[go: up one dir, main page]

CN107635550B - 改良的含二硫化物的炔烃交联剂 - Google Patents

改良的含二硫化物的炔烃交联剂 Download PDF

Info

Publication number
CN107635550B
CN107635550B CN201680016228.7A CN201680016228A CN107635550B CN 107635550 B CN107635550 B CN 107635550B CN 201680016228 A CN201680016228 A CN 201680016228A CN 107635550 B CN107635550 B CN 107635550B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogen
alkyl
methyl
rnai
disulfide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680016228.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107635550A (zh
Inventor
A·埃尔米达
A·V·布罗金
D·H·维基菲尔德
J·D·本森
D·B·罗泽玛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arrowhead Pharmaceuticals Inc filed Critical Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Publication of CN107635550A publication Critical patent/CN107635550A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107635550B publication Critical patent/CN107635550B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

本发明描述具有支化的二硫化物的改良的含二硫化物的炔连接试剂。所述改良的连接试剂表现出改善的稳定性。所述连接试剂在寡核苷酸连接于靶向基团或递送试剂中是有用的。

Description

改良的含二硫化物的炔烃交联剂
技术背景
在生物医学研究、诊断和治疗中，对合成的寡核苷酸，例如反义分子、寡核苷酸适配子、核糖酶和RNA干扰(RNAi)分子的使用在逐步增加。这些合成的寡核苷酸已在体外、原位、和体内以序列依赖的方式被用于抑制或敲除基因的表达。
将靶向配体或其他药学上的改性剂附着或连接于合成的寡核苷酸常常是有用的，特别是对于体内递送的治疗。为了变得有用，连接化学物应当是模块化的，以使其易适用于不同的合成寡核苷酸，以及不同的靶向配体和药学上的改性剂。此外，连接化学物应具有简单的反应条件，高效(即给出高化学产率)，不需要有毒的或其他有害的产物，并且不产生有毒的或其他有害的副产物。连接化学物还应当在靶向细胞的外部稳定，例如在循环中、在皮下空间或细胞外空间，但是例如在靶向细胞的内部，在作用的最终位点易分裂。
这样的将合成寡核苷酸连接到靶向配体或其他药学上的改性剂中有用的反应的一个例子是环炔烃和叠氮化物的环加成，其为所谓的“点击反应”或“点击化学”的反应的一种。在点击反应中，两个单独的分子实体，一个带有叠氮化物，一个带有张力的环炔烃，将会通过所谓的张力引发的叠氮-炔基环加成(SPAAC)的反应自发地结合成单个的分子。上述反应本质上温和、快速和高产率，并且大约生理学的pH下，在水中且在生物大分子的官能团的附近发生。该反应已成为用于生物正交标记和生物分子(例如蛋白质、脂质、多糖类等)、蛋白质组学和材料科学的成像的通用工具。上述环加成反应在不存在催化剂下自发地进行。无金属的环加成也记为“无金属点击反应”。SPAAC对于生物正交标记的作用力在于孤立的环炔烃或叠氮对于生物官能团，例如胺类、硫醇类、酸类或羰基类完全惰性，但是在结合时经历快速和不可逆转的环加成，产生稳定的三唑偶联物。例如，叠氮基改性的蛋白质通过营养缺陷型细菌中的表达、基因工程或化学转化而获得，且能用生物素、荧光团、PEG链或其他官能团，基于简单地搅拌叠氮基蛋白质和环炔烃偶联物进行清晰的标记。还有，叠氮化物的小尺寸已证明对于将SPAAC以化学报导策略的方式应用于特异生物分子的成像是非常有用的。
我们已发现目前可获得的炔烃二硫化物，例如二苯并环辛炔(DBCO)-S-S-NHS，
Figure BDA0001409379800000021
在化合物的改性过程中提供不足够的稳定性，导致差的合成产率和存在不需要的杂质。本文现在描述的改良的炔烃二硫化物具有改良的稳定性并导致改良的产率和纯度。
发明内容
此处描述的是具有下式代表的结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure BDA0001409379800000022
其中，R1和/或R2是烷基，L1和L2是连接体，X是环辛炔，Y包括反应性基体、合成的寡核苷酸、或RNAi试剂。在一些实施方式中，R1是烷基，且R2是氢。在一些实施方式中，R2是烷基，且R1是氢。在一些实施方式中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
此处描述的是具有下式代表的结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure BDA0001409379800000023
其中，R1、R1'、R2和/或R2'是烷基，X包括环辛炔，Y包括反应性基团或合成的寡核苷酸。在一些实施方式中，R1和R1'是烷基，R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2和R2'是烷基，R1和R1'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'、R2和R2'是烷基。在一些实施方式中，R1是烷基，且R1'、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R1'是烷基，且R1、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2是烷基，R1、R1'和R2'是氢。在一些实施方式中，R2'是烷基，R1、R1'和R2是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2是烷基，且R2'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2'是烷基，且R2是氢。在一些实施方式中，R1、R2和R2是烷基，且R1'是氢。在一些实施方式中，R1'、R2和R2'是烷基，且R1是氢。在一些实施方式中，所述烷基是甲基。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
此处描述的是具有下式代表的结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure BDA0001409379800000031
其中，R3是C(R5R6)，其中R5是氢、甲基或乙基，且R6是氢、甲基或乙基；R4是C(R7R8)，其中R7是氢、甲基或乙基，且R8是氢、甲基或乙基；R5、R6、R7和R8中的至少一个是甲基或乙基，L1是第一连接体，L2是第二连接体，Y包括反应性基团、合成的寡核苷酸或RNAi试剂。在一些实施方式中，R5或R6是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R7或R8是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R5是CH3，且R6、R7和R8分别为氢。在一些实施方式中，R7是CH3，且R5、R6和R8分别为氢。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
此处描述的是具有下式代表的结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure BDA0001409379800000032
其中，R3是C(R5R6)，其中R5是氢、甲基或乙基，且R6是氢、甲基或乙基；R4是C(R7R8)，其中R7是氢、甲基或乙基，且R8是氢、甲基或乙基；R5、R6、R7和R8中的至少一个是甲基或乙基，L1是连接体，Y包括反应性基团、合成的寡核苷酸或RNAi试剂。在一些实施方式中，R5或R6是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R7或R8是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R5是CH3，且R6、R7和R8分别为氢。在一些实施方式中，R7是CH3，且R5、R6和R8分别为氢。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
此处描述的是具有下式代表的结构的化合物：
Figure BDA0001409379800000041
其中，R是反应性基团、NHS反应性基团、合成的寡核苷酸、或RNAi试剂。
此处描述的是具有下式代表的结构的化合物：
Figure BDA0001409379800000051
Figure BDA0001409379800000061
