CN107635411A - 用于漂白原壳小球藻生物质的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于漂白富含蛋白质的原壳小球藻(Chlorella protothecoides)微藻生物质的方法，所述生物质是通过发酵产生的，其特征在于，该方法包括：选择在异养条件下和连续发酵下产生微藻生物质；并通过监测μ/μ_最大生长速率比来改变所述生物质的着色。

Description

用于漂白原壳小球藻生物质的发酵方法

本发明涉及一种用于漂白微藻生物质的发酵方法，该微藻更具体地是小球藻属(Chlorella genus)，甚至更具体地是原壳小球藻(Chlorella protothecoides)物种。

大型藻类和微藻具有在很大程度上仍未开发的特定丰富性。它们用于膳食的、化学的或生物能的目标的利用仍是高度边缘性的。尽管如此，它们包含具有大价值的组分。

确实，微藻是维生素、脂质、蛋白质、糖、色素和抗氧化剂的来源。

因此，藻类和微藻受到使用它们来制造食物补充剂、功能性食物、化妆品以及药物或进行水产养殖的工业部门的关注。

在替代性食物来源的寻找中，日益考虑使用微藻生物质(且主要是其蛋白质)作为食品，以满足全球对动物蛋白逐渐增加的需求(如FAO所报道)。

此外，欧盟至今已经受多年的植物蛋白的结构性短缺，近年来累计短缺超过两千万吨大豆等效物，目前从南美洲进口。

因此设想大量生产某些富含蛋白质的微藻作为减小此“蛋白质短缺”的可能方式。

广泛的分析和营养学研究已显示，这些藻类蛋白等效于常规植物蛋白，或甚至质量更优。

但是，由于将源自微藻的材料纳入感官上可接受的食物制剂中的高生产成本和技术困难，微藻蛋白的广泛分布仍处于初级阶段。

实际上，尽管例如用在室外池塘中或使用光生物反应器以光合作用方式培养的微藻产生的藻类粉末是可商购的，但其具有深绿色(与叶绿素有关)和强烈的使人不愉快的味道。

即使配制于食物产品中或作为营养补充剂，这些藻类粉末也总是赋予食物产品或营养补充剂这种在视觉上无吸引力的绿色且具有难闻腥味或海藻味。

因此，仍存在对于具有适宜感官品质的小球藻属的微藻生物质的组合物的未满足需要，允许将这些组合物用于更多和更多样化食物产品中。

提出的第一种解决方案是选择具有低含量叶绿素色素或不含叶绿素色素的小球藻变体。因此，原藻菌属(Prototheca)通常被描述为无色小球藻。

第二个解决方案包括用X射线或紫外线辐射、或用化学试剂(NTG)或物理试剂(热处理)处理亲本菌株以选择脱色突变体。

这些突变体的培养优先在异养条件下(在黑暗中并且在营养性碳基源如葡萄糖存在下)进行，以保持选择压力。

然而，这些技术解决方案不能自动保证这些脱色变体的稳定性，或保证保存生物质感兴趣的其他成分的质量、丰富性和/或多样性。

因此，仍存在对于具有适宜感官品质(仍然具有与感兴趣的组分(例如蛋白质)相同的丰富性)的小球藻属的微藻生物质的组合物的未满足需要，允许将这些组合物用于更多和更多样化食物产品中。

发明内容

本发明涉及一种用于漂白富含蛋白质的小球藻微藻生物质的方法，该方法的特征在于：

-该微藻生物质是在异养条件下和连续发酵条件下产生的，并且

-通过增加μ/μ_最大生长速率比降低所述生物质的着色。

优选地，该微藻生物质通过以使得μ/μ_最大生长速率比大于或等于0.90，优选大于或等于0.95这样的方式将连续发酵的进行参数化来漂白。

优选地，该连续发酵在恒化器中进行。

优选地，该富含蛋白质的微藻生物质具有以N 6.25表示的大于50％的蛋白质含量。优选地，该小球藻微藻是原壳小球藻。

发明内容

因此，本发明涉及一种用于通过控制生物质的着色来产生富含蛋白质的小球藻微藻的生物质的方法，该方法的特征在于：

-选择在异养条件下和连续发酵条件下产生微藻生物质，

-通过控制μ/μ_最大生长速率比改变所述生物质的着色。

为了本发明的目的，术语“富含蛋白质的生物质”旨在意指具有以N 6.25表示的大于50％、优选大于53％、甚至更优选大于55％的蛋白质含量的生物质。

优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻(Chlorella vulgaris)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX 250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at theUniversity of Texas at Austin–USA))。在另一个具体实施例中，该菌株为耐热性小球藻(菌株UTEX 1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心)。

