CN107532137A

CN107532137A - 乳酸菌及其用于治疗乳腺炎的用途

Info

Publication number: CN107532137A
Application number: CN201680005957.2A
Authority: CN
Inventors: B.梅尔斯塔姆; E.康诺里
Original assignee: Biogaya
Current assignee: Biogaya
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2018-01-02
Also published as: CA2972967A1; BR112017014225A2; US20200318061A1; US20180273895A1; KR20170103804A; CL2017001818A1; MX2017007969A; HK1248756A1; WO2016113365A1; JP2018504902A; EP3244904A1; AU2016208009A1

Abstract

本发明涉及选自罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232的新型乳酸菌菌株罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)以及包含这些菌株的产品。本发明还涉及一种或多种乳酸菌菌株作为益生菌用于治疗炎症和感染(例如乳腺炎和/或鹅口疮)的用途，特别是在局部给予所述菌株之后。

Description

乳酸菌及其用于治疗乳腺炎的用途

技术领域

本发明涉及新型乳酸菌菌株和包含这些菌株的产品。本发明还涉及一种或多种乳酸菌菌株作为益生菌用于治疗炎症和感染如乳腺炎和/或鹅口疮的用途。

背景技术

乳酸生产菌的某些菌株，如乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)通常用作各种类型产品(如食品、食品补充剂和美容或药物组合物)中的益生菌。“益生菌(probiotic)”一词来源于希腊词pro (意思是“促进”)和biotic (意思是“生命”)。联合国粮食及农业组织将益生菌定义为“当以足够量给予时，对宿主产生健康益处的活体微生物”。有害微生物的生长和定殖可以通过乳酸生产细菌通过其在哺乳动物上或内部的竞争性定殖，或通过形成生物膜，或通过竞争可用的营养物或其它机制来预防。细菌可以通过其生产降低流体中的pH的特定物质，例如过氧化氢、细菌素、有机酸(包括乳酸和乙酸)，从而可以防止有害细菌的生长而是有用的。哺乳动物可以通过许多方式从益生菌中受益。益生菌的有效性主要是菌株特异性的，其中每个菌株或菌株群可通过不同的特异性机制促进哺乳动物的健康。益生菌可以例如防止或抑制病原体的增殖，抑制病原体产生毒力因子，或以促炎或抗炎的方式调节免疫应答。

乳腺炎是乳腺组织的感染，导致乳腺或乳房的乳房疼痛、肿胀、温热和发红。乳腺炎是一种影响所有哺乳动物物种的感染，主要由细菌感染(感染性乳腺炎)引起，而在大多数情况下由金黄色葡萄球菌引起。乳腺炎不同于阻塞的导管，因为阻塞的导管不被认为是感染，因此不需要用抗生素治疗。阻塞的乳管有时被称为非感染性乳腺炎。“轻度”乳腺炎与“严重”阻塞的导管之间的差异可能不容易确定，阻塞的导管可能最终演变成乳腺炎。

预防感染性乳腺炎对于用于乳生产的动物如牛、骆驼、母羊或山羊来说是非常重要的，因为在感染和治疗期间产生的乳必须被丢弃。乳腺炎最常见影响哺乳动物，包括进行母乳喂养的女性(哺乳期乳腺炎)，尽管乳腺炎可能发生在未进行母乳喂养的哺乳动物中。

一些针对金黄色葡萄球菌的抗生素包括：头孢氨苄、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、阿莫西林与克拉维酸联合、克林霉素和环丙沙星。其它实例可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)，如复方新诺明(cotrimoxazole)和四环素。然而，在许多情况下，最好避免使用抗生素，因为抗生素可能会使其它感染成为可能，并且还已知导致生态失调和哺乳动物中微生物群的改变。此外，哺乳动物身体可以通过其它方式从乳腺炎治愈而不受抗生素干扰，从而避免潜在的抗生素耐药性问题。

益生菌以前已被证明是使用抗生素治疗和预防人体乳腺炎的替代方法。已经测试了某些类型的双歧杆菌和乳杆菌(Sytnik,S.I. et al. (Vrach DeIo., 1990, 3:98-100), Greene,W.A. et al. (J.Dairy Sci., 1991, 74:2976- 2981))。例如，US4591499描述了通过乳房内注射含有非致病性乳杆菌菌株的水包油乳液来治疗乳腺炎的方法。在现有技术中，益生菌经口或肠胃外给药，例如皮下或肌肉间。

WO2008145756公开了通过以下步骤来选择益生菌菌株的方法：(i)通过在乳酸培养基中的选择，分离存在于来自哺乳动物物种的新鲜乳中的乳酸菌或双歧菌菌株，(ii)选择步骤(i)中的那些菌株，其能够在口服摄入后转移到乳腺和/或在局部应用后定殖乳腺，(iii)选择来自步骤(ii)的那些菌株，其能够通过产生细胞因子降低金黄色葡萄球菌的生存率，和/或对上皮细胞的粘附率，和(iv)选择来自步骤(iii)的那些菌株，其能够保护动物免于乳腺炎。在步骤(ii)中，步骤(i)中分离的菌株是基于其在口服摄入后转移到乳腺和/或定殖乳腺的能力来选择的。为了检测转移到乳腺的能力，可以使用例如在WO2004003235中描述的用于在口服摄入之后检测微生物转移到乳的测定法。

