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CN107592815A - 三维打印用组合物及其制备方法、以及利用其的三维结构体的制备方法 - Google Patents

三维打印用组合物及其制备方法、以及利用其的三维结构体的制备方法 Download PDF

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CN107592815A
CN107592815A CN201680018382.8A CN201680018382A CN107592815A CN 107592815 A CN107592815 A CN 107592815A CN 201680018382 A CN201680018382 A CN 201680018382A CN 107592815 A CN107592815 A CN 107592815A
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曹东佑
张珍娥
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T&r Bi Oufabo Co Ltd
POSTECH Academy Industry Foundation
Original Assignee
T&r Bi Oufabo Co Ltd
POSTECH Academy Industry Foundation
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Publication date
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Abstract

本发明涉及三维打印用组合物，其包含脱细胞化的细胞外基质，以及作为交联剂的核黄素。实施使用本发明的三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序(layer‑by‑layer process)来制作三维结构体形状，然后对获得的三维结构体形状进行热凝胶化时，能够制备具有高机械强度的三维结构体。此外，本发明提供所述三维打印用组合物的制备方法，以及利用所述三维打印用组合物的三维结构体的制备方法。

Description

三维打印用组合物及其制备方法、以及利用其的三维结构体 的制备方法
技术领域
本发明涉及三维打印用组合物。此外，本发明涉及所述三维打印用组合物的制备方法和利用三维打印用组合物的三维结构体的制备方法。
背景技术
三维打印是指将从形状复杂的组织(tissue)或器官(organ)的医疗数据获得的任意形状信息变换为G代码(G-code)后通过层叠工序(layer-by-layer process)构建复杂的骨架结构。这种三维打印也被称为“三维生物打印(three-dimensional bioprinting，3Dbioprinting)”。例如“多头组织器官打印系统”是代表性的三维打印技术中的一种，其由2个通过气压喷射材料的气压式注射器和2个利用步进电机(step motor)以纳升单位精密喷射的活塞式注射器组成，并且可以同时使用多种材料。通常而言，将如PLA(聚乳酸，Polylactic Acid)、PGA(聚乙醇酸，Poly-glycolic Acid)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物，Poly-lactic-co-glycolid Acid)、PCL(聚己内酯，Polycaprolactone)或它们的混合物等热塑性生物相容性高分子装入气压式注射器来制作结构体。此外，将由胶原蛋白、透明质酸、明胶、海藻酸盐、壳聚糖或纤维蛋白(fibrin)等组成的水凝胶装入活塞式注射器来制作三维结构体。
生物打印需要含细胞的介质的分配，因此生物打印的重要方面是打印工序应为细胞相容性(cytocompatible)。这种限制导致需要在水性或水性凝胶环境下实施，从而减少材料的选择。因此，用于制备从肝到骨的多种组织的生物打印中利用如下水凝胶，即，使用明胶、明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸盐、明胶/纤连蛋白、Lutrol F127/海藻酸盐、以及海藻酸盐等材料的水凝胶。用于生物打印的所述水凝胶或水凝胶和细胞的混合物等也被称为“生物油墨(bioink)”。
通常而言，细胞在整个培养期间特异性地一直位于原来的位置，这是由于细胞无法维持或分解周围的海藻酸盐凝胶基质(Fedorovich，N.E.et al.Tissue Eng.13，1905-1925(2007))。因此，虽然有关于细胞-打印结构体的生物打印的一些成功的报道，但是最低限度的细胞-材料相互作用(cell-material interactions)和差的(inferior)组织形成是最重要的问题。实际上，这些材料无法显示出天然的细胞外基质(extracellularmatrices，ECMs)的复杂性，由此不足以再现具有活体组织的典型的细胞-细胞连接(cell-cell connections)和三维(three-dimensional，3D)细胞构成的微环境。因此，所述水凝胶中的细胞无法显示出活体内的活组织的固有形状及功能。因此，如果能够向细胞提供与细胞的亲本组织(parent tissue)相似的天然微环境，则是理想的。脱细胞化的细胞外基质(decellularized extracellular matrix，dECM)就是其中的最佳选择，其原因在于，任何天然或人工材料都不能完全再现天然细胞外基质的所有特性。