CN107619829B - 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行gins2基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas9系统针对间充质干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。其中使用了新的增效蛋白CREnhancer1.0，能够显著提高细胞内CRISPR/Cas9基因编辑效率。本发明提供的骨髓间充质干细胞GINS2敲除质粒具有较好的遗传稳定性。

Description

使用CRISPR-CAS系统对间充质干细胞进行GINS2基因敲除的 方法

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对间充质干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如，被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。

间充质干细胞(MSCs)是一类多能干细胞，源于发育早期的中胚层和外胚层。主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展，美国批准了60余项临床试验，随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，我国也批准了多项临床试验，走入了间充质干细胞核心技术研发的舞台。我国已经大力加强干细胞研究工作的开展，包括国家昂赛细胞基因工程有限公司、细胞产品国家工程研究中心在内的多家权威研究机构以及各地方脐带血库已将研究技术引向临床。对于间充质干细胞用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一，位于人染色体16q24上，其mRNA长度为1196bp，编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶，在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明，GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用，如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达，也有文献表明，DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用，如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面，GINS均发挥了一定功能，特别是与染色体的分离密切相关。

而目前关于GINS2在肿瘤相关领域的报道很少。在CN106620703 A中，针对人GINS2基因的小分子干扰RNA序列，RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒，进一步检测了GINS2基因的沉默效率、GINS2-siRNA慢病毒对肿瘤细胞增殖能力和凋亡水平的影响，结果显示采用RNAi方法下调人GINS2基因的表达后可有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长并促进其凋亡，表明GINS2基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点，通过RNAi方式沉默GINS2基因的表达可作为抑制肿瘤发展的有效手段。但是在该研究中，采用的是SiRNA进行干扰，所述方法具有敲除不彻底，不能稳定的敲除遗传的缺陷。在(Integration of Genomic,Biologic,and ChemicalApproaches to Target p53 Loss and Gain-of-Function in Triple NegativeBreastCancer)中，虽然提到了CRISPR/Cas可以用于MCM2，GINS2，C19orf43，ELOVL2，ARL4D，DNM3OS，FGFR2，IFIT2，MPPED2，B2M，ERRFI1，GLUL CASP4，CPED1，SPTLC2，CMTM6，CFH，CARS2，SUMF1，但是只是一个构想，并没有实施。针对不同的基因进行CRISPR修饰并非简单容易设计的，需要克服众多障碍，具有极大地实验困难。

基于间充质干细胞的多能性，为了研究敲除GINS2基因的间充质干细胞在癌症治疗方面的功能，建立敲除GINS2基因的间充质干细胞细胞系变得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种敲除GINS2基因的间充质干细胞，有效克服了现有技术使用siRNA进行干扰不能稳定遗传的技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种CRISPR-cas系统的靶标，根据GINS2的基因序列，设计的具体可选择的靶位点如下(划线部分表示PAM基序)：

