CN107525935A - 用于在恶性疾病的临床症状之前高达十年的早期癌症检测和癌症诊断的靶向二维免疫印迹分析的方法和组合物 - Google Patents
用于在恶性疾病的临床症状之前高达十年的早期癌症检测和癌症诊断的靶向二维免疫印迹分析的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107525935A CN107525935A CN201610595973.3A CN201610595973A CN107525935A CN 107525935 A CN107525935 A CN 107525935A CN 201610595973 A CN201610595973 A CN 201610595973A CN 107525935 A CN107525935 A CN 107525935A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enox2
- cancer
- transcriptional variants
- protein
- activation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 226
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 191
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 18
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 title description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 9
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 title description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title description 4
- 101001064096 Homo sapiens Protein disulfide-thiol oxidoreductase Proteins 0.000 claims abstract description 258
- 102100030728 Protein disulfide-thiol oxidoreductase Human genes 0.000 claims abstract description 257
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 120
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 41
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 80
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 40
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 37
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 36
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 29
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 20
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 7
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 claims description 7
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 4
- 210000003360 nephrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 claims description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 2
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013066 combination product Substances 0.000 claims 11
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 claims 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 claims 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 claims 1
- OTCVAHKKMMUFAY-UHFFFAOYSA-N oxosilver Chemical class [Ag]=O OTCVAHKKMMUFAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims 1
- 229910001923 silver oxide Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000012354 positive regulation of binding Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 16
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 13
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 13
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 7
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 7
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010066066 tumor-associated NADH oxidase Proteins 0.000 description 3
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N (-)-Epigallocatechin-3-o-gallate Chemical compound O([C@@H]1CC2=C(O)C=C(C=C2O[C@@H]1C=1C=C(O)C(O)=C(O)C=1)O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 1
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- UTSXERRKRAEDOV-UHFFFAOYSA-N 3-[dimethyl-[3-(tetradecanoylamino)propyl]azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O UTSXERRKRAEDOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040193 ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3 Human genes 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100033899 Ankyrin repeat and SOCS box protein 14 Human genes 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 208000033116 Asbestos intoxication Diseases 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 101001016210 Bos taurus Dynein axonemal heavy chain 12 Proteins 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000208293 Capsicum Species 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001037079 Homo sapiens ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3 Proteins 0.000 description 1
