CN107604036B - 一种制备β-胡萝卜素的方法以及β-胡萝卜素制品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备β‑胡萝卜素的方法以及β‑胡萝卜素制品。本发明公开的制备β‑胡萝卜素的方法，该方法通过在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入生物酶，进行酶解处理，该生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合。通过生物酶的作用，以酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等物质，达到降低发酵液粘度，改善菌丝分布程度，有效提高发酵液中溶氧，进而实现提高β胡萝卜素产量和提高产品质量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种制备β-胡萝卜素的方法以及β-胡萝卜素制品。
背景技术
β-胡萝卜素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有良好的抗氧化、抗癌防癌功效，且对预防心血管疾病、增强机体免疫力以及延缓衰老等都具有一定的作用，是一种很有开发价值的功能性天然色素。
β-胡萝卜素原料的生产，主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法所需要的原料主要是胡萝卜，番茄等植物，这些植物受气候、产地、运输等条件限制，且植物提取工艺繁琐冗长，成本昂贵，不能满足工业化生产的需求。化学合成法尽管成本较低，但其对环境影响比较大，且产品活性较低，因此应用范围受到极大限制。
采用微生物发酵法生产β-胡萝卜素，其产品质量和生理活性和天然提取产品完全相同，且不受环境条件限制，具有产量高、成本低、安全性高、易于被人体吸收等优点。
三孢布拉氏霉菌是最常用的β-胡萝卜素生产菌株。但是，现有的以三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的方法得到的β-胡萝卜素产量较低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备β-胡萝卜素的方法，该方法通过在发酵过程中加入的生物酶的作用，以酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等，达到降低发酵液粘度，提高溶氧，进而实现提高β胡萝卜素产量的目的。
本发明的另一目的在于提供一种β-胡萝卜素制品，其具有较高含量的β-胡萝卜素，具有广阔的应用范围。
本发明是这样实现的：
一种制备β-胡萝卜素的方法，其包括：在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入生物酶，进行酶解处理；
所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合。
一种β-胡萝卜素制品，该β-胡萝卜素制品由三孢布拉氏霉正负菌混合后发酵所制得的含有类胡萝卜素的混合物，其中：
(1)全反式β-胡萝卜素与γ-胡萝卜素的比例不低于272(质量比)；
(2)全反式β-胡萝卜素与9-cis-β-胡萝卜素的比例不低于380(质量比)；
(3)全反式β-胡萝卜素与13-cis-β-胡萝卜素的比例不低于126(质量比)。
本发明具有以下有益效果：
三孢布拉氏霉菌属于高度嗜氧的微生物，且生长过程中菌丝容易缠绕成团，导致对数生长期溶氧量远远不够，氧的不足会造成代谢异常、生物量和目标代谢产物产率降低，供氧问题是制约三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的重要因素。此外，供氧不足的情况下，全反式β-胡萝卜素纯度会大大降低，γ胡萝卜素、9-cis-β胡萝卜素、13-cis-β等杂质含量会提高，影响产品的品质。本发明针对β-胡萝卜素的产量及纯度的提高以及杂质降低的问题提供了一系列方案予以解决。
本发明提供的制备β-胡萝卜素的方法，该方法通过在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入生物酶，进行酶解处理，该生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合。通过生物酶的作用，以酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等物质，达到降低发酵液粘度，改善菌丝分布程度，有效提高发酵液中溶氧，进而实现提高β胡萝卜素产量，提高β胡萝卜素纯度的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的发酵液中的三孢布拉氏霉菌在显微镜下的状态图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种制备β-胡萝卜素的方法以及β-胡萝卜素制品进行具体说明。
三孢布拉氏霉菌是最常用的β-胡萝卜素生产菌株。在使用三孢布拉氏霉菌生产β-胡萝卜素的方法中，由于三孢布拉氏霉菌属于高度嗜氧的微生物，且生长过程中菌丝容易缠绕成团，导致对数生长期溶氧量远远不够，氧的不足会造成代谢异常、生物量和目标代谢产物产率降低，因此供氧问题是制约三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的重要因素。
本发明的发明人发现，导致发酵液中的溶氧水平降低的一个主要因素是三孢布拉氏霉菌在发酵过程中发生缠绕、抱团现象，通过改善这种菌丝缠绕、抱团的现象可以提高发酵液中的溶氧水平，提高β-胡萝卜素产量。
通过进一步的研究和创造性的思维劳动，发明人进一步发现，导致三孢布拉氏霉菌在发酵过程中发生缠绕、抱团现象的主要原因在于三孢布拉氏霉菌在发酵过程中易产生黏性物质例如果胶质、蛋白、油脂等物质，这些物质起到了黏性作用，导致菌丝缠绕、抱团现象。
