩阵。例如，以名称《比对(Align)》从网站ebi.ac.uk在全球范围可获得Needle软件。

然后，通过比较两个全局和最佳比对序列来测定两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中比较的核酸或氨基酸序列与参照序列相比可以具有取代、添加或缺失以实现两个序列之间的最佳全局比对。通过测定两个序列之间的氨基酸或核苷酸相同的位置数目，将相同位置的数目除以最佳全局比对中的总位置数目，并将结果乘以100以获得两个序列之间的百分比同一性来计算百分比同一性。当使用适合于最佳全局比对的软件，如needle软件时，可以通过软件直接计算两个比较序列之间的百分比同一性。

对于与参照氨基酸序列显示至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，优选实例包括在参照序列中含有某些修饰的那些，特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或取代、截短或延伸。在取代一个或多个连续或不连续的氨基酸的情况下，优选的取代是其中取代的氨基酸被“等同”氨基酸替换的取代。在本文，表述“等同氨基酸”意指可能取代结构氨基酸之一，然而不修改感兴趣的多肽的生物学活性的任何氨基酸，并且特别地包括以下定义的具体实例。

等同氨基酸可以根据与其取代的氨基酸的其结构同源性或基于可能产生的各种抗体之间的生物活性的比较试验的结果来确定。

作为非限制性实例，下表1概括了可能实施而不导致感兴趣多肽的生物活性的显著修饰的可能取代；在相同条件下，反向取代是天然可能的。

表1

如上文所述的多肽及其片段识别本发明人表征的痤疮丙酸杆菌表面蛋白(Pfg)，结合它，并且抑制痤疮丙酸杆菌对皮肤细胞的粘附。

在本发明中，令人惊讶地，本发明人通过使用生物素化的配体结合测定法鉴定由人血纤蛋白原特异性识别的58-kDa的痤疮丙酸杆菌表面蛋白(Pfg)。通过2-D电泳和MALDI-ToF分析进一步表征Pfg为其C端中含有LPXTG基序的推定的粘附表面蛋白。Pfg主要在培养的稳定期期间表达，并且似乎是高度糖基化的，含有GalNAc残基。纯化的Pfg强烈识别Fg的Aα和Bβ亚基。Fg的特异性酶促脱糖基化显示蛋白质主链参与识别过程。

本发明人还证明了，其Fg的Bβ亚基及其片段能够抑制粘附蛋白Pfg与其靶配体(Fg)或靶细胞(皮肤细胞)的相互作用。特别地，如上文所述的多肽和其片段允许与该相互作用竞争，并因此参与防止细菌对宿主细胞的粘附。

除此能力之外，如上文所述的多肽及其片段可以用作药物，特别是用于治疗和/或预防痤疮。

本发明人还发现如上文所述的多肽及其片段是通用的抗炎特性，其不利于痤疮丙酸杆菌的存在，因此可以用作药物，特别是用于治疗和/或预防其它炎性皮肤疾病，优选银屑病。

如本文所用，“炎性皮肤疾病”是以多种形式出现的疾病，从偶发的皮疹伴随皮肤瘙痒和发红到慢性状况如皮炎(湿疹)、酒渣鼻、脂溢性皮炎和银屑病。皮肤炎症可以以急性或慢性表征。急性炎症可以源自暴露于UV照射(UVR)、电离照射、变应原或与化学刺激物(肥皂、染发剂等)接触。这类炎症通常在1至2周内消退，几乎没有伴随的组织破坏。相比之下，慢性炎症源自皮肤自身内持续的免疫细胞介导的炎症应答。此炎症是持久的，并且可以导致重大且严重的组织破坏。

如本文所用，“银屑病”是指以皮肤损伤，包括红、鳞状斑块、丘疹和斑块(其通常发痒)为特征的常见、慢性、复发/缓解的免疫介导的系统性疾病。银屑病中看到的皮肤损伤在严重程度上可以从轻微局部斑块变化到完全身体覆盖。银屑病的五大类型是斑块、滴状、倒转、脓疱和红皮病型。

本发明的具体片段

从血纤蛋白原的亚基Bβ的序列开始，本发明人鉴定出能够结合痤疮丙酸杆菌粘附蛋白Pfg，因此抑制痤疮丙酸杆菌对其靶蛋白(血纤蛋白原)和宿主皮肤细胞的粘附的特异性片段。

另一方面，本发明因此涉及包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的片段，所述片段包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。

为了获得这些特异性片段，将人血纤蛋白原的亚基Bβ分成具有相同长度的四个区段(命名为Fg1、Fg2、Fg3和Fg4)，并在细菌载体中克隆并产生。血纤蛋白原的亚基Bβ和这些片段的氨基酸序列示于下表2a中。

表2a：血纤蛋白原的亚基Bβ和片段Fg1、Fg2、Fg3和Fg4的氨基酸序列。

测试后，看起来在片段Fg1、Fg2、Fg3、Fg4中，活性片段为Fg1。

此外，首先将片段Fg1分为大致具有相同长度(分别为35、35和36个氨基酸)的三个不重叠的片段(Fg1.1、Fg1.2和Fg1.3，如表2b所示)，并且此后每个切割区域围绕有15个氨基酸，从而允许获得具有30个氨基酸的相同长度并且与片段Fg1.1、Fg1.2和Fg1.3重叠的两个其它片段(表2b中显示的Fg1.4和Fg1.5)。

测试后，看起来在片段Fg1.1、Fg1.2、Fg1.3、Fg1.4和Fg1.5中，活性片段是Fg1.1和Fg1.4。

片段Fg1.1进一步分为六个其它片段(Fg1.1.1、Fg1.1.2、Fg1.1.3、Fg1.1.4、Fg1.1.5和Fg1.1.6，在表2b所示)。

表2b：衍生自Fg1和Fg1.1的片段的氨基酸序列。

片段名称	氨基酸序列	SEQ ID NO:
			Fg1.1	MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKSQGVND	SEQ ID NO:2
Fg1.2	NEEGFFSARGHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGG	SEQ ID NO:3
			Fg1.3	YRARPAKAAATQKKVERKAPDAGGCLHADPDLGVLC	SEQ ID NO:4
Fg1.4	LLLCVFLVKSQGVNDNEEGFFSARGHRPLD	SEQ ID NO:5
			Fg1.5	APSLRPAPPPISGGGYRARPAKAAATQKKV	SEQ ID NO:6
Fg1.1.1	LLLCVFLVKSQGVND	SEQ ID NO:7
			Fg1.1.2	LLLCV	SEQ ID NO:8
Fg1.1.3	FLVKS	SEQ ID NO:9
			Fg1.1.4	QGVND	SEQ ID NO:10
Fg1.1.5	LLLCVFLV	SEQ ID NO:11
			Fg1.1.6	KSQGVND	SEQ ID NO:12

为了使本发明的片段适合于更有效地用于疗法并且以最小的成本增强其合成，发明人提供了具有减小的长度的片段。

因此，根据本发明的一个实施方案，这些片段具有不超过150、不超过130、优选不超过110个氨基酸或不超过90个氨基酸的长度。

更优选地，本发明的片段具有对应于SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:47(片段Fg1)的106个氨基酸的长度。

更优选地，本发明的片段具有5-50个氨基酸，优选5-40个，更优选5-35的长度。根据一个实施方案，根据本发明的片段可以具有包含在25-40个氨基酸，优选30-35个氨基酸。

根据另一个实施方案，根据本发明的片段可具有5-20个氨基酸，优选5-15个氨基酸，更优选5-10个氨基酸的长度。

优选地，根据本发明的片段具有对应于SEQ ID NO:2、5和7至12的序列，更优选SEDID NO:2和5。

根据本发明的分离的核酸、载体和宿主细胞

另一方面，本发明涉及编码本发明片段的分离的核酸分子。

核酸序列还可以在最佳全局比对后与优选的序列表现出至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的百分比同一性。意味着相对于参照核酸序列，核酸序列表现出某些修饰，诸如特别是缺失、截短、延伸、嵌合融合和/或取代，特别是准时的。优选地，这些是编码与参考序列相同的氨基酸序列的序列，这与遗传密码的简并性或可能与参照序列特异性杂交(优选在高度严格的条件下)的互补性序列有关。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子的载体。

如本文所用，术语“载体”意图指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”载体，其是指可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

根据本发明的载体优选还包含允许在宿主细胞或受试者内递送、增殖和/或表达本文所述的任何核酸分子所必需的元件。特别地，在根据本发明的载体中，根据本发明的核酸分子优选可操作地连接到适当的调节序列。如本文所用，术语“调节元件”或“调节序列”是指允许、促成或调节给定宿主细胞或受试者中核酸分子的表达，包括核酸或其衍生物(即mRNA)的复制、重复、转录、剪接、翻译、稳定性和/或转运的任何元件。本领域技术人员将理解，调节序列的选择可取决于诸如载体本身、宿主细胞或受试者、期望的表达水平等因素。

用于本发明的此类合适的质粒载体的代表性实例包括但不限于原核生物中的pBSK载体、pET、pDEST、pRSET载体；酵母中的pYES；真核生物中的pDEST，pcDNA。