- 101000925508 Homo sapiens Ankyrin repeat and SOCS box protein 14 Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033701 Papillary thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010035600 Pleural fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- WCZQFZXLQAMLDO-UHFFFAOYSA-N [O].CC(CC(C)(C)C)(C)C1=CC=CC=C1 Chemical compound [O].CC(CC(C)(C)C)(C)C1=CC=CC=C1 WCZQFZXLQAMLDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N anhydrous creatine Natural products NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 206010003441 asbestosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 125000003739 carbamimidoyl group Chemical group C(N)(=N)* 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical class SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- -1 lauryl creatine Chemical compound 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 208000030045 thyroid gland papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/561—Immunoelectrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本发明包括用于检测受试者中的癌症的良性到恶性的转化的方法，包括以下步骤：在电泳蛋白质分离之前收集来自受试者的样品；使用ENOX2电子供体激活电泳分离的ENOX2转录变体；和使用泛‑ENOX2可检测的结合试剂检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在，其中样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在表示癌症的恶性转化，由此当与等价的未激活的ENOX2转录变体比较时，一种或多种激活的ENOX2转录变体的检测灵敏度获得10至100倍的升高。
Description
技术领域
本发明一般地涉及癌症检测和诊断的领域，更具体地涉及基于NADH-靶向检测的功能化的单链可变区域重组ENOX2抗体。
引入光盘上提交的材料作为参考
本申请包括ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，并且将其全文引入本文作为参考。2016年5月30日建立的所述ASCII副本名为MNCE1002.txt并且大小为18kb。
背景技术
在不限制本发明的范围的情况下，结合癌症蛋白质生物化学描述其背景。
有一个具有蛋白质二硫键-巯基互换活性的细胞表面氢醌或NADH氧化酶的独特的、生长相关的家族，称为ECTO-NOX蛋白质(对于细胞表面NADH氧化酶)(Morre,1998.Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress andDisease(Asard,H.,Berczi,A.和Caubergs,R.J.,Eds)pp.121-156,Kluwer AcademicPublishers,Dordrecht,Netherlands；Morre和Morre,2003.Free Radical Res.37:795-805)。称为ENOX2(对于肿瘤相关的)的ECTO-NOX家族的一个成员对癌细胞的表面和癌症患者的血清具有特异性(Morre等人,1995.Proc.Natl.Acad.Sci.92:1831-1835；Bruno等人,1992.Biochem.J.284:625-628)。已针对若干人类肿瘤组织证实了ENOX2蛋白质的存在(乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、结肠癌和黑素瘤)(Cho等人,2002.Cancer Immunol.Immunother.51:121-129)；并且血清分析表明与人类癌症更广泛的联系(Morre,等人,1997.Arch.Biochem.Biophys.342:224-230；Morre和Reust,1997.J.Bioenerg.Biomemb.29:281-289)。
ENOX蛋白质是锚定在质膜的外部小叶中的外蛋白质(Morre,1965.Biochim.Biophys.Acta 1240:201-208；图1)。与外蛋白质的其他实例(唾液酸和半乳糖基转移酶、二肽基氨基肽酶IV等)的特征一样，ENOX蛋白质是脱落的。它们以可溶形式出现在培养的细胞的条件培养基(Cho等人,2002.Cancer Immunol.Immunother.51:121-129)和患者血清(Morre,等人,1997.Arch.Biochem.Biophys.342:224-230；Morre和Reust,1997.J.Bioenerg.Biomemb.29:281-289)中。来自癌症患者的ENOX2的血清形式显示与膜相关形式的相同程度的药物反应性。在多种人类癌症患者的血清中发现药物反应性ENOX2活性，所述患者包括患有白血病、淋巴瘤或实体瘤(前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢和肝癌)的患者(Morre,等人,1997.Arch.Biochem.Biophys.342:224-230；Morre和Reust,1997.J.Bioenerg.Biomemb.29:281-289)。ENOX2蛋白质的极端稳定性和蛋白酶抗性(del Castillo-Olivares等人,1998.Arch.Biochem.Biophys.385:125-140)可以帮助解释其在癌症患者的血清中聚集到可容易地检测的水平的能力。相反，在健康志愿者的血清中或在患有除瘤形成以外的障碍的患者的血清中未发现药物反应性NOX活性(Morre,等人,1997.Arch.Biochem.Biophys.342:224-230；Morre and Reust,1997.J.Bioenerg.Biomemb.29:281-289)。