US20030235560公开了专门针对在产乳牛中引起乳腺炎的细菌而使用的溶原性噬菌体，以及用于在哺乳动物的乳房上给予的组合物。

US20070077235公开了使用细菌相关的噬菌体蛋白、酶或肽和/或其肽片段来治疗细菌感染，例如产乳牛的乳腺炎的方法和组合物。更具体地，US 20070077235公开了与载体共混的噬菌体溶解和/或holin蛋白质或其肽和肽片段，用于治疗和预防细菌感染如乳腺炎。

组胺是涉及哺乳动物的几种健康相关过程的有机氮化合物，包括局部免疫应答以及调节肠道中的生理功能并用作神经递质。作为对外来病原体的免疫应答的一部分，组胺可以由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。组胺可以衍生自氨基酸组氨酸的脱羧基，这是由L-组氨酸脱羧酶催化的反应。某些细菌菌株对组胺的这种生产直到最近才被看作是一种对人类的健康风险，而不是可能的益处。例如，Scombroid中毒是由于腐败食物，特别是鱼类中的细菌产生组胺。与这种类型的组胺产生相反，来自所选细菌的受控量的组胺的局部产生可以产生有益效果而不是有害效果。如US2013149291中所述，某些细菌能够使用与真核生物中发现的那些无关的组氨酸脱羧酶产生抗炎组胺。

选择的一组乳酸菌菌株，包括罗伊乳杆菌的某些菌株，可以产生组胺，并且这种组胺与早先的理念相反，可以通过减少炎症来使哺乳动物受益。罗伊乳杆菌被认为是人类胃肠道的固有生物，并且例如存在于胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上。

WO2013/011137公开了用于在口服给予乳杆菌菌株(或者与另外的组氨酸源一起)之后治疗身体各个位置的炎症性病症的新型乳杆菌菌株。所述乳杆菌在体内将组氨酸转化为组胺。组胺用于治疗炎症性病症。

由于乳腺炎，乳制品生产者的利润大幅减少，包括减少产奶量，丢弃奶，抗生素药物的使用，兽医服务和劳动力。这促使研究改进治疗方法。此外，使用抗生素治疗乳腺炎可能会导致不希望的副作用，并可能增加抗生素耐药性。本发明旨在解决与乳腺炎病症相关的健康相关问题。

发明目的和简述

本发明的目的是至少部分克服上述问题，并提供新的乳酸菌菌株(细菌)。

该目的通过选择和使用具有将组氨酸转化成组胺的能力的细菌菌株来实现，其中通过在身体内部或外部的包含组氨酸的体液的方式，细菌可利用组氨酸。这样的体液可以是乳。组胺提供抗炎作用。通过将组氨酸转化为组胺所需的基因的存在，使用例如聚合酶链反应(PCR)，来选择细菌。细菌具有在组氨酸浓度大于5、或10mg/100ml、或1至75mg/100ml流体、或10至50mg/100ml、或10至40mg/100ml流体或母乳的流体中将组氨酸转化成组胺的能力。可以使用细菌，而没有可能由组胺引起的副作用。细菌可以经口服，肠胃外或局部给予。在一个实施方案中，细菌经口服给予。在另一个实施方案中，细菌经局部给予，并且身体的皮肤或粘膜上存在组氨酸。

本发明的目的通过选自包含罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232或由其组成的组的罗伊乳杆菌菌株的生物学纯的培养物来实现。

在又一个实施方案中，一种或多种乳酸菌菌株选自包含罗伊乳杆菌ATCC PTA6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA 5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290或由其组成的组。

组氨酸操纵子包含三个基因(组氨酸/组胺反向转运体、组氨酸脱羧酶丙酮酰A型(HdcA)和组氨酸脱羧酶丙酮酰B型(HdcB)。这些细菌可以从组氨酸产生组胺。不具有组氨酸操纵子的细菌不能自组氨酸产生组胺。

本发明的另一个目的涉及一种或多种乳酸菌菌株用于治疗乳腺炎的用途，其中所述细菌具有将存在于局部体液中的组氨酸转化为组胺的能力。该用途可以是医学的或美容的。该治疗不需要额外的外部组氨酸。

鹅口疮是由念珠菌菌株的积累引起的真菌感染。它可以影响任何人，但它更有可能影响婴儿的口腔。认为有鹅口疮的婴儿会增加哺乳期母亲发生乳腺炎的风险。

如本文定义的本发明的所选乳酸菌菌株还具有产生和分泌抗微生物化合物如乳酸的优点。念珠菌菌株对这种抗微生物化合物敏感，包括通过乳酸降低局部pH。因此，使用乳酸菌菌株，特别是上述那些，还可能有益于预防或治疗鹅口疮。所述细菌菌株也可用于预防或治疗其新生儿或婴儿被鹅口疮感染的哺乳动物中的乳腺炎。

在一个实施方案中，一种或多种乳酸菌菌株用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮。在一个实施方案中，治疗是局部治疗。