此外，本发明的核酸分子和包含这些分子的本发明的载体可用于转化合适的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”意图指为了表达本发明的多肽或片段而引入重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语意在不仅指特定的受试细胞，而且也指此类细胞的后代。由于某些修饰可以由于突变或环境影响而在后续世代中发生，此类后代实际上可以不与亲本细胞相同，但仍被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。本发明背景中合适的宿主细胞的非限制性实例包括细菌细胞，如大肠杆菌(特别是菌株DH5α)、酵母细胞(特别是酿酒酵母)、哺乳动物细胞(特别是HeLa、CHO、3T3细胞系)。

可通过用于将多核苷酸导入细胞宿主中的任何已知方法进行转化。此类方法是本领域技术人员公知的，并且包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包囊到脂质体中、生物射弹注射和DNA直接显微注射入核。

可与两个或更多个核酸分子或表达载体，包括表达本发明的多肽或片段的载体共转染宿主细胞。

药物组合物、药物和组合产品

发明人证明，本发明的片段，优选具有对应于SEQ ID NO:2、5、和7-13和47的氨基酸序列的片段识别和结合痤疮丙酸杆菌的Pfg粘附蛋白，因此抑制痤疮丙酸杆菌与其靶配体(血纤蛋白原)和宿主皮肤细胞的粘附。

另一方面，本发明因此涉及包含至少一种选自根据本发明的片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞的化合物和药学上可接受的媒介物的药物组合物。

如本文所用，“药学上可接受的媒介物”包括生理上相容的任何和所有溶剂、缓冲剂、盐溶液、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等。可以基于意图的施用途径来选择载体的类型。在各种实施方案中，载体适合于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、表面、透皮或口服施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。用于静脉内输注的典型药物组合物可以制成含有250ml无菌林格氏溶液和100mg组合。用于制备肠胃外可施用化合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且在更为详细记载于例如Remington's Pharmaceutical Science，第17版，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1985)、和其第18和第19版。组合物中的化合物优选配制成有效量。“有效量”是指在必需的剂量和时间段，有效实现期望结果(如预防或治疗炎性皮肤病症，特别是痤疮)的量。“治疗有效量”是指足以影响特定疾病状态的治疗过程的量。治疗有效量也是治疗有益效果超出药剂的任何有毒或不利效果的量。

应当理解，可根据在建立适合患者的治疗时通常考虑的标准，例如患者的年龄、其一般状态的严重程度、其对治疗的耐受性和经历的副作用来确定施用途径、给药日程表和最佳的盖仑制剂(galenic)形式。

例如，根据本发明的片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞可以0.1-10％重量/重量(w/w)，优选地0.5-2％w/w，更优选地0.5-4％w/w，甚至更优选地2-6％w/w的范围存在于根据本发明的药物组合物中。

根据另一方面，本发明涉及根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物，其用作药物。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物用于治疗和/或预防痤疮。

本发明人还显示了，根据本发明的分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物可用于治疗和/或预防其它炎性疾病，优选银屑病。

根据本发明的片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物可以单独使用或与其它抗炎剂组合使用以增强其治疗效果。

在另一个方面中，本发明因此还涉及组合产品，其包含：

-选自下组的至少一种化合物：根据本发明的片段、分离的核酸分子、载体和宿主细胞；和

其用作药物同时、分开或序贯使用。

此类另外的药剂可选自下组：多西环素、异维A酸、维A酸、阿达帕林、过氧化苯甲酰、克林霉素和红霉素。

实施例

材料和方法

细菌菌株和生长条件

痤疮丙酸杆菌菌株6919获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并且从患有关节感染的患者中分离痤疮丙酸杆菌RON和PIE。在厌氧条件下在强化梭菌液体和固体培养基(RCM)(Difco Laboratories，Detroit，MI)中培养所有菌株。将痤疮丙酸杆菌从细菌原液转移到RCM琼脂平板上，并通过使用GasPak^TM EZ厌氧容器系统(Becton Dickinson&Co，Sparks MD，USA)在无氧条件下温育5天。将单菌落转移到100ml RCM中并如上文所述培养。然后，将细菌悬浮液在最终10％甘油的存在下在-80℃冷冻贮存。此种原液称为“起始原液”，并且用于所有实验。对于常规培养，使用100ml RCM或补充有0.1％tween 80的RCM(RCM+T80)，并且在37℃5天后通过在4℃以7,000Xg离心10分钟收获细菌。将团粒合并，并且在约30ml冷PBS中清洗，并如上文所述再次离心。最后，将细菌团粒悬浮于PBS[1.5mM KH₂PO₄,2.7mM Na₂HPO₄.7H₂O,0.15M NaCl(pH 7.4)](来自体积培养物的1:10)中。如上文所述，也将细菌培养到补充有5％绵羊血液的Columbia琼脂上在37℃在厌氧条件下5-8天。将细菌在PBS(每培养皿3ml PBS)中废弃，并用于表面蛋白质提取。对于大量的培养物，使用200ml的痤疮丙酸杆菌5天龄RCM培养物作为先前在37℃平衡的2升RCM的接种物。为了确保厌氧条件，将培养物用N₂广泛冲洗10分钟并密封。每2小时，收获10ml培养物以测定600nm处的吸光度和pH，并且如上文所述用N₂冲洗培养物。将细菌以7,000Xg离心10分钟，并且将团粒重悬于PBS中。如下所述获得总表面蛋白质提取物。

总表面蛋白质提取

在单独的PBS中或在2％SDS存在下在60℃持续20分钟或在1％LiCl存在下在45℃持续2小时将表面蛋白质提取(Shen 1993)。通过在4℃以16,000Xg离心20分钟除去细菌。在针对PBS透析下除去过量的SDS和LiCl。将所得溶液称为痤疮丙酸杆菌热提取物(PAHE)，并在4℃搅拌下在80％饱和下进行硫酸铵沉淀1小时，用于浓缩。在4℃以22,000Xg离心30分钟后回收沉淀的蛋白质，然后重悬于PBS中，并对PBS充分透析。该蛋白质溶液称为浓缩的痤疮丙酸杆菌热提取物(cPAHE)。使用BSA作为Peterson描述的标准品，通过Lowry的方法测定蛋白质浓度(Peterson 1983)。

生物素化

将cPAHE、纯化的Pfg和商业ECM配体在PBS中调节至1至10mg/ml的浓度，并在4℃对[74mM四硼酸钠、60mM硼酸(pH8.8)]透析过夜。如上文所述在PBS中回收痤疮丙酸杆菌全细胞，并且将团粒重悬浮在硼酸盐缓冲液中。将该操作重复两次。使用外在标记试剂磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-生物素(Sigma)以1mg蛋白质为250μg NHS-生物素的比率在4℃在翻滚搅拌下将蛋白质和全细菌温育4小时。通过添加1M NH₄Cl停止反应。通过对于蛋白质溶液在4℃针对PBS透析和对于全细菌通过离心除去过量的生物素-NHS。将生物素化的蛋白质制剂在-80℃贮存，并且将生物素化的细菌在使用前在+4℃贮存。在制备后不超过5天使用生物素化细菌的制备物。

结合活性

为了表征痤疮丙酸杆菌和配体之间的相互作用，我们在定量和定性测定法中使用生物素化分子。在第一组测定法中，ECM配体(血纤蛋白原、胶原I、IV、VI和VIII)用作用生物素标记的蛋白质。在第二组测定法中，将痤疮丙酸杆菌表面蛋白(总提取物和纯化的Pfg)生物素化。为了定量分析，将未标记的蛋白质稀释到50mM碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.9缓冲液中，以产生范围为0.01至50μg/ml的蛋白质浓度，然后在4℃固定到96孔聚苯乙烯板过夜。用0.2ml含有0.05％Tween-20的PBS(PBS-Tween)将孔冲洗三次。将生物素化蛋白(PBS-Tween中0.01至16μg/ml)添加到孔，并在室温下温育1小时。将孔用0.2ml PBS-Tween漂洗3次。添加与链霉亲合素(PBS-Tween中0.5μg/ml)缀合的过氧化物酶，并在室温下温育30分钟。清洗后，使用生色过氧化物酶底物ABTS检测结合的过氧化物酶。对于定性分析，通过SDS-PAGE分离未标记的蛋白质(每条泳道10-75μg)，然后转移到硝酸纤维素膜(孔径0.45μm)，如前所述(Towbin，1979)。然后将膜在4℃在含有5％BSA，0.05％Tween-20的PBS(PBT缓冲液)中饱和过夜。通过将膜与20ml含有生物素化蛋白质(0.1μg/ml)的PBT在室温下温育2小时，然后用PBT三次清洗来检测结合活性。通过将膜与同链霉亲合素(PBT中的0.5μg/ml)缀合的过氧化物酶在室温下温育1小时来检测结合的生物素化蛋白质。清洗后，在CoCl₂和H₂O₂存在下使用3,3’-二氨基联苯胺检测结合的过氧化物酶活性(Harlow和Lane，1988)。