其中，R包括反应性基团、NHS反应性基团、合成的寡核苷酸、或RNAi试剂。
附图说明
图1是说明DBCO-烷烃-SS-NHS的合成的反应方案。
图2是说明DBCO-甲基-SMPT-NHS的合成的反应方案。
图3是显示DBCO-甲基-SMPT-NHS的ESI质谱分析的图。
图4是显示DBCO-甲基-SMPT-NHS的H1NMR的图。
图5是某些环辛炔-烷基-S-S化合物的实施方案，R包括反应性基团、NHS反应性基团、合成的寡核苷酸、或RNAi试剂，n和m是0至10的整数。
图6是某些环辛炔-烷基-S-S化合物的实施方案，R包括反应性基团、NHS反应性基团、合成的寡核苷酸、或RNAi试剂。
图7是用非支化的DBCO二硫化物改性剂(DBCO-二硫化物-NHS酯)制备的RNAi试剂正义链偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
图8是用DBCO-NHS酯制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
图9是用DBCO-烷烃(甲基)-二硫化物改性剂制备的RNAi试剂正义链偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
图10是用支化的DBCO-烷烃(二甲基)-二硫化物改性剂制备的RNAi试剂正义链偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
图11是用DBCO-二硫化物-甲基-SMPT制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
图12是某些环辛炔-烷基-S-S-寡核苷酸化合物的实施方案，R包括寡核苷酸或RNAi试剂。所示出的磷酸基团可以是合成的寡核苷酸或RNAi试剂的一部分。
详述
在此揭示包含环辛炔和支化的二硫化物的新型化合物，它们的合成和它们的使用方法。此处揭示的改良的化合物相对于前述的包含环辛炔的组合物表现出改良的稳定性。
此处揭示的是环辛炔-烷基-二硫化物改性的寡核苷酸、它们的合成和它们的使用方法。上述环辛炔-烷基-二硫化物改性的寡核苷酸容易附着于感兴趣的化合物，例如靶向配体、脂质、胆固醇、递送试剂(例如内体裂解聚合物)、或药学上的改性剂。所述环辛炔-烷基-二硫化物改性的寡核苷酸更容易被合成为具有改良的产率，且具有比相应的环辛炔-二硫化物改性的寡核苷酸更少的杂质。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000071
(式I)
其中，
R1是烷基且R2是氢，或者R1是氢且R2是烷基，或者R1和R2是烷基。
X包括环辛炔，
Y包括反应性基团、或合成的寡核苷酸。
X和Y可通过连接体相连。在一些实施方式中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方式中，上述烷基是甲基。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000072
(式Ia)
其中，
R1、R1'、R2和R2'中的一个或多个是烷基，
X包括环辛炔，
Y包括反应性基团、或合成的寡核苷酸。
X和Y可通过连接体相连。在一些实施方式中，上述烷基独立地为甲基或乙基。在一些实施方式中，上述烷基是甲基。在一些实施方式中，R1和R1'是烷基，R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2和R2'是烷基，R1和R1'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'、R2和R2'是烷基。在一些实施方式中，R1是烷基，且R1'、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R1'是烷基，R1、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2是烷基，R1、R1'和R2'是氢。在一些实施方式中，R2'是烷基，R1、R1'和R2是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2是烷基，且R2'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2'是烷基，且R2是氢。在一些实施方式中，R1、R2和R2是烷基，且R1'是氢。在一些实施方式中，R1'、R2和R2'是烷基，且R1是氢。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000081
(式II)
其中，
R1是烷基且R2是氢，或者R1是氢且R2是烷基，或者R1和R2是烷基，
L1和L2是连接体，
X包括环辛炔，以及
Y包括反应性基团、或合成的寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述烷基是甲基或乙基。在一些实施方式中，所述烷基是甲基。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000082
(式Ila)
其中，
R1、R1'、R2和R2'中的一个或多个是烷基，
L1是第一连接体，
L2是第二连接体，
X包括环辛炔，以及
Y包括反应性基团或合成的寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述烷基独立地为甲基或乙基。在一些实施方式中，所述烷基是甲基。在一些实施方式中，R1和R1'是烷基，R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2和R2'是烷基，R1和R1'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'、R2和R2'是烷基。在一些实施方式中，R1是烷基，且R1'、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R1'是烷基，R1、R2和R2'是氢。在一些实施方式中，R2是烷基，R1、R1'和R2'是氢。在一些实施方式中，R2'是烷基，R1、R1'和R2是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2是烷基，且R2'是氢。在一些实施方式中，R1、R1'和R2'是烷基，且R2是氢。在一些实施方式中，R1、R2和R2是烷基，且R1'是氢。在一些实施方式中，R1'、R2和R2'是烷基，且R1是氢。在一些实施方式中，Y包括RNAi试剂。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000091
(式III)
其中，
R3是C(R5R6)，其中R5是氢、甲基或乙基，且R6是氢、甲基或乙基，
R4是C(R7R8)，其中R7是氢、甲基或乙基，且R8是氢、甲基或乙基，
R5、R6、R7和R8中的至少一个是甲基或乙基，
L1是第一连接体，
L2是第二连接体，以及
Y包括反应性基团、或合成的寡核苷酸。
在一些实施方式中，R5或R6是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R5是甲基或乙基，且R6、R7和R8是氢。在一些实施方式中，R6是甲基或乙基，且R5、R7和R8是氢。在一些实施方式中，R5和R6独立地是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R7或R8是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R7是甲基或乙基，且R8、R5和R6是氢。在一些实施方式中，R8是甲基或乙基，且R7、R5和R6是氢。在一些实施方式中，R7和R8独立地是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R5是CH3，且R6、R7和R8分别为氢。在一些实施方式中，R7是CH3，且R5、R6和R8分别为氢。在一些实施方式中，上述合成的寡核苷酸是RNAi试剂。
在一些实施方式中，环辛炔-烷基二硫化物化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000101
(式IIIa)
其中，
R3是C(R5R6)，其中R5是氢、甲基或乙基，且R6是氢、甲基或乙基，
R4是C(R7R8)，其中R7是氢、甲基或乙基，且R8是氢、甲基或乙基，
R5、R6、R7和R8中的至少一个是甲基或乙基，
L1是连接体，以及
Y包括反应性基团、或合成的寡核苷酸。
在一些实施方式中，R5或R6是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R5是甲基或乙基，且R6、R7和R8是氢。在一些实施方式中，R6是甲基或乙基，且R5、R7和R8是氢。在一些实施方式中，R5和R6独立地是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。在一些实施方式中，R7或R8是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R7是甲基或乙基，且R8、R5和R6是氢。在一些实施方式中，R8是甲基或乙基，且R7、R5和R6是氢。在一些实施方式中，R7和R8独立地是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。在一些实施方式中，R5是CH3，且R6、R7和R8分别为氢。在一些实施方式中，R7是CH3，且R5、R6和R8分别为氢。在一些实施方式中，上述合成的寡核苷酸是RNAi试剂。