基于此，一方面，本发明实施例提供了一种制备β-胡萝卜素的方法，其包括：在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入生物酶，进行酶解处理；
所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合。
该方法通过在发酵过程中加入的生物酶的作用，以酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等具有粘连作用的物质，达到降低发酵液粘度，提高发酵液溶氧，改善菌丝分布程度，使菌丝能够最大程度地与氧气接触，进而实现提高β胡萝卜素产量的目的。
需要说明的是，上述的生物酶可以是单一酶类，例如可以是果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶，也可以是两种、三种或四种酶的组合。
例如生物酶是两种酶的组合，该组合可以是果胶酶和纤维素酶的组合，果胶酶和中性蛋白酶的组合，果胶酶和脂肪酶的组合，纤维素酶和中性蛋白酶的组合，纤维素酶和脂肪酶的组合，或者是中性蛋白酶和脂肪酶的组合。
例如生物酶是三种酶的组合，该组合可以是纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合，或者是果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合，或者是果胶酶、纤维素酶和脂肪酶的组合，又或者是果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述生物酶的添加量与所述发酵液的初始体积比(即质量体积比(g：ml))为(0.05-0.12):100。
其中，发酵液的初始体积是指，发酵液刚接种三孢布拉氏霉菌时的体积，即为初始体积；每100ml的发酵液添加0.05-0.12g生物酶。
优选地，在本发明的一些实施方案中，所述生物酶的添加量与所述发酵液的初始体积比为0.1:100。即每100ml的发酵液添加0.1g生物酶。
过早或过晚加入生物酶均对酶解效果产生影响；例如过早加入生物酶，会对菌体生长造成影响，使菌体的量积累不足，又例如过晚加入生物酶，由于菌丝的量积累太多，菌丝体相互之间缠绕过于紧密，导致加入的生物酶无法充分酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等物质，酶解效果不理想，进而影响最终的β胡萝卜素含量的提高。因此，在合适的时间加入生物酶可以提高酶解效果，有利于提高β胡萝卜素含量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵培养过程中，在发酵培养第20小时-第90小时期间添加所述生物酶。
需要说明的是，以刚接种三孢布拉氏霉菌时(第0小时)，作为发酵培养的起始时间。在发酵培养的第20小时-第90小时期间添加所述生物酶可以起到较好的酶解效果，提高β胡萝卜素含量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为(2-4):(2-3):(1-2):(1-2)。
通过控制果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比，可以有效地提高酶解效果，进而提高β胡萝卜素产量。
优选地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为4:3:2:2。
果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为4:3:2:2时，发酵液中的β-胡萝卜素产量可达10.18g/L，相对于空白对照(不添加生物酶)提高了99.22％。
优选地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为3:2:2:1。
果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为3:2:2:1时，发酵液中的β-胡萝卜素产量可达9.76g/L，相对于空白对照(不添加生物酶)提高了91.00％。
优选地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为2:2:1:1。
果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为2:2:1:1时，发酵液中的β-胡萝卜素产量可达9.51g/L，相对于空白对照(不添加生物酶)提高了86.11％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为(2-3):(1-2):(1-2)。
优选地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为2:2:1。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，当所述生物酶选自果胶酶和纤维素酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶和纤维素酶质量比为1:1。
需要说明的是，所用的生物酶的酶活性为：果胶酶10000-1000000U/g；纤维素酶10000-800000U/g；中性蛋白酶100000-1500000U/g；脂肪酶10000-200000U/g。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵培养前，所述方法还包括：将含有所述三孢布拉氏霉菌正菌和所述三孢布拉氏霉菌负菌的种子液以9-11％的接种量接种至所述发酵液中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述种子液中，所述三孢布拉氏霉菌正菌与所述所述三孢布拉氏霉菌负菌的菌体质量比为1:1-1:50。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在加入所述生物酶之前，所述方法还包括：采用物理手段处理发酵液提高溶氧；