二维电泳

用含有来自cPAHE的200μg蛋白质的250μl IEF溶液(8M尿素-2％CHAPS(wt/vol)-0.5％IPG缓冲液pH 4-7(vol/vol)-0.002％溴酚蓝)在20℃将13cm pH10-3固定化pH梯度(IPG条)(Amersham-Bioscience，Sweden)再水化13小时。使用Ettan IPGphor系统(Amersham-Pharmacia,Sweden)在20℃在四个步骤中，于200V 1小时、于500V 1小时、于8000V以梯度模式30分钟、和于8000V 3小时进行等电聚焦。对于第二维，通过在6M尿素-30％甘油(wt/vol)-0.05M Tris-HCl-2％SDS(wt/vol)-0.002％溴酚蓝-100mM DTT的溶液中震荡将IPG条平衡15分钟，并且在6M尿素-30％甘油(wt/vol)-0.05M Tris-HCl-2％SDS(wt/vol)-0.002％溴酚蓝-400mM碘乙酰胺的溶液中平衡15分钟。然后将IPG条施加到12％SDS-PAGE凝胶上。通常，在70mA电流常数下，将2个凝胶平行运行6小时。通过在没有戊二醛步骤的情况下银染色将蛋白质检测到一个凝胶中。如前所述，使用BOA显现感兴趣的点。将银染的凝胶和膜匹配，并从凝胶中切下感兴趣的点。

通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)-飞行时间(ToF)质谱法的肽质量指纹法(fingerprinting)

在真空干燥之前，在含有50％(vol/vol)乙腈的25mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)中进行二维蛋白质点的胶凝内胰蛋白酶消化(Jonsson 2001)。用含有0.02g/l测序级修饰的猪胰蛋白酶(Promega，Madison，Wis.)的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)进行再水合，并在37℃进行消化18小时，并通过添加0.4％(vol/vol)三氟甲酸停止。将回收的肽溶液点样到基质膜上，并允许在室温干燥。用纯水漂洗样品沉积物，随后插入配备有337nm N₂激光的MALDI质谱仪(Applied Biosystems，Voyager DE super STR)中。如前所述(Vorm，1994)通过使用丙酮中4-羟基-γ-氰基肉桂酸(Sigma)的饱和溶液来产生快速蒸发基质膜。通过使用猪胰蛋白酶自动消化肽完成所有谱的内部质量校准。针对SWISS-PROT和Genpept数据库搜索了肽质量。

Pfg纯化

将cPAHE(16ml中的90mg)在室温下以5,000x g离心10分钟以除去未溶解的物质，并通过阴离子交换层析分级，所述阴离子交换层析以流速24ml/h进行到缓冲液A[25mMTris(pH8.0)]中平衡的UNOsphere Q阴离子交换柱(2.5x 10cm)(BioRad)上。用缓冲液A(24ml)清洗未结合的蛋白质，并用缓冲液A+2M NaCl以0至160(28ml)，160-200mM(40ml)逐步洗脱结合的蛋白质。合并含有Fg结合活性的级分(1.5ml)，通过在4℃针对缓冲液0.1MNH₄HCO₃,pH 8.0进行广泛透析脱盐，并冻干。通过以6ml/h(1.5ml/级份)的流速在24小时的时段内将体积5ml中的3mg蛋白质加载到用0.1M NH₄HCO₃,pH 8.0平衡的Sephacryl S-300HR柱(1x 120cm)(GE Healthcare)上实现Pfg的最终纯化。合并含有Fg结合活性的级分(1.5ml)，并在-20℃贮存。

血纤蛋白原脱糖基化

为了评估痤疮丙酸杆菌表面蛋白质识别血纤蛋白原的哪个部分，已经酶促除去为了保持蛋白质骨架的完整性的聚糖部分。由于已经显示血纤蛋白原是含有N-和O-连接的聚糖两者的糖蛋白(Debeire 1985；Reid Townsend 1982；1996)，使用用于除去聚糖的内切糖苷酶、N-聚糖酶和O-聚糖酶。所有使用的酶和试剂均购自ProZyme(Prozyme，SanLeandro，Caflif.)。将纯化的商业人和牛Fg(100μg；Sigma)在100℃在含有[0.4％SDS、200mMβ-巯基乙醇、50mM磷酸钠(pH 7.0)]的缓冲液中变性5分钟，在室温冷却，然后添加3％NP-40。为了除去N-连接的聚糖，添加大肠杆菌中0.5U的脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)重组体PNGase F(N-聚糖酶)，并且在37℃温育24小时，终体积为50μl。为了除去O-连接的聚糖，将变性人血纤蛋白原首先在0.25U的霍乱弧菌唾液酸酶A、牛睾丸β-半乳糖苷酶和刀豆粗粉β-N-乙酰-氨基葡糖苷酶的存在下在37℃温育3小时，因为必须除去单糖，直到只有Galβ(1-3)GalNAc核心保持附着于蛋白质。然后，添加大肠杆菌中0.5U肺炎链球菌重组体内切-β-N-乙酰-半乳糖胺酶(O-聚糖酶)，并在37℃温育24小时。通过将样品与电泳样品缓冲液混合，然后在100℃变性3分钟来终止酶反应。然后使用上文描述的结合测定法对N-和O-脱糖基化的Fg测试其结合生物素化Pfg的能力。在考马斯蓝染色后，SDS-PAGE上脱糖基化之前和之后监测脱糖基化反应的血纤蛋白原的迁移率变化。如下所述，也通过使用RCA-I和榴莲凝素(jacalin)植物凝集素实现了监测。

质粒构建

通过RT-PCR从总RNA获得人血纤蛋白原的Bβ亚基的片段，所述总RNA从在补充有10％胎牛血清的改良Dulbecco培养基中培养的人肝癌细胞系Hep-G2提取。简言之，用TRIzol试剂(Invitrogen Ltd，Paisley，UK)根据制造商的说明书分离总RNA，并且用DNA酶I(Roche Molecular Biochemical)处理。通过样品的A₂₆₀值测定RNA浓度。使用oligo(dT)引物和200U SuperScript^TM II逆转录酶(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)从2μg总RNA产生互补DNA，然后用作标准PCR反应的模板。使用0.5U的高保真Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)以25μl终体积进行标准扩增，循环条件设定在94℃15秒，50℃30秒和68℃45秒，共35个循环。引物扩增出血纤蛋白原cDNA的318、441、462和462bp片段。

如下使用特异性引物对：

对于Fg1为GCAGGAATTCTGATGAAAAGGATGGTTTCTTGG(SEQ ID NO:17)和GGCCGCTCGAGTACACAACACCCCCAGGTCTGG(SEQ ID NO:18)；对于Fg2为GCAGGAATTCTGGATGCTGGAGGCTGTCTTCAC(SEQ ID NO:19)和GGCCGCTCGACTAGACACCACAGGAATATTGCA(SEQ ID NO:20)；对于Fg3为GCAGGAATTCTGAAGTTAGAATCTGATGTCTCA(SEQ ID NO:21)和GGCCGCTCGAGTTTCATTCTGTACAGTGAATCC(SEQ ID NO:22)；对于Fg4为GCAGGAATTCTGCCCACAGAACTTTTGATAGAA(SEQ ID NO:23)和GGCCGCTCGAGTCTGTGGGAAGAAGGGCCTGAT(SEQ ID NO:24)。

将EcoRI和XhoI的限制性位点分别添加到正义引物和反义引物中。纯化血纤蛋白原PCR片段，首先插入pBSK载体中。用EcoRI/XhoI消化片段后，将片段插入用EcoRI和XhoI消化的pGEX-4T-2中。

GST融合蛋白的表达和纯化

使用大肠杆菌BL21DE3pLys菌株产生不同的GST-血纤蛋白原-片段融合蛋白。将细菌在补充有100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml氯霉素的LB培养基(10ml)中培养过夜，并用于接种1μl LB培养基。当在30℃温育的培养物达到OD₆₅₀＝0.7时，通过添加0.5mM异丙基α-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并将培养物再延长4小时。通过以5000xg离心10分钟收获培养物。将团粒在PBS中清洗一次，并重悬于通过冰上爆发超声处理30秒并且补充有DTT 2mM，N-月桂基肌氨酸1.5％的裂解缓冲液TEN-T(20mM TrisHCl pH：7.5，EDTA 0.5mM，NaCl 150mM，Triton X-100 1％)中。将裂解物在20000xg离心20分钟，并且弃去上清液。将含有GST-融合蛋白的不溶性团粒级分溶解在TEN-T缓冲液+8M尿素中，并且通过以20,000Xg离心20分钟澄清溶液。将溶解的蛋白质加载到Protino GST/4B柱(Macherey&Nagel)上，并使用缓冲液50mM Tris，10mM谷胱甘肽，pH 8.0洗脱。合并含有重组肽(通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)的级分。在最后一步中，刚好在利用前，将上清液针对PBS透析以除去尿素。