在一些实施方式中，上述环辛炔-烷基二硫化物-胺反应性基团化合物具有下式代表的结构：
Figure BDA0001409379800000111
其中，R包括选自下组的反应性基团：活化的酯、NHS、TFP、PFP、四嗪、降冰片烯、反式-环辛烯、肼(例如联肼尼克酰胺)、氨氧基试剂、和醛类(例如4-甲酰基苯甲酸)。
在一些实施方式中，所述环辛炔-烷基-S-S-胺反应性基团化合物具有图5-6中示出的结构。
在一些实施方式中，所述环辛炔-烷基-S-S-胺反应性基团化合物具有下式结构：
Figure BDA0001409379800000112
(式VII)，或
Figure BDA0001409379800000113
(式VIII)，
其中，RNA包括RNAi试剂。
在一些实施方式中，所述的环辛炔-烷基-S-S-合成的寡核苷酸化合物被用于将寡核苷酸连接至含叠氮的化合物上。在一些实施方式中，含叠氮的化合物选自下组：靶向配体、脂质、胆固醇、或递送试剂，例如内体裂解聚合物、多胺、改性多胺，或者药学上的改性剂。
在一些实施方式中，所述的环辛炔-烷基-S-S-寡核苷酸与聚合物偶联，其中所述聚合物包含叠氮基。在一些实施方式中，所述聚合物是促进寡核苷酸在体内递送的聚合物。在一些实施方式中，所述寡核苷酸包括RNAi试剂。
此处揭示将合成的寡核苷酸例如RNAi试剂共价地连接于药学上的改性剂或递送聚合物的方法，其中，上述合成的寡核苷酸偶联至所述的环辛炔-烷基-二硫化物-氨基反应性基团化合物，以形成环辛炔-烷基-S-S-合成的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述的环辛炔-烷基-S-S-合成的寡核苷酸进一步与药学上的改性剂或递送聚合物反应，其中所述药学上的改性剂或递送聚合物包含至少一个叠氮基。
所述的化合物和方法可被用于形成含RNAi试剂的组合物，该组合物可用作治疗剂、诊断剂、或用于分子生物学研究。
如本文所用，环辛炔是无铜的炔烃偶联试剂。环辛炔包括但不限于：二芳基环辛炔、DBCO(也记为氮杂二苯并环辛炔(DIBAC或ADIBO))、部分融合于芳基的环辛炔(苯并环组成的体系)，
Figure BDA0001409379800000131
如本文所用的术语“连接体”是指将化合物的两部分连接的有机部分。连接体通常包括直接键合，或原子例如氧或硫，或单元例如NRL(其中RL是氢、酰基、脂肪族或被取代的脂肪族)、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH，或者原子链，例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，它们的一个或多个亚甲基可以被下列基团中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RL)(其中RL是氢、芳基、脂肪族或取代的脂肪族)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基；-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)x-、-C(O)-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)m-、-C(O)-(CH2)n-C(O)-(CH2)m-、-C(O)-(CH2)n-NH-C(O)-(CH2)m-、-C(O)-(CH2)n-O-(CH2-CH2-O)m-(CH2)x-、-(O-CH2-CH2)n-、-O-(CH2-CH2-O)n-、-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-、-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-、-(CH2-CH2-O)n-、-(CH2-CH2-O)n-CH2-，
Figure BDA0001409379800000141
反应性基团是现有技术中通常可获得的那些，包括但不限于活化的酯、NHS、TFP、PFP、四嗪、降冰片烯、反式-环辛烯、肼(例如联肼尼克酰胺)、氨氧基试剂、和醛类(例如4-甲酰基苯甲酸)。
靶向配体(也称为靶向基团)用于将化合物靶向或递送至靶细胞或组织，或特异性细胞类型。靶向配体增强分子和靶细胞的连接。因此，靶向配体可增强其结合的偶联物的药代动力学或生物分布性质，以改善所述偶联物的细胞分布和细胞摄取。靶向基团与细胞或细胞受体的结合可引发内吞。靶向基团可以是单价、二价、三价、四价或更高的价位。靶向基团可以是，但并不限于对细胞表面分子、细胞受体配体、抗体、单克隆抗体、抗体片段有亲和性的化合物，以及对细胞表面分子、疏水性基团、胆固醇、胆甾醇基团或类固醇有亲和性的抗体模拟物。在一些实施方式中，靶向基团包括细胞受体配体。已使用多种靶向基团来将靶药物和基因靶向至细胞和特异性细胞受体。细胞受体配体可以是但不限于：碳水化合物、聚糖、糖类(包括但不限于半乳糖、半乳糖衍生物(例如N-乙酰基-半乳糖胺)、甘露糖、和甘露糖衍生物)、半抗原、维生素、叶酸盐、生物素、适体、和肽(包括但不限于：含RGD的肽、RGD模拟物、胰岛素、EGF、和转铁蛋白)。
如本文所用，位阻稳定剂是非离子亲水性聚合物(天然、合成或非天然)，相比不含位阻稳定剂的分子，其阻止或抑制结合其的分子的分子内或分子间相互作用。位阻稳定剂阻碍与其结合的分子参与静电相互作用。静电相互作用是两种或更多物质之间由于正电荷和负电荷之间的吸引力产生的非共价结合。位阻稳定剂能抑制与血液组分的相互作用，以及因而的调理作用、噬菌作用以及被网状内皮系统摄入。位阻稳定剂因此能增加其附着的分子的循环时间。位阻稳定剂还能抑制分子的聚集。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。适合于本发明的PEG分子具有约1-120个乙二醇单体。
如本文所用，“药物组合物”包含药理学上有效量的至少一种RNAi试剂和一个或多个药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)是除活性药物组分(PAI，治疗产品，例如RNAi试剂)以外的物质，其已经适当地进行了安全性评价，且有意地包含于药物递送系统。赋形剂以预期的剂量不促进或不意图促进治疗效果。赋形剂可起到以下作用：a)在制造中在药物递送系统的加工中起辅助作用；b)保护、支持或提高API的稳定性、生物利用率或患者接受度；c)在产品的鉴定中起协助作用；和/或d)在储藏或使用中提高API的递送的整体安全性、有效性中的任何其他特性。
赋形剂包括但不限于：吸收促进剂、防粘剂、防泡剂、抗氧化剂、粘合剂、粘合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、色素、递送促进剂、葡糖聚糖、葡萄糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、膨胀剂、填料、香味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、等张剂、媒介物(vehicles)、防水剂、和润湿剂。药学上可接受的赋形剂可以是或不是惰性物质。
药物组合物可包含其他另外的在药物组合物中通常使用的成分。上述药学活性材料可包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、或抗炎剂(例如抗组胺药、苯海拉明等)。也考虑到表达或包括本文定义的RNAi试剂的细胞、组织或分离的器官可以被用作“药物组合物”。如本文所述，“药学上有效量”、“治疗上有效量”或简单的“有效量”是指有效产生预期的药学、治疗或预防性结果的RNAi试剂的量。
如本文所用，药学上的改性剂是在储藏或使用过程中保护、支持或提高API的稳定性、生物活性、递送、有效性或患者接受度的化合物。
如本文所用，递送聚合物是提高API在体内的生物活性或递送的聚合物。递送聚合物的例子包括但不限于：两亲性膜活性聚胺、和可逆改性的两亲性膜活性聚胺。
如本文所用，膜活性聚胺是具有表面活性、两亲性的聚胺，其能在生物膜上诱导一种或多种下述影响：膜的变化或破坏使膜不透性分子进入细胞或穿过膜，在膜上形成孔，膜分裂，或使所述膜破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包括脂质双层。膜的变化或破坏可通过至少一个下述试验中的聚胺活性来进行功能性定义：红血细胞裂解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞裂解、和内体释放。认为优先在质膜上引起内体(endosome)或溶酶体的破坏的聚胺是内体裂解聚合物。膜活性聚胺对细胞膜的影响可以是短暂的。膜活性聚胺具有对膜的亲和性，并引起双层结构的变性或变形。将RNAi试剂递送到细胞中由膜活性聚胺介导，其破坏或使质膜或内囊泡膜(如内体或溶酶体)不稳定，包括通过在膜上形成孔、或破坏内体或溶酶体囊泡，从而允许所述囊泡的内含物释放到细胞胞质中。在一些实施方式中，膜活性聚胺包括蜂毒素或类蜂毒素肽(MLP)。