所述物理手段包括如下方式中的任意一种：
(1)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行剪切处理；
(2)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行胶体磨处理；
(3)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行旋流混合气动处理。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述剪切处理的条件为：转速为300-15000转/分钟，剪切时间为1-30分钟；
所述胶体磨处理的条件为：胶体磨的磨齿间隙0.01-1.5mm，研磨转速为1000-9000转/分钟，研磨次数为1-10次；
所述旋流混合气动处理为：利用旋流混合器进行旋流混合气动处理，旋流混合器的进气压力为0.15-0.25MPa，气流量为50-300Nm3/min。
本发明的发明人发现，在发酵培养一段时间后，其在加入生物酶之前，通过采用物理手段(例如剪切处理、胶体磨处理、旋流混合气动处理)对发酵液进行处理，可进一步提高β-胡萝卜素产量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述三孢布拉氏霉菌正菌为三孢布拉氏霉菌BT7251(+)，保藏编号为CCTCC M2014378；所述三孢布拉氏霉菌负菌为三孢布拉氏霉菌BT7603(-)，保藏编号为CCTCC M2014379。
三孢布拉氏霉菌正菌菌株：三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7251(+)，于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2014378；
三孢布拉氏霉菌负菌菌株：三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7603(-)，于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2014379。
三孢布拉氏霉菌正、负菌混合培养生产β-胡萝卜素中，正、负菌的菌丝体相互接触、融合，不断生成接合孢子，进而合成β-胡萝卜素。
使用保藏编号为CCTCC M 2014378三孢布拉霉菌株正菌和保藏编号为CCTCC M2014379的三孢布拉霉菌株负菌生产β-胡萝卜素，可以提高β-胡萝卜素的产量；且由于该菌株对发酵工艺要求低，可以使得发酵工艺简单，便于控制，有利于工业化生产。
当然，需要说明的，本发明也可以采用其他类型的三孢布拉氏霉菌进行发酵培养，以生产β-胡萝卜素。
另一方面，本发明提供了一种β-胡萝卜素制品，该β-胡萝卜素制品由三孢布拉氏霉正负菌混合后发酵所制得的含有类胡萝卜素的混合物，其中：
(1)全反式β-胡萝卜素与γ-胡萝卜素的比例不低于272(质量比)；
(2)全反式β-胡萝卜素与9-cis-β-胡萝卜素的比例不低于380(质量比)；
(3)全反式β-胡萝卜素与13-cis-β-胡萝卜素的比例不低于126(质量比)。
进一地，在本发明的一些实施方案中，该β-胡萝卜素制品中全反式β胡萝卜素占类胡萝卜素的98％(质量比)以上。
本发明实施例提供的β-胡萝卜素制品，其β-胡萝卜素含量较高，具有广阔的应用范围。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的一种制备β-胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：
1斜面培养
取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
其中，三孢布拉氏霉菌正菌为三孢布拉氏霉菌BT7251(+)，保藏编号为CCTCCM2014378；三孢布拉氏霉菌负菌为三孢布拉氏霉菌BT7603(-)，保藏编号为CCTCCM2014379。
其中，PDA斜面培养基包括：葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；其配制方法可参考如下：将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉即可。
2种子培养
分别从三孢布拉氏霉菌正、负菌株的PDA斜面培养基上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，再分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。
其中，种子培养基包括：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3发酵培养(摇瓶发酵)
将步骤2中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液，按照正、负菌菌体质量比为1:1混合均匀，得到种子液混合液，以10％(体积比)接种量将该种子液混合液接入装有40ml发酵液的250ml三角瓶中，于25℃，180rpm条件下培养；
其中，发酵液包括：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
在发酵培养开始后的第36h时，加入发酵液初始体积0.1％的生物酶(每100mL发酵液中加入0.1g生物酶，加入方式为一次性全部加入)，于25℃，180rpm培养120小时。