细胞培养和刺激

将永生化的人角质形成细胞细胞系HaCaT，成纤维细胞MRC5在含有1mM丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基-Glutamax-I(DMEM)中培养。在Roswell Park MemorialInstitute 1640培养基-Glutamax-I(RPMI)中培养永生化的人单核细胞系ThP1。DMEM和RPMI在37℃在含有5％CO₂的湿润气氛中补充有0.1％和10％热灭活的胎牛血清(Invitrogen)和抗生素/抗真菌溶液(10U/ml青霉素，10μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素(Amphoterin))，如描述的(Life Technologie)。分别在KGM-Gold和FGM-2Bullet试剂盒中培养原始人角质形成细胞(NHDK)和成纤维细胞(HDF)，如由制造商描述(Lonza)。常规测试永生化细胞系以评估支原体感染的缺乏。

对于用痤疮丙酸杆菌刺激的经验，将细胞与适当浓度调节的痤疮丙酸杆菌悬浮液一起温育，于37℃预处理1小时或不然，其中在37℃，5％CO₂以0.87、1.5、3.5或7μM的浓度用血纤蛋白原重组肽Fg1和Fg2处理期望的时间段。

对于LTA(脂磷壁酸)、PGN(肽聚糖)或LPS(脂多糖)刺激的经验，在37℃，5％CO₂中以浓度7、3.5或1.75μM用血纤蛋白原重组肽Fg1和Fg2将细胞预处理24小时或不然，然后在37℃用终浓度10μg/ml的LTA或PGN或LPS刺激18小时。

对于使用银屑病的体外模型的经验，在培养基中将皮肤原代人角质形成细胞(NHDK)培养24小时。然后，通过1.52、3.05、6.1和12.2μM浓度的肽Fg1.1.1或参照(10μM的JAK抑制剂I；阳性对照)处理或不处理(阴性对照)细胞，并且预温育2或24小时。在该预温育后，除去培养基并用含有或不含有1.52、3.05、6.1和12.2μM浓度的Fg1.1.1或10μM浓度的JAK抑制剂和促炎混合物(IL-17+OSM+TNF-α的组合，各3或5ng/ml)的培养基替换，并且将细胞温育48或72小时。

粘附测定法

于600nm将细菌悬浮液调节至期望的浓度，于37℃用范围为0.87至7μM的终浓度的肽Fg1和Fg2预处理1小时，并用PBS SVF 2％溶液沉积在先前饱和的细胞上2小时。在37℃温育1小时后，通过用PBS清洗3次除去未结合的细菌，并且用0.5μg/ml的链霉亲合素-过氧化物酶溶液检测固定的细菌30分钟。3次清洗后，通过底物ABTS(2,2’-氮杂双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)揭示检测到的细菌30分钟，并在410nm读数。

通过荧光分光光度法分析测量ROS产量

将所有细胞系(5.10⁴至10⁵个细胞/孔)接种在96孔板(Corning Costar，Brumath，France)中并如前所述进行处理。刺激后，将细胞在PBS中清洗三次，并如前所述用每孔100μl 5μM DHE(用于测定O₂ ^·-)或5μM H₂-DCFDA(用于测定H₂O₂)温育30分钟，并且在5小时的时段内每小时记录荧光强度。荧光激发/发射最大值为对于DHE：480/610nm和对于H₂-DCFDA：507/525nm。在实验结束时，如下所述通过结晶紫测定法来评估粘附细胞的数目。通过荧光分光光度法在Fusion分光荧光计(PackardBell，Paris，France)上测定O₂ ^·-和H₂O₂。在每个样品中如下计算ROS的水平：活性氧种类速率(任意单位/分钟/10⁶个细胞)＝(T5h时的荧光强度[任意单位]-To时的荧光强度[任意单位]/300分钟/粘附细胞的数目，如通过结晶紫测定法测量，并表示为任意单位(A.U.)。

细胞活力测定法

结晶紫染色用于确定96孔板中粘附细胞的数目。简言之，与测试化合物一起温育后，弃去培养基，并将细胞与0.05％结晶紫溶液(Sigma)在室温下温育30分钟。用PBS清洗后，添加100％甲醇，并且在ELISA多孔读数器上在540nm用分光光度法测量吸光度。MTT(1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基月替)测定以测试96孔板中的细胞活力。将细胞与细胞培养基中的0.2％MTT溶液在37℃温育4小时。然后弃去MTT溶液，并且添加DMSO以溶解活细胞中产生的MTT-甲月替(formazan)晶体。充分混合后，在540nm测量吸光度。

ELISA

使用各种ELISA成套试剂盒(来自eBioscience的Ready-Set-Go试剂盒，用于痤疮实验，和用于银屑病实验，来自R&D Systems的Duo IL-8成套试剂盒和来自Peprotech的BD-2 Human Development(hBD-2))根据制造商的说明书在刺激细胞的上清液中测量人IL-1β、IL-8、IL-12、hBD-2和TNF-α蛋白浓度。我们使用重组人IL-1β、IL-8、IL-12和TNF-α的系列稀释液以得到标准品曲线。在540nm的波长校正下，在450nm处测定光密度。

统计分析

通过配对Student检验分析来自实验组的数据间差异的统计学显著性。认为P≤0.05的水平是显著的。统计学显著性分别由*(P≤0.05)、**(P≤0.01)和***(P≤0.001)标示。

结果

用真核配体鉴定痤疮丙酸杆菌细胞表面蛋白

为了鉴定由ECM配体识别的痤疮丙酸杆菌表面蛋白，我们使用了由皮肤相关细菌识别的最常见的ECM蛋白，如胶原和血纤蛋白原。将痤疮丙酸杆菌菌株培养到三种不同的培养基上，以使细菌表达其推定的表面蛋白质，其通过在氯化锂存在或不存在下加热细菌悬浮液来提取。为了鉴定表面蛋白质，将痤疮丙酸杆菌总热蛋白提取物电泳分离并通过银染检测(图1B)。检测到范围为14至100kDa的几个条带，一种表观分子量58-kDa的蛋白质占总蛋白质提取物的约90％(图1B，泳道2)。在RCM和RCM 0.1％Tween 20培养基之间没有发现主要的差异，然而似乎在存在锂而非单独的热提取的情况下提取较多的蛋白质。当将痤疮丙酸杆菌培养到富含血液的固体培养基上时，58kDa存在于这两种提取物中，约90-kDa的蛋白质条带和约20kDa的另一个蛋白质条带也仅存在于锂热提取物中(图1B，泳道3)。随后，通过用生物素化配体的Western印迹法鉴定推定的痤疮丙酸杆菌表面粘附素(图1A)。我们发现，不依赖于所使用的生长培养基，在热提取物和锂热提取物两者中，58-kDa蛋白质被生物素化的血纤白蛋白识别(图1A，泳道2)。在胶原蛋白的情况下没有发现识别(图1，泳道2)。使用胶原VI获得非常微弱且非再现的识别，并且认为不是特异性的。令人感兴趣的是注意到，识别强度在锂提取物中更高，提示了用此方法的更好的回收。此外，在不同培养基上培养痤疮丙酸杆菌不显著影响所识别的表面蛋白的表达。根据这些结果，将痤疮丙酸杆菌在RCM培养基上培养，并且在存在锂的情况下加热提取表面蛋白质。为了证实这些结果，将痤疮丙酸杆菌总表面蛋白质固定到聚苯乙烯板上，并用生物素化的Fg和胶原蛋白I进行探测(图2)。首先测试几种浓度的蛋白质提取物，并显示血纤蛋白原的结合活性，在每孔约6.25μg/ml蛋白质时达到平台期，而对胶原I没有检测到结合活性。为了验证该结果，每孔固定化25μg/ml的蛋白质，并用各种量的生物素化的Fg和胶原蛋白I进行测试(图2B)。已经显示与血纤蛋白原的强烈的结合活性，达到平台期，这提示了识别位点的可能的饱和。用胶原I没有检测到结合活性，提示了血纤蛋白原与痤疮丙酸杆菌蛋白提取物之间的特异性相互作用。这些结果与先前显示的定性结果一致。因此，尚未描述58-kDa蛋白质，因此对其进一步进行表征。由于58-kDa是从痤疮丙酸杆菌表面提取的血纤蛋白原结合蛋白，因此它命名为PFg。

Pfg的表征

通过2-D凝胶电泳分离痤疮丙酸杆菌表面提取物。第一维是覆盖从10到3的广泛pI范围的IEF。在12.5％SDS-PAGE上运行第二维，之后通过银染检测蛋白质(图3A)。分离后观察到约50个蛋白点(图3A)。为了定位对应于Pfg的点，平行运行第二个凝胶，并使用生物素化的血纤蛋白原进行Western配体印迹测定法(图3B)。Pfg看起来在2-3个主要点下(图3B，泳道3)，并与银染色凝胶中的点匹配(图3A，泳道3)。均由血纤蛋白原识别的几个点的存在提示了Pfg将被糖基化，因此在第一维期间在几个等电点下分离。将感兴趣的蛋白质点切出，并且在凝胶内消化后通过肽混合物的MALDI-ToF表征。图3C显示了由图3A中箭头所示的蛋白质点产生的胰蛋白酶肽混合物的MALDI质谱。发现22个实验获得的胰蛋白酶肽质量匹配预测的肽质量至0.1Da内，覆盖了57％的氨基酸序列。蛋白质序列数据库搜索将蛋白质鉴定为痤疮丙酸杆菌假设蛋白基因的产物，推定的粘附或S层蛋白YP_056792(表3)(GeneID2933198，基因座标签PPA2127)(Bruggemann 2004)。PPA2127基因产物是在C端处具有富含重复的脯氨酸和苏氨酸的区域的405个氨基酸的假设蛋白(脯氨酸-苏氨酸重复蛋白[PTRP])。PTRP的氨基酸序列分析显示了324位至355位的C端区域中存在基序Pro-Thr或Pro-Lys的16个串联重复。蛋白质的理论分子量为41.7kDa。蛋白质序列分析揭示了C端的400位处存在LPXTG基序，其对应于分选酶的细胞锚定基序可能位点并且支持痤疮丙酸杆菌膜上存在的表面蛋白质。