在另一个实施方案中，体液是存在于待治疗的哺乳动物体外的乳。

所述一种或多种乳酸菌菌株具有从身体外部将从乳腺产生的经治疗哺乳动物自身乳中发现的天然量的组氨酸转化成组胺的能力，从而使得包含所述细菌的局部产品有可能从身体的外部向哺乳动物提供局部抗炎作用。这允许通过将细菌施用于身体的皮肤或粘膜而不加入外部组氨酸来治疗乳腺炎。细菌具有在组氨酸浓度大于5、或10mg/100ml、或1至75mg/100ml流体、或10至50mg/100ml或10至40 mg/100ml流体或母乳的流体中将组氨酸转化为组胺的能力。局部给药对于患者来说侵入性较小，并被认为是改善患者的治疗依从性。

在另一个实施方案中，基于在哺乳动物体外，它们将存在于乳中的天然量的组氨酸转化成组胺的能力来选择一种或多种乳酸菌菌株。

在另一个实施方案中，选择具有在哺乳动物体外将存在于乳中的天然量的组氨酸转化成组胺的能力的罗伊乳杆菌菌株。

在另一个实施方案中，所述一种或多种乳酸菌菌株选自包含罗伊乳杆菌DSM32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232或由其组成的组，用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮。在另一个实施方案中，一种或多种乳酸菌菌株选自包含罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA 5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290或由其组成的组，用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮。

所述乳酸菌或包含所述细菌的组合物的优点是当与包含组氨酸的流体接触时其将组氨酸转化成组胺的能力。根据本文的发明，所述流体可以在体外。组氨酸的位置对于上述乳酸菌并不重要。这意味着这些乳酸菌可以局部应用于哺乳动物的身体。一旦与含有组氨酸的流体接触，乳酸菌可以开始通过一个或多个腺体开口迁移到体内。因此，乳酸菌提供了治疗乳腺炎和/或鹅口疮的非侵入性方法。

本发明还涉及预防和/或治疗乳腺炎和/或鹅口疮的方法，其包括向有需要的哺乳动物例如人给予治疗有效量的上文定义的一种或多种乳酸菌。

本发明还涉及上文定义的一种或多种乳酸菌菌株在缓解与阻塞的腺体导管的状况相关的炎症性病症中的用途。本发明还涉及上文定义的一种或多种乳酸菌菌株在减轻和/或预防哺乳动物的乳系统(例如乳腺或乳房)的炎症性病症复发中的用途。

本发明还涉及上文定义的一种或多种乳酸菌菌株在制造药物产品、医疗装置(例如霜剂、软膏或油)或美容产品中的用途，用于治疗和/或预防疾病、病症或病况，例如炎症、乳腺炎和/或鹅口疮。

当通过与来自乳腺、导管或乳头的乳接触而被激活时，一种或多种乳酸菌菌株可以定殖或以其它方式与哺乳动物的乳系统接触并提供有益效果，包括对哺乳动物的抗炎和抗菌作用。选择的乳酸菌菌株提供组胺的局部产生，从而预防和/或减少细菌感染，而不需要额外的组氨酸，即不向给予的细菌添加外部组氨酸。因此，在哺乳期间患有乳腺炎病况的雌性哺乳动物将受益于可以减少炎症并减少导致乳腺炎和/或鹅口疮的细菌感染的作用。

哺乳动物可以是人，牛，狗，猫，骆驼，母羊和山羊，或任何其它产乳哺乳动物。

本发明的目的还通过一种用于局部给予一种或多种罗伊乳杆菌菌株的方法来实现，其中使用吸附剂或非吸附剂产品将该菌株施用于哺乳动物的皮肤或粘膜。在一个实施方案中，罗伊乳杆菌选自上述定义的菌株。

在该方法的另一个实施方案中，吸附剂或非吸附剂产品是由吸附剂或非吸附剂材料制成的垫、擦拭物和/或薄纸(tissue)，其中所述材料适合作为罗伊乳杆菌菌株的载体。在一个实施方案中，所述产品适于通过擦拭被放置而与哺乳动物的乳腺接触。

在另一个实施方案中，吸附剂或非吸附剂产品被棉絮、羊毛或具有类似于羊毛的特征的羊毛状材料包含或包围。

在该方法的另一实施方案中，棉絮、羊毛或羊毛状材料适于提供热量。这种加热作用可有助于减少乳腺炎症，有助于排出乳腺，减轻疼痛，增加舒适度，并进一步为局部给予乳腺进行定殖的益生菌提供最佳的生长条件。

如上定义的一种或多种乳酸菌菌株可以局部施用于炎症性病症的部位处或其部位附近。这提供了与现有技术方法相比更有效和高效的治疗方式。局部施用与紧邻炎症性病症的部位相结合，允许减少治疗病症所需的乳酸菌的量。这继而降低治疗费用。

本发明还涉及一种组合物，其包含与可接受的载体联合的如上定义的一种或多种乳酸菌菌株。

本发明还涉及如上定义的药物或美容组合物的制备方法，其包括将如上定义的一种或多种乳酸菌菌株的培养物与可接受的载体混合。载体可以例如是脂质或添加剂。

本发明的另一个目的涉及一种组合物，其包含呈干燥形式的如上定义的一种或多种乳酸菌菌株的培养物，任选连同防潮剂和一种或多种添加剂。在一个实施方案中，一种或多种乳酸菌菌株的培养物为冻干形式。

通常，保存的乳酸菌在潮湿或甚至半潮湿的条件下表现出快速的活力丧失，因此在贮存期间细菌不暴露于水分是非常重要的。该问题可以部分地通过供应包含所述细菌的产品并干燥所述产品以除去水分，和/或通过向所述产品中加入一种或多种防潮剂来处理。一种或多种乳酸菌菌株的培养物可以以冷冻干燥或冻干的形式保存。

在另一个实施方案中，防潮剂是选自植物来源的脂质或聚合物的脂质。聚合物选自聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉。在一个实施方案中，脂质选自橄榄油、菜籽油(canola oil)、椰子油、棕榈仁油、花生油、大豆油、二甲硅油、石蜡油和凡士林。

通过将其中细菌处于具有低水分活性的环境中的形式，例如干燥、优选冷冻干燥的形式的一种或多种乳酸菌菌株的培养物与一种或多种脂质一起悬浮，增加细菌存活。脂质提高细菌对皮肤区域的转移速率，并且脂质当递送至皮肤时通过创建合适的微环境也增加了细菌的存活。通过使用这些脂质，预期一种或多种乳酸菌菌株的培养物的存活和细菌向皮肤区域的转移速率得到改善。脂质可具有与皮肤脂质相互作用的进一步优点。这将使皮肤光滑。特别是在炎症部位，脂质可以提供愈合皮肤的协同作用。

在另一个实施方案中，组合物包含一种或多种选自碳水化合物、C_6-12中链脂肪酸、软化剂(emollient)、表面活性剂、乳化剂、蛋白质、氨基酸、多元醇、二氧化硅和抗氧化剂的添加剂。这些添加剂以相对低的成本容易获得。

在另一个实施方案中，组合物包含

a)C_6-12中链甘油三酯(MCT) 25-48.5wt％

b)向日葵油 25-48.5wt％

c)二氧化硅 0-1wt％

d)一种或多种乳酸菌(干燥) 0.5-2wt％

其中重量百分比(wt％)是组合物总重量的百分比，乳酸菌的活性为10⁵-10¹² CFU(菌落形成单位)/克。

在一个实施方案中，乳酸菌的活性为10⁷-10⁸CFU/克。

认为该组合物可用于治疗乳腺炎。参见下面概述的实验数据。

在组合物的一个实施方案中，所述一种或多种乳酸菌菌株选自包含罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232或由其组成的组。在组合物的另一个实施方案中，所述一种或多种乳酸菌菌株选自包含罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA 5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290或由其组成的组。

本发明的另一方面涉及该组合物用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮的用途。在一个实施方案中，治疗是局部治疗。

根据上述关于乳酸菌及其用途的讨论，组合物的优点及其优选实施方案是显而易见的。

本发明还涉及乳酸菌菌株的选择方法，其中所述细菌具有将存在于局部体液中的组氨酸转化为组胺的能力，如实施例1所述。

在一个实施方案中，选择乳酸菌菌株的方法包括使用PCR方法筛选和选择具有活性组氨酸操纵子的乳酸菌菌株的步骤，如实施例5进一步描述的。

附图简述

提供以下附图来说明本发明构思的各个方面，除非在此指出，否则并不意图限制本发明的范围。

图1表示所描述的乳腺和不同病况的示意图；a，在正常条件下的乳腺；b，在炎症下的乳腺(阻塞导管或类似病况)；c，在感染和乳腺炎期间的乳腺。灰色实心圆说明了炎症，具有方格填充的椭圆形说明了感染期间的细菌，箭头说明了乳流。

本发明的优选实施方案的详细描述

定义

本文所用的术语“治疗”应理解为包括阻止、减少和预防。

本文所用的术语“细菌”应理解为包括乳酸菌菌株，包括但不限于本文提及的任何具体的乳酸菌菌株。

本文所用的术语“局部”应理解为是指对身体上或身体内特定位置的施用或给药，与系统性施用或给药相反。

本文所用的术语“病症”应理解为包括疾病和病况。

术语“非侵入性”应理解为在不切割身体或将某物放入身体的情况下进行的治疗，例如，该术语应理解为在哺乳动物的皮肤或粘膜上的局部给药。

乳酸菌

罗伊乳杆菌菌株93a已于2015年12月11日在DSMZ (Leibniz Institute DSMZ -German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(德国微生物保藏中心),Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)根据布达佩斯条约保藏，并已获得保藏号DSM 32229。

罗伊乳杆菌菌株F33已于2015年12月11日在DSMZ (Leibniz Institute DSMZ -German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)根据布达佩斯条约保藏，并已获得保藏号DSM 32232。

罗伊乳杆菌菌株C30已于2015年12月11日在DSMZ (Leibniz Institute DSMZ -German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)根据布达佩斯条约保藏，并已获得保藏号DSM 32230。

罗伊乳杆菌菌株D276已于2015年12月11日在DSMZ (Leibniz Institute DSMZ -German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)根据布达佩斯条约保藏，并已获得保藏号DSM 32231。

罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290是Biogaia AB, Sweden拥有的罗伊乳杆菌菌株。

可以根据将组氨酸转化为组胺所需的基因的存在情况，使用PCR或其它相关方法，筛选和选择乳酸菌的菌株，如Thomas CM et al. (2012) PLoS ONE 7(2): e31951. doi:10.1371/journal.pone. 0031951所述，其全部内容通过引用并入本文。

这些罗伊乳杆菌的生物学纯的培养物可以通过选择方法获得，包括以下步骤：

- 使用PCR方法，用根据以下的两种引物对于活性组氨酸操纵子的存在，筛选乳酸菌菌株：序列(CGTCAYTATCCWGCTCCWGG)，称为hdcA425fde和序列(TCCATRTCAGTATCWGGKGT)，称为hdcA867rde。引物根据来自罗伊乳杆菌(L. reuteri)、L. hilgardii、L. buchneri和L. sakei的hdc的比对进行设计。PCR分析在实施例5中进一步描述；和

- 选择具有活性组氨酸操纵子的菌株。

如实施例1所述，乳酸菌也可以基于它们将存在于体液中的组氨酸转化成组胺的能力进行选择。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：收集母乳样品，确定乳中组氨酸的量，在约37℃或其它合适的温度下将样品与待测试的细菌无氧孵育20至30小时，测定样品中组胺的量，并选择具有将组氨酸转化为组胺的能力的细菌菌株。

医学和美容用途

认为罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232可用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮，特别是在局部给予哺乳动物后。

具有将体液中存在的组氨酸转化为组胺的能力的其它乳酸菌菌株的实例可以是选自罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA 5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290的细菌。

乳酸菌菌株，尤其是罗伊乳杆菌菌株，特别是上述的乳酸菌菌株，被认为可用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮，特别是在局部给予哺乳动物后。如上定义的细菌可用于上述治疗，而不加入外部组氨酸来源，例如，所述细菌仅使用来自待治疗的哺乳动物的乳中的组氨酸。

如上定义的细菌菌株也被认为可用于缓解与阻塞的腺体导管的状况相关的炎症性病症，以及缓解和预防哺乳动物的乳系统(例如乳腺或乳房)的炎症性病症复发。

通过利用由乳腺产生的乳中存在的天然量的组氨酸并将其转化为组胺，如上定义的细菌菌株可以局部给予以提供在哺乳动物的乳腺(breast)、乳头、乳房和乳腺(mammarygland)附近和内部局部产生组胺的手段。通过在乳系统的部位或哺乳动物的发炎部位局部给予一种或多种上文定义的乳酸菌菌株，并将所给予的一种或多种上文定义的乳酸菌菌株与来自哺乳动物的乳组合，所述细菌被激活，并通过转化存在于乳中的组氨酸开始产生组胺。

局部组胺具有抗炎作用，用于治疗炎症。同时，细菌可以使用乳从身体外部迁移到哺乳动物的乳腺中。因此，如上定义的乳酸菌菌株从身体外部向哺乳动物提供抗炎和/或抗细菌作用和/或抗感染作用，并且不添加外部组氨酸，即并非来自待治疗的哺乳动物的乳的组氨酸。

如上定义的细菌菌株也可用于美容处理。

母乳中存在的组氨酸的天然量已经在几项研究中得到了深入的研究(ECScientific Committee on Food (2003) Report on the Revision of EssentialRequirements of Infant Formulae and Follow-on Formulae. European CommissionHealth and Consumer Protection Directorate- General, European Commission,Brussels)，导致平均浓度为29mg/100ml的母乳，或24mg/g总粗蛋白。此外，已知母乳为乳酸菌在乳腺繁殖和定殖提供所有各种类型的营养物。

组合物

组合物可以是药物组合物或美容组合物或装置等。

为了防止在潮湿或甚至在半潮湿的条件下快速丧失活力，在贮存期间细菌不暴露于水分是非常重要的。该问题可以部分地通过提供含所述细菌的产品，并干燥所述产品以除去水分并最终将所述产品提供在不透水包装中来处理。

在包含一种或多种乳酸菌菌株的组合物中，细菌优选以干燥形式使用，例如冷冻干燥形式或冻干形式。

为了保护保存的细菌免受潮湿，可以将细菌分散在一种或多种疏水物质或防潮剂中，其由于疏水性能而防止水分到达包埋的细菌细胞。任选地，可以向组合物中加入一种或多种添加剂。

可以使用脂质作为防潮剂。脂质的实例包括石油衍生的脂质，合成脂质和动物或植物来源的脂质。一种或多种脂质可以选自橄榄油，菜籽油，椰子油，棕榈仁油，花生油，大豆油，二甲硅酮，石蜡油和凡士林。

聚合物也可以用作防潮剂。适合于在储存和运输过程中保护细菌细胞免受潮湿的聚合物可优选当暴露于水分或潮湿的条件时溶解于体液中以释放细菌细胞。聚合物对哺乳动物皮肤应无毒，无刺激性。一种或多种聚合物可以选自聚乙烯醇，聚环氧乙烷，聚乙烯吡咯烷酮和淀粉。

可以添加另外的组分以在制造含有细菌的产品期间保护细菌，例如，碳水化合物如麦芽糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，葡萄糖和果糖；蛋白质，如脱脂乳和白蛋白；氨基酸，如谷氨酸钠；多元醇，如木糖醇，甘露糖醇和山梨糖醇；和抗氧化剂，如抗坏血酸钠。一旦细菌开始定殖在哺乳动物上和哺乳动物中，上述的一些组分也可以被细菌利用作为其繁殖的营养物。优选的生长条件将包含碳源，特别是葡萄糖，其将支持由罗伊乳杆菌菌株产生组胺(Thomas CM et al. (2012) PLoS ONE 7(2): e31951. doi:10.1371/journal.pone.0031951)。优选地，生长条件不依赖于蔗糖作为碳源，或者至少将仅包含不会显著损害罗伊乳杆菌菌株产生组胺的水平的蔗糖。

组合物可以包含选自碳水化合物、C_6-12中链脂肪酸(MCT)、软化剂(emollient)、表面活性剂、乳化剂和二氧化硅的其它添加剂。

组合物或装置可以选自洗剂、霜剂、软膏剂(ointment)、油、药膏剂(salve)、擦剂(liniment)、搽剂(embrocation)、摩擦剂(rub)、凝胶剂、凡士林、香脂(balm)、润肤剂(emollient)、油膏剂(unguent)、香膏(balsam)等。

根据本发明的组合物的实例可以是包含以下的组合物：

a)C_6-12中链甘油三酯(MCT) 20-49.5wt％或25-48.5wt％

b)向日葵油 20-49.5wt％或25-48.5wt％

c)二氧化硅 0-5wt％或0-1wt％

d)一种或多种乳酸菌(干燥) 0.1-5wt％或0.5-2wt％

和脂质，例如向日葵油或MCT，直至100％。

重量百分比(wt％)是组合物总重量的百分比。乳酸菌的活性可以在10⁵-10¹²CFU /克之间或在10⁷-10⁸CFU /克之间。

组合物中产生组胺的罗伊乳杆菌菌株的浓度应该以使得实现所需效果而不引起不良作用的方式来选择。在一些实施方案中，某些产生组胺的罗伊乳杆菌菌株的重量浓度为约0.01至约10wt％，或约0.1至约10wt％，或约0.1至约5wt％，或约0.5至约5wt％的组合物总重量。所用细菌的活性可以为10⁵-10¹²CFU/克或10⁷-10⁸CFU/克的细菌培养物。

这些浓度水平可以对应于组合物每天一次，两次，三次或四次的局部施用。

给药

本发明还提供了使如上定义的益生菌与哺乳动物的乳系统接触的方法。包含所述细菌的局部组合物可以以足以治疗乳腺炎的产生组胺的细菌菌株的浓度施用于皮肤。例如以上面提到的浓度。

该方法可以包括使用吸附剂或非吸附剂产品(例如薄纸、垫或擦拭物)将如上定义的细菌或包含所述细菌的组合物施用于哺乳动物的皮肤或粘膜。组合物可以在使用之前掺入吸附剂产品中，例如薄纸、垫或擦拭物并密封。例如，可以将组合物浸入薄纸、垫或擦拭物，真空干燥并密封。产品可以通过擦拭与哺乳动物的乳腺接触。

该方法还可以包括将如上所定义的细菌在包含所述细菌的组合物中施用于哺乳动物的皮肤或粘膜，所述组合物选自洗剂、霜剂、软膏剂(ointment)、油、药膏剂(salve)、擦剂(liniment)、搽剂(embrocation)、摩擦剂(rub)、凝胶剂、凡士林、香脂(balm)、润肤剂、油膏剂(unguent)、香膏(balsam)等。

该组合物可以施用于乳头、乳晕和整个乳房，以及乳房上最终发红的区域。乳酸菌或包含所述细菌的组合物可以使用由吸附剂或非吸附剂材料制成的垫给予，所述垫可以与哺乳动物的乳系统或乳腺接触，例如作为内衣胸罩中的插入物。这样的垫优选与存活但休眠的益生菌，特别是如上定义的乳酸菌相容并适于作为其载体。垫是例如护理垫。垫可以被棉絮、羊毛或具有类似于羊毛的特征的羊毛状材料包含或包围。垫可以适于为哺乳动物的皮肤提供绝缘或加热效果。这种加热效果可以由身体本身与覆盖和绝缘衣服组合提供。

吸附剂或非吸附剂产品可以减少，消除和/或预防乳腺炎和/或鹅口疮的病况。这样的效果可以由医疗保健专业人员，治疗对象或观察者在临床上客观和/或主观地评估。治疗可以进行一周，两周，三周或长至进行母乳喂养的时间。优选地，每天进行三次治疗，持续两周。

或者，如上所定义的细菌或包含所述细菌的组合物可以在包含上文定义的细菌和可接受的载体系统的试剂盒中提供。试剂盒可以包括在组合物的处理、制备和使用中有用的其它制品以及使用它们的说明书。