虽然之前未确定细胞表面ENOX2的癌症特异性的基础，但该概念受到若干证据的支持。药物反应性ENOX2活性已经严格确定为不在非转化的人类和动物细胞和组织的的质膜上(Morre等人,1995.Proc.Natl.Acad.Sci.92:1831-1835)。ENOX2蛋白质缺乏跨膜结合结构域(Morre,等人,2001.Arch.Biochem.Biophys.392:251-256)，并且通过在低pH下短暂的处理从细胞表面释放(del Castillo-Olivares等人,1998.Arch.Biochem.Biophys.358:125-140)。未在来自健康志愿者或患有除癌症以外的疾病的患者的血清中检测到药物反应性ENOX2活性(Morre,等人,1997.Arch.Biochem.Biophys.342:224-230；Morre和Reust,1997.J.Bioenerg.Biomemb.29:281-289)。当使用转化的细胞和癌症患者的组织或血清作为抗原来源时，几种ENOX2抗血清已通过免疫印迹分析或免疫沉淀确定在34kDa下的免疫反应性带(ENOX2的细胞表面形式之一的加工的分子量)(Cho等人,2002.CancerImmunol.Immunother.51:121-129；Morre,等人,2001.Arch.Biochem.Biophys.392:251-256；Chueh等人,2002.Biochemistry 44:3732-3741)。当使用转化的细胞和来自健康志愿者或患有除癌症以外的障碍的患者的组织或血清时，在免疫印迹分析或免疫沉淀的情况下不存在34kDa下的免疫反应性带(Cho等人,2002.Cancer Immunol.Immunother.51:121-129；Morre,等人,2001.Arch.Biochem.Biophys.392:251-256；Chueh等人,2002.Biochemistry 44:3732-374)。这些抗血清包括单克隆抗体(Cho等人,2002.CancerImmunol.Immunother.51:121-129)、与来自正常和赘生性细胞的细胞表面NADH氧化酶反应的单链可变区域片段(scFv)、应答表达的ENOX2制备的多克隆抗血清(Chueh等人,2002.Biochemistry 44:3732-374)和ENOX2的保守腺嘌呤核苷酸结合区域的多克隆肽抗血清(Chueh等人,2002.Biochemistry 44:3732-374)。
ENOX2cDNA已经被克隆(GenBank登录号AF207881；11；美国专利公开2003/0207340A1)。从开放阅读框架推导的分子量为70.1kDa。功能基序包括醌结合位点、腺嘌呤核苷酸结合位点和作为基于定点诱变的潜在的蛋白质二硫键-巯基互换位点的CXXXXC半胱氨酸对(Chueh等人,2002.Biochemistry 44:3732-374)。基于可得的基因组信息(Bird,1999.来自克隆875H3(PK1抗原的部分)的人类DNA序列直接提交到NCBI的GenBank数据库)，ENOX2基因位于染色体X，并且其由多个外显子(13个)组成。已知有许多剪接变体mRNA和表达的蛋白质。
产生肿瘤NADH氧化酶特异性单克隆抗体MAB 12.1的杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约，于2002年4月4日保藏在美国典型培养物保藏中心,Manassas,Va.,20108。该保藏物由登录号ATCC PTA-4206确定。保藏物将在受限的情况下在ATCC保藏所保持自保藏日起30年的时间，或或在最近请求后5年，或持续至本专利的有效期限(取较长者)，并且如果在该期间变得不可用时将被更换。该单克隆抗体描述于2006年5月30日授权的第7,053,188号美国专利中，将其引入本文作为参考。
由于癌症对人类健康构成明显威胁并且由于癌症导致显著的经济成本，因此本领域对其中分析癌症的存在和器官位点的有效的、经济的和技术上简单的系统具有长期的需要。
发明内容
本发明包括用于分析生物样品的称为ENOX2的泛-癌症抗原的特定转录变体的存在的方法(针对肿瘤特异性NADH氧化酶)。本方法包括例如，二维凝胶电泳和使用对泛-癌症ENOX2抗原和表征癌症的具体类型的各种同工型具有特异性的抗体进行免疫杂交。本发明的方法还可以适用于评价对治疗的反应，其中降低量的ENOX2同工型反映成功的治疗，以及适用于复发性疾病(反映ENOX2特异性同工型的升高或再现)的早期检测。
在一个实施方案中，本发明包括用于检测受试者中的癌症的良性到恶性转化的方法，包括以下步骤：在电泳蛋白质分离之前收集来自受试者的样品；使用ENOX2电子供体激活电泳分离的ENOX2转录变体；和使用泛-ENOX2可检测的结合试剂检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在，其中样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在表示癌症的恶性转化，由此当与等价的未激活的ENOX2转录变体比较时，获得一种或多种激活的ENOX2转录变体的检测灵敏度的10至100倍的升高。在一个方面中，激活ENOX2转录变体所需的ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，并且在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内。在另一个方面中，所述方法还包括进行二维(2D)电泳蛋白质分离并杂交到膜或纸上。在另一个方面中，泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ IDNO:11。在另一个方面中，样品为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或其他体液。在另一个方面中，泛-ENOX2可检测的结合试剂包括抗-ENOX2scFv融合蛋白，所述抗-ENOX2scFv融合蛋白：在4℃至40℃下是非聚集的；包括ScFv融合蛋白的重链和轻链部分之间的功能连接肽，所述ScFv融合蛋白主要由具有另外包含间隔为CXXXXC或CXXXXXC的两个半胱氨酸残基的小侧链(Gly/Ser)的氨基酸构成；并且能够与ENOX2的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序形成链间二硫键。在另一个方面中，所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11的scFv，其中SEQ ID NO:1的scFv的稳定性、结合效率和有效期通过在防止聚集的50％的-70℃的甘油中储存来改善。在另一个方面中，浓缩血液、血清或血浆样品的步骤进一步定义为使用结合和浓缩一种或多种ENOX2转录变体的镍-琼脂糖底物浓缩一种或多种ENOX2转录变体。在另一个方面中，所述方法还包括在临床症状前至少一年检测癌症和/或确定人类癌症起源的组织。在另一个方面中，所述方法还包括在临床症状前至少一年(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或20年)检测癌症和/或确定人类癌症起源的组织。在另一个方面中，所述方法还包括确定一种或多种未知原发灶的癌症(CUP)的起源的组织。在另一个方面中，所述方法还包括筛选以下至少一种：在具有家族癌症史、环境暴露的人群中或在一般人群中的早期癌症。在另一个方面中，方法还包括基于下表1中描述的ENOX2转录变体的存在确定一种或多种激活的ENOX2转录变体的起源的组织：
表1：针对诊断患有代表20个不同的起源的组织的24种不同的癌症的患者的血清测定的分子量(MW)和等电点(Pi)范围
*血细胞癌症包括表示为总数的淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
**非小细胞肺癌在两个子集中以避免与小细胞肺癌的分子量重叠。
***子宫癌在基于分子量的两个子集中以避免与膀胱癌的重叠(参见脚注1和2)。
1.蛋白质1的等电点pH≥蛋白质2。
2.蛋白质1的等电点pH<蛋白质2。
在另一个方面中，本方法还包括解析在53和/或79至85kDa下的蛋白质作为总蛋白质装载对照。在另一个方面中，方法还包括基于一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在区分远处转移和多原发性癌症。在另一个方面中，方法还包括检测0期和1期癌症并确定癌症的起源的组织。在另一个方面中，预测的癌症的假阳性和确认的假阴性的发生率小于1％。在另一个方面中，用于检测癌症的方法的灵敏度大于95％。在另一个方面中，方法的灵敏度检测两百万个或更少的癌细胞的存在。在另一个方面中，方法还包括监测癌症的再现，其中两百万个或更少的癌细胞的存在基于一种或多种激活的ENOX2转录变体的再现是可检测的。在另一个方面中，方法还包括确定恶性和良性早期肿瘤病变，其中如果检测到良性区域，则可以避免进行手术、化疗或放疗的步骤。在另一个方面中，方法还包括确定前列腺癌的早期指征。在另一个方面中，方法还包括在导管乳腺癌发展前，测定原位并且需要治疗性早期干预的可延迟性乳腺癌以潜在地避免手术、对放疗或化疗的需要。在另一个方面中，在临床症状发展前至少一年检测良性到恶性转化。在另一个方面中，检测的癌症的起源的组织选自以下至少一种：膀胱、血细胞、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤和骨髓瘤、乳腺、宫颈、结肠直肠、食道、胃、肝细胞、肺，非小细胞、黑素瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、肾细胞(肾)、肉瘤、鳞状细胞、睾丸生殖细胞、甲状腺滤泡、甲状腺乳头状癌或子宫(子宫内膜)。