本实施例中，生物酶为纤维素酶(20000U/g)。
4发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，得到含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
5准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测，检测结果见表1。
其中，高效液相色谱检测方法参考如下：
1色谱条件：
色谱柱：Suplex PKB-100(Supelco)；250x 4.6mm，5μm；
波长：453nm；
流速：0.5ml/min；
进样体积：10μL；
柱温：30℃；
2流动相配制及条件：
A相：甲醇
B相：称取50mgBHT至1L容量瓶中，加20ml异丙醇溶解。加入0.2ml N,N-二异丙基乙胺，25ml 0.2％醋酸铵溶液，455ml乙腈，450m甲醇，溶液恢复至室温，并用甲醇稀释至刻度。
流动相梯度表
| 时间(min) | 流速(ml/min) | A％ | B％ |
| 0 | 0.5 | 0 | 100 |
| 32 | 0.5 | 16 | 84 |
| 50 | 0.5 | 16 | 84 |
| 57 | 0.5 | 0 | 100 |
6使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
其中，在其他的实施例中，步骤4-6为可选步骤，可根据实际情况选择进行。
实施例2
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶(50000U/g)。检测结果见表1。
实施例3
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为中性蛋白酶(100000U/g)。检测结果见表1。
实施例4
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为脂肪酶(10000U/g)。检测结果见表1。
实施例5
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶和纤维素酶的组合，其中，果胶酶(50000U/g)和纤维素酶(20000U/g)质量比为1:1；检测结果见表1。
实施例6
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶(50000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)的组合，其中，果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为2:1:1；得到的干菌体中的类胡萝卜素含量结果见表1。
实施例7
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)的组合，其中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为2:2:1:1；检测结果见表1。
实施例8
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)的组合，其中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为3:2:2:1；检测结果见表1。
实施例9
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中添加的生物酶为果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)的组合，其中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为4:3:2:2；检测结果见表1。
对比例1
本对比例提供的制备β-胡萝卜素的方法，与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：步骤3发酵培养过程中不添加生物酶，检测结果见表1。
表1
表中：干菌体的β-胡萝卜素含量是指每100g干菌体含β-胡萝卜素量(g)。
实施例10-14
实施例10-14提供的制备β-胡萝卜素的方法与实施例1基本相同，不同之处见表2，其相应的β-胡萝卜素产量的检测结果见表2。所用的生物酶的酶活性为：果胶酶100000U/g、纤维素酶50000U/g、中性蛋白酶200000U/g、脂肪酶20000U/g。
对比例2
对比例2的制备β-胡萝卜素的方法与对比例1相同，相应的检测结果见表2。
表2
实施例15-19
实施例15-19提供的制备β-胡萝卜素的方法与实施例1基本相同，不同之处见表3，其相应的检测结果见表3。所用的生物酶的酶活性为：果胶酶25000U/g、纤维素酶50000U/g、中性蛋白酶150000U/g、脂肪酶10000U/g。
对比例3
对比例3的制备β-胡萝卜素的方法与对比例1相同，相应的检测结果见表3。
表3
从上述结果可看出，本发明实施例1-19提供的制备β-胡萝卜素的方法，每个实施例中的干菌体中和发酵液中的β-胡萝卜素含量、全反式β胡萝卜素比例、β与γ胡萝卜素的比例、β与9-cis-β胡萝卜素的比例、β与13-cis-β胡萝卜素的比例均高于相应的对比例，由此可说明，在发酵培养过程(培养时间20-90h)添加选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的中的任意一种或几种的组合的生物酶(添加量0.1-0.8％)时能够提高菌体中β-胡萝卜素的产量和纯度。