诸位发明人完全出人意料地注意到，着色与μ/μ_最大生长速率比成反比：当μ/μ_最大生长比增加时着色降低，并且当μ/μ_最大生长比降低时，着色增加。

本发明的富含蛋白质的小球藻的生物质以其标记的绿色(与其叶绿素的天然含量相关)已知。

为了本发明的目的，“生物质的漂白”旨在将碱性绿色变为黄色，经过从绿色至黄色的所有色调。

可以使用本领域技术人员已知的任何色度模型来进行绿色或黄色的测量。

可以选择HSL(色调、饱和度、亮度的首字母缩写)模型，该模型基于人类感知的感觉，因此它的名字为感知模型。

表征HSL的三个指标是色调、饱和度、最后是亮度。因为从鲜艳颜色变成灰色，饱和度很好地反映了直观的着色概念。在黑色(无光或值0)与白色(最大光或值1)之间测量亮度。

HSL模型的主要优点是清楚地将亮度分量与色彩分量分开。色调和饱和度在同一个平面上，与眼睛的有色感觉一致，而亮度，就其本身而言，被放置在垂直轴上。

也可以使用由国际照明委员会(Commission Internationale de l'Eclairage[International Commission on Lumination))建立的“L，a，b体系”，该体系由三维笛卡尔参考系(Cartesian reference frame)(L，a，b)组成，其中“L”轴表示澄清度，“a”轴表示红色和绿色之间的颜色色调，并且“b”轴表示黄色和蓝色之间的颜色色调。

通过说明的方式，下表呈现了根据HSL模型和根据L，a，b系统进行的针对绿色和黄色两种颜色(在针对根据本发明的生物质常规测量的颜色序列结束时)的测量(一式三份进行测量)。

表1

如将在下文示例，本申请人公司已经选择使用HSL模型来表示生物质的颜色，L，a，b模型相反适合于测量白色至黄色的粉末的色度变化(黄色平衡的测量，“b”轴或“黄色指数”)。

关于连续发酵方法，这里应该理解为更具体地指通过添加无菌培养基进行发酵，并在同一个发酵周期内进行抽出。

然而，求助于这种连续发酵过程并不是旨在提高生物质生产率，而是控制产生的生物质的颜色。

实际上，本申请人公司出人意料地并且意外地发现，可以通过控制μ/μ_最大生长速率比来改变所述生物质的着色。

为了示例这一结果，本申请人公司建议在恒化器中进行这种连续发酵：然后将新鲜培养基以恒定流速(F)提供，并且然后以相同的流速从发酵罐中移出，从而保持恒定培养物体积(V)。

在稳定状态下，培养物的生长速度“μ”等于稀释率“D”，并由关系式D＝F/V定义。

生物质的浓度和其他参数稳定在取决于发酵动力学的值。

基本上，恒化培养允许本领域技术人员将生长速率(μ)控制在低于最大值(称为最大生长速率(μ_最大)的值。

这与分批模式培养不同，在分批模式培养中生物质的浓度和环境条件(在pH、营养物浓度等方面)在发酵的(有限的)持续时间的过程中显著变化，并且本领域技术人员无法控制生长速率。

决定恒化器中细胞群的生长速率的因素是稀释率，也就是限制性营养元素的进料流速。

在本发明的方法中，在这种情况下该因素是葡萄糖。

在以低稀释率操作的恒化器中，葡萄糖在静止状态下以非常低的浓度存在。

因此，大多数营养元素在细胞中转化，并且生物质的浓度高(接近对数期结束时等量分批培养物的细胞浓度)。

当稀释率增加时，葡萄糖的可利用率增加；然而，从发酵罐中消除细胞的速度也更高，并且因此生物质的浓度下降。

在D值接近于μ_最大的情况下，因为在培养物中存在太少使用有效营养物的细胞，营养物限制完全消失。

因为相同的限制性营养物过量存在，残留在发酵罐中的细胞以其最大生长速率生长。

最后，在D大于μ_最大时，不能再保持平衡状态，并且发酵罐中的细胞数量开始下降，因为产生新细胞的速度不足以避免通过加入新鲜培养基的稀释，这导致发酵罐中的细胞的洗涤。