GINS2-sgRNA1:5’to 3’gcgtctcctccgggacgctgagg

GINS2-sgRNA2:5’to 3’ccgaggagaccgtgaggctctgg

GINS2-sgRNA3:5’to 3’attcctcgccgagaaggagctgg

GINS2-sgRNA4:5’to 3’gtcgcctgctccctccagagtgg

GINS2-sgRNA5:5’to 3’cctgctccctccagagtggatgg

GINS2-sgRNA6:5’to 3’gtggatggatgtagaaaagttgg

GINS2-sgRNA7:5’to 3’aatgcccagcccttactacatgg

GINS2-sgRNA8:5’to 3’tcccgaaggcagacgaaatccgg

GINS2-sgRNA9:5’to 3’ggcagacgaaatccggaccctgg

GINS2-sgRNA10:5’to 3’tgacagctttgtgagacagcagg

GINS2-sgRNA11:5’to 3’cagctttgtgagacagcaggagg

GINS2-sgRNA12:5’to 3’gctggataacttgaccttgatgg

GINS2-sgRNA13:5’to 3’ttgatggagatcaacaccagcgg

GINS2-sgRNA14:5’to 3’ccgcacgaacctccagcctctgg

GINS2-sgRNA15:5’to 3’tctggagagtactcagtctcagg

GINS2-sgRNA16:5’to 3’gtctcaggacttctagagaaagg

GINS2-sgRNA17:5’to 3’gatgcatgaaaaatgtgtgatgg

GINS2-sgRNA18:5’to 3’gaaaaatgtgtgatggtgcaagg

GINS2-sgRNA19:5’to 3’atggtgcaaggaatggattcagg

GINS2-sgRNA20:5’to 3’gtccttaaaacttagctccctgg

GINS2-sgRNA21:5’to 3’tccttaaaacttagctccctggg

GINS2-sgRNA22:5’to 3’tctccctagcagagccacttggg

GINS2-sgRNA23:5’to 3’tgcatggaagccatcacacttgg

GINS2-sgRNA24:5’to 3’gcaggtgttcagtgactggtagg

GINS2-sgRNA25:5’to 3’ctggtaggtgtagatacagcagg。

根据这些靶位点，设计具体的sgRNA如下：

GINS2-sgRNA1:5’to 3’gcgtctcctccgggacgctg

GINS2-sgRNA2:5’to 3’ccgaggagaccgtgaggctc

GINS2-sgRNA3:5’to 3’attcctcgccgagaaggagc

GINS2-sgRNA4:5’to 3’gtcgcctgctccctccagag

GINS2-sgRNA5:5’to 3’cctgctccctccagagtgga

GINS2-sgRNA6:5’to 3’gtggatggatgtagaaaagt

GINS2-sgRNA7:5’to 3’aatgcccagcccttactaca

GINS2-sgRNA8:5’to 3’tcccgaaggcagacgaaatc

GINS2-sgRNA9:5’to 3’ggcagacgaaatccggaccc

GINS2-sgRNA10:5’to 3’tgacagctttgtgagacagc

GINS2-sgRNA11:5’to 3’cagctttgtgagacagcagg

GINS2-sgRNA12:5’to 3’gctggataacttgaccttga

GINS2-sgRNA13:5’to 3’ttgatggagatcaacaccag

GINS2-sgRNA14:5’to 3’ccgcacgaacctccagcctc

GINS2-sgRNA15:5’to 3’tctggagagtactcagtctc

GINS2-sgRNA16:5’to 3’gtctcaggacttctagagaa

GINS2-sgRNA17:5’to 3’gatgcatgaaaaatgtgtga

GINS2-sgRNA18:5’to 3’gaaaaatgtgtgatggtgca

GINS2-sgRNA19:5’to 3’atggtgcaaggaatggattc

GINS2-sgRNA20:5’to 3’gtccttaaaacttagctccc

GINS2-sgRNA21:5’to 3’tccttaaaacttagctccct

GINS2-sgRNA22:5’to 3’tctccctagcagagccactt

GINS2-sgRNA23:5’to 3’tgcatggaagccatcacact

GINS2-sgRNA24:5’to 3’gcaggtgttcagtgactggt

GINS2-sgRNA25:5’to 3’ctggtaggtgtagatacagc

为了提高基因编辑效率，包括向间充质干细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白CREnhancer1.0是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。

进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：

a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；

b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

进一步地，克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因，构建EGFP标记的增效蛋白CREnhancer1.0慢病毒表达载体，用GP2-293T细胞包装慢病毒，修饰干细胞。

更进一步地，提供一种在间充质干细胞中采用CRISPR/Cas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：(1)用于表达SEQ ID NO：1所述的CREnhancer1.0基因的质粒；(2)sgRNA已经插入的表达PX330的质粒(其可以表达sgRNA和cas9)。

更进一步地，所述sgRNA和cas9表达载体也可以是本领域常用的其他表达载体。

为实现上述目的，本发明还提供一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系方法，包括将所述基因编辑系统导入间充质干细胞中，获得编辑阳性细胞，随后繁殖、收获所述干细胞。

具体的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015，购买自上海艾研生物科技有限公司。

本发明提供了一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系方法，具有以下优点：本发明在间充质干细胞中，构建了GINS2基因敲除的细胞系，筛选并优化获得了最佳的sgRNA，敲除效率高，传代稳定。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1 PX330质粒图；