术语多核苷酸或多聚核酸是本领域术语，指含有至少两种核苷酸的聚合物。核苷酸是多核苷酸聚合物的单体单元。具有少于120个单体单元的多核苷酸常称为寡核苷酸。天然核酸具有去氧核醣-或核糖-磷酸盐主链。非天然或合成的多核苷酸是体外或在无细胞系统中聚合的多核苷酸且含有相同或相似的碱基但可含有天然核糖或脱氧核糖磷酸盐主链以外的主链类型。合成的寡核苷酸可用本领域已知的任何方法合成。本领域已知的多核苷酸主链包括：PNA类(肽核酸类)、磷硫酰类、磷酸二酰胺类(phosphorodiamidates)、吗啉代类、和天然核酸的磷酸骨架的其他变体。碱基包括嘌呤类和嘧啶类，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成类似物包括但不限于将新反应基团置于核苷酸上的修饰，例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸盐/酯和卤代烷。术语碱基包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物。术语多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA、RNA的组合，以及其他自然和合成的核苷酸。
本发明的合成的寡核苷酸可以是化学改性的。使用化学改性的多核苷酸能改良多核苷酸的多种性质，包括但不限于：耐体内核酸酶降解、细胞摄取、活性和序列特异性杂交。该化学改性的非限制性示例包括：磷硫酰核苷酸间键合、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、2',3'-开环(seco)核苷酸模拟物(打开的核苷碱基类似物，本文中表示为NUNA或NUNA)，以及反向脱氧脱碱基残基掺入。用于各种多核苷酸结构时，这些化学改性显示在细胞中保持多核苷酸活性，同时显著地增加这些化合物的血清稳定性。
在一些实施方式中，本发明的合成的寡核苷酸包含具有双链的双螺旋，其中一个或两个可被化学改性，且每个链为约19至约29(例如约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)个核苷酸。在一些实施方式中，本发明的合成的寡核苷酸包含一个或多个改性的核苷酸。本发明的合成的寡核苷酸可在约5％至约100％的核苷酸位置(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸位置)上包含改性的核苷酸。
合成的寡核苷酸可包含5'或3'末端修饰。3'或5'末端修饰包括但不限于：含氨基的基团、烷基基团、烷基氨基基团、反应性基团、TEG基团和PEG基团。
“RNAi试剂”(也称为“RNAi触发剂”、或双链的RNA干扰多核苷酸)通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi试剂包含双链的RNA或类RNA结构，该结构通常包含15-50个碱基对，优选18-26个碱基对，在细胞内的表达的靶向基因中具有至少85％的与编码序列互补的核苷碱基序列。RNAi试剂包括但不限于：短的干扰RNAs(siRNAs)、双链RNAs(dsRNA)、微RNAs(mi RNAs)、短发夹RNAs(shRNA)、部分双螺旋(meroduplexes)、和Dicer基板(dicer substrates)(美国专利第8084599、8349809和8513207号)。本文所用的术语“RNAi试剂”和“RNAi触发剂”可以互换使用。
抑制、下调或敲除基因表达表示如用所述基因转录的mRNA水平或从所述mRNA翻译的多肽、蛋白或蛋白亚基水平所测量，所述基因的表达低于不存在本文所揭示的化合物时观察到的水平。用本发明组合物所递送多核苷酸进行的基因表达抑制、下调或敲减优选低于对照失活的多核苷酸、序列杂乱的多核苷酸或钝化错配的多核苷酸存在时、或者不存在多核苷酸与本文所揭示的组合物的偶联时观察到的水平。
在一些实施方式中，上述RNAi试剂包含至少两个序列，该至少两个序列部分地、基本上或完全地彼此互补。在一些实施方式中，两个RNAi试剂序列包含正义链和反义链，上述正义链包含第一序列，上述反义链包含第二序列。在一些实施方式中，两个RNAi试剂序列包含两个正义链和一个反义链，上述两个正义链都包含第一序列，上述反义链包含第二序列，其中上述正义链和上述反义链一起形成减缩双螺旋(meioduplex)。上述正义链可以通过连接分子，例如多核苷酸连接体或非核苷酸连接体与上述反义链连接。
上述反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列与由靶向基因编码的mRNA的一部分互补，且互补性的区域最优选长度为少于30个核苷酸。上述RNAi试剂正义链包含与靶向mRNA的至少一部分具有至少85％同一性的序列。上述RNAi试剂在递送至表达靶向基因的细胞后，抑制所述靶向基因在体外或体内的表达。
在一些实施方式中，上述RNAi试剂可由自然产生的核苷酸构成、或由至少一种改性的核苷酸或核苷酸模拟物构成。可以通过本领域建立成熟的方法合成和/或修饰本发明的RNAi试剂正义链和反义链。RNAi试剂核苷、或核苷酸碱基可以通过含磷酸的(天然的)或含非磷酸的(非天然的)共价核苷间键连接，即上述RNAi试剂可具有天然的或非天然的寡核苷酸主链。在一些实施方式中，上述RNAi试剂在核苷酸碱基间包含非标准的(非磷酸的)键。
如本文中所用，“改性的核苷酸”是核苷酸、核苷酸模拟物、无碱基位点、或替代取代部分，而不是核糖核苷酸(2'-羟基核苷酸)。在一个实施方式中，改性的核苷酸包含2'-改性的核苷酸(即，核苷酸在五元糖环的2'位置具有除羟基外的基团)。改性的核苷酸包括但不限于：2'-改性的核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-O-2-甲氧基乙基)核苷酸、2'-氨基核苷酸、2'-烷基核苷酸、3'对3'键合(反向的)核苷酸、包含核苷酸的非天然碱、桥接的核苷酸、肽核酸、2',3'-开环核苷酸模拟物(打开的核苷碱基类似物)、锁定核苷酸、3'-O-甲氧基(2'核苷酸间连接的)核苷酸、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基磷酸酯脱氧核糖核苷酸、乙烯基磷酸酯核苷酸、以及脱碱基核苷酸。不需要对给定RNAi试剂的所有位置进行统一的修饰。相反地，可将多于一个的修饰并入单个RNAi试剂或者甚至是其单个核苷酸中。本文所述的RNAi试剂正义链和反义链可以通过本领域已知的方法合成和/或改性。在每个核苷酸上的改性独立于其他核苷酸的改性。
在一些实施方式中，RNAi试剂可包含5'或3'末端改性。3'或5'末端改性包括但不限于：含氨基的基团、烷基基团、烷基氨基基团、反应性基团、TEG基团和PEG基团。
在一些实施方式中，上述RNAi试剂可包含突出端，即通常是非成对的、突出的核苷酸，该核苷酸不直接参与通常由本文定义的成对的正义链和反义链的核心序列形成的双螺旋结构。
在一些实施方式中，正义链和反义链都包含独立地在各个正义链和反义链上的1-5个碱基的3'和/或5'突出端。在一些实施方式中，正义链和反义链都包含3'和5'突出端。在一些实施方式中，一个链的一个或多个3'突出端核苷酸与另一个链的一个或多个5'突出端核苷酸碱基成对。在一些实施方式中，一个链的一个或多个3'突出端核苷酸与另一个链的一个或多个5'突出端核苷酸不成对。RNAi试剂的正义链和反义链可以包含或不包含相同数量的核苷酸碱基。上述反义链和正义链可形成双螺旋，其中上述5'末端仅具有钝末端、上述3'仅具有钝末端、上述5'和3'都具有钝末端、或者上述5'和3'都不具有钝末端。在一些实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸包含硫代磷酸盐、硫逐磷酸酯、脱氧核苷酸、反向(3'对3'连接的)核苷酸，或是改性的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，如维尔康姆基金会桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾州生物信息中心(Penn Center forBioinformatics)、斯隆凯特林癌症纪念纪念中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter)和欧洲分子生物实验室等。已知的有效siRNA序列和关联结合位点也在相关文献中充分记述。RNAi试剂分子通过本领域已知的技术容易地设计和生产。此外，计算工具可用于增加发现有效和特异性序列基序的可能性(Pei等 2006,Reynolds等 2004,Khvorova等2003,Schwarz等 2003,Ui-Tei等 2004,Heale等 2005,Chalk等 2004,Amarzguioui等2004)。
实施例
实施例1.DBCO-S-S-甲基-NHS(图1，化合物7)的合成。
Figure BDA0001409379800000201
DBCO-二硫化物-甲基-NHS
A)N-Boc-氨基酸3：将4-(吡啶-2-基二磺酰基)戊酸1(安诺瓦化学公司(AnnovaChem,INC.),产品#L10067,800mg,3.29毫摩尔)与2-(boc-氨基)乙硫醇2(1.748g,9.86毫摩尔)和DIEA(1.72mL,9.86毫摩尔)在无水MeOH(15mL)中、在Ar下、于室温下搅拌14小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂，将残余物再次溶解于DCM(100mL)中，用5％KHSO4(2x20mL)、H2O(1×25mL)和盐水(1×20mL)洗涤。将粗产品用Na2SO4干燥、过滤，并在旋转蒸发仪上进行浓缩。在SiO2上进行柱纯化(流动相梯度正己烷:EtOAc:乙酸＝9:1:0.05-7:3:0.05)，产生650mg(70％)的纯产品3。
B)氨基酸4：将上述产品3(650mg,2.28毫摩尔)在HCl/二噁烷(4M,6mL)的冰冻溶液中搅拌10分钟，并在室温下搅拌1.5小时。在旋转蒸发仪上除去所有的挥发物，将残余物放入DMF(2.5mL)中，并在Et2O(40mL)中压碎。用Et2O将分离的产品磨碎，并在真空中进行干燥。产量为416mg。
C)按照文献工艺的8个步骤制备化合物DBCO NHS 5。