尤其是，当生物酶为选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时菌体中β-胡萝卜素的产量高于添加单一种类的生物酶；更尤其是，当果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为4:3:2:2时，发酵液中的β-胡萝卜素产量可达10.18g/L，相对于对比例(不添加生物酶)产量提高了99.22％。
实施例20-22
实施例20-22提供的制备β-胡萝卜素的方法与实施例1基本相同，不同之处在于发酵培养步骤，将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀，以10％(体积比)接种量接入50L发酵罐中，发酵培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(L/L.min)，罐压0.1Mpa，培养时间120h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。在发酵培养开始后的第36h时采用流加方式往发酵罐中加入生物酶，流速控制0.1g/L/min，生物酶用量见表4。所用的生物酶的酶活性为：果胶酶100000U/g、纤维素酶50000U/g、中性蛋白酶200000U/g、脂肪酶100000U/g。
其相应的检测结果见表4。
对比例4
对比例4的制备β-胡萝卜素的方法与实施例20的方法基本相同相同，但不添加生物酶，其相应的检测结果见表4。
表4
从表4可看出，与对比例4相比，在大规模发酵过程中，通过加入生物酶的方式也能够提高相应的β-胡萝卜素产量和纯度。尤其是实施例22提供的制备β-胡萝卜素的方法，其相对于对比例4的β-胡萝卜素产量提高比例达104.28％。
实施例23
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：
1斜面培养
取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
其中，三孢布拉氏霉菌正菌为三孢布拉氏霉菌BT7251(+)，保藏编号为CCTCCM2014378；三孢布拉氏霉菌负菌为三孢布拉氏霉菌BT7603(-)，保藏编号为CCTCCM2014379。
2种子培养
分别从三孢布拉氏霉菌正、负菌株的PDA斜面培养基上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，再分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。
3发酵培养
3.1将步骤2中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀，以10％(体积比)接种量接入50L发酵罐中，发酵培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(L/L.min)，罐压0.1Mpa，培养时间120h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。
3.2在发酵培养开始后的第20h时，由于菌体生长菌浓增加，溶氧下降(记为DO1)，同时，取少量发酵液，于电子显微镜下观察菌丝形态，结果如图1中的A所示。此时，将发酵液经8000转/分钟剪切5分钟后，溶氧上升(记为DO2)。
其中剪切方法为：将待剪切的发酵液移入装有在线剪切装置的缓冲罐，在缓冲罐中经过剪切后再移入发酵罐中。剪切时在缓冲罐夹套中通入冷冻水，以控制剪切过程中剪切体系温度为25-30℃。
3.3随着发酵过程中菌体分泌的果胶质、大分子蛋白、油脂等物质的增多，导致发酵液粘度增大，在发酵培养开始后的第48h时，溶氧再次下降(记为DO3)，此时加入发酵液体积0.3％的果胶酶(100000U/g)，流速控制0.1g/L/min。酶流加结束2小时后，溶氧上升(记为DO4)，且取少量发酵液，于电子显微镜下观察菌丝形态，结果如图1中的B所示。
4发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即得含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
5准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量，结果见表5。
6使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
由图1结果可看出(图中：A为剪切处理前的发酵液中菌体在显微镜下的观察结果图，B为生物酶流加结束时的发酵液中菌体在显微镜下的观察结果图)，在发酵培养开始后的第20h时，发酵液中菌丝缠绕、抱团聚集在一起(图1-A)，通过剪切处理和生物酶的处理后，菌丝呈均匀分散状态(图1-B)。
实施例24
本实施例提供的制备β-胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：
1斜面培养
操作同实施例23。
2种子培养
操作同实施例23。
3发酵培养
3.1将步骤2中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀，以10％(体积比)接种量接入50L发酵罐中，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(L/L.min)，罐压0.1MPa培养时间120h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。
3.2在发酵培养开始后的第20h时，由于菌体生长菌浓增加，溶氧下降(记为DO1))。将发酵液使用胶体磨研磨，磨齿间隙1mm，4000转/分钟，循环研磨2次，溶氧上升(记为DO2)。
研磨过程：将发酵液从物料进口移入在线式胶体磨，从物料出口移入发酵罐中，循环研磨。研磨过程中通过向冷却系统中通入冷冻水，以控制研磨过程中体系温度为25-30℃。