图2 PX330中sgRNA插入位点图；

图3 25个sgRNA基因标记效率示意图；

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。

实施例1、CRISPR表达载体的构建

gRNA的设计

根据靶基因的基因序列，通过申请人独特的优化设计方法，具体筛选得到具体的sgRNA的形式如下：

GINS2-sgRNA1:5’to 3’gcgtctcctccgggacgctg

GINS2-sgRNA2:5’to 3’ccgaggagaccgtgaggctc

GINS2-sgRNA3:5’to 3’attcctcgccgagaaggagc

GINS2-sgRNA4:5’to 3’gtcgcctgctccctccagag

GINS2-sgRNA5:5’to 3’cctgctccctccagagtgga

GINS2-sgRNA6:5’to 3’gtggatggatgtagaaaagt

GINS2-sgRNA7:5’to 3’aatgcccagcccttactaca

GINS2-sgRNA8:5’to 3’tcccgaaggcagacgaaatc

GINS2-sgRNA9:5’to 3’ggcagacgaaatccggaccc

GINS2-sgRNA10:5’to 3’tgacagctttgtgagacagc

GINS2-sgRNA11:5’to 3’cagctttgtgagacagcagg

GINS2-sgRNA12:5’to 3’gctggataacttgaccttga

GINS2-sgRNA13:5’to 3’ttgatggagatcaacaccag

GINS2-sgRNA14:5’to 3’ccgcacgaacctccagcctc

GINS2-sgRNA15:5’to 3’tctggagagtactcagtctc

GINS2-sgRNA16:5’to 3’gtctcaggacttctagagaa

GINS2-sgRNA17:5’to 3’gatgcatgaaaaatgtgtga

GINS2-sgRNA18:5’to 3’gaaaaatgtgtgatggtgca

GINS2-sgRNA19:5’to 3’atggtgcaaggaatggattc

GINS2-sgRNA20:5’to 3’gtccttaaaacttagctccc

GINS2-sgRNA21:5’to 3’tccttaaaacttagctccct

GINS2-sgRNA22:5’to 3’tctccctagcagagccactt

GINS2-sgRNA23:5’to 3’tgcatggaagccatcacact

GINS2-sgRNA24:5’to 3’gcaggtgttcagtgactggt

GINS2-sgRNA25:5’to 3’ctggtaggtgtagatacagc

根据上述的gRNA，在其5'端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’，变性、退火体系为：2μl正向寡核苷酸链(50μM)2μl反向寡核苷酸链(50μM)46μll*NEBbuffer在PCR仪中按以下程序运行：90℃，4min；70℃，10min；37℃，20min；25℃，20min。

退火后的双链寡核苷酸链含有BbsI的粘性末端，直接与被BbsI酶切过的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(以下简称PX330)(SEQ ID NO.3)载体进行连接，可以得PX330-gRNA-Cas9重组质粒。

酶切体系：水39.3μl，10*FD buffer 5μl，BbsI 2μl，PX330 3.7μl(2μg)37℃水浴2h酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。

连接体系：退火产物0.5μl，线性化的PX330质粒2μ1，5*ligation buffer 2μl，T4DNA Ligase(3units/μ1)，1μl，水4.5μl，16℃水浴2h将上述步骤得到的连接产物转化JM109感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到PX330-gRNA质粒。

实施例2 克隆增效蛋白CREnhancer1.0及构建载体

克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因，通过全基因合成的方法，获得SEQ ID NO：1所述的基因序列，以该序列为模板，根据上下游引物序列分别为5'-ATGCAGGAGAACCTGGCCCCCTG-3'，5'-CAGGCAGCTCACGCTCCTCTCG-3'，引物和全基因组由上海生工有限公司合成。PCR反应扩增CREnhancer1.0基因目的基因片段，扩增反应体系如下:95℃、40s，57℃、1min，72℃、1min，72℃、10min，循环35次，PCR产物由上海生工有限公司进行测序，通过测序，结合与SEQ ID NO：1完全匹配。随后，将PCR扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015，通过重组而包装成能表达CREnhancer1.0基因的人骨髓间质干细胞。通过PCR筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。