表3：胰蛋白酶肽的测定和计算分子量^a。

^a:鉴定出58kDa蛋白质条带的这些肽覆盖405个残基的231个，对应于57％的序列覆盖率。

^b：单同位素，质量。

Pfg纯化

在表4中总结典型的Pfg纯化的结果。大体积的痤疮丙酸杆菌锂提取物的盐沉淀导致蛋白质的浓缩和所得的浓缩提取物的比活性的少量增加(每单位蛋白质的1.45倍血纤蛋白原结合活性)(表4和图4C、D，泳道3)。将浓缩的痤疮丙酸杆菌表面蛋白分级到阴离子交换柱上(图4A)。在该步骤期间，于180mM NaCl的浓度开始，除去大量的蛋白质污染物。含有血纤蛋白原结合活性的级分以于160mM开始的NaCl浓度洗脱(图4A)。该级份含有大比例的Pfg以及很少的不明显的蛋白污染物(图4C和D，泳道4)。通过Sephacryl高分辨率凝胶过滤实现Pfg的最终纯化，期间完全除去所有蛋白质污染物(图4B和C，D，泳道5)。该步骤后获得的纯Pfg的量为0.23mg，比活性为1840U/mg(表4)。

表4：Pfg的纯化

Pfg结合特异性

由于显示了血纤蛋白原识别Pfg，使用此ECM配体来分析此相互作用的性质。首先分析了血纤蛋白原由纯化的Pfg识别的能力(图5)。将人和牛Fg(hFg，bFg)固定到聚苯乙烯板上，并且测量生物素化Pfg的结合活性。显示了Pfg与hFg和bFg的结合是剂量依赖性的，对hFg具有更高的亲和力。对照的牛血清清蛋白用作阴性，显示无结合活性(图5A)。为了确定Pfg识别哪个Fg亚基，电泳分离Fg并进行结合测定法(图5B，C，D)。已经显示了，Pfg识别hFg(图5D，泳道3)和bFg(图5D，泳道4)。此外，似乎Bβ亚基在hFg和bFg两者中受到强烈识别，而Aα亚基仅在hFg中受到识别。没有对γ亚基以及用作对照的血清清蛋白观察到识别(图5D，泳道2)。这些结果与用固定化血纤蛋白原获得的结果一致，并且证明了Pfg对Fg的特异性识别。已经显示了血纤蛋白原是含有N-和O-连接的聚糖两者的糖蛋白(Debeire 1985；ReidTownsend 1982；1996)。为了证明糖蛋白的哪个部分涉及痤疮丙酸杆菌表面蛋白的识别，分别用PNGase F和O-糖苷酶处理纯化的血纤蛋白原，以分别从蛋白主链特异性除去N-和O-连接的聚糖，并测试其被痤疮丙酸杆菌表面蛋白质提取物识别的能力(图6和7)。除去N-连接的聚糖后，血纤蛋白原仍被Pfg强烈识别(图6B，泳道3和5)。平行地，通过电泳分离和考马斯蓝染色后的迁移率变换的显现(图6A，泳道3和5)以及还通过使用能够识别末端位置中的β-连接的半乳糖残基的RCA-I植物凝集素评估了脱糖基化(图6C)(Green，1987)。我们显示脱糖基化的Fg不再被RCA-I凝集素识别(图6C，泳道3和5)。在除去O-连接的聚糖后得到相同的结果(图7B，泳道3)，其中脱糖基化对照显示酶促处理除去所有碳水化合物，如通过迁移率变化(图7A，泳道3)和特异性识别O-连接聚糖上的Galβ(1-3)残基的榴莲凝素植物凝集素(Tachibana 2006)(图7C，泳道3)检测的。这些结果指示血纤蛋白原的蛋白主链参与痤疮丙酸杆菌表面蛋白的识别过程。

Pfg识别的Bβ人血纤蛋白原序列的描述

将人血纤蛋白原的Bβ亚基任意分成4个相等的序列(Fg1、Fg2、Fg3、Fg4)，其通过RT-PCR从人肝细胞中获得。纯化含有EcoRI和XhoI的限制性位点的扩增子，随后克隆到质粒pBSK中以产生Fg插入物，将所述Fg插入物克隆到pGEX-4F-2表达质粒中(图8A)。将重组大肠杆菌克隆进行IPTG诱导，并通过电泳分析总蛋白。在诱导后过表达分别为Fg1和Fg2、Fg3、Fg4的表观分子量37和43kDa的重组蛋白(图8B)。与生物素化Pfg的接触已经显示了仅识别Fg1(图8C)。

血纤蛋白原衍生肽抑制Pfg和血纤蛋白原之间的相互作用

由于已经显示了仅Fg1能够识别Pfg，将生物素化的Pfg用各种浓度的纯化的Fg1预处理并测试其识别固定化血纤蛋白原的能力。使用Fg2和BSA作为阴性对照(图9)。已经显示了Fg1显著降低了Pfg和人血纤蛋白原之间的识别，而Fg2和BSA则不然。

这些结果显示了Pfg和血纤蛋白原之间的相互作用涉及血纤蛋白原的蛋白主链。因此，使用来自人血纤蛋白原的Bβ亚基的重组肽允许抑制Pfg与血纤蛋白原之间的相互作用。

对不同痤疮丙酸杆菌菌株评价Fg1抗粘附效应

通过生物素化标记痤疮丙酸杆菌全细菌，用肽预处理或不然，并且与多种细胞系接触。除去未固定的细菌后，通过使用链霉亲合素-过氧化物酶缀合物和显色底物用分光光度法测量粘附活性。在本发明中使用的5种细胞系中在细胞毒性上测试了Fg1Fg2产物和肽的所有批次。已经显示了Fg1和Fg2对所有细胞系表现出无细胞毒性活性(图10)。

在3种浓度测试痤疮丙酸杆菌菌株6919、RON和PIE粘附到各种细胞系的能力。已经显示了测试的痤疮丙酸杆菌的菌株与测试的三种细胞系(角质形成细胞，单核细胞和成纤维细胞)结合，具有发现角质形成细胞的最大粘附强度(图11)。知道痤疮丙酸杆菌能够识别血纤蛋白原，使用人和牛全血纤蛋白原来竞争细菌和靶细胞之间的相互作用。已经表明，人和牛血纤蛋白原的增加量能够抑制痤疮丙酸杆菌对角质形成细胞的粘附(图12)。然后，在3种主要类型的细胞中评价了抑制细菌和RON PIE粘附的Fg1能力。已显示Fg1肽以剂量依赖的方式抑制RON菌株对角质形成细胞(NHDK)、单核细胞(THP-1)和成纤维细胞(HDF)的粘附。用作阴性对照的平行Fg2肽显示无抗粘附活性(图13)。以6919和PIE痤疮丙酸杆菌菌株获得了相同的结果。

因此，已经证明，痤疮丙酸杆菌菌株能够以对角质形成细胞的较高的亲和力粘附到不同的靶细胞。整个血纤蛋白原能够竞争细菌和角质形成细胞之间的粘附。当使用来自血纤蛋白原的Bβ亚基的Fg1重组肽时，全细菌与靶细胞的粘附显著降低。

评价用痤疮丙酸杆菌刺激的细胞中Fg1的抗炎活性

为了评估Fg1重组肽的功效，测量了由预处理的痤疮丙酸杆菌菌株6919、RON和PIE刺激的HaCaT细胞NHDK、THP-1、MRC5和HDF的O₂°^-和H₂O₂产生。将所产生的ROS的量与用未处理的细菌刺激的细胞产生的量进行比较。通过在未刺激的细胞上测量ROS获得生成基线。在上文引用的所有条件下也测量了IL-1β、IL-8、IL-12和TNF-α的产生。在单层细胞上在存在特定荧光染料的情况下通过荧光分光法直接进行ROS生成的测量。在细胞培养上清液上平行进行细胞因子产生的测定。

实施了两组实验：1)通过先前用范围为0.87至7μM的终浓度的Fg1和Fg2肽于37℃预处理1小时的痤疮丙酸杆菌菌株刺激细胞(37℃18小时)；和2)首先用范围为0.87至7μM的终浓度的Fg1和Fg2肽于37℃预处理细胞24小时，并用痤疮丙酸杆菌菌株刺激(37℃18小时)。