3.3随着发酵过程中菌体分泌的果胶质、大分子蛋白、油脂等物质的增多，导致发酵液粘度增大，在发酵培养开始后的第48h时，溶氧下降(记为DO3)，此时加入发酵液体积0.3％的果胶酶(100000U/g)和中性蛋白酶(200000U/g)按质量比为1:1组成的复合酶，流速控制0.1g/L/min。酶流加结束2小时后，溶氧上升(记为DO4)。
4发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即得含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
5准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测，结果见表5。
实施例25
1斜面培养
操作同实施例23。
2种子培养
操作同实施例23。
3扩大培养
最终种子罐的体积为10m3，依次选用容积为10L，100L，1m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤2中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照10％(体积比)接种量分别接种到种子罐中进行培养，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1vvm(L/L.分钟)，培养时间48h，所述扩大培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4发酵罐培养
4.1将步骤3中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀后，以10％(体积比)接种量接入10m3安装有旋流混合器的发酵罐中。
培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(L/L.分钟)，罐压0.05-0.1MPa，培养时间120-144h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4.2在发酵培养开始后的第20h时，由于菌体生长菌浓增加，溶氧下降(记为DO1)。将发酵液使用旋流混合器混合，旋流混合器进气压力0.2MPa，气流量150Nm3/min，溶氧上升(记为DO2)。
4.3随着发酵过程中菌体分泌的果胶质、大分子蛋白、油脂等物质的增多，导致发酵液粘度增大，在发酵培养开始后的第48h时，溶氧下降(记为DO3)，此时加入发酵液体积0.3％生物酶，生物酶为果胶酶(100000U/g)、中性蛋白酶(200000U/g)和脂肪酶(50000U/g)按质量比为2:1:1组成的复合酶，流速控制0.1g/L/min。酶流加结束2小时后，溶氧上升(记为DO4)。
5发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即得含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
6准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测，结果见表5。
实施例26
1斜面培养
操作同实施例25。
2种子培养
操作同实施例25。
3扩大培养
操作同实施例25。
4发酵培养
4.1将步骤3中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀后，以10％(体积比)接种量接入10m3安装有旋流混合器的发酵罐中。
培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(L/L.分钟)，罐压0.05-0.1MPa，培养时间120-144h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4.2在发酵培养开始后的第20h时，由于菌体生长菌浓增加，溶氧下降(记为DO1)。将发酵液使用环流混合器混合，旋流混合器进气压力0.3MPa，气流量300Nm3/min，溶氧上升(记为DO2)。
4.3随着发酵过程中菌体分泌的果胶质、大分子蛋白、油脂等物质的增多，导致发酵液粘度增大，在发酵培养开始后的第48h时，溶氧下降(记为DO3)，此时加入发酵液体积0.3％的生物酶，生物酶为果胶酶(100000U/g)、纤维素酶(50000U/g)、中性蛋白酶(200000U/g)和脂肪酶(50000U/g)按质量比为3：2:1:1组成的复合酶，流速控制0.1g/L/min。酶流加结束2小时后，溶氧上升(记为DO4)。5发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即得含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
6准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测，结果见表5。
实施例27
1斜面培养
操作同实施例25。
2种子培养
操作同实施例25。
3扩大培养
操作同实施例25。
4发酵罐培养
4.1将步骤3中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀后，以10％(体积比)接种量接入10m3发酵罐中。
培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(L/L.分钟)，罐压0.05-0.1MPa，培养时间120-144h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。发酵培养基同实施例22。