实施例3 CRISPR/Cas9在骨髓间质干细胞中的应用

基于含BSD-fsEGFP融合基因pBGN质粒的CRISPR/Cas9编辑载体

(1)BSD-fsEGFP融合基因：利用常规PCR，扩增公知的BSD基因，5’-PCR引物带HindIII位点，3’-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。将PCR产物(BSD)插入EGFP质粒(EGFP核苷酸序列为本领域公知的序列,例如CN105647968A中的序列1和序列2所示)中CMV驱动子和EGFP编码区的之间的HindIII和EcoRI位点，生成含BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN，BSD-fsEGFP融合基因核苷酸序列为如CN105647968A中的序列3和序列4所示)。该融合基因由CMV驱动子或PGK驱动子驱动，但EGFP由于移码而无活性，因此称fsEGFP。

5’-PCR引物为

CTCAAGCTTAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG，

3’-PCR引物为

AGAATTCCAGTAGGGATAACAGGGTAATGCCAGGTCCGCCCTCCCACACATAACCAGAG。

(2)将测试质粒pBGN，实施例1制备的表达质粒共转染骨髓间质干细胞。以未转染实施例2的增效基因的干细胞作为阳性对照，同时，将常规用的GFP表达质粒平行转染细胞以测定转染效率，利用转染效率校正获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。

(4)转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP⁺细胞的频率。

(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。这个相对效率由GFP阳性细胞频率与转染效率的比值代表，结果如图3所示。我们发现未转染实施例2的增效蛋白的干细胞中GFP阳性细胞频率明显低于转染了实施例2的增效蛋白的细胞。其中在25个sgRNA中，只有GINS2-sgRNA7和GINS2-sgRNA23具有较好的基因编辑效果。采用空载体制备的阴性对照没有GFP阳性细胞，其中P值均小于0.01，具有统计学意义。

将骨髓间质干细胞GINS2-sgRNA23(即采用GINS2-sgRNA23进行CRISPR编辑后获得的干细胞)和将骨髓间质干细胞GINS2-sgRNA7进行稳定传代培养，培养40代之后，通过针对GINS2PCR测序，发现该基因仍然是突变失活的，保持了基因被敲除的效果。这充分说明，本发明的敲出系统具有较好的稳定性。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 洛阳轩智生物科技有限公司

<120> 使用CRISPR-CAS系统对间充质干细胞进行GINS2基因敲除的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgcaggaga acctggcccc ctggggcgag ctggccaccg acaacatcat cctgaccgtg 60