D)DBCO衍生物6：将上述氨基酸4(410mg,2.22毫摩尔)与二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺基(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))(893mg,2.22毫摩尔)和DIEA(0.965mL,5.54毫摩尔)在DCM/MeOH溶液(4:1,20mL)中搅拌2小时。在旋转蒸发仪上除去所有的挥发物，通过二噁烷的两次连续的蒸发将残余的DIEA从粗产物中除去。在SiO2柱(洗脱剂：梯度2％-4％MeOH在CHCl3中)上纯化产品。产量706mg(68％)。
E)DBCO-(单甲基)炔-S-S-NHS 7：将上述产品6(700mg,1.48毫摩尔)溶解于无水ACN(25mL)，并在冰浴上冷却。添加NHS(196mg,1.706毫摩尔)和EDC(326mg,1.706毫摩尔)，并搅拌30分钟。代替冰浴，在室温下继续搅拌14小时。在真空下除去所有的挥发物，将残余物再次溶解于CHCl3(125mL)中，用2％KHSO4(2x25mL)、盐水(2x25mL)洗涤，进行干燥(Na2SO4)、过滤，并在真空下浓缩。产量802mg(95％)。(NMR:AB)
F)DBCO-二甲基-S-S-NHS
Figure BDA0001409379800000211
DBCO-二硫化物-二甲基-NHS
使用下式化合物作为起始物，与7相似地制备了DBCO-二硫化物-二甲基-NHS。
Figure BDA0001409379800000212
G)使用相似的技术可容易地制造相关的化合物，包括但不限于：
Figure BDA0001409379800000213
DBCO-二硫化物-乙基-NHS
Figure BDA0001409379800000214
DBCO-甲基-二硫化物-NHS
Figure BDA0001409379800000215
DBCO-二甲基-二硫化物-NHS。
实施例2.DBCO-烷基-SMPT-NHS(式VI,图2,化合物13)的合成。
Figure BDA0001409379800000221
DBCO-二硫化物-甲基-SMPT-NHS
A)将4-溴乙基苯甲酸(22.7g,0.1摩尔)和硫脲(9.3g,0.12摩尔,1.2当量)溶解于H2O(200mL)中，且加热并回流4小时，然后在室温下加热11小时。添加10％NaOH(水溶液)(120mL)，加热并回流3小时。接着，将上述混合物冷至室温，添加6M盐酸(60mL)，形成沉淀。将上述沉淀过滤，用冷水洗涤，并在减压下进行干燥。将10.4g(58％)的粗产品8用于下一步骤。
B)将4-巯基乙基苯甲酸8(9.60g,52.8毫摩尔)在MeOH(240mL)中的溶液添加到DPDS(23.2g,105.6毫摩尔,2当量)和AcOH(3mL,52.8毫摩尔,1当量)溶解于MeOH(240mL)的溶液中，在冰浴下搅拌3小时。之后，使反应在室温下继续进行2小时。在减压下除去溶剂，将残余的油装填在硅胶柱上。用EtOAc:EtOH:Et3N(200:10:2)洗涤副产物，且用EtOAc:EtOH:AcOH(200:20:1)洗脱产品9(9.8g,64％)。
C)在酸9(9.7g,33.8毫摩尔)和MeOH(20mL)的溶液中添加2-(Boc-氨基)乙硫醇(6g,33.8毫摩尔)和DIEA(5.9mL,33.8毫摩尔)。将该混合物在氩气下回流搅拌24小时。通过TLC监测反应进展。将反应混合物冷却至室温，进行浓缩并再次溶解于EtOAc(100mL)中，用饱和NaHCO3(3×30mL)和盐水洗涤。将EtOAc层用Na2SO4干燥，进行浓缩并在真空下干燥以分离粗产品，进一步用硅胶柱纯化以获得产品2A，重量为11g，产率为91.2％。将化合物2A(11g,30.8毫摩尔)于0℃溶解于二噁烷(50mL)中的4M HC1，除去冷却浴，使反应在室温下搅拌2小时。2小时后TLC(CHCl3:MeOH:AcOH(9.6:0.4:0.025))显示不存在起始材料。在旋转蒸发仪上于35℃除去所有的挥发物，然后用Et2O(2×50mL)磨碎。将产品10(作为HCl盐)在真空下干燥一整夜，重量为9.1g，产率为100％。
D)按照文献工艺的8个步骤制备化合物DBCO NHS 11。
E)将DBCO NHS 11(12.4g,30.8毫摩尔)和胺10(9.1g,30.8毫摩尔)溶解于DCM/MeOH混合物(4:1,200mL)中。添加DIEA(11mL,61.6毫摩尔)，并将反应混合物在Ar气中搅拌2小时。在旋转蒸发仪上除去所有的挥发物，用油泵干燥上述残余物，将产品在SiO2柱(洗脱剂:梯度1-3％MeOH在CHCl3中)上纯化，获得呈白色固体的化合物12，重量为11.7g，产率为70％。
F)DBCO SMPT 13(最终产品)：将酸12(10.9g,20毫摩尔)溶解于ACN/THF混合物(4:1,150mL)中，并将溶液用冰浴冷却。将NHS(2.3g,20毫摩尔)和EDC(4g,21毫摩尔)连续地加入搅拌中的反应混合物，除去冷却浴，使反应在室温下继续反应16小时。在旋转蒸发仪上除去所有的挥发物，将残余物再次溶解于CHCl3(200mL)中并用H2O(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤两次。将有机相用MgSO4干燥，进行过滤，通过旋转蒸发仪进行浓缩，获得呈白色固体的最终产品DBCO SMPT(13)，重量为12.5g，产率为97.5％。
G)使用相似的技术可容易地制造相关的化合物，包括但不限于：
Figure BDA0001409379800000231
DBCO-二硫化物-乙基-SMPT-NHS
Figure BDA0001409379800000232
DBCO-二硫化物-二甲基-SMPT-NHS
Figure BDA0001409379800000233
DBCO-甲基-二硫化物-SMPT-NHS
Figure BDA0001409379800000234
DBCO-二甲基-二硫化物-SMPT-NHS。
实施例3.靶向因子VII基因的RNAi试剂与非支化的连接体(AD00096)、甲基支化的连接体(AD00919)、或二甲基支化的连接体(AD00920)偶联。
Figure BDA0001409379800000241
AD0096(非支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
Figure BDA0001409379800000242
AD0919(甲基支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
Figure BDA0001409379800000243
AD0920(二甲基支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
当使用上述支化的连接体时，HPLC分析(图7、9、10)显示明显较少的杂质。产率也提高。
A)DBCO-二硫化物-RNAi试剂偶联物的合成。
Figure BDA0001409379800000244
DBCO-二硫化物-
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
使用乙酸钠(0.5M)的EtOH溶液将具有5'C-6氨基改性的原始RNA(2.7mg,402纳摩尔)沉淀，进行冷冻干燥，再将其溶解于442μL 0.1M NaHCO3pH 8-9。将二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(DBCO-SS-NHS)酯(2.3mg,4063.6纳摩尔)溶解于227μL的DMF中，并将其添加至RNA溶液。将反应混合物充分混合，并使其在室温下进行反应2小时。使用RP-HPLC监测反应，在反应完成后确定纯度(纯度34.4％)。在反应完成后，将反应混合物彻底干燥，并使用RP-HPLC进行纯化。制得RNAi试剂偶联物，产率为18％(75纳摩尔)。通过RP-HPLC确定RNAi试剂偶联物的最终纯度(纯度：92.4％)，且通过MALDI-TOF/TOF确认特性(计算质量：7164.0；观察质量：7165.3)。图7是用DBCO-二硫化物-NHS酯(AM00253-SS,1141-66K_6)制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
B)DBCO-RNAi试剂偶联物的合成。
Figure BDA0001409379800000251
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
使用不具有二硫化物键的DBCO-NHS酯同样地制备RNAi试剂偶联物。通过RP-HPLC确定反应完成后的纯度(纯度：54.0％)。制得RNAi试剂偶联物，产率为60％(270纳摩尔)。通过RP-HPLC确定最终纯度(纯度：90.1％)，且通过MALDI-TOF/TOF确认特性(计算质量：6999.3；观察质量：6998.7)。图8是用DBCO-NHS酯(AM01707-SS,1141-18K_1)制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
C)DBCO-二硫化物-甲基-RNAi试剂偶联物的合成。
Figure BDA0001409379800000252
DBCO-二硫化物-甲基-
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