本发明的又一个实施方案包括在免疫印迹上定量ENOX2转录变体的校正方法，包括：使来自受试者浓缩的样品的样品经受电泳蛋白质分离；将电泳分离的蛋白质免疫杂交到蛋白质俘获膜或纸上；使用还原的ENOX2底物激活蛋白质俘获膜或纸上的一种或多种ENOX2转录变体；和使用泛-ENOX2可检测的结合试剂检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在，其中血液、血清或血浆样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在表明癌症的恶性转化，其中当与未激活的ENOX2比较时，获得ENOX2的检测灵敏度10至100倍的升高，其中当与已知量的一种或多种ENOX2转录变体比较时，基于蛋白质俘获膜或纸上的ENOX2转录变体的斑点直径和强度校正一种或多种激活的ENOX2转录变体的量。在一个方面中，将斑点直径与重组ENOX2的标准曲线比较。在另一个方面中，斑点直径和ENOX2的质量的对数线性相关。
本发明的又一个方面包括确定受试者中的癌症的起源的组织的方法，包括：使来自受试者的样品中的蛋白质经受二维(2D)分子量和等电点电泳蛋白质分离；将蛋白质转移到蛋白质俘获膜或纸；通过与蛋白质俘获膜或纸上的ENOX2电子供体孵育来激活电泳分离的ENOX2转录变体；检测激活的ENOX2转录变体；和基于来自表1的样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在确定癌症的起源的组织，其中当与未激活的ENOX2转录变体相比时，一种或多种ENOX2转录变体的原位激活使检测灵敏度提高10至100倍。在另一个方面中，激活ENOX2转录变体所需的所述ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，并且在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内。在另一个方面中，方法还包括进行二维(2D)电泳蛋白质分离并杂交到膜或纸上，其中所述ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，和在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内。在另一个方面中，泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11。在另一个方面中，泛-ENOX2可检测的结合试剂包括抗-ENOX2scFv融合蛋白，所述抗-ENOX2scFv融合蛋白：在4℃至40℃下是非聚集的；包括包含间隔为CXXXXC或CXXXXXC的半胱氨酸(C)的氨基酸残基的小侧链(Gly/Ser)；和能够与ENOX2的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序形成链间二硫键。在另一个方面中，泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11的scFv，其中SEQ IDNO:11的scFv的稳定性、结合效率和有效期通过在防止聚集的50％的甘油中在-70℃下储存来改善。在另一个方面中，浓缩样品的步骤进一步定义为使用结合和浓缩一种或多种ENOX2转录变体的镍-琼脂糖底物浓缩一种或多种ENOX2转录变体。在另一个方面中，方法还包括在临床症状前至少一年检测癌症和/或确定人类癌症起源的组织。在另一个方面中，样品为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或体液。
本发明的又一个实施方案包括一种印迹，其包括来自受试者的浓缩的样品的一种或多种电泳分离的蛋白质，其中将所述印迹暴露于泛-ENOX2检测试剂和激活印迹上的ENOX2转录变体的ENOX2的还原底物，其中针对来自表1的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在分析印迹，其中一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在用于在临床症状前至少一年检测和确定人类癌症的起源的组织，当与未激活的ENOX2转录变体相比时，一种或多种ENOX2转录变体的原位激活使检测灵敏度提高10至100倍。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，显著参照本发明的详述以及附图，其中：
图1是显示如通过2-D凝胶电泳/免疫印迹分析测定的在分析中的不同量的ENOX2的斑点尺寸和密度的两倍升高的图表，比较了与没有NADH相比在15μM NADH存在下的孵育。
图2是描绘ENOX2活性和NADH的浓度的关系的图表。在约500μM NADH下实现了最大活性，kM为约0.8μM(参见用于测定kM的图3)。
图3是显示ENOX2活性(纳摩尔/min/mg蛋白质)V对mM底物浓度S的双倒数Lineweaver-Burke绘图的图表，产生约0.8mM的kM。纵坐标截距对于具有和不具有抗体的情况是相同或相似的，表明抗体与NADH底物竞争活性位点，为底物和抗体结合位点在ENOX2序列的相同区域提供了证据。
图4是显示ENOX2活性作为时间的函数的示意图的图表，以说明汇集的癌症血清的ENOX2活性周期的五个最大值。如表1中所定量，抑制在22min活性周期内在最大值4下发生。因此，抗体结合必须仅发生在最大值4期间，因为最大值5是待抑制的第一个最大值。在最大值5下的抗体添加没有作用，在最大值4之前的抗体添加也没有作用。
图5是描绘在临床症状之前高达10年的石棉工人的恶性间皮瘤的早期检测的图表。显示了在诊断出石棉诱导的恶性间皮瘤之前168至96个月开始的七名男性受试者的连续分析，其诊断的中值年龄为67岁。实心符号–恶性间皮瘤的蛋白质1和蛋白质2特征，明显。空心符号--蛋白质1和蛋白质2均不明显。阴影符号–仅蛋白质1明显。
图6是利用癌症特异性的细胞表面蛋白质的ENOX2家族用于早期诊断和早期干预癌症的示意图。ENOX2的癌症位点特异性转录变体流入血清以允许早期检测和诊断。在细胞表面起源的ENOX2蛋白质充当未经调节的癌症生长所必需的质膜电子传递功能的末端氧化酶。当例如通过EGCg/辣椒(Capsicum)协同作用抑制ENOX2蛋白质时，未经调节的生长停止并且癌细胞经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
图7提供了ENOX2转录变体飞二维凝胶/免疫印迹，比较了汇集的非癌症(左图)和代表主要癌加上白血病和淋巴瘤的汇集的癌症(右图)患者血清。标记了无反应性(在背景下)白蛋白的近似位置用于比较。ENOX2反应性蛋白质限于象限I和IV。检测使用与碱性磷酸酶连接的重组scFv-S(S-标签肽标签肽：His-Glu-Ala-Ala-Lys-Phe-Gln-Arg-Glu-His)抗体。汇集的癌症血清的约10种ENOX2转录变体不存在于非癌症(A)中并且是癌症位点特异性的。
图8A至8J显示单独分析的来自癌症患者的血清的2-D凝胶电泳的免疫印迹/免疫印迹。以存在的主要转录变体的分子量下降的顺序显示癌症位点。图8A.宫颈癌。图8B.卵巢癌。图8C.前列腺癌。图8D.乳腺癌。图8E.非小细胞肺癌。图8F.小细胞肺癌。图8G.胰腺癌。图8H.结肠癌。图8I.非霍奇金淋巴瘤。图8J.黑素瘤。标记非反应性(在背景下)白蛋白(Ab)的大致位置用于比较。平行分析了约180份非癌症患者血清，没有表明用于作为阳性对照比较的特异性转录变体的蛋白质的迹象。