实施例

现在将参考以下实施例描述本发明。这些实施例是为了说明本发明的各方面的目的，并不意图限制由权利要求限定的本发明的范围。

实施例1

制备三种试验产品，其由以下组成：

1. 在LDM中新鲜生长的罗伊乳杆菌菌株DSM 17938

2. 在LDM中新鲜生长的罗伊乳杆菌菌株ATCC PTA 4659

3. 单独的乳杆菌限定培养基(LDM)

自瑞典哥德堡Sahlgrenska医院新生儿科的乳库(Milk bank)提供20份人类母乳样品。使用Chen等人(Analytica Chimica Acta，Volume 570，Issue 1，2006年6月7日，第109-115页)的方法分析样品的组氨酸含量。

合并样品以制备总共4份样品，其含有约10、20、30和40mg组氨酸/100ml乳。

将4份合并的乳样品放入3个试管中，每个管的量为20ml。

将试验产品1、2和3放入相应的试管中，产品1和2的量为10⁷CFU细菌菌株/管，和产品3以与产品1和2相当的体积放入。将试管放入厌氧室中，并在37℃下孵育过夜。

使用组胺ELISA试剂盒(Neogen，Lexington，KY)根据制造商的说明书分析试管中的样品的组胺含量。

结果

合并的人乳样品中组胺的量(mg/100ml)

试验产品	10mg组氨酸	20mg组氨酸	30mg组氨酸	40mg组氨酸
					1	0	0	0	0
2	0.4	0.7	1.0	1.2
					3	0	0	0	0

选择测试产品2的菌株，罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659。

实施例2

测试局部组合物，C、I和J。测试含有不同组分的三种不同的局部组合物。所有组合物经混合，总重量为15克，全部含有某种产生组胺的罗伊乳杆菌菌株的2％培养物，在这种情况下以罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659为例。所有组分均来自AarhusKarlshamn Sweden AB，除了羊毛脂(Lanolines Stella S.A., Belgium)。

实施例3

测试局部组合物。将组合物混合至总重量为15克，含有某种产生组胺的罗伊乳杆菌菌株的2％培养物，在这种情况下以罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659为例。所有组分均来自AarhusKarlshamn Sweden AB。

实施例4

益生菌罗伊乳杆菌对泌乳性乳腺炎的治疗效果的试验性研究

在试验性研究中，出现泌乳性乳腺炎症状的女性被随机化，预期每组20个完整病例。女性将通过来电到Sahlgrenska University Hospital East, Gothenburg, Sweden的母乳喂养诊所进行确认。在母乳喂养诊所工作的所有助产士具有照料有母乳喂养问题的女性的长期经验，并在母乳喂养方面具有至少7.5个高等教育点。通常的例行程序是，建议有乳腺炎相关症状的女性进行家庭护理和待产。第二天，母乳喂养诊所的助产士将通过电话对这些女性进行例行随访。有资格接受抗生素治疗的患者将被邀请到诊所就诊。

有资格参加这项研究的女性是那些被建议进行家庭护理和待产的女性。研究助产士将通过电话联系符合条件的女性获取更多信息，并邀请有兴趣的女性到诊所(同一天)进行首次就诊。该女性将获得更多关于研究的口头和书面信息，并且助产士评估母亲是否有资格参加研究。此评估将基于问卷和身体检查。

然后，女性将通过电子数据库随机分配到益生菌治疗或安慰剂。两组的治疗将持续14天。女性在治疗期间将继续哺乳。女性将通过就诊和电话采访进行随访28天，并在前14天期间填写关于自己和其孩子症状的日记。

所有研究参与者将由母乳喂养诊所进行随访。这可能包括电话随访，到母乳喂养诊所或医院其它科室就诊，并且如果认为必要的话，按照医院的例行程序进行抗生素治疗。不依赖于随访或治疗，除了她们希望退出研究外，女性一旦包括在内，将继续留在研究中。

纳入标准

•根据Kvist量表，具有至少4小时发热≥38°C、至少1分红斑和1分乳房绷紧(breasttension)的历史的女性，以及在母乳喂养诊所由助产士对抗生素治疗建议家庭护理和待产的女性

•年龄≥18岁

•能够给予知情同意书

•愿意遵守治疗申请

•能够理解和遵守研究方案要求

•婴儿经过儿科医生检查，被认为是健康的

•唯一的母乳喂养

排除标准

•目前的乳房损伤/创伤

•目前的乳腺脓肿或其它乳腺病理学

•目前乳腺癌/乳腺癌史

•过去一个月的乳房手术

•新怀孕

•早产婴儿，孕龄<37周出生

•婴儿正处于新生儿护理下

•自身免疫性疾病(母亲和儿童二者)

•对研究产品的任何组分已知或疑似过敏(母亲和儿童二者)

•在治疗开始前30天内参与另一项研究性药物研究。

•使用任何其它益生菌(口服或局部)

•持续的抗生素治疗

治疗组1)和2)：

1)该组接受含有10⁸CFU/10滴罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659的益生菌油，用于各乳房上3次/天的外部局部施用，持续14天。