使用以甲基稳定二硫化物键的DBCO-SS-甲基-NHS酯同样地制备RNAi试剂偶联物。通过RP-HPLC确定反应完成后的纯度(纯度：74.7％)。制得RNAi试剂偶联物，产率为53％(1808纳摩尔)。通过RP-HPLC确定最终纯度(纯度：96.6％)，且通过MALDI-TOF/TOF确认特性(计算质量：7191.3；观察质量：7191.7)。FIG.9.图9是用DBCO-二硫化物-甲基-NHS(AM01637-SS,1141-11K_5)制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
D)DBCO-二硫化物-二甲基-RNAi试剂偶联物的合成。
Figure BDA0001409379800000261
DBCO-二硫化物-二甲基-
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
使用以两个甲基稳定二硫化物键的DBCO-二硫化物-二甲基-NHS酯制备RNAi试剂偶联物。通过RP-HPLC确定反应完成后的纯度(纯度：80.6％)。制得RNAi试剂偶联物，产率为66％(2259纳摩尔)。通过RP-HPLC确定最终纯度(纯度：96.6％)，且通过MALDI-TOF/TOF确认特性(计算质量：7205.3；观察质量：7204.9)。图10是用DBCO-二硫化物-二甲基-NHS(AM01638-SS,1141-11K_4)制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
E)DBCO-二硫化物-甲基-SMPT-RNAi试剂偶联物的合成。
Figure BDA0001409379800000262
DBCO-二硫化物-甲基-SMPT-
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
使用DBCO-二硫化物-甲基-SMPT制备了RNAi试剂偶联物。通过RP-HPLC确定反应完成后的纯度(纯度：72.7％)。制得RNAi试剂偶联物，产率为35％(1050纳摩尔)。通过RP-HPLC确定最终纯度(纯度：96.6％)，且通过MALDI-TOF/TOF确认特性(计算质量：7238.3；观察质量：7238.3)。图11是用DBCO-二硫化物-甲基-SMPT(AM02455-SS,1183-61K_2)制备的RNAi试剂偶联物的反应混合物的RP-HPLC色谱图。
表1.使用五种不同的改性剂的反应混合物纯度和百分比产率的小结。
Figure BDA0001409379800000263
Figure BDA0001409379800000271
在稳定二硫化物键时，RNAi试剂偶联物可制备为在纯化前具有高纯度，可获得较高的反应产率。
LC显示使用支化的连接体(DBCO偶联至RNAi试剂)时杂质减少。
Figure BDA0001409379800000272
AD0096(非支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
Figure BDA0001409379800000273
AD0919(甲基支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
Figure BDA0001409379800000274
AD0920(二甲基支化的连接体)
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
Figure BDA0001409379800000275
AD0921
(磷酸基团可以是RNAi试剂或RNAi试剂正义链的一部分。)
实施例4.炔-二硫化物-烷基改性剂的体内效果。
A)RNAi试剂，其具有下述序列，使用在正义链的5'末端具有C6氨基连接体的标准亚磷酰胺化学物、且使用可市售获得的6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(购自格伦研究公司(Glen Research))。
表2.因子VII RNAi试剂
Figure BDA0001409379800000281
n(小写)＝2'-OMe取代核苷酸
Nf＝2'-氟核苷酸
dN＝2-脱氧取代；
inv＝3'对3'连接
s＝磷硫酰(phosphorothioate)连接
B)N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯和丙烯酸仲丁酯(EAB)的RAFT共聚物。
配制内含AIBN(1.00mg/mL)和RAFT试剂CPCPA(10.0mg/mL)的乙酸丁酯溶液。单体摩尔供给为55％的N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯、45％的丙烯酸仲丁酯(CAS#2998-08-5)。理论Mw为100000。
将N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯(0.890g,3.43毫摩尔)、丙烯酸仲丁酯(0.391mL,0.360g,2.81毫摩尔)、CPCPA溶液(0.350mL,0.0125毫摩尔)、AIBN溶液(0.308mL,0.00188毫摩尔)、和乙酸丁酯(5.3mL)添加至带有搅拌棒的20mL玻璃小瓶中。将上述小瓶用隔帽密封，使用长注射器用氮气对溶液鼓泡1小时，并具有第二注射器作为出口。除去上述注射器，使用油浴将小瓶加热至80℃、16小时。使上述溶液冷却至室温，并在将其移至50mL离心管之前添加己烷(35mL)。将上述溶液以4400rpm离心分离2分钟。轻轻倒出上清液层，并用己烷漂洗底部(固体或胶状)层。然后，使该底部层重新溶于DCM(7mL)，在己烷(40mL)中沉淀并再离心一次。轻轻倒出上清，用己烷冲洗底部层，然后使聚合物减压干燥数小时。粗EAB共聚物的产率为0.856g。采取上述粗聚合物的样品用于多角度光散射(MALS)。使所述干燥的粗聚合物溶于DCM(100mg/mL)。添加己烷直至刚过浊点。将所得乳白状溶液离心。将底部层萃取并完全沉淀在己烷中。将上述部分离心，之后分离所述共聚物并真空干燥。EAB共聚物的分离部分的产率为0.478g。采取分离部分的共聚物的样品用于1H-NMR和MALS。通过1H-NMR检测的组合物是61％的N-Boc-乙氧基乙胺和丙烯酸酯，39％的丙烯酸仲丁酯。
MALS分析：使约10mg的共聚物溶于0.5mL的75％二氯甲烷、20％四氢呋喃、5％乙腈中。用连接至岛津公司(Shimadzu)Prominence HPLC的Wyatt Heleos II多角度光散射检测器，使用Jordi 5μ7.8×300混合床LS DVB柱来测量分子量和多分散性(PDI)。粗聚合物：MW:59000(PDI 1.3)；分离部分的聚合物：MW 70000(PDI:1.1)。
去保护/透析。将干燥的样品用乙酸(～7ml)中的2M HCl处理，除去BOC保护基团。然后，用20mL水稀释所述反应，并搅拌10～15分钟。然后，用3500MW透析管分别在高盐、高盐和水中对所述部分透析15小时、8小时和15小时。然后，将所述部分转移至50mL的离心管，并冷冻干燥3天或直至干燥。将上述干燥样品制成20mg/mL水溶液，用于进一步研究。
RNAi试剂-聚合物制剂。将5mM、pH 8.0HEPES缓冲液中的聚丙烯酸EAB用N-羟基琥珀酰亚胺基活化的PEG4叠氮化物(购自量子生物设计公司(Quanta BioDesign)的叠氮基-dPEG4-NHS酯)进行改性，获得用于随后的RNAi试剂的连接的叠氮基。然后，将上述叠氮化物改性的聚合物在60mg/mL HEPES碱中稀释至5mg/mL。向该溶液中添加15mg/mL(3重量当量)PEG掩蔽剂PEG-Ala-Cit-PABC，以改性40-50％的可获得的氨基。在1小时后，将DBCO-改性的啮齿动物因子VII RNAi试剂(相对于聚合物为0.125重量当量)添加至聚合物溶液。在培养一整夜后，通过相对于N-乙酰基半乳糖胺衍生的NAG-Ala-Cit-PABC(示于表2)的可获得的氨基以摩尔过量的方式进行添加来进一步改性偶联物，并培养30分钟。
小鼠和注射过程。6～8周龄的雌性ICR小鼠获自美国印第安纳州印第安纳波利斯市哈伦斯普拉道莱公司(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)。所有的小鼠根据箭头麦迪逊公司的动物管理和使用委员会批准的动物使用协议进行操作。将啮齿类动物保持在12小时光照/黑暗循环下，使其自由取用水和食物(美国威斯康星州麦迪逊市，哈伦，哈伦塔克拉德鼠饲料(Harlan Teklad Rodent Diet，Harlan，Madison，WI))。将递送制剂作为集合药团以总体积0.2mL(小鼠)注射到尾静脉，或者作为HEPES缓冲的(5mM，pH 7.5)等渗葡萄糖在标准条件下注射。用偶联于0.25mg/kg RNAi试剂的2mg/kg聚合物注射小鼠。在注射5天后收集血清样品。
血清FVII活性检测。通过下颌下出血收集血液，按照标准程序装入含0.109M柠檬酸钠抗凝血剂(1体积)的微量离心管中，由此制备血清样品。血清中FVII活性使用测试试剂盒(BIOPHEN VII，美国俄亥俄州梅森市阿尼拉公司(Aniara，Mason，OH))用生色法按照生产商推荐测量。比色显影的吸光度通过Tecan Safire-2酶标仪在405nm处测量。
表3.注射聚合物-RNAi试剂二硫化物偶联物后的标准化的因子VII水平。
DBCO二硫化物 相关的FVII活性
EAB-RNA 91±15
EAB-SS-RNA 16±7
EAB-SS-甲基-RNA 12±7
EAB-SS-二甲基-RNA 36±10
EAB-S-S-甲基-SMPT-RNA 26±7
序列表
<110> 箭头药业股份有限公司（Arrowhead Research Corporation）