图9A和9B显示了患者血清的分析凝胶电泳和免疫印迹。图9A.来自患有非小细胞肺癌的患者的血清包含54kDa，等电点pH 5.1的转录变体(箭头)。图9B.来自患有小细胞肺癌的患者的血清包含52kDa，等电点4.3的转录变体(箭头)。参照斑点向右，MW 52kDa和等电点pH 4.1为α1-抗胰蛋白酶抑制剂。白蛋白和其他血清蛋白质是非反应性的。
图10显示了通过患者血清的免疫杂交，对乳腺癌具有特异性的ENOX2转录变体的2-D凝胶电泳分离和检测。箭头＝66至68kDa的乳腺癌特异性转录变体。R＝52kDa，等电点pH4.1的α-胎球蛋白参照斑点。
图11示出了斑点直径和装载在2-D凝胶上的ENOX2蛋白质的量之间的双对数关系。通过免疫印迹分析了不同量的重组ENOX2。然后将检测的ENOX2斑点的直径的对数绘制为装载的ENOX2的量的函数。
图12显示了混合实验的免疫印迹，以证实与常规的XXXXXXX连接肽(图12B)相比，具有-CXXC-XX-C连接肽(图12A)的ScFV的功效。在针对两者(以保留S-S键)的非还原条件下，具有功能性半胱氨酸连接肽的ScFV重组抗体当与重组ENOX2孵育时显示降低水平的53kDa ScFV(a)和来自下游起始位点的46kDa的截短ScFV(b)，主要是通过全长ScFV和72kDa全长ENOX2之间的以针对约176kDa的组合分子量的一个ENOX2分子加上两个ScFV分子(ENOX2的两个蛋白质二硫键异构酶结合位点中的每个连接一个)的比例的二硫键形成。在图12B中，使用缺乏半胱氨酸的常规连接肽，未观察到在相同反应条件下的交联的迹象。
图13是由光散射(Agilent 7080粒径分光光度计)测定的基于尺寸(nm)的抗体的颗粒分布随浓度(％)的变化，主要显示了当在-70℃下在50％甘油中储存时，非聚集抗体的主要贡献。
图14是本文描述的NADH靶向的二维免疫印迹分析与Hostetler等人2009(Clin.Proteomics 5:46-51)描述的常规二维免疫印迹分析的比较，证实ENOX2转录变体检测的灵敏度的10倍升高。
具体实施方式
虽然制备和使用本发明的各种实施方案在以下更详细地讨论，但应理解本发明提供了可以在各种特定背景下实施的许多适用的发明性构思。本文讨论的具体实施方案仅说明制备和使用本发明的具体方式，不限制本发明的范围。
为了易于理解本发明，以下定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”不旨在仅指代单数实体，而且包括具体实例用于说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不限定本发明，除非在权利要求中指出。
本发明的领域是用于癌症的早期泛-癌症诊断的基于血清的分析，其允许基于靶向细胞表面ENOX2蛋白质的癌症特异性家族的特异性功能化的单链可变区域重组抗体，在恶性疾病的临床症状之前高达十年检测癌症，借以通过使用与NADH靶向技术组合的具有ENOX2特异性重组scFv抗体的二维凝胶电泳测定起源特异性转录变体的组织的分子量和等电点，比先前开发的方案提供10至100倍的提高的灵敏度。
外-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶二硫键巯基交换肽2(ENOX2)(GenBank登录号AF207881；Chueh等人,2002)也称为肿瘤相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(ENOX2)，理想地适用作早期诊断以及早期预防性干预的靶标(图6)。蛋白质在恶性肿瘤细胞表面上表达，并且在患有癌症的患者的血清中是可检测的(Cho等人,2002)。ENOX2蛋白质是质膜电子传递的末端氢醌氧化酶。从早期干预的观点来看，他们在肿瘤细胞的生长和扩大中是重要的(Morre和Morre,2003；Tang等人,2007.Biochemistry46:12337-12346；2008.Oncol.Res.16:557-567)。我们的方法使用ENOX2作为早期检测和早期干预两者的靶标，是基于这些特性的(Cho等人,2002；Morre和Morre,2003；Davies和Bozzo综述,2005.Drug News Perspect 19:223-225)。虽然ENXO2的存在提供了癌症检测的非侵入性方法，但在没有确定癌症位点特异性ENOX2形式的方法的情况下，不能提供关于癌症类型或部位的指示。
本发明提供了用于分析生物样品的称为ENOX2的泛-癌症抗原的具体同工型的存在的方法(针对肿瘤特异性NADH氧化酶)。本发明需要使用对泛-癌症ENOX2抗原和表征癌症的具体形式的各种同工型具有特异性的抗体进行二维凝胶电泳和免疫印迹。如具体例示的，装载约30μL的血清用于分析。
使用ENOX2特异性单克隆抗体(MAb)(第7,053,188号美国专利)，使用识别所有细胞表面NOX蛋白质的单链可变区域(scFv)片段(两种年龄相关的正常细胞和瘤形成特异性NADH氧化酶)或使用针对ENOX2培养的多克隆血清，通过检测在其分子量和等电点的基础上确定ENOX2转录变体。首先通过结合于镍-琼脂糖并随后洗脱从生物样品，希望地血清样品中富集和浓缩ECTO-NOX蛋白质。在通过涡旋从镍琼脂糖上释放蛋白质后，通过等电聚焦在第一维度上分离蛋白质以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳在第二维度上分离蛋白质。如本文中具体例示的，等电聚焦步骤在3至10的pH范围内，并且尺寸分离在10％聚丙烯酰胺凝胶上。大多数癌症特异性ENOX2同工型显示在pH 3.9至6.3的非常窄的范围内的等电点，但分子量从34到136kDa不等。在具体例示的2D凝胶系统中，癌症特异性同工型位于象限I(相对高分子量的材料)和IV(更低分子量的材料)，明显地30至50kDa的范围。IgG重链(象限II和IgG轻链(象限III)与scFv抗体以及参考蛋白质交叉反应，所述参考蛋白质在53和79至85kDa下充当装载对照。所有ENOX2同工型的缺乏表明没有癌症或累积癌症尺寸在分析中的检测限以下。ENOX2同工型的存在表明存在癌症。存在于血清样品中的具体分子量或同工型的具体组合提供癌症的起源的细胞类型或组织的指示。该方法不仅确定癌症的存在，而且本发明的方法提供了关于起源的组织的诊断性信息。目前，没有具有这些具体能力的其他泛癌症(所有形式的人类癌症)测试。表观分子量在64-69kDa的范围内、pH在4.2-4.9范围内的ENOX2转录变体与乳腺癌相关。52-53kDa、pH 4.1-4.6的ENOX2转录变体与小细胞肺癌相关。54-56kDa、pH 4.6-5.3的ENOX2转录变体与非小细胞肺癌相关。约72-90kDa和37-47kDa、等电点均为pH 3.7-5.0的两个ENOX2转录变体表征卵巢癌。71-88kDa、pH 5.1-6.5的ENOX2转录变体与前列腺癌相关。约90-100kDa，pH 4.2-5.4的ENOX2转录变体表明宫颈癌。约80-96kDa，pH4.4-5.4；50-65kDa、pH 4.2-5.3；和33-46kDa、pH 3.8-5.2的三个ENOX2转录变体是结肠癌的特征。当患者疑似患有癌症时，使用本发明进行的生物样品，有利地血清样品的2D凝胶电泳/免疫学分析将显示癌症存在和器官部位。
方法1-免疫印迹检测方案的灵敏度和特异性的10至100倍升高。
使用本发明，免疫印迹检测方案的灵敏度和特异性的10至100倍的升高源自在血清ENOX2暴露于抗体结合位点抑制配体后，NADH氧化的抑制有延迟时间的观察。观察到在30分钟孵育期间，抑制在0至22分钟(22分钟是ENOX 2活性周期的长度)之间的不同时间发生(Wang等人,2001.Biochim.Biophys.Acta 1539:i92-204)。因此，其中EEMTE抗体结合位点对于与抗体的组合可用的每个22min活性周期期间的时间是相对短暂的，并且约小于5分钟。此外，ENOX2蛋白质必须是活性的以使抗体在该相对短的机会窗口期间接近结合位点。
表2显示了在抗体添加后，在5个连续的22分钟活性周期期间，在五个活性最大值下的ENOX2的活性。
纳摩尔/min/mg蛋白质
抑制发生在22min活性周期内的最大值4。因此，抗体结合必须仅在最大值4期间发生，由于最大值5是待抑制的第一个最大值。在最大值5处的抗体添加没有作用，在最大值4之前的抗体添加也没有作用。以上结果的推论是抗体将不结合或将仅较差地结合到非活性ENOX2转录变体。因此，启动步骤使免疫印迹上的ENOX2在与抗体孵育期间有活性。