已经显示了当由所有三种痤疮丙酸杆菌菌株刺激时，所有测试的细胞系中，O₂°^-的产生是重要的，这些结果代表对照实验。相比之下，Fg1肽对痤疮丙酸杆菌菌株的预处理对测试的5种细胞系和3种菌株以剂量依赖性方式抑制O₂°^-的产生。在两组实验中对H₂O₂产生获得相同类型的结果(表5)。图14对应于在角质形成细胞HaCaT细胞系上用痤疮丙酸杆菌PIE菌株获得的结果，并且代表了用所有痤疮丙酸杆菌和测试的细胞系获得的结果。

已经显示了IL-1β的产生仅对单核细胞有效。无论使用的痤疮丙酸杆菌的菌株如何，Fg1对IL-1β的产生均无影响(表5)。TNF-α的产生对于单核细胞和成纤维细胞是有效的，而它在角质形成细胞中较为随机。显示了对于3种细菌测试菌株对由单核细胞和成纤维细胞的TNF-α生成减少的Fg1剂量应答效应。对于所测试的所有细菌菌株和细胞系，IL-12的产生非常低或不存在，证明是此模型中的炎症的较差标志物(表5)。当由三种痤疮丙酸杆菌菌株(6919、RON和PEI)刺激时，IL-8的产生对角质形成细胞(HaCaT和原代)和成纤维细胞(MRC5和原代)是重要的。单核细胞不产生IL-8。显示了对3种细菌测试菌株的对角质形成细胞和成纤维细胞中IL-8的产生减少的Fg1剂量响应效应。代表性的结果显示在图15中，并涉及用痤疮丙酸杆菌RON菌株在MRC5细胞系上获得的IL-8的产生。

表5：Fg1抗炎活性评价的结果概述

na：不适用；nt：未测试

对照pos：未刺激的和经痤疮丙酸杆菌刺激的细胞中的炎性分子的产生分别为阴性和阳性。

对照低：未刺激的和经痤疮丙酸杆菌刺激的细胞中的炎性分子的产生分别为阴性和弱。

抑制pos：Fg1以剂量依赖性方式减少炎性分子的产生

抑制NO：Fg1对炎症分子的产生没有影响

I：首先预处理细菌的实验组。II：首先预处理细胞的实验组

评价从Fg1产生的小肽的抗炎活性

将含有106个残基的Fg1氨基酸序列分成3个含有30-36个氨基酸残基的非重叠小序列(小的Fg1相关肽；Fg1.1、Fg1.2和Fg1.3)。为了避免在切割区域中失去推定活性，从此切割位点产生了与2个切割区域重叠的两个序列(Fg1.4和Fg1.5)(图16)。

首先，评估所有小的Fg1相关肽的细胞毒性，并且显示所测试的所有小肽在2.5至20μM范围内对细胞无毒性。图1显示了永生化角质形成细胞HaCaT细胞系获得的结果。在永生化的单核细胞ThP1和成纤维细胞MRC5细胞系上获得了相同的结果。

为了评估小Fg1相关肽的功效，在存在或不存在小肽的情况下测量通过由三种痤疮丙酸杆菌菌株6919、RON和PIE刺激的几种细胞系(HaCaT、NHDK、THP-1、MRC5和HDF)的H₂O₂生成。将所产生的H₂O₂量与由用未处理的细菌刺激的细胞产生的量进行比较。通过在未刺激的细胞上测量H₂O₂获得生成基线。在单层细胞上存在特定荧光染料的情况下通过分光荧光分光光度法直接进行H₂O₂的产生的测量。

已经进行了两个实验组：

I)通过以前在37℃用范围为2.5至20μM的终浓度的Fg1.1、Fg1.2、Fg1.3、Fg1.4和Fg1.5小肽预处理1小时的痤疮丙酸杆菌菌株刺激细胞(37℃18小时)；

II)首先在37℃用范围为2.5至20μM的终浓度的5种小肽将细胞预处理24小时，并通过痤疮丙酸杆菌菌株刺激(37℃18小时)。

已经显示了当所有三种痤疮丙酸杆菌菌株刺激时，在所测试的所有细胞系中，H₂O₂的产生是足够的，这些结果代表对照实验。相比之下，Fg1.1和Fg1.4小肽对痤疮丙酸杆菌菌株的预处理对测试的5种细胞株和3种菌株以剂量依赖性方式抑制H₂O₂的产生，而小肽Fg1.2、Fg1.3和Fg1.5不然。图17对应于在成纤维细胞MRC5细胞系上用痤疮丙酸杆菌RON菌株获得的结果，并且代表测试的所有痤疮丙酸杆菌和细胞系获得的结果(表6)。

表6：小Fg1-产生肽的抗炎活性的评价结果的概述。

nt：未测试

对照pos：未刺激的和经痤疮丙酸杆菌刺激的细胞的H₂O₂生成分别为阴性和阳性。

抑制pos：Fg1.1和Fg1.4以剂量依赖的方式降低H2O2的产生

I：首先预处理细菌的实验组。II：首先预处理细胞的实验组

在缺乏痤疮丙酸杆菌的情况下Fg1片段的抗炎特性

为了更一般地评估Fg1和Fg2片段的抗炎性质，在存在或不存在Fg1或Fg2的情况下测量由LTA(脂磷壁酸、LPS(脂多糖)和PGN(肽聚糖))刺激的若干细胞系(NHDK、THP-1和HDF)的H₂O₂生成。

由LTA刺激的NHDK细胞获得的结果呈现于图18中，并且显示Fg1而非Fg2显著降低由LTA刺激的NHDK细胞的H₂O₂生成。在用LTA、LPS和PGN刺激的原代成纤维细胞(HDF)和单核细胞(ThP1)细胞上获得类似的结果。

还在存在或不存在Fg1或Fg2的情况下在由LTA、LPS和PGN刺激的NHDK细胞中测量IL-8生成。由PGN刺激的NHDK细胞获得的结果呈现于图19中，并且显示Fg1而不是Fg2显著降低由PGN刺激的NHDK细胞产生的IL-8。在LTA和LPS刺激的NHDK细胞上获得了类似的结果。

这些结果显示了Fg1对角质形成细胞也具有抗炎特性，不依赖于痤疮丙酸杆菌的存在。

评价从Fg1.1产生的小肽的抗炎活性

评估小片段Fg1.1.1、Fg1.1.2、Fg1.1.3、Fg1.1.4和Fg1.1.6的抗炎活性。

本发明人首先评估了所有Fg1.1-产生的小肽的细胞毒性，并且显示所测试的所有肽在2.5至20μM范围内对细胞无毒性。图20显示了永生化角质形成细胞HaCaT细胞系上获得的结果。在永生化成纤维细胞MRC5细胞系上获得了类似的结果。

图21显示了使用用于溶解相同浓度的肽的稀释剂(媒介物)进行的相同实验。在下列各种中制备储备溶液：对于Fg1.1.4为PBS，对于Fg1.1.1和Fg1.1.3为60％DMSO/PBS，对于Fg1.1.2为100％DMSO。

这些结果清楚显示了具有高达20个氨基酸，优选高达15个氨基酸的序列的本发明的小片段对角质形成细胞没有毒性效应。

发明人然后评估小片段Fg1.1.1、Fg1.1.2、Fg1.1.3、Fg1.1.4和Fg1.1.6减少痤疮丙酸杆菌刺激后细胞的炎症应答的能力。测量由痤疮丙酸杆菌6919株刺激的细胞系(HaCaT和MRC5)的IL-8生成。将IL-8的量与由用未处理的细菌刺激的细胞产生的量进行比较。通过在未刺激的细胞上测量IL-8获得生成基线。通过ELISA测定法进行IL-8生成的测量。进行由下列各项组成的两组实验：I)首先通过范围为2.5至20μM的终浓度的肽预处理痤疮丙酸杆菌菌株(参见图22)和II)首先由如上文所述的肽预处理细胞，然后用痤疮丙酸杆菌刺激(见图23)。在这种情况下，IL-8分泌水平越低，测试片段的抗炎能力越高。

结果显示了当通过痤疮丙酸杆菌刺激时，所有细胞系中IL-8的生成都是足够的。然而，当用Fg1.1.1肽预处理痤疮丙酸杆菌菌株时，IL-8的产生以剂量依赖性方式降低。虽然用其它小片段观察到IL-8产生的一些抑制，但是效果不如在Fg1.1.1的情况下明显。图22对应于HaCaT细胞上用预处理细菌获得的结果。已经在成纤维细胞MRC5细胞上，以及当首先预处理细胞系时获得了类似的结果(图23)。

体内评价小肽Fg1.1.1的抗炎活性

根据显示Fg1.1.1肽对抗炎应答的体外功效的以前结果，本发明人测试了其在炎症体内模型中抑制由痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应的能力。

该模型基于小鼠耳在皮内注射痤疮丙酸杆菌时起反应的能力。通过测量耳的厚度、发红以及脱屑和/或小脓疱的存在，在痤疮丙酸杆菌注射后4天时段内每天评估炎症反应。在实验结束时，实现了炎症的最终测量，并拍摄了耳的照片。然后，将小鼠实施安乐死，并取出耳以及耳相关的神经节。将耳立即固定在含福尔马林的缓冲液中，以进行未来的组织学分析。将耳相关的神经节置于冰上适当的细胞培养基中，立即进行提取淋巴细胞。对所有淋巴细胞悬浮液进行计数并调整，以在预先用抗CD3(2μg/ml)和抗-CD28(2.5μg/ml)抗体包被的96孔板中每孔获得2.10⁵个细胞。生长72小时后，根据与细胞代谢相关的氧化还原指标(UptiBlue)测量增殖率。

实验设计由各含有8只小鼠的5组组成。1)PBS对应于用PBS注射的未处理组。2)PA+媒介物局部对应于单独用凡士林处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。3)PA+肽局部对应于在用凡士林混合的5％Fg1.1.1肽处理的耳中注射的痤疮丙酸杆菌。4)将痤疮丙酸杆菌株(OD_620nm＝1.5)在37℃用Fg1.1.1肽(140μM)预处理1小时(PA+肽注射组)或5)与单独媒介物(PBS中最终1％DMSO)(PA+媒介物注射组)，然后皮内注射到小鼠的耳(约2.0⁷CFU/20μl)中以诱导炎症。

5％Fg1.1.1肽凝胶的制备由以下组成：在室温(21℃)即时轻轻混合15mg肽与300mg凡士林达1分钟，然后直接施用于小鼠耳。

结果显示了与未处理的耳相比，Fg1.1.1肽能够减少局部应用中(图24，图26#6)以及预处理细菌上(图25，图26#5)的耳炎症。组织学分析揭示了，当应用Fg1.1.1时最少的渗透免疫细胞数目(图27#5和6)，以及淋巴细胞活化水平降低(图28)。

比较了大片段Fg1(106个氨基酸)和小片段Fg1.1.1(15个氨基酸)抑制IL-8分泌的能力，并且呈现于图29中，其显示了对IL-8生成的抑制的标准化百分比，所述IL-8生成来自分别在具有10％SVF的DMEM、具有10％SVF的RPMI、KGM-Gold、FGM培养基中在37℃培养；并且在存在可变浓度的肽Fg1或Fg1.1.1的情况下以5.10⁴至10⁵个细胞/孔接种的永生化角质形成细胞(HaCaT)、成纤维细胞(MRC5)、单核细胞(ThP1)细胞系和原代角质形成细胞(NHDK)、成纤维细胞(HDF)细胞系。

在这种情况下，抑制越高，测试片段的抗炎能力越高。图29还显示，当细胞用具有15个氨基酸的小片段Fg1.1.1比用具有211个氨基酸的大片段Fg1处理时对IL-8生成的抑制百分比更高。

银屑病模型中Fg1.1.1的抗炎特性

银屑病是由引发表皮角质形成细胞的病理生理反应的Th17淋巴细胞浸润介导的慢性炎性疾病。在这种情况下，角质形成细胞是许多细胞因子的靶标，所述细胞因子通过促进炎症反应来促成其生物学特性的调节。此角质形成细胞应答的特征在于它们的分化和迁移能力以及细胞因子、趋化因子和抗微生物肽的分泌的变化，其中IL-8、hBD-2、S100A7、IL-12RA2是良好的标志物。

将永生角质形成细胞HaCaT细胞以10⁵个细胞/孔接种在96孔板中(CorningCostar，Brumath，France)，并用在37℃用浓度为2.5、5和10μM的Fg1和Fg1.1.1肽预处理1小时的痤疮丙酸杆菌6919菌株(O.D._620nm＝0.3)在37℃，5％CO₂下刺激18小时。然后，除去培养物上清液，并通过ELISA测定(eBioscience)测量IL-8浓度。

为了评估Fg1.1.1对银屑病的抗炎活性，我们使用了由再现“银屑病”表型类型的促炎性混合物(IL-17+OSM+TNF-α的组合)刺激的正常人表皮角质形成细胞(NHEK)的体外模型。因此，我们评估了Fg1.1.1抑制由在此条件下刺激的角质形成细胞的Il-8和β-防御素-2蛋白(hBD-2)释放的能力。

Fg1.1.1对Il-8生成的活性(图30)：

图30显示，在基础条件下，正常人表皮角质形成细胞(NHEK)释放少量的Il-8(单独细胞)。此释放通过用3种细胞因子的组合的处理(刺激细胞)大大增加。参照Jak抑制剂I(阳性对照)强烈地抑制这种关联的刺激作用(67％抑制)。

在本研究的实验条件下，在6.1和12.2μM下测试的Fg1.1.1以浓度依赖性效应显著抑制NHEK的Il-8释放(25％和49％抑制)。在较低浓度(1.25和3.05μM)下，观察到较小的作用。

Fg1.1.1对hBD-2生成的活性(图31)：

图31显示，在基础条件下，正常人表皮角质形成细胞释放出非常少量的β-防御素-2蛋白(hBD-2)(单独细胞)。通过用Il-17、TNF-α和OSM的组合(刺激细胞)的处理，该释放大大增加。参照Jak抑制剂I(阳性对照)强烈抑制了这种关联的刺激作用(80％抑制)。

在本研究的实验条件下，以12.2μM测试的Fg1.1.1显著抑制NHEK的hBD-2释放。此外，Fg1.1.1在所有测试浓度下对细胞活力无影响。

当使用银屑病的体外模型时，我们已经显示Fg1.1.1肽能够以剂量依赖的方式抑制IL-8和hBD-2分子的产生而没有任何细胞毒性。此外，在所测试的浓度范围内，对IL-8趋化因子生成的抑制比hBD-2抗微生物肽生成更强，这提示了较高的剂量将消除抗炎分子生成。因此，Fg1.1.1肽是减少银屑病样炎症的良好候选物。

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序列表

<110> 巴黎笛卡尔大学(UNIVERSITE PARIS DESCARTES)

巴黎公共援助医院(ASSISTANCE PUBLIQUE - HOPITAUX DE PARIS)

巴黎第十一大学(UNIVERSITE PARIS-SUD)

皮埃尔和玛丽•居里大学(巴黎第六大学)(UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE(PARIS 6))

法国国家健康和医疗研究所 (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LARECHERCHE MEDICALE (INSERM))

法国国家科学研究中心(CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS))

古斯塔夫-鲁西研究所(INSTITUT GUSTAVE-ROUSSY)

<120> 特别在皮肤炎性疾病中用作药物的来自血纤蛋白原的分离的肽及其片段

<130> D34732

<140> PCT/EP2016/056179

<141> 2016-03-21

<150> EP 15305414.3

<151> 2015-03-20

<160> 47

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 491

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<223> 血纤蛋白原的亚基Bβ

<400> 1

Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly

20 25 30

Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro

35 40 45

Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala

65 70 75 80

Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu

85 90 95

His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys Pro Thr Gly Cys Gln Leu

100 105 110

Gln Glu Ala Leu Leu Gln Gln Glu Arg Pro Ile Arg Asn Ser Val Asp

115 120 125

Glu Leu Asn Asn Asn Val Glu Ala Val Ser Gln Thr Ser Ser Ser Ser

130 135 140

Phe Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Lys Asp Leu Trp Gln Lys Arg Gln Lys

145 150 155 160

Gln Val Lys Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr Ser Ser Glu Leu

165 170 175

Glu Lys His Gln Leu Tyr Ile Asp Glu Thr Val Asn Ser Asn Ile Pro

180 185 190

Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser Ile Leu Glu Asn Leu Arg Ser Lys

195 200 205

Ile Gln Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala Gln Met Glu Tyr Cys Arg

210 215 220

Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro Val Val Ser Gly Lys Glu

225 230 235 240

Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys Gly Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu

245 250 255

Ile Gln Pro Asp Ser Ser Val Lys Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met

260 265 270

Asn Thr Glu Asn Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Asn Arg Gln Asp Gly

275 280 285

Ser Val Asp Phe Gly Arg Lys Trp Asp Pro Tyr Lys Gln Gly Phe Gly

290 295 300

Asn Val Ala Thr Asn Thr Asp Gly Lys Asn Tyr Cys Gly Leu Pro Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Asp Lys Ile Ser Gln Leu Thr Arg Met Gly

325 330 335

Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val

340 345 350

Lys Ala His Tyr Gly Gly Phe Thr Val Gln Asn Glu Ala Asn Lys Tyr

355 360 365

Gln Ile Ser Val Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met

370 375 380

Asp Gly Ala Ser Gln Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His

385 390 395 400

Asn Gly Met Phe Phe Ser Thr Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp Leu

405 410 415

Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gln Cys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp

420 425 430

Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp

435 440 445

Gly Gly Gln Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly

450 455 460

Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met

465 470 475 480

Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gln Gln

485 490

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1

<400> 2

Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly

20 25 30

Val Asn Asp

35

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.2

<400> 3

Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Gly

35

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.3

<400> 4

Tyr Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr Gln Lys Lys Val Glu

1 5 10 15

Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu His Ala Asp Pro Asp Leu

20 25 30

Gly Val Leu Cys

35

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.4

<400> 5

Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly Val Asn Asp Asn

1 5 10 15

Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.5

<400> 6

Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr

1 5 10 15

Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr Gln Lys Lys Val

20 25 30

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.1

<400> 7

Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly Val Asn Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.2