A·埃尔米达（Almeida, Aaron）
A·V·布罗金（Blokhin, Andrie V）
D·H·维基菲尔德（Wakefield, Darren H）
J·D·本森（Benson, Jonathan D）
D·B·罗泽玛（Rozema, David B）
<120> 改良的含二硫化物的炔烃交联剂
<130> 30634-US1
<150> 62134186
<151> 2015-03-17
<150> 62168244
<151> 2015-05-29
<150> 62235860
<151> 2015-10-01
<160> 10
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂反义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 2-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 1
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂正义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 1-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 2
gcaaaggcgu gccaacucat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂反义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 2-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 3
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂正义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 1-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 4
gcaaaggcgu gccaacucat 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂反义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 2-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂正义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 1-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 6
gcaaaggcgu gccaacucat 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂反义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 2-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 7
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂正义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 1-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 8
gcaaaggcgu gccaacucat 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂反义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 2-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 9
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi试剂正义链
<220>
<221> 改性碱基
<222> 1-19
<223> 改性碱基 = "2'-羟基相应的核苷酸"
<400> 10
gcaaaggcgu gccaacucat 20

Claims (9)

1.一种具有下式结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure FDA0003251830140000011
其中，
R1是烷基且R2是氢，或者R1是氢且R2是烷基，
L1选自
Figure FDA0003251830140000012
Figure FDA0003251830140000013
L2是
Figure FDA0003251830140000014
X是
Figure FDA0003251830140000015
其中X’是N，并且
Y是RNAi试剂。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述烷基是甲基。
3.一种具有下式结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure FDA0003251830140000016
其中，
R1和R1'分别为烷基且R2和R2'分别为氢，或者R1和R1'分别为氢且R2和R2'分别为烷基，
L1选自
Figure FDA0003251830140000021
Figure FDA0003251830140000022
L2是
Figure FDA0003251830140000023
X是
Figure FDA0003251830140000024
其中X’是N，
Y是RNAi试剂。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述烷基是甲基。
5.一种具有下式结构的环辛炔-烷基二硫化物化合物：
Figure FDA0003251830140000025
其中，
R3是C(R5R6)，其中R5是氢、甲基或乙基，且R6是氢、甲基或乙基，
R4是C(R7R8)，其中R7是氢、甲基或乙基，且R8是氢、甲基或乙基，
R5、R6、R7和R8中的至少一个是甲基或乙基，
L1选自
Figure FDA0003251830140000026
Figure FDA0003251830140000031
L2是
Figure FDA0003251830140000032
Y是RNAi试剂。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，R5或R6是甲基或乙基，且R7和R8都是氢。
7.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，R7或R8是甲基或乙基，且R5和R6都是氢。
8.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述R5是CH3，且R6、R7和R8分别为氢。
9.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述R7是CH3，且R5、R6和R8分别为氢。
CN201680016228.7A 2015-03-17 2016-03-16 改良的含二硫化物的炔烃交联剂 Active CN107635550B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562134186P 2015-03-17 2015-03-17
US62/134,186 2015-03-17
US201562168244P 2015-05-29 2015-05-29
US62/168,244 2015-05-29
US201562235860P 2015-10-01 2015-10-01
US62/235,860 2015-10-01
PCT/US2016/022560 WO2016149313A1 (en) 2015-03-17 2016-03-16 Improved disulfide-containing alkyne linking agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107635550A CN107635550A (zh) 2018-01-26
CN107635550B true CN107635550B (zh) 2021-12-24

Family

ID=56919276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680016228.7A Active CN107635550B (zh) 2015-03-17 2016-03-16 改良的含二硫化物的炔烃交联剂

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9803201B2 (zh)
EP (1) EP3270903B1 (zh)
JP (1) JP6773677B2 (zh)
CN (1) CN107635550B (zh)
TW (1) TW201704471A (zh)
WO (1) WO2016149313A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201908771YA (en) * 2017-03-22 2019-10-30 Univ California Modified oligonucleotides and therapeutic uses thereof