cccaccacca acctgcaggc cctgaaggac cccgagcccg tgctgaggct gtgggacgag 120

atgatgcagg ccgtggccag gctggccgcc gagcccttcc ccttcaggag gcccgagagg 180

atcgtggccg acgtgcagat cagcgccggc tggatgcaca gcggctaccc catcatgtgc 240

cacctggaga gcgtgaagga gatcatcaac gagatggaca tgaggagcag gggcgtgtgg 300

ggccccatcc acgagctggg ccacaaccag cagaggcacg gctgggagtt ccccccccac 360

accaccgagg ccacctgcaa cctgtggagc gtgtacgtgc acgagaccgt gctgggcatc 420

cccagggccc aggcccacga ggccctgagc ccccccgaga gggagaggag gatcaaggcc 480

cacctgggca agggcgcccc cctgtgcgac tggaacgtgt ggaccgccct ggagacctac 540

ctgcaggtgc tgagcaggaa cagcggcagg aggggcgtgg acggcaggct ggtgcacacc 600

tgcatcaagg ccggcgccgt gaggtggctg gccaggggcc agaccggcaa ggtgggcgtg 660

aacaccaacc tgaaggacct gtgccccctg ctgagcgagc acggcctgca gtgcagcctg 720

gagccccacc tgaacagcga cctgtgcgtg tactgctgca aggcctacag cgacaaggag 780

gccaagcagc tgcaggagtt cgtggccgag ggcggcggcc tgctgatcgg cggccaggcc 840

tggtggtggg ccagccagaa ccccggccac tgccccctgg ccggcttccc cggcaacatc 900

atcctgaact gcttcggcct gagcatcctg ccccagaccc tgaaggccgg ctgcttcccc 960

gtgcccaccc ccgagatgag gagctaccac ttcaggaagg ccctgagcca gttccaggcc1020

atcctgaacc acgagaacgg caacctggag aagagctgcc tggccaagct gagggtggac1080

ggcgccgcct tcctgcagat ccccgccgag ggcgtgcccg cctacatcag cctgcacagg1140

ctgctgagga agatgctgag gggcagcggc ctgcccgccg tgagcaggga gaaccccgtg1200

gccagcgaca gctacgaggc cgccgtgctg agcctggcca ccggcctggc ccacagcggc1260

accgactgca gccagctggc ccagggcctg ggcacctgga cctgcagcag cagcctgtac1320

cccagcaagc accccatcac cgtggagatc aacggcatca accccggcaa caacgactgc1380

tgggtgagca ccggcctgta cctgctggag ggccagaacg ccgaggtgag cctgagcgag1440

gccgccgcca gcgccggcct gagggtgcag atcggctgcc acaccgacga cctgaccaag1500

gccaggaagc tgagcagggc ccccatggtg acccaccagt gctggatgga caggaccgag1560

aggagcgtga gctgcctg 1578

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Gln Glu Asn Leu Ala Pro Trp Gly Glu Leu Ala Thr Asp Asn Ile

1 5 10 15

Ile Leu Thr Val Pro Thr Thr Asn Leu Gln Ala Leu Lys Asp Pro Glu

20 25 30

Pro Val Leu Arg Leu Trp Asp Glu Met Met Gln Ala Val Ala Arg Leu

35 40 45

Ala Ala Glu Pro Phe Pro Phe Arg Arg Pro Glu Arg Ile Val Ala Asp

50 55 60

Val Gln Ile Ser Ala Gly Trp Met His Ser Gly Tyr Pro Ile Met Cys

65 70 75 80

His Leu Glu Ser Val Lys Glu Ile Ile Asn Glu Met Asp Met Arg Ser

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Pro Ile His Glu Leu Gly His Asn Gln Gln Arg

100 105 110

His Gly Trp Glu Phe Pro Pro His Thr Thr Glu Ala Thr Cys Asn Leu

115 120 125

Trp Ser Val Tyr Val His Glu Thr Val Leu Gly Ile Pro Arg Ala Gln

130 135 140

Ala His Glu Ala Leu Ser Pro Pro Glu Arg Glu Arg Arg Ile Lys Ala

145 150 155 160

His Leu Gly Lys Gly Ala Pro Leu Cys Asp Trp Asn Val Trp Thr Ala

165 170 175

Leu Glu Thr Tyr Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Ser Gly Arg Arg Gly

180 185 190

Val Asp Gly Arg Leu Val His Thr Cys Ile Lys Ala Gly Ala Val Arg

195 200 205

Trp Leu Ala Arg Gly Gln Thr Gly Lys Val Gly Val Asn Thr Asn Leu

210 215 220

Lys Asp Leu Cys Pro Leu Leu Ser Glu His Gly Leu Gln Cys Ser Leu

225 230 235 240

Glu Pro His Leu Asn Ser Asp Leu Cys Val Tyr Cys Cys Lys Ala Tyr

245 250 255

Ser Asp Lys Glu Ala Lys Gln Leu Gln Glu Phe Val Ala Glu Gly Gly

260 265 270

Gly Leu Leu Ile Gly Gly Gln Ala Trp Trp Trp Ala Ser Gln Asn Pro

275 280 285

Gly His Cys Pro Leu Ala Gly Phe Pro Gly Asn Ile Ile Leu Asn Cys

290 295 300

Phe Gly Leu Ser Ile Leu Pro Gln Thr Leu Lys Ala Gly Cys Phe Pro

305 310 315 320

Val Pro Thr Pro Glu Met Arg Ser Tyr His Phe Arg Lys Ala Leu Ser

325 330 335

Gln Phe Gln Ala Ile Leu Asn His Glu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ser