2)该组接受外部局部施用的安慰剂油(相同组成的不含罗伊乳杆菌的益生菌油)，各乳房上3次/天，持续14天。

结果

预期益生菌的局部给药

- 缓解由泌乳性乳腺炎引起的症状(流感样症状，发热，导致发红的局部炎症，乳房疼痛和绷紧，乳头和/或乳晕裂隙)。

- 14天治疗后恢复母乳中的罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659。

- 降低葡萄球菌和链球菌的乳计数。

- 减少抗生素治疗需求。

实施例5

使用PCR检测罗伊乳杆菌中编码组氨酸脱羧酶(hdc)的基因

方法：

样品制备

细菌在MRS肉汤中在37℃生长过夜。将细菌悬浮液以3500rpm离心5分钟，将1μl沉淀物悬浮于100μl PBS中。

PCR分析

引物：

hdcA425fde(CGTCAYTATCCWGCTCCWGG)和hdcA867rde(TCCATRTCAGTATCWGGKGT)；产物大小442 bp；引物自罗伊乳杆菌、L. hilgardii, L. buchneri和L. sakei的hdc的对比进行设计。

DreamTaq Green PCR Mastermix(2X Thermo Scientific，制品编号K1081)用于PCR反应。根据以下进行PCR反应：

含引物的Mastermix 体积/反应

水(PCR质量级) 10.0μl

正向引物(10pmol/μl) 1.0μl

反向引物(10pmol/μl) 1.0μl

DreamTaq 12.5μl

将24.5μl Mastermix与0.5μl细菌悬浮液混合，并运行以下程序：95℃10分钟// 30x(95℃30s，48℃30s，72℃30s)// 72℃5分钟 // 保持4°C。

结果

结果表明，不同宿主来源的许多罗伊乳杆菌菌株对编码组氨酸脱羧酶的基因是阳性的(见表1)。

表1. 来自PCR分析的结果的总结，显示所测试细菌的物种、菌株和宿主来源。

本发明不限于所公开的实施方案，而是可以在所附权利要求的范围内进行变化和修改。

Claims

1. 选自罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232的罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的生物学纯的培养物。

2.根据权利要求1的罗伊乳杆菌菌株，其用于治疗乳腺炎。

3.根据权利要求1的罗伊乳杆菌菌株，其用于治疗鹅口疮。

4.一种或多种乳酸菌菌株用于治疗乳腺炎的用途，其中所述细菌菌株具有将存在于局部体液中的组氨酸转化为组胺的能力。

5.一种或多种乳酸菌菌株用于治疗鹅口疮的用途。

6.根据权利要求4或5的用途，其中所述治疗是局部治疗。

7.根据权利要求4至6中任一项的用途，其中所述体液是存在待治疗的哺乳动物体外的乳。

8.根据权利要求4至7中任一项的用途，其中所述一种或多种乳酸菌菌株是罗伊乳杆菌菌株。

9. 根据权利要求4至8中任一项的用途，其中所述一种或多种乳酸菌菌株选自罗伊乳杆菌DSM 32229、罗伊乳杆菌DSM 32230、罗伊乳杆菌DSM 32231和罗伊乳杆菌DSM 32232。

10. 根据权利要求4至8中任一项的用途，其中所述一种或多种乳酸菌菌株选自罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌ATCC PTA 4659、罗伊乳杆菌ATCC PTA 5289和罗伊乳杆菌ATCC PTA 5290。

11.一种组合物，其包含呈干燥形式的权利要求9或10所定义的一种或多种乳酸菌，任选连同防潮剂和一种或多种添加剂。

12.根据权利要求11的组合物，其中所述组合物选自洗剂、霜剂、软膏剂、油、药膏剂、擦剂、搽剂、摩擦剂、凝胶剂、凡士林、香脂、润肤剂、油膏剂和香膏。

13.根据权利要求11和12中任一项的组合物用于治疗乳腺炎和/或鹅口疮的用途。

14.根据权利要求13的用途，其中所述治疗是局部治疗。

15.一种用于局部给予乳酸菌菌株以治疗乳腺炎和/或鹅口疮的方法，其中所述细菌菌株具有将存在于局部体液中的组氨酸转化为组胺的能力，其中使用包含所述细菌的组合物将细菌给予哺乳动物的皮肤或粘膜，其中所述组合物选自洗剂、霜剂、软膏剂、油、药膏剂、擦剂、搽剂、摩擦剂、凝胶剂、凡士林、香脂、润肤剂、油膏剂和香膏。

16.根据权利要求15的方法，其中组合物如权利要求11所定义。

17.一种用于局部给予乳酸菌菌株以治疗乳腺炎和/或鹅口疮的方法，其中所述细菌菌株具有将存在于局部体液中的组氨酸转化为组胺的能力，其中使用吸附剂或非吸附剂产品将细菌给予哺乳动物的皮肤或粘膜。

18.根据权利要求17的方法，其中所述吸附剂或非吸附剂产品是由吸附剂或非吸附剂材料制成的垫、擦拭物和/或薄纸，其中所述材料适合作为所述一种或多种罗伊乳杆菌菌株的载体，和所述产品适于放置而与哺乳动物的乳腺接触。

19.根据权利要求18的方法，其中所述吸附剂或非吸附剂产品被棉絮、羊毛或具有类似于羊毛的特征的羊毛状材料包含或包围。

20.根据权利要求19的方法，其中棉絮、羊毛或羊毛状材料适于提供热量。