BR112020006901A2 (pt) 2017-11-01 2020-10-13 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. ligantes de integrina e usos dos mesmos
JP7320821B2 (ja) * 2018-08-10 2023-08-04 国立大学法人九州大学 化合物、高分子化合物及び高分子化合物の製造方法
US11685801B2 (en) 2018-11-06 2023-06-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Derivatizable monomers and polymers, and methods for making and using same
CN114364404A (zh) 2019-04-11 2022-04-15 东北大学 寡核苷酸-聚合物多手臂偶联物以及使用方法
MX2023011909A (es) 2021-04-08 2023-10-18 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de rnai para inhibir la expresion del receptor para productos finales de glicacion avanzada, composiciones de estos y metodos de uso.
CN114106012B (zh) * 2021-12-13 2023-05-23 宜昌博仁凯润药业有限公司 一种化合物Biotin-PEG3-SS-DBCO制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014134483A2 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2226316T3 (en) 2002-05-30 2016-04-11 Scripps Research Inst Copper catalyzed ligation of azides and acetylenes
WO2005089287A2 (en) 2004-03-15 2005-09-29 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
US8431558B2 (en) 2004-11-01 2013-04-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
US8658211B2 (en) * 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
WO2008022309A2 (en) * 2006-08-18 2008-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US8133515B2 (en) * 2007-11-21 2012-03-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Alkynes and methods of reacting alkynes with 1,3-dipole-functional compounds
CA2708171C (en) 2007-12-04 2018-02-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Folate conjugates
AU2009336191B2 (en) 2008-12-18 2017-08-24 Novo Nordisk A/S Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
PL2563753T6 (pl) 2010-04-27 2016-05-31 Synaffix Bv Stopione związki cyklooktynu i ich zastosowanie w reakcjach typu "click" bez udziału metalu
US8912322B2 (en) 2010-07-29 2014-12-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aza-dibenzocyclooctynes and methods of making and using same
EP2675479B1 (en) 2011-02-15 2016-01-13 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
JP6158185B2 (ja) * 2011-09-07 2017-07-05 プロリンクス エルエルシー 生分解性架橋を有するヒドロゲル
US9732161B2 (en) * 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014189370A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Stichting Katholieke Universiteit Substituted azadibenzocyclooctyne compounds and their use in metal-free click reactions
KR20160035081A (ko) 2013-08-07 2016-03-30 애로우헤드 리서치 코오포레이션 생체 내에서 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달하기 위한 폴리콘주게이트

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014134483A2 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nanoparticles Functionalized with Collagenase Exhibit Improved Tumor Accumulation in a Murine Xenograft Model;Murty, S. et al;《Particle & Particle Systems Characterization》;20141231;第31卷(第12期);1307–1312 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107635550A (zh) 2018-01-26
US20180023084A1 (en) 2018-01-25
EP3270903A4 (en) 2018-12-19
US10047361B2 (en) 2018-08-14
EP3270903A1 (en) 2018-01-24
EP3270903B1 (en) 2020-05-06
JP6773677B2 (ja) 2020-10-21
TW201704471A (zh) 2017-02-01
JP2018510164A (ja) 2018-04-12
US9803201B2 (en) 2017-10-31
US20160272971A1 (en) 2016-09-22
WO2016149313A1 (en) 2016-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107635550B (zh) 改良的含二硫化物的炔烃交联剂
CN103492568B (zh) 用于siRNA的半乳糖簇‑药代动力学调节剂靶向部分
JP6290848B2 (ja) ｓｉＲＮＡの標的化送達のための組成物
US8563527B2 (en) Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
US12084661B2 (en) Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
CN103547272B (zh) 基于肽的体内siRNA递送系统
AU2010248239B2 (en) siRNA conjugate and preparation method thereof
JP7420727B2 (ja) トリアルキン結合剤及び使用方法
JP2014531476A (ja) インビボ核酸送達のためのポリ（ビニルエステル）ポリマー
BR112016000160B1 (pt) estrutura de oligonucleotídeo tipo nanopartícula melhorada tendo alta eficiência e método para a preparação da mesma
WO2011140644A1 (en) Polyacetal or polyketal and ether polymers
HK1191566A (zh) 基於肽的體內sirna遞送系統
HK1191566B (zh) 基於肽的體內sirna遞送系統
EP2807216A1 (en) Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant