CN107604018A - 一种布瓦西坦中间体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种布瓦西坦中间体的制备方法，以4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮为底物，在重组烯还原酶和辅酶及辅酶再生系统的作用下，在温度为25℃‑30℃且pH值为6.0‑9.0的水相缓冲液中反应生成中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2‑酮。本发明通过采用特定的烯还原酶，解决了现有布瓦西坦中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2‑酮合成路线长、收率低、成本高和采用有毒危险试剂造成环保压力大的问题，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种布瓦西坦中间体的制备方法。
背景技术
布瓦西坦(brivaracetam)，化学名为(2S)-2-[(4R)-2-氧代-4-丙基-1-吡咯烷基]丁酰胺，其结构式如下：
布瓦西坦是由比利时UCB最新开发的第三代抗癫痫药物，分别于2016年1月和2月获EMEA和FDA批准上市，用于治疗成人和16岁以上青少年癫痫患者的部分发作、伴有或不伴有继发性全身发作的辅助治疗。
作为一种新型的SV2A高亲和性配体，布瓦西坦通过影响突触功能发挥抗癫痫作用，同时对电压依赖性Na离子通道也有一定的抑制作用，通过与钠离子通道相互作用，抑制兴奋性神经递质的释放，减少痫性放电的持续时间和频率，从而减少癫痫的发作。鉴于其良好的药理学活性、临床疗效及安全性，布瓦西坦有望成为继左乙拉西坦后又一重磅抗癫痫药物。
(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮是布瓦西坦合成过程中一个关键的中间体，BenoitM.(J.Med.Chem.2004,47,530-549)报道了如下反应路线：
Arnaud Schülé等(Org.Process Res.Dev.,2016,20(9),pp 1566–1575)报道了另一种合成路线，如下：
Kosugi H等(J.Org.Chem.,1987,52(6),pp 1078–1082，J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1,1989,0,935-943)设计了如下反应路线：
中国专利CN201510648574、CN201511028929公布了如下反应路线：
中国专利CN201611008717公布了如下反应路线：
上述路线中，路线1、2在合成过程中，采用手性柱或酶拆分的方式，得到单一构型的产品，这一方法路线长，收率低；路线3、4、5则采用手性起始原料直接构建手性中心的方法合成(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮，虽然可避免手性拆分导致收率低的问题，但是手性起始原料价格较贵，提高了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种布瓦西坦中间体的制备方法，该方法反应条件温和、反应效率高、操作简便、无需手性拆分，且收率高、成本低。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：一种布瓦西坦中间体的制备方法，以4-正丙基-2(5H)-呋喃酮为底物，在烯还原酶和辅酶及辅酶再生系统的作用下进行反应，具体步骤包括：
步骤1：重组烯还原酶的制备：将已双酶切的表达载体pET-30a与合成的目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激60sec。冰上放置2min。加入预热的0.45mL LB培养基220rpm 37℃培养1h。将200uL菌液加入含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12-16，得到重组菌E.coli Rosseta；
将含有烯还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜；进行振荡培养OD600值达到0.6-0.8，再加入诱导剂继续培养过夜；离心收集细胞，用磷酸缓冲液悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰浴中，利用超声波破碎，最后进行离心处理；
步骤2：将所述步骤1获得的重组烯还原酶、辅酶、辅酶再生系统和底物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮加入到PH值为6.0-9.0的水相缓冲液中进行反应；
步骤3：待反应终止后，用硅藻土过滤掉溶液中的杂质，用乙酸乙酯对滤液进行萃取，用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏，重结晶得到布瓦西坦中间体(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮；
所述辅酶为NAD+和NADP+中任意一种；
所述辅酶的质量为底物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的0.5‰～1％；
所述辅酶再生系统包含酮还原酶、异丙醇、一水葡萄糖和甲酸铵；
所述水相缓冲液为磷酸盐；
所述超声波破碎的时间为8-12分钟；
所述步骤2中的反应温度为25～40℃，反应时间为20～24小时；
所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
与现有技术相比，本发明所采用的技术方案带来的有益技术效果为：
本发明方法通过采用特定的重组烯还原酶、辅酶和辅酶再生系统，催化4-正丙基-2(5H)-呋喃酮手性还原为(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮，解决了现有布瓦西坦关键中间体合成路线中合成路线长，收率低、成本高的问题。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，特别是，反应路线短，产物光学纯度高，提高了制备(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮的效率和降低了生产的成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1
重组烯还原酶的制备：
将已双酶切的表达载体pET-30a与合成的目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激60sec。冰上放置2min。加入预热的0.45mL LB培养基220rpm 37℃培养1h。将200uL菌液加入含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12-16，得到重组菌E.coli Rosseta。