这些数据有可能解释为什么当推荐在恒化器中发酵以提高在零残留葡萄糖下的生产率时，本领域技术人员将选择以如下方式运行恒化器：D小于μ_最大，以便获得最高浓度的生物质的原因。

就其本身而言，本申请人公司发现，μ朝向μ_最大增加越多，生产率增加越多，而且产生的生物质越多地被漂白。

如将在下文示例，在该连续发酵中使用的参数如下，取决于在下文示例的条件：

-用10％(v/v)氨水调节pH＝5.2，

-pO₂＝在振荡下级联调节30％，

-通气：1vvm(1.5L/min)。

在平衡时：

-进料流量＝输出流量＝0.120l/h至0.180l/h

-稀释率＝μ＝0.02h^-1至0.12h^-1

-生物质浓度＝50g/l至100g/l

-葡萄糖浓度＝100g/l至200g/L。

在一个实例中，恒化器在5次更新过程中平衡(如果D＝0.08h^-1，则为62.5h)。在5次更新和随后7h以上后取样品，以验证恒化器的平衡状态。

因此发现，如果μ从0.08h^-1增加到0.1h^-1，则绿色碱性原壳小球藻生物质将逐渐被漂白成黄色。

相反，如果μ从0.08h^-1降低到0.06h^-1，生物质的着色就朝绿色调增强。

此外，并且这是在根据本发明的方法中必不可少的，以这种方式在恒化器中进行发酵不会改变产生的生物质的组成。

如将在下文示例，生长速率是弱(0.06h^-1)还是强(0.1h^-1)，没有观察到对产生的原壳小球藻生物质的组成的显著影响。

相反，主要差异在生产速度方面，生产速度总体上用强μ改进。

作为举例，对于原壳小球藻，获得的最佳结果使得有可能实现9.5g生物质/l/h的生产率，同时保持以N6.25的％表示的蛋白质含量大于55％。

再次，更出人意料的是，μ的变化对产生的生物质的颜色有相当大的影响。

不受任何理论的约束，关于所获得的结果(在针对每次测量通过生物质的色调H作为亮度L的函数的HSL模型表示的基础上)，本申请人公司认为：

-色调的变化可以对应于掩盖其他色素(类胡萝卜素)的叶绿素产生的逐渐减少，

-就其本身而言，亮度可以进一步对应于总色素浓度的降低。

如将在下文示例，被认为是“正确”的颜色水平是以下颜色水平(对于30至60之间的色调范围和50和230之间的亮度范围)：

-色调值小于40，

-亮度值大于135，优选大于150，甚至更优选大于或等于170。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

附图说明

图1：所消耗的O₂和所产生的CO₂的变化作为施加的稀释率的函数。

图2：吸光度、葡萄糖和生物质含量的变化作为施加的稀释率的函数。

图3：色调和亮度的变化作为施加的稀释率的函数。

图4：色调的变化作为μ/μ_最大生长速率比的函数。

图5：亮度的变化作为μ/μ_最大生长速率比的函数。

图6：色调和亮度的变化作为D/D_最大稀释率比的函数。

实例

实例1：在加速器(accelerostat)中测定μ_最大值和作为μ/μ_最大比的函数的生物质的 颜色变化

所用的菌株是原壳小球藻UTEX 250(美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心)。

在加速器中进行发酵，该加速器是恒化器的变体，在其中的发酵罐决不会进入静止式动态平衡。事实上，D从低值开始以线性和逐渐的方式增加。

该技术的优点是研究了宽范围的稀释率，并且在所实施的条件下快速准确地获取了菌株的μ_最大。

用于生产100g/l的生物质的发酵条件如下：

进料培养基

-葡萄糖200g/l

-(NH₄)₂SO₄：1g/l

-NH₄H₂PO₄：8g/l

-MgSO₄.7H₂O：4.8g/l

-FeSO₄.7H₂O：0.020g/l

-CaCl₂.7H₂O：0.050g/l

-ZnSO₄.7H₂O：0.025g/l

-MnSO₄.1H₂O：0.020g/l

-CuSO₄.5H₂O：0.001g/l

-盐酸硫胺：0.020g/l

-生物素：0.001g/l

-吡哆素：0.010g/l

进行发酵：

-用10％(w/v)的NH₄OH使pH至5.2

-孵育温度：28℃

-接种物：在2L的发酵罐中(在加入之前，除振荡外1.5L培养基)0.5L锥形瓶的预培养物(具有OD_750nm＝15)