为了在与抗体免疫杂交期间保持活性ENOX2，在使用1％牛奶封闭10分钟并使用TBST漂洗两次以除去多余的牛奶后，在与初级scFv抗体孵育期间以15μM的浓度添加还原型吡啶核苷酸[NAD(P)H]。在10μM范围的终浓度下优选NADH。根据NADH的浓度、温度和抗体效价，在有或没有振摇的情况下在4℃至40℃之间的任何温度下用抗体孵育印迹1至16小时的时间，优选地在振摇下在4℃下孵育过夜(约16小时)。
本发明的癌症诊断系统利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离人类血清中的蛋白质以产生癌症特异性同工型模式和组合物，其指示癌症存在、肿瘤类型、疾病严重性和治疗反应。设计方案用于检测至少26种ENOX2转录变体的癌症特异性模式，每种表示代表20种不同的癌症起源的组织的不同的肿瘤类型，对其进行解析以指示癌症存在和原发性癌症的起源。该说明书说明了转录的过程—解析二维凝胶电泳方案和随后免疫分析以检测反映具体癌症的ENOX2转录变体。
二维凝胶电泳通过在彼此以直角定向的两个方向上的位移分离，并且免疫印迹确定ENOX2同工型。在第一维度上，通过等电聚焦(IEF)根据电荷由等电点(pI)分离变体。随后，根据以千道尔顿(kDa)计的分子量，通过SDS-PAGE在第二维度上分离变体。然后将同工型杂交到硝酸纤维素膜上用于使用包含稳定抗体结合到转录变体的功能连接肽的泛-癌症特异性抗体制剂进一步分析。
同时测定癌症存在和起源的癌症组织两者的时机作为二维凝胶电泳分离的结果出现，其中使用携带S标签的泛ENOX2重组单链可变区域(scFv)抗体的免疫印迹(图7)用于检测(Hostetler等人,2009.Clin.Proteomics 5:46-51)。抗体与来自人类起源的血液肿瘤和实体瘤的所有已知的ENOX2转录变体交叉反应，但其自身在不同种类的癌症中没有区别。使用该抗体的分析，当与二维凝胶电泳分离组合时，显示随后确定为转录变体的ENOX2蛋白质的具体种类，各自具有指示具体癌症形式的特征分子量和等电点(表1)。
方法2–特定分子量和等电点的ENOX转录变体由患有癌症的患者独特地产生。
转录变体流入循环并具有充当确定的、非侵入性和灵敏的血清标志物的潜能，用于在高危人群中早期检测原发性和复发性癌症两者，因为它们是由癌细胞特异性产生的分子特征分子并且不存在于非癌细胞中，因此具有低的假阳性和假阴性两者的发生率。
由于2-D-免疫印迹方案在临床症状之前早期检测癌症，提供了将早期检测与早期干预组合为癌症的治疗性预防策略的时机，借以在疾病的最早期消除疾病是独特地可能的。
图2是描绘ENOX2活性和NADH的浓度的关系的图表。最大活性在约500μM NADH下实现，具有约0.8μM的kM(参见用于测定kM的图3)。
图3是显示ENOX2活性(纳摩尔/min/mg蛋白质)V对mM底物浓度S的双倒数Lineweaver-Burke绘图的图表，产生约0.8mM的kM。纵坐标截距对于具有和不具有抗体的情况是相同或相似的，表明抗体与NADH底物竞争活性位点，为底物和抗体结合位点在ENOX2序列的相同区域提供了证据。
图4是显示ENOX2活性作为时间的函数的示意图的图表，以说明汇集的癌症血清的ENOX2活性周期的五个最大值。如表1中所定量，抑制在22分钟活性周期内在最大值4下发生。因此，抗体结合必须仅发生在最大值4期间，因为最大值5是待抑制的第一个最大值。在最大值5下的抗体添加没有作用，在最大值4之前的抗体添加也没有作用。
图5是描绘在临床症状之前高达10年的石棉工人的恶性间皮瘤的早期检测的图表。显示了在诊断出石棉诱导的恶性间皮瘤之前168至96个月开始的七名男性受试者的连续分析，其诊断的中值年龄为67岁。实心符号–恶性间皮瘤的蛋白质1和蛋白质2特征，明显。空心符号--蛋白质1和蛋白质2均不明显。阴影符号–仅蛋白质1明显。
来自混合癌症患者的群体(膀胱、血细胞(白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、乳腺、宫颈、结肠直肠、食道、胃、肝细胞、肺、黑素瘤、卵巢、胰腺、前列腺、肾细胞(肾)、肉瘤、鳞状细胞、睾丸生殖细胞、甲状腺和子宫(子宫内膜))的ENOX蛋白质分析2-D凝胶电泳和免疫印迹显示象限I和IV中分子量介于34和100kDa的酸性蛋白质的多个种类(图7，右图)，其均不存在于非癌症患者的血清中(图7，左图)。在第一个维度上的分离是通过在3至10的pH范围内的等电聚焦，并且在第二个维度上的分离是通过10％的SDS-PAGE。ENOX2转录变体的等电点在3.2至6.3的范围内。除ENOX2形式以外的主要反应性蛋白质为充当便利的装载对照和等电点参照53kDa等电点pH 4.1的、主要磷酸化的α-胎球蛋白(在图8中标记为“R”)，和充当装载的参照的第二点和作为等电点参照的79-85kDa，等电点pH 6.8的血清转铁蛋白。两种交叉反应性参照蛋白质存在于癌症和非癌症受试者的大多数血清和血浆中。白蛋白和其他血清蛋白质当以低量存在时通常不反应。在一些印迹上，重组scFv与重(约52kDa)和轻(约25kDa)免疫球蛋白链蛋白质具有弱交叉反应性。
图8A至8J显示单独分析的来自癌症患者的血清的2-D凝胶电泳的免疫印迹/免疫印迹。以存在的主要转录变体的分子量下降的顺序显示癌症位点。图8A.宫颈癌。图8B.卵巢癌。图8C.前列腺癌。图8D.乳腺癌。图8E.非小细胞肺癌。图8F.小细胞肺癌。图8G.胰腺癌。图8H.结肠癌。图8I.非霍奇金淋巴瘤。图8J.黑素瘤。标记非反应性(在背景下)白蛋白(Ab)的大致位置用于比较。平行分析了约180份非癌症患者血清，没有指示用于作为阳性对照比较的特异性转录变体的蛋白质的迹象。
图9A和9B显示了患者血清的分析凝胶电泳和免疫印迹。图9A.来自患有非小细胞肺癌的患者的血清包含54kDa，等电点pH 5.1的转录变体(箭头)。图9B.来自患有小细胞肺癌的患者的血清包含52kDa，等电点4.3的转录变体(箭头)。参照斑点向右，MW 52kDa和等电点pH 4.1为α1-抗胰蛋白酶抑制剂。白蛋白和其他血清蛋白质是非反应性的。
图10显示了通过患者血清的免疫杂交，对乳腺癌具有特异性的ENOX2转录变体的2-D凝胶电泳分离和检测。箭头＝66至68kDa的乳腺癌特异性转录变体。R＝52kDa，等电点pH4.1的α-胎球蛋白参照斑点。
通过2-D凝胶电泳和免疫印迹分析来自患有各种形式的癌症的单个患者的血清，以将图7的每种ENOX2同工型分配到特定的起源的组织的癌症中(参见表3)。表观分子量在64-69kDa的范围内、pH在4.2-4.9范围内的ENOX2转录变体与乳腺癌相关。52-53kDa、pH4.1-4.6的ENOX2转录变体与小细胞肺癌相关。54-56kDa、pH 4.6-5.3的ENOX2转录变体与非小细胞肺癌相关。约72-90kDa和37-47kDa、等电点均为pH 3.7-5.0的两个ENOX2转录变体表征卵巢癌。71-88kDa、pH 5.1-6.5的ENOX2转录变体与前列腺癌相关。约90-100kDa、pH 4.2-5.4的ENOX2转录变体表明宫颈癌。约80-96kDa、pH 4.4-5.4；50-65kDa、pH 4.2-5.3；和33-46kDa、pH 3.8-5.2的三个ENOX2转录变体是结肠癌的特征。当患者疑似患有癌症时，使用本发明进行的生物样品，有利地血清样品的2D凝胶电泳/免疫学分析将显示癌症存在和器官部位两者。
ENOX2的蛋白质序列显示与两种与泛ENOX2scFv重组抗体具有反应性的参照蛋白质α-胎球蛋白和血清转铁蛋白的相似性。相似性的区域限于在ENOX2中邻近E394EMTE398醌抑制剂结合位点的7个氨基酸的序列(下划线)，其充当特异性scFv抗体结合的抗原序列。
A.样品制备
B.等电聚焦(第一维度)
运行参数：
C.制备SDS-Page凝胶(用于第二维度)
D.平衡(第一维度)
E.SDS-PAGE(第二维度)
F.蛋白质转移(用于免疫印迹)
G.使用具有连接到碱性磷酸酶的S-标签或碱性磷酸酶连接的抗S-标签的对免疫印迹进行免疫分析以便于放大信号
H.免疫印迹的显影和扫描
用于第一维度的溶液
I.再水化缓冲液pH 7(25mL)：
将尿素溶于最少的ddi-H2O中(不要加热到30℃以上)
将硫脲溶于尿素/ddi-H2O溶液，并随后添加其余的化学品。
使用ddi-H2O补足到25mL并等分到1mL管中并在-80℃下储存
使用前添加1％DTT-10mg(0.01g)
用于第二维度的溶液
Tris缓冲液(1.5M,pH 8.8)(1L):
将Trizma溶于750mL ddi-H2O中并使用HCl调节pH至8.8.