从平板将含有烯还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到15mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接150mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于25℃环境下继续过夜培养。离心收集细胞，用20mL磷酸缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。将细胞悬浮液置于冰浴中，利用超声波破碎8-12分钟，最后进行离心处理，所得上清液即为重组烯还原酶液。
实施例2
克级(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮的制备：
将55ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.0)加至250mL的圆底烧瓶中，加入20mL异丙醇，称取10g 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮加入其中；然后加入20g重组烯还原酶、5g酮还原酶和30mgNAD+；在25℃的温度下利用磁力搅拌，滴加2mol/L的氢氧化钠溶液维持体系pH值，20小时后取样进行GC分析；转化率>99％，终止反应，用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；用无水硫酸钠进行干燥，浓缩后得9.37g，收率为92.2％，GC纯度98.2％，ee值99.4％。
实施例3
克级(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮的制备：
将55ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)加至250mL的圆底烧瓶中，加入20mL异丙醇，称取10g 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮和和18.9g一水葡萄糖加入其中；然后加入20g重组烯还原酶、5g酮还原酶和30mg NADP+；在30℃的温度下利用磁力搅拌，滴加2mol/L的氢氧化钠溶液维持体系pH值，24小时后取样进行GC分析；转化率>99％，终止反应，用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；用无水硫酸钠进行干燥，浓缩后得9.37g，收率为92.2％，GC纯度98.2％，ee值99.4％。
实施例4
克级(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮的制备：
将55ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)加至250mL的圆底烧瓶中，加入20mL异丙醇，称取10g 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮及6g甲酸铵加入其中；然后加入20g重组烯还原酶、5g酮还原酶和30mgNAD+；在35℃的温度下利用磁力搅拌24小时后取样进行GC分析；转化率>99％，终止反应，用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；用无水硫酸钠进行干燥，浓缩后得9.38g，收率为92.2％，GC纯度98.3％，ee值99.4％。
实施例5
公斤级(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮的制备：
在反应器中加入5.5L磷酸盐缓冲液(0.1M，pH9.0)，再加入2L异丙醇，称取1Kg 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮加入其中；然后加入2Kg重组烯还原酶，0.5Kg酮还原酶和3g NAD+；在40℃的温度下通过机械搅拌24小时后取样进行GC分析；转化率>99％，终止反应。用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；用无水硫酸钠干燥，浓缩后得0.98Kg产品，收率96.3％，GC纯度98.5％，ee值99.3％。
上述烯还原酶存于本公司，其它辅酶再生系统所用酶存于本公司或采用市售，辅酶及其它试剂均为市售。
应当理解，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (8)
1.一种布瓦西坦中间体的制备方法，以4-正丙基-2(5H)-呋喃酮为底物，在烯还原酶和辅酶及辅酶再生系统的作用下进行反应，具体包括：
步骤1：重组烯还原酶的制备：将已双酶切的表达载体pET-30a与合成的目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激60sec，冰上放置2min，加入预热的0.45mL LB培养基220rpm 37℃培养1h，将200uL菌液加入含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12-16，得到重组菌E.coli Rosseta；
将含有烯还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜；进行振荡培养OD600值达到0.6-0.8，再加入诱导剂继续培养过夜；离心收集细胞，用磷酸缓冲液悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰浴中，利用超声波破碎，最后进行离心处理；
步骤2：将所述步骤1获得的重组烯还原酶、辅酶、辅酶再生系统和底物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮加入到PH值为6.0-9.0的水相缓冲液中进行反应；
步骤3：待反应终止后，用硅藻土过滤掉溶液中的杂质，用乙酸乙酯对滤液进行萃取，用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏，重结晶得到布瓦西坦中间体(R)-4-正丙基二氢呋喃-2-酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，优选的，所述辅酶为NAD+和NADP+中任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述辅酶的质量为底物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的0.5‰～1％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统包含酮还原酶、异丙醇、一水葡萄糖和甲酸铵。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相缓冲液为磷酸盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声波破碎的时间为8-12分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的反应温度为25～40℃，反应时间为20～24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
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