340 345 350

Cys Leu Ala Lys Leu Arg Val Asp Gly Ala Ala Phe Leu Gln Ile Pro

355 360 365

Ala Glu Gly Val Pro Ala Tyr Ile Ser Leu His Arg Leu Leu Arg Lys

370 375 380

Met Leu Arg Gly Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Arg Glu Asn Pro Val

385 390 395 400

Ala Ser Asp Ser Tyr Glu Ala Ala Val Leu Ser Leu Ala Thr Gly Leu

405 410 415

Ala His Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gln Leu Ala Gln Gly Leu Gly Thr

420 425 430

Trp Thr Cys Ser Ser Ser Leu Tyr Pro Ser Lys His Pro Ile Thr Val

435 440 445

Glu Ile Asn Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Asp Cys Trp Val Ser Thr

450 455 460

Gly Leu Tyr Leu Leu Glu Gly Gln Asn Ala Glu Val Ser Leu Ser Glu

465 470 475 480

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Leu Arg Val Gln Ile Gly Cys His Thr Asp

485 490 495

Asp Leu Thr Lys Ala Arg Lys Leu Ser Arg Ala Pro Met Val Thr His

500 505 510

Gln Cys Trp Met Asp Arg Thr Glu Arg Ser Val Ser Cys Leu

515 520 525

<210> 3

<211> 8506

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 900

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc1020

tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg1080

accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag1140

ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac1200

ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc atggactata1260

aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga1320

tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt1380

acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt1440

acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga1500

agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga1560

agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga1620

tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct1680

tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg1740

aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca1800

gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc1860

ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt1920

tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg1980

gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc2040

tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga2100

gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc2160

agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc2220

agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca2280

tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat2340

acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg2400

agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg2460

gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg2520

gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct2580

tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc2640

ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga2700

ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga2760

tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg2820

gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg2880

agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga2940

ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga3000

aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga3060

aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag3120

atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg3180

acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac3240

tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg3300

acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga3360

agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt3420

ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta3480

aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg3540

ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg3600

acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca3660

gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg3720

aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc3780

agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg3840

accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga3900

gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg3960

gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc4020

agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga4080

gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc4140

ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg4200

agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg4260

atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc4320

acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg4380

aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga4440

gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact4500

ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga4560

caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga4620

aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct4680

tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg4740

actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg4800

tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg4860

ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca4920

agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg4980

agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg5040

aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc5100

tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact5160

acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg5220

ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc5280

aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca5340

agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg5400

ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc5460

tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagt5520

aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt5580

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc5640

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg5700

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga5760

gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct5820

cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt5880

gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca5940

tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc6000

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc6060

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc6120

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc6180

gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg6240

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact6300

ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt6360

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa6420

atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag6480

ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc6540

ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt6600

tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag6660

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg6720

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga6780

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat6840

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca6900

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc6960

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca7020

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg7080

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca7140

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gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca7380

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta7440

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct7500

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca7560

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag7620

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat7680

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt7740

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa7800

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga7860

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg7920

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc7980

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag8040

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc8100

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg8160

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac8220

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga8280

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt8340

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag8400

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg8460

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 8506

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

atgcaggaga acctggcccc ctg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

caggcagctc acgctcctct cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

aatgcccagc ccttactaca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

tgcatggaag ccatcacact 20

Claims (4)

1.一种用于骨髓干细胞细胞基因编辑的CRISPR-CAS系统，其特征在于：系统的组成包括：(1)用于表达SEQ ID NO：1所述的CREnhancer1.0基因的质粒；(2)用于表达SEQ ID NO：6或7任一所示sgRNA的PX330的质粒。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：(1)的质粒可以提前导入到基因编辑细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入(2)的质粒。

3.权利要求1的系统在制备用于骨髓间充质干细胞基因编辑的试剂中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其中骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015。