使用ddi-H2O补足到1L的终体积并在4℃下储存。
平衡缓冲液(400mL):
使用ddi-H2O补足到4L的终体积。
添加溴酚蓝(使用移液管尖端添加以提供痕量蓝色)
等分到15mL管中并在-20℃下储存
丙烯酰胺凝胶(20cm x 20cm；1-mm厚)
用于Protean II凝胶的配方。
10％碱性磷酸酶底物(APS)
使用ddi-H2O补足到20mL的终体积
琼脂糖溶液(1％):
合并琼脂糖和SDS-电泳缓冲液。
微波以加热并溶解。
添加溴酚蓝(使用移液管尖端添加以提供痕量蓝色)
10X SDS电泳缓冲液(4L):
使用ddi-H2O补足到4L的终体积
用于免疫印迹的溶液
Western转移缓冲液(4L):
使用ddi-H2O补足到4L的终体积
封闭缓冲液(5％BSA)
使用TBST补足到100mL的终体积
具有吐温-20的10X Tris缓冲盐水(TBST)(4L)
将Trizma和NaCl添加到3.5L ddi-H2O中。
通过HCl调节pH到7.5。
使用ddi-H2O补足到4L。
方法3-2-D凝胶电泳免疫印迹早期检测方案
通过静脉穿刺(具有止血带)收集在具有或不具有安全头的标准B&D13x 100(7ml)真空抽血凝血管(或等价方式)中的5ml血液制备血清。在室温下约30分钟以允许凝血后，凝块通过在2,500至3,000rpm下离心5至10分钟成团。将无凝块血清倾倒至洁净管中，标记并新鲜分析或冷冻储存。
对于免疫印迹分析，将30μL血清添加到120μL的再水化缓冲液(7M尿素，2M硫脲，2％(w/v)CHAPS[(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺基]-1-丙烷-丙磺酸盐)，一种非变性两性离子去污剂]，0.5％(w/v)ASB-14(脒基磺基甜菜碱-14，一种两性离子去污剂)，0.5％(v/v)两性电解质pH 3-10(Bio-Rad)，0.5％(v/v)固定pH梯度(IPG)缓冲液pH 3-10(Amersham-Pharmacia Biotech)和65mM二硫苏糖醇)。快速涡旋样品以混合血清与再水化缓冲液。装载四至六毫克蛋白质用于分析。通过使用具有IPG干胶条(Amersham)的市售平板电泳系统(Ettan IPGphor 3,Amersham-Pharmacia Biotech)在第一维度上对样品进行电泳。在7cmIPG胶条上使用3至10的线性pH范围。IPG胶条使用样品在室温下再水化过夜。然后胶条聚焦在50mA每条胶条下，和在250V持续250Vhr，500V持续500Vhr，1,000V持续1,000Vhr和4,000V持续3小时的升高的电压下。然后将样品聚焦在恒定的4,000V下持续28,000伏特-小时。在等电聚焦后，将IPG胶条在2.5％(w/v)SDS，6M尿素，30％(v/v)甘油，100mM Tris-HCl(pH8.8)中再平衡20分钟。将胶条放置在线性SDS-PAGE凝胶(10％(w/v)聚丙烯酰胺)上并在恒定250V下进行电泳75分钟。然后通过使用Bio-Rad转印电泳转移室的电印迹将样品转移到硝酸纤维素膜。使用乳蛋白(1％低脂奶粉)在室温下封闭膜10分钟。使用碱性磷酸酶连接的抗体(scFv)的重组抗-ENOX2单链可变区域在4℃下检测过夜。洗涤后，使用西方四氮唑蓝(NBT)底物在室温下进行检测(Promega,Madison,Wis.；目录号53841).扫描图像并使用Adobe Photoshop处理。利用针对该目的开发的算法定量。反应性蛋白质呈现红蓝色。出于解释性目的，印迹被分为象限I-IV，其中非反应性血清处于中心图7()。
实施例
实施例1.如通过2-D凝胶电泳/免疫印迹分析测定的在分析中的不同量的ENOX2的斑点尺寸和密度的两倍升高，比较了与没有NADH相比在15μM NADH存在下的孵育(图1)。
实施例2.来自1,626名已确诊癌症的癌症患者的血清的分析(表1，从发明概述复制)，显示区分26种不同的癌症和20种不同的起源的组织的转录变体(蛋白质1至蛋白质3)的数量、分子量和等电点的非重叠模式。
表1，从发明概述中复制：针对诊断患有代表20个不同的起源的组织的24种不同的癌症的患者的血清测定的分子量(MW)和等电点(Pi)范围
*血细胞癌症包括表示为总数的淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
**非小细胞肺癌在两个子集中以避免与小细胞肺癌的分子量重叠。
***子宫癌在基于分子量的两个子集中以避免与膀胱癌的重叠(参见脚注1和2)。
1.蛋白质1的等电点pH≥蛋白质2。
2.蛋白质1的等电点pH<蛋白质2。
实施例3.ONCOblot测试正确地根据患有0期和I期癌症的起源的组织确定癌症(表3)。0期和I期癌症通常称为原位癌，该疾病未扩散到起源的组织以外。因此，ONCOblot癌症测试比仅检测血液中的癌细胞的循环肿瘤细胞测试更早地指示癌症。
表3.分析的0期和I期癌症的起源组织
实施例4.通过使用存档的血清样品纵向随访64岁男性16年。起始PSA为0.8ng/mL。未记录临床症状，直到第16年通过活检证实前列腺癌。在临床症状之前8年，在第8年首次检测到ENOX2，PSA为4ng/ml。
实施例5.恶性间皮瘤是侵袭性的，几乎一致地为主要由暴露于石棉引起的致命的癌症。在症状明显的间皮瘤发展之前，通过2-D凝胶-免疫印迹分析来分析从暴露于石棉的个体收集的连续血清样品的ENOX2存在，以确定在临床症状之前多久可以检测到间皮瘤特异性转录变体。在恶性间皮瘤的临床诊断前4到10年(平均6.2年)，在暴露于石棉的个体的血清中检测到两种间皮瘤特异性转录变体。在伴随或不伴随石棉肺的诊断为良性胸膜斑的15名受试者中的14名中不存在指示恶性间皮瘤的任一种或两种ENOX2蛋白质转录变体。
实施例6.患有未知原发灶的癌症(CUP)的患者血清的分析。来自患有其中原发性肿瘤未知的癌症的患者的2-D凝胶显示80和42.5kDa的存在，均具有等电点pH 4.2和4.1的转录变体，指示原发性癌症为卵巢癌，其随后通过活检证实。
实施例7.在1,587例ONCOblot分析中成功验证和定量ENOX2存在，比较20种不同的起源的组织(表1)