而且，各组织的ECM在组成(composition)及局部解剖学(topology)方面是独特的，所述组成及解剖学特性是通过常驻细胞(resident cells)和微环境之间的动态且相互的相互作用生成。对于从组织及器官分离的细胞和ECM的最近研究中，为了保存所选择的细胞功能及表现型(phenotype)，强调组织特异性(tissue specificity)的必要性(Sellaro，T. L. et al. Tissue Eng.PartA16，1075-1082(2010)；Petersen，T.H.et al.Science 329，538-541(2010)；Uygun，B.E.etal.Nat.Med.16，814-821(2010)；Ott，H.C.et al.Nat.Med.16，927-933(2010)；Flynn，L.E.Biomaterials 31，4715-4724(2010))。所收获的dECM材料通常从包含皮肤、小肠粘膜下层组织(small intestinal submucosa)的多种组织加工为二维(two-dimensional，2D)支架，在初期步骤中渗透性或接种的细胞为了生存到生成支撑性血管网络(supportingvascular network)为止而依赖于氧和营养素的扩散。然而，所打印的组织类似物结构需要研究开放的多孔性3D结构的制备方法，以允许营养素的流动。本发明人曾开发了使用dECM生物油墨的用于打印细胞装载(cell-laden)结构的三维打印方法，其能够提供适合3D结构组织的生长的优化的微环境，所述细胞-装载结构能够再现固有的细胞形状及功能(Falguni Pati，et al.，Nat Commun.5，3935(2014))。
另外，使用dECM生物油墨并通过三维打印制作的结构体需要具有能够维持三维形状的机械强度。例如，在诸如多头组织器官打印系统的基于挤出的打印中，从注射器挤出的过程中以约15℃以下的温度保持预凝胶(pre-gel)形态的生物油墨的同时形成三维结构体形状。就如此形成的三维结构体形状而言，作为用于赋予适当的机械强度的工序，实施热加工(thermal processing)或打印后交联(post-print crosslinking)。所述热加工例如在约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中进行凝胶化来实施。所述打印后交联是通过用诸如戊二醛(glutaraldehyde)的交联剂溶液处理三维结构体形状来进行交联化而实施。然而，通过热加工来进行凝胶化而获得的三维结构体的机械强度相对低，从而难以制备需要令人满意的机械强度的器官。此外，打印后交联需要使用诸如戊二醛(glutaraldehyde)的毒性交联剂，从而导致安全性问题，并且，三维结构体内部没有形成充分的交联，从而导致获得交联不均匀的三维结构体。
发明内容
要解决的技术问题
本发明人为了开发出通过三维打印方法制备具有高机械强度的三维结构体的得到改善的制备方法而进行了各种研究。本发明人开发了能够制备机械强度均匀且高的三维结构体的方法，其中实施使用三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序(layer-by-layer process)来制作三维结构体形状，所述三维打印用组合物包含高安全性的核黄素(riboflavin)作为交联剂，然后对所获得的三维结构体形状进行热凝胶化。即，本发明人新开发了使用核黄素的交联-热凝胶化方法(crosslinking-thermal gelation)。
因此，本发明的目的在于提供三维打印用组合物，其包含核黄素作为交联剂。
此外，本发明的目的在于提供所述三维打印用组合物的制备方法。
此外，本发明的目的在于提供利用所述三维打印用组合物的三维结构体的制备方法。
技术方案
根据本发明的一个实施方式，提供三维打印用组合物，其包含脱细胞化的细胞外基质，以及作为交联剂的核黄素。
本发明的三维打印用组合物中，所述脱细胞化的细胞外基质可以是通过对排出到体外的心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织(mucosal epithelial tissue)、羊膜组织或角膜组织进行脱细胞化来获得的；相对于组合物的总重量，所述脱细胞化的细胞外基质的含量可以为1～4重量％。此外，相对于组合物的总重量，所述核黄素的含量可以为0.001～0.1重量％。
本发明的三维打印用组合物可以进一步包含选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)中的一种以上的蛋白酶，以及pH调节剂。一个具体实施方式中，相对于组合物的总重量，本发明的三维打印用组合物可以包含1～4重量％的脱细胞化的细胞外基质，0.001～0.1重量％的核黄素，0.03～30重量％的选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，0.1～0.4重量％的选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，以及pH调节剂。此外，本发明的三维打印用组合物在约15℃下测定时，在剪切速率(shear rate)1s-1下的粘度可以为1～30Pa·S范围。
根据本发明的另一实施方式，提供三维打印用组合物的制备方法，其包括以下步骤：(a)在选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸溶液中添加脱细胞化的细胞外基质；(b)在步骤(a)中获得的混合物中添加选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，然后进行搅拌而获得溶液；以及(c)在步骤(b)中获得的溶液中添加核黄素和pH调节剂。
根据本发明的另一实施方式，提供三维结构体的制备方法，其包括以下步骤：(i)实施使用所述三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序(layer-by-layer process)来制作三维结构体形状；以及(ii)在15℃以上的温度下，对步骤(i)中获得的三维结构体形状进行热凝胶化(thermal gelation)来获得三维结构体。
一具体实施方式中，各个层叠工序中交联化可以进行1～10分钟。
发明效果
通过本发明查明了实施使用包含核黄素的三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序来制作三维结构体形状，然后对所获得的三维结构体形状进行热凝胶化，从而能够制备具有高机械强度的三维结构体。即，本发明通过提供使用核黄素的交联-热凝胶化方法(crosslinking-thermal gelation)能够实现机械强度均匀且高的三维结构体的制备。此外，本发明中使用高安全性的核黄素作为交联剂，从而能够避免诸如戊二醛(glutaraldehyde)的毒性交联剂的使用。因此，本发明能够有效应用于通过三维打印制作组织工程支架(tissue-engineering scaffolds)、基于细胞的传感器(cell-basedsensors)、药物/毒性筛选、以及组织或肿瘤模型。
附图说明
图1为从心脏组织获得的脱细胞化的细胞外基质(hdECM)的光学显微镜照片(b)和组织染色照片(a)。
图2是使用PCL框架来示出本发明中制备的三维结构体的形状的照片。
图3是没有使用PCL框架来示出本发明中制备的三维结构体的形状的照片。
最佳实施方式
本发明提供三维打印用组合物，其包含脱细胞化的细胞外基质，以及作为交联剂的核黄素。
所述脱细胞化的细胞外基质(decellularized extracellular matrix)可以通过对人、猪、牛、兔、狗、山羊、绵羊、鸡、马等哺乳动物排出的组织进行脱细胞来获得。所述组织不受特别限定，例如，包含心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织(mucosal epithelial tissue)、羊膜组织或角膜组织等，优选包含心脏组织、软骨组织、骨组织，更优选包含从猪获得的心脏组织、软骨组织、骨组织。所述脱细胞化可以通过公知的方法，例如使用Ott，H.C.et al.Nat.Med.14，213-221(2008)，Yang，Z.etal.Tissue Eng.Part C Methods 16，865-876(2010)等中公开的方法，或者稍作变形来实施。优选地，可以使用本发明人提出的脱细胞化方法，即Falguni Pati，et al.，NatCommun.5，3935(2014)中公开的脱细胞方法来实施。所获得的脱细胞化的细胞外基质通常以冻结干燥的粉末状态加以保管。所述脱细胞化的细胞外基质的使用量不受特别限制，例如，相对于组合物的总重量，可以使用1～4重量％的含量，优选可以使用2～3重量％的含量。
通过本发明查明了实施使用三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序来制作三维结构体形状，所述三维打印用组合物包含高安全性的核黄素，然后对获得的三维结构体形状进行热凝胶化，从而能够制备机械强度均匀且高的三维结构体。即，本发明提供使用核黄素的交联-热凝胶化方法(crosslinking-thermal gelation)。所述核黄素可以使用足以在UVA下进行交联的量，例如，相对于组合物的总重量，可以使用0.001～0.1重量％，优选可以使用0.01～0.1重量％。
为了有效的三维打印，本发明的三维打印用组合物优选具有pH为6.5～7.5范围的粘弹性的均匀溶液的形态。因此，本发明的三维打印用组合物在水性介质中可以进一步包含选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase)中的一种以上的蛋白酶，以及用于调节pH至6.5～7.5范围的pH调节剂(例如，氢氧化钠)。所述酸起到溶解脱细胞化的细胞外基质的功能，优选可以使用乙酸、盐酸等，更优选可以以0.01～10M的乙酸水溶液(例如，约0.5M的乙酸水溶液)或0.01～10M的盐酸水溶液的形态使用。所述蛋白酶起到消化(digestion)脱细胞化的细胞外基质的端肽(telopeptide)的功能，优选可以使用胃蛋白酶、基质金属蛋白酶等。所述蛋白酶的使用量根据脱细胞化的细胞外基质的含量而不同，例如，相对于100mg的脱细胞化的细胞外基质，可以以5～30mg的比例使用，优选可以以10～25mg的比例使用。pH调节剂起到将为了溶解脱细胞化的细胞外基质而使用的酸中和的功能，比如，可以使用氢氧化钠，并使用足以调节pH至6.5～7.5的量，优选使用足以调节pH至约7的量。
一具体实施方式中，相对于组合物的总重量，本发明的三维打印用组合物可以包含1～4重量％的脱细胞化的细胞外基质，0.001～0.1重量％的核黄素，0.03～30重量％的选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，0.1～0.4重量％的选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，以及pH调节剂。此外，本发明的三维打印用组合物优选为粘度随着剪切速率的增加而降低的粘弹性物质，例如，在约15℃下测定时，在剪切速率(shear rate)1s-1下的粘度优选为1～30Pa·S范围。所述粘度可以通过适当调节水性介质(例如，水、蒸馏水、PBS、生理食盐水等)的量来调节。