-SIGMA S208消泡剂50％乙醇(v/v)脉冲，以每小时1个1秒的脉冲的速率

-振荡：开始为300rpm

-通气：1.5l/min的空气

-pO₂调控：30％

气体(O₂/CO₂)的分析、在750nm处的吸光度、葡萄糖浓度和细胞的重量是为了确定μ_最大值而测量的参数。

图1显示了所消耗的O₂和所产生的CO₂的变化作为施加的稀释率的函数。

看起来，O₂和CO₂逐渐变化直到0.05h^-1，然后曲线突然反转。

与气体测量平行，对吸光度、葡萄糖和生物质含量的变化进行动力学监测。

图2呈现了获得的结果。

再次，从0.05h^-1开始，存在：

-残留葡萄糖积累的开始，

-生物质曲线的转折(最初稳定在75g/l干细胞)，

这表明恒化器开始进入浸取阶段，也就是说在施加条件下，施加的μ变得高于菌株的μ_最大。

因此，该系统更快地消除其不再生的细胞，从而导致反应器中的细胞负荷减小、未被消耗的O₂再次增加、并且产生的CO₂减少。

吸光度的降低也反映了从0.05h^-1的μ开始生物质含量下降。

由所有这些分析得出，在所选择的发酵条件下D_最大＝μ_最大＝0.05h^-1。

根据HSL模型进行所产生的生物质的颜色测量。

图3呈现了颜色(色调和亮度)的变化作为稀释率的函数。

色调和亮度曲线的变化直接取决于μ_最大。

呈曲线图形式的三种表示使得有可能说明颜色变化作为μ/μ_最大比的函数：

-色调的变化作为μ/μ_最大比的函数(图4)，

-亮度的变化作为μ/μ_最大比的函数(图5)，

从此推断：

-贯穿整个加速器时间，颜色变化非常强烈(也就是说，是D值的函数)，

-在所选择的操作条件下，当μ趋向于μ_最大时，获得最黄的且漂白的生物质。

实例2：生物质颜色的变化作为恒化器中平衡点的稀释率(以及因此μ值)的函数

恒化器在与实例1相同的条件下运行，但是使用少了两倍浓缩的培养基，使得平衡时的生物质浓度为50g/l。该培养基上的μ_最大为0.104h^-1。

一旦获得平衡(5次更新)，就在各种稀释率下进行以下测量。它们证实了μ/μ_最大比对着色的影响：

表2

测试	1	2	3	4
					D(h-1)	0.102	0.028	0.088	0.064
μ/μ最大	0.98	0.27	0.85	0.61
					色调	36	52	47	48
亮度	171	68	86	81

相反，如下文给出的蛋白质(N 6.25和总氨基酸)、总脂肪酸和总糖的含量所示，生物质的组成没有显著改变。

表3

测试	1	2	3	4
					N 6.25(％干的)	60.0	56.1	54.2	57.2
总氨基酸(％干的)	37.6	40.6	39.5	40.6
					总脂肪酸(％干的)	8.4	7.0	7.2	7.6
总糖(％干的)	31.2	24.8	30.1	26.2

Claims (6)

1.一种用于漂白富含蛋白质的小球藻微藻生物质的方法，其特征在于：

-该微藻生物质是在异养条件下和连续发酵条件下产生的，并且

-通过增加μ/μ_最大生长速率比降低所述生物质的着色。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该微藻生物质通过以使得该μ/μ_最大生长速率比大于或等于0.90这样的方式将连续发酵的进行参数化来漂白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该微藻生物质通过以使得该μ/μ_最大生长速率比大于或等于0.95这样的方式将连续发酵的进行参数化来漂白。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，该连续发酵在恒化器中进行。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，该富含蛋白质的微藻生物质具有以N 6.25表示的大于50％的蛋白质含量。

6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，该小球藻微藻是原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。