实施例8.在健康的年轻人群体中在临床症状之前早期检测癌症。通过本文描述的技术分析来自100名年龄介于20至39岁之间的受试者(50名男性和50名女性)的血清的ENOX2存在。在20-29岁的年龄组中，25名女性均未显示指示癌症存在的ENOX2蛋白质，以及25名男性中仅有一名(结肠直肠)显示指示癌症存在的ENOX2蛋白质。类似地，在30-39岁的年龄组中，25名女性中的一名(血细胞)以及25名男性中的一名(前列腺)显示ENOX2蛋白质。因此，所有100份血清样品中ENOX2存在的总发生率为3％。在20至29岁的男性和女性群体中的新诊断的癌症的总发生率为约2％(Howlander等人SEER Cancer Statistics Review,1975-2012,National Cancer Institute,Bethesda,Md)。
方法4-具有连接肽中表示的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序的功能化的重组抗体的产生
为了进一步提高在免疫印迹上的重组抗体与ENOX2的结合的亲和力和特异性，设计连接肽以特异性模拟蛋白质的ENOX2家族的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序。
针对ENOX2NADH氧化酶肿瘤细胞特异性产生的单克隆抗体在sp-2骨髓瘤细胞中产生；然而，单克隆抗体在72小时后减缓用于与脾细胞融合的sp-2骨髓瘤细胞的生长。该现象使得难以定量产生抗体。为了克服该问题，克隆了抗体cDNA的重链和轻链(Fv区域)的抗原-结合可变区域的编码序列并连接到S-标签编码序列上游的一个嵌合基因内。抗体的Fv部分由重链可变(VH)和轻链可变(VL)结构域组成，可以保持原始抗体的结合特异性和亲和力(Glockshuber等人1990.Biochemistry 29:1262-1367)。
对于重组抗体，编码免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VI)的可变区的cDNA使用简并引物克隆。轻链和重链的哺乳动物免疫球蛋白包含邻近高变互补决定区(CDR)的保守区域。简并寡引物集允许PCR使用扩增这些区域(Jones等人1991.Bio/Technology 9:88-89；Daugherty等人1991.Nucleic Acids Research 19:2471-2476)。重组DNA技术已经通过借助多肽连接肽共价连接两个片段来促进可变片段的稳定(Huston等人1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。VL或VH中任一者可以提供单链可变片段(scFv)的NH2-末端结构域。连接肽应被设计成抵抗蛋白水解，并使蛋白质聚集最小化。连接肽长度和序列有助于并控制柔性和与scFv和抗原的相互作用。优选的连接肽独特地作为ScFv融合蛋白的重链和轻链部分之间的功能连接肽被包括，所述ScFv融合蛋白主要由具有还包含间隔为CXXXXC或CXXXXXC的两个半胱氨酸残基(C)的小侧链(Gly/Ser)的氨基酸组成；其与ENOX2的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序形成链间二硫键。
通过从Chomczynski等人(1987)Anal.Biochem.162:156-159和Gough(1988)Anal.Biochem 176:93-95改良的以下程序，从产生ENOX2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞分离总RNA。从培养基中收获细胞并通过在450x g下离心10分钟成团。将团温和地重悬在10体积的冰冷的PBS中并再次离心。丢弃上清液并将细胞与等体积的PBS重悬。在使用前添加变性溶液(0.36ml的2-巯基乙醇/50ml的胍盐储备溶液-4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸)10ml每1g细胞团并温和混合。醋酸钠(pH 4.0,1ml，2M)，10ml酚饱和水和2ml氯仿:异戊醇(24:1)混合物在每次添加后序贯添加。通过倒置彻底混合溶液。剧烈振摇溶液10秒，在冰上冷却15分钟然后在12,000x g下离心30分钟。转移上清液并添加等体积的2-丙醇，并放置在-20℃下过夜以沉淀RNA。在12,000x g下使RNA成团15分钟并使用2-3ml变性溶液和2体积乙醇重悬团。将溶液放置在-20℃下2小时，随后在12,000x g下离心15分钟。使用70％乙醇并随后使用100％乙醇洗涤RNA团。在12,000x g下离心5分钟后，将团重悬于无RNA酶的水(DEPC处理的水)中。用分光光度法测量分离的RNA的量并由280nm和260nm下的吸光度计算。
聚(A)mRNA分离试剂盒购自Stratagene。在65℃下加热总RNA5分钟后，将总RNA施加到寡(dT)纤维素柱。在施加前，将RNA样品与500μL的10x样品缓冲液((10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,5M NaCl)混合。RNA样品以1滴每2秒的速率推进通过柱。汇集洗脱液并再施加到柱和再次纯化。施加预热的洗脱缓冲液(65℃)，并且洗脱mRNA并收集在冰上的1.5ml离心管中。在OD260下测定mRNA的量(1OD单位＝40μg的RNA)。从4X 10e 8个细胞获得的总RNA和mRNA的量分别为1328μg和28μg。
接下来，溶于DEPC处理的水中的mRNA(1-2μg)用于cDNA合成。在三个不同的日期分离的mRNA被汇集用于第一链cDNA合成。cDNA合成试剂盒购自Pharmacia Biotech。在65℃下加热mRNA(1.5μg/5μL的DEPC处理的水)10分钟，并立即在冰上冷却。包含鼠科白血病病毒(MuLV)逆转录酶(11μL)和用于反应的适宜的缓冲液的最初的第一链混合物与mRNA样品混合。DTT溶液(1μL，0.1M)和不含RNA酶的水(16μL)也添加到溶液中。在37℃下孵育混合物1小时。
轻链和重链的简并引物(Novagen,Madison,Wis.)用于PCR。使用Robocycler(Stratagene,La Jolla,Calif.)，以100μL反应体积在0.5ml微离心管中进行PCR合成。所有PCR合成包括2μL有义和反义引物(20皮摩尔/μL)，1μL的第一链cDNA作为模板，2μL的10mMdNTPs，1μl的Vent聚合酶(2单位/μL)，10μL的10X PCR缓冲液(100mM Tris-HCl,在25℃下pH8.8,500mM KCl,15mM MgCl2,1％Triton X-100)，82μL的H2O。Triton X-100为叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。所有PCR方案包括在94