此外，本发明提供所述三维打印用组合物的制备方法。即，本发明提供三维打印用组合物的制备方法，其包括以下步骤：(a)在选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸溶液中添加脱细胞化的细胞外基质；(b)在步骤(a)中获得的混合物中添加选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，然后进行搅拌而获得溶液；以及(c)在步骤(b)中获得的溶液中添加核黄素和pH调节剂。
本发明的制备方法中，酸、脱细胞化的细胞外基质、核黄素、蛋白酶及pH调节剂如前所述。
步骤(a)的酸溶液例如可以为0.01～0.5M的乙酸水溶液，优选可以为约0.5M的乙酸水溶液。步骤(b)的所述搅拌可以进行至脱细胞化的细胞外基质完全溶解为止，通常可以进行24～48小时，但并不限定于此。为了防止凝胶化，步骤(c)的工序在约15℃以下的低温下进行，优选在约4～10℃的低温下进行。所获得的三维打印用组合物是pH得到调节的预凝胶(pH-adjusted pre-gel)形态，优选在约4℃下冷藏保管。
此外，本发明提供三维结构体的制备方法，其包括以下步骤：(i)实施使用所述三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序(layer-by-layer process)来制作三维结构体形状；以及(ii)在15℃以上的温度下，对步骤(i)中获得的三维结构体形状进行热凝胶化(thermal gelation)来获得三维结构体。
步骤(i)的所述打印可以使用公知的三维打印方法(例如，使用“多头组织器官打印系统”的打印方法)并根据Falguni Pati，et al.，Nat Commun.5，3935(2014)等中公开的方法进行。例如，可以利用多头组织器官打印系统的2个注射器进行所述打印。即，将聚己内酯框架(polycaprolactone(PCL)framework)装入注射器，并加热至约80℃，使得聚合物熔融。将所述预凝胶形态的三维打印用组合物装入另一注射器中，并将温度维持在约15℃以下，优选维持在约4～10℃。为了PCL框架的制作(fabrication)，以400～650kPa的范围施加气压(pneumatic pressure)。使用基于活塞的低用量喷射系统(plunger-based low-dosage dispensing system)喷射所述预凝胶形态的组合物。此外，所述打印也可以使用基于活塞的低用量喷射系统(plunger-based low-dosage dispensing system)只喷射所述预凝胶形态的组合物来进行，而不使用聚己内酯框架。
所述UVA下的交联化可以以315～400nm波长，优选以约360nm波长的UVA照射1～10分钟来进行，优选可以照射约3分钟来进行。反复实施所述打印和UVA下的交联化，即，实施层叠工序(layer-by-layer process)，从而形成三维结构体形状。
步骤(ii)是通过在15℃以上的温度下对步骤(i)中获得的三维结构体形状进行热凝胶化(thermal gelation)来进行。所述热凝胶化可以通过以下方式来进行：优选在维持20～40℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))，更优选在维持约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中保持5～60分钟，优选保持20～30分钟。
以下，通过实施例更详细地说明本发明。但是，下述实施例是为了例示本发明而提出的，本发明的范围并不受其限制。
下述实施例中使用的脱细胞化的细胞外基质是使用猪的心脏组织并根据FalguniPati，et al.，Nat Commun.5，3935(2014)中公开的方法获得的，以下称为“hdECM”。对于所述hdECM，最终进行冻结干燥并冷冻保管直至使用。所述hdECM的光学显微镜照片和组织染色照片如图1所示。
实施例1：三维打印用组合物的制备
在冻结干燥的hdECM中加入液氮，然后用研钵和研杵进行粉碎。在0.5M的乙酸水溶液(10ml)中添加hdECM粉末(330mg)，然后加入胃蛋白酶(33mg)(P7125，Sigma-Aldrich公司)后在常温下搅拌48小时。将所获得的溶液的温度维持在10℃以下，同时加入核黄素(2mg)，并滴加冷却至10℃以下的10M的NaOH溶液，从而将pH调节至约7。在约4℃下冷藏保管所获得的预凝胶(pre-gel)形态的溶液。
实施例2：三维结构体的制备
使用实施例1中获得的三维打印用组合物并根据Falguni Pati，et al.，NatCommun.5，3935(2014)中公开的方法制作了三维结构体。具体而言，将聚己内酯框架(polycaprolactone(PCL)framework)装入多头组织器官打印系统(Jin-Hyung Shim etal.，J.Micromech.Microeng.22 085014(2012))的注射器(第一注射器)，并加热至约80℃，使得聚合物熔融。将实施例1中获得的预凝胶形态的三维打印用组合物装入另一注射器(第二注射器)，并将温度维持在约10℃以下。向第一注射器施加约600kPa的气压，从而制作具有约100μm以下的线宽、约300μm的间隙、120μm的厚度的薄PCL框架，并在PCL框架上喷射第二注射器的内容物，然后将约360nm的UVA照射3分钟来进行交联化。