4.2在发酵培养开始后的第20h时，由于菌体生长菌浓增加，溶氧下降(记为DO1)。将发酵液8000转/分钟剪切5分钟后，溶氧上升(记为DO2)。
剪切过程：将待剪切的发酵液通过移种管道移入缓冲罐，在缓冲罐中经过剪切后再移入发酵罐中。剪切过程中通过在缓冲罐夹套中通入冷冻水，以控制剪切过程中剪切体系温度为25-30℃。
4.3随着发酵过程中菌体分泌的果胶质、大分子蛋白、油脂等物质的增多，导致发酵液粘度增大，在发酵培养开始后的第48h时，溶氧下降(记为DO3)，此时加入发酵液体积0.3％的生物酶，生物酶为果胶酶(100000U/g)和纤维素酶(20000U/g)按质量比为1:1组成的复合酶，流速控制0.1g/L/min。酶流加结束2小时后，溶氧上升(记为DO4)。
5发酵培养结束后，收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重，即得含有β-胡萝卜素的β-胡萝卜素生物制品。
6准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测，结果见表5。
对比例5
对比例5的制备β-胡萝卜素的方法与实施例25的方法基本相同相同，但不通过物理手段处理发酵液，也不添加生物酶，其相应的检测结果见表5。
表5
从表5数据可知，通过对发酵液采用剪切处理、胶体磨处理或者旋转混流处理等物理手段的处理以及加入生物酶手段可明显提高发酵液中的溶氧水平；且相较于单一的添加生物酶来提高β-胡萝卜素产量的这种方式，结合物理手段例如采用剪切处理、胶体磨处理或者旋转混流处理等提高发酵液中溶氧的方式也可明显提高β-胡萝卜素产量和纯度。
综上，本发明提供的制备β-胡萝卜素的方法，其通过在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合的生物酶，进行酶解处理，通过生物酶的作用，以酶解菌丝之间粘连的果胶质、蛋白、油脂等物质，达到降低发酵液粘度，改善菌丝分布程度，有效提高发酵液中溶氧，进而实现提高β胡萝卜素产量，提高β胡萝卜素纯度的目的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，其包括：在发酵培养过程中，向含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液中加入生物酶，进行酶解处理；
所述生物酶选自果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶中的任意一种或几种的组合；
在发酵培养过程中，在发酵培养第20小时-第90小时期间添加所述生物酶。
2.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述生物酶的添加量与所述发酵液的初始体积比为(0.05-0.12):100。
3.根据权利要求1或2所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，当所述生物酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶的质量比为(2-4):(2-3):(1-2):(1-2)。
4.根据权利要求1或2所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，当所述生物酶为果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶质量比为(2-3):(1-2):(1-2)。
5.根据权利要求1或2所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，当所述生物酶为果胶酶和纤维素酶的组合时，在所述生物酶中，果胶酶和纤维素酶质量比为1:1。
6.根据权利要求1或2所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，在加入所述生物酶之前，所述方法还包括：采用物理手段处理发酵液提高溶氧；
所述物理手段包括如下方式中的任意一种：
(1)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行剪切处理；
(2)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行胶体磨处理；
(3)对含有三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的发酵液进行旋流混合气动处理。
7.根据权利要求6所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述剪切处理的条件为：转速为300-15000转/分钟，剪切时间为1-30分钟；
所述胶体磨处理的条件为：胶体磨的磨齿间隙0.01-1.5mm，研磨转速为1000-9000转/分钟，研磨次数为1-10次；
所述旋流混合气动处理为：利用旋流混合器进行旋流混合气动处理，旋流混合器的进气压力为0.15-0.25MPa，气流量为50-300Nm3/min。
8.一种β-胡萝卜素制品，其特征在于，该β-胡萝卜素制品由三孢布拉氏霉正负菌混合后发酵所制得的含有类胡萝卜素的混合物，所述β-胡萝卜素制品由根据权利要求1-7任一项所述的制备β-胡萝卜素的方法制得，其中：
(1)全反式β-胡萝卜素与γ-胡萝卜素的比例不低于272(质量比)；
(2)全反式β-胡萝卜素与9-cis-β-胡萝卜素的比例不低于380(质量比)；
(3)全反式β-胡萝卜素与13-cis-β-胡萝卜素的比例不低于126(质量比)。
9.根据权利要求8所述的β-胡萝卜素制品，其特征在于，该β-胡萝卜素制品中全反式β胡萝卜素占类胡萝卜素的98％(质量比)以上。
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