<400> 8

Leu Leu Leu Cys Val

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.3

<400> 9

Phe Leu Val Lys Ser

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.4

<400> 10

Gln Gly Val Asn Asp

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.5

<400> 11

Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1.1.6

<400> 12

Lys Ser Gln Gly Val Asn Asp

1 5

<210> 13

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1

<400> 13

Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly

20 25 30

Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro

35 40 45

Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Pro Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr

65 70 75 80

Gln Lys Lys Val Glu Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu His

85 90 95

Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys Met Lys Arg Met Val Ser Trp

100 105 110

Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys His Leu Leu Leu Leu Leu Leu

115 120 125

Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly

130 135 140

Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu

145 150 155 160

Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr

165 170 175

Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg

180 185 190

Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu His Ala Asp Pro Asp Leu Gly

195 200 205

Val Leu Cys

210

<210> 14

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg2

<400> 14

Asp Ala Gly Gly Cys Leu His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys

1 5 10 15

Pro Thr Gly Cys Gln Leu Gln Glu Ala Leu Leu Gln Gln Glu Arg Pro

20 25 30

Ile Arg Asn Ser Val Asp Glu Leu Asn Asn Asn Val Glu Ala Val Ser

35 40 45

Gln Thr Ser Ser Ser Ser Phe Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Lys Asp Leu

50 55 60

Trp Gln Lys Arg Gln Lys Gln Val Lys Asp Asn Glu Asn Val Val Asn

65 70 75 80

Glu Tyr Ser Ser Glu Leu Glu Lys His Gln Leu Tyr Ile Asp Glu Thr

85 90 95

Val Asn Ser Asn Ile Pro Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser Ile Leu

100 105 110

Glu Asn Leu Arg Ser Lys Ile Gln Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala

115 120 125

Gln Met Glu Tyr Cys Arg Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro

130 135 140

Val Val Ser

145

<210> 15

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg3

<400> 15

Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala Gln Met Glu Tyr Cys Arg Thr Pro

1 5 10 15

Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro Val Val Ser Gly Lys Glu Cys Glu

20 25 30

Glu Ile Ile Arg Lys Gly Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu Ile Gln

35 40 45

Pro Asp Ser Ser Val Lys Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met Asn Thr

50 55 60

Glu Asn Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Asn Arg Gln Asp Gly Ser Val

65 70 75 80

Asp Phe Gly Arg Lys Trp Asp Pro Tyr Lys Gln Gly Phe Gly Asn Val

85 90 95

Ala Thr Asn Thr Asp Gly Lys Asn Tyr Cys Gly Leu Pro Gly Glu Tyr

100 105 110

Trp Leu Gly Asn Asp Lys Ile Ser Gln Leu Thr Arg Met Gly Pro Thr

115 120 125

Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val Lys Ala

130 135 140

His Tyr Gly Gly Phe Thr Val Gln Asn Glu

145 150

<210> 16

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg4

<400> 16

Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val

1 5 10 15

Lys Ala His Tyr Gly Gly Phe Thr Val Gln Asn Glu Ala Asn Lys Tyr

20 25 30

Gln Ile Ser Val Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met

35 40 45

Asp Gly Ala Ser Gln Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His

50 55 60

Asn Gly Met Phe Phe Ser Thr Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp Leu

65 70 75 80

Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gln Cys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp

85 90 95

Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gly Gln Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly

115 120 125

Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met

130 135 140

Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gln

145 150

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 17

gcaggaattc tgatgaaaag gatggtttct tgg 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

ggccgctcga gtacacaaca cccccaggtc tgg 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

gcaggaattc tggatgctgg aggctgtctt cac 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 20

ggccgctcga ctagacacca caggaatatt gca 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcaggaattc tgaagttaga atctgatgtc tca 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 22

ggccgctcga gtttcattct gtacagtgaa tcc 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 23

gcaggaattc tgcccacaga acttttgata gaa 33

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 24

ggccgctcga gtctgtggga agaagggcct gat 33

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 25

Ala Gly Ile Asp Lys

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 26

Ala Ala Ile Ala Gly Ala Leu Val Lys

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 27

Thr Ala Glu Gln Leu Glu Lys

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 28

Ile Val Thr His Leu Val Arg

1 5

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 29

Ala Ala Ala Ala Val Asp Leu Gly Ile Lys

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 30

Ser Leu Ala Val Gln Ile Ala Pro Arg

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 31

Ala Ala Ile Glu His Ile Ile Gly Arg

1 5

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 32

Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asn Thr Ala Lys

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 33

Gln Ile Val Asp Val Ile Thr Ala Asp Lys

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 34

Gln Ile Val Asp Val Ile Thr Ala Asp Lys

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 35

Lys Ala Ala Ile Glu His Ile Ile Gly Arg

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 36

Glu Leu Pro Ala Leu Asp Asp Leu Val Lys

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 37

Glu Gly Val Leu Leu Ile Asn His His Lys

1 5 10

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 38

Ala Glu Ile Ala Ala Gln Ala Ala Leu Leu Val Gly Arg

1 5 10

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 39

Ala Gly Phe Ser Ser Ala Asp Ala Val Ala Leu Ala Pro Arg

1 5 10

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 40

Asp Ala Val Val Ala Asn Leu Val Ala Ala Gly Val Asp Lys

1 5 10

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 41

Asp Ala Val Val Ala Asn Leu Val Ala Ala Gly Val Asp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 42

Ala Gly Phe Ser Ser Ala Asp Ala Val Ala Leu Ala Pro Arg Ile Ala

1 5 10 15

Lys

<210> 43

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 43

Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ile Ile Pro Asn Ala Leu His Ser Ala Ala

1 5 10 15

Phe Lys

<210> 44

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 44

Ala Thr Ala Val Ala Ile Ala Ala Thr Ala Leu Asn Pro Ala Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ala Lys

20

<210> 45

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 45

Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Thr Ala Ile Val Ser Ser Pro Ile Leu

1 5 10 15

Asn Ala Arg

<210> 46

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 痤疮丙酸杆菌(P.acnes) Pfg蛋白的片段

<400> 46

Ser Gly Gly His Ser Gln Gly Gly Ser Gly Thr His Tyr Ile His His

1 5 10 15

Gly Val Ala Pro Val Leu Thr His Ser Ser Asp Leu Pro Ser Thr Gly

20 25 30

Phe

<210> 47

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 片段Fg1

<400> 47

Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly

20 25 30

Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro

35 40 45

Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala

65 70 75 80

Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu

85 90 95

His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys

100 105

Claims

1.一种用作药物的分离的多肽或其片段，所述分离的多肽包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述片段包含在最佳全局比对后与SEQID NO:2、5和7至13和47中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的用于根据权利要求1的用途的分离的多肽，其中所述多肽选自SEQID NO:2、5和7至13和47或在最佳全局比对后与SEQ ID NO:2、5和7至13和47之一具有至少80％同一性的多肽。

3.根据权利要求1或2的用于根据权利要求1或2的用途的分离的多肽或其片段，其用于治疗和/或预防皮肤炎性疾病。

4.根据权利要求1至3中任一项的用于根据权利要求3的用途的分离的多肽或其片段，其中所述皮肤炎性疾病是痤疮。

5.根据权利要求1至4中任一项的用于根据权利要求1至4中任一项的用途的分离的多肽或其片段，其能够抑制牵涉对宿主细胞的细菌粘附的至少一种微生物蛋白质与血纤蛋白原的相互作用，其中所述细菌优选是痤疮丙酸杆菌，并且血纤蛋白原优选是人血纤蛋白原。

6.根据权利要求1至4中任一项的用于根据权利要求1至4中任一项的用途的分离的多肽或其片段，其中所述皮肤炎性疾病是银屑病。

7.一种多肽的片段，所述多肽包含在最佳全局比对后与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述片段包含在最佳全局比对后与选自SEQ ID NO:2、5和7至13和47之一的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

8.权利要求7的片段，其具有不超过150个氨基酸。

9.权利要求7或权利要求8的片段，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、5和7至13和47。

10.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求7至9中任一项的片段。

11.一种载体，其包含根据权利要求10的核酸分子。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10的核酸分子或根据权利要求11的载体。

13.一种药物组合物，其包含药学可接受媒介物和选自以下的至少一种化合物：权利要求7至9中任一项的片段、根据权利要求10的分离的核酸分子、根据权利要求11的载体、根据权利要求12的宿主细胞。

14.根据权利要求10的分离的核酸分子、根据权利要求11的载体、根据权利要求12的宿主细胞或根据权利要求13的药物组合物，其用作药物。

15.根据权利要求10的分离的核酸分子、根据权利要求11的载体、根据权利要求12的宿主细胞或根据权利要求13的药物组合物，其用于治疗和/或预防皮肤炎性疾病，所述皮肤炎性疾病选自银屑病和/或痤疮，优选痤疮。

16.一种组合产品，其包含：

-选自以下的至少一种化合物：权利要求7至9中任一项的片段、根据权利要求10的分离的核酸分子、根据权利要求11的载体、根据权利要求12的宿主细胞；和

-另一种药剂，优选用于治疗和/或预防皮肤炎性疾病，所述皮肤炎性疾病选自银屑病和/或痤疮，优选痤疮；

其用于作为药物同时、分开或序贯使用。