之后，喷射第二注射器的内容物并实施通过所述交联化的层叠工序(layer-by-layer process)，从而形成三维结构体形状。将获得的三维结构体形状放入约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中并保持30分钟来进行热凝胶化，从而制备了三维结构体。所获得的三维结构体具有约300～400μm的厚度，其形状的一个例子如图2所示。
实施例3：三维结构体的制备
除了没有使用PCL框架以外，通过与实施例2相同的方法制备了三维结构体。即，将实施例1中获得的预凝胶形态的三维打印用组合物装入多头组织器官打印系统(Jin-HyungShim et al.，J.Mieromech.Microeng.22 085014(2012))的注射器，并将温度维持在约10℃以下。向所述注射器施加约600kPa的气压而喷射内容物，然后将约360nm的UVA照射3分钟来进行交联化。之后，喷射注射器的内容物并实施通过所述交联化的层叠工序(layer-by-layer process)，从而形成三维结构体形状。将获得的三维结构体形状放入约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中并保持30分钟来进行热凝胶化，从而制备了三维结构体。所获得的三维结构体具有约400μm的厚度，其形状的一个例子如图3所示。
比较例
除了没有使用核黄素以外，通过与实施例1相同的方法制备了预凝胶形态的溶液。
试验例
向实施例1中获得的预凝胶形态的溶液照射约360nm的UVA，共照射3分钟来进行交联化，然后放入约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中并保持30分钟来进行热凝胶化，从而形成水凝胶(水凝胶A)。此外，将比较例中获得的预凝胶形态的溶液放入约37℃的培养器(humid incubator(湿润的培养器))中并保持30分钟来进行热凝胶化，从而形成水凝胶(水凝胶B)。对于所获得的各水凝胶，分别测定了在频率(frequency)1 rad/s下的复数模量(complex modulus)，其结果如下述表1所示。
表1
模量(n＝3，1rad/s)
水凝胶A 10.58±3.4kPa
水凝胶B 0.33±0.13kPa
从所述表1的结果可知，本发明中获得的水凝胶在1rad/s下的模量为10.58kPa，通过交联化，强度得到约30倍以上的提高。

Claims (13)

1.三维打印用组合物，其包含脱细胞化的细胞外基质，以及作为交联剂的核黄素。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脱细胞化的细胞外基质是通过对排出到体外的心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织、羊膜组织或角膜组织进行脱细胞化来获得的。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述脱细胞化的细胞外基质的含量为1～4重量％。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述核黄素的含量为0.001～0.1重量％。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，以及pH调节剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述组合物包含1～4重量％的脱细胞化的细胞外基质，0.001～0.1重量％的核黄素，0.03～30重量％的选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸，0.1～0.4重量％的选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，以及pH调节剂。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，在15℃下测定时，在剪切速率1s-1下的粘度为1～30Pa·S范围。
8.三维打印用组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(a)在选自乙酸及盐酸中的一种以上的酸溶液中添加脱细胞化的细胞外基质；
(b)在步骤(a)中获得的混合物中添加选自胃蛋白酶及基质金属蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，然后进行搅拌而获得溶液；以及
(c)在步骤(b)中获得的溶液中添加核黄素和pH调节剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞化的细胞外基质是通过对排出到体外的心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织、羊膜组织或角膜组织进行脱细胞化来获得的。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述脱细胞化的细胞外基质的含量为1～4重量％。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述核黄素的含量为0.001～0.1重量％。
12.三维结构体的制备方法，其包括以下步骤：
(i)实施使用权利要求1～7中任一项所述的三维打印用组合物的打印和通过UVA下的交联化的层叠工序来制作三维结构体形状；以及
(ii)在15℃以上的温度下，对步骤(i)中获得的三维结构体形状进行热凝胶化来获得三维结构体。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，各个层叠工序中交联化进行1～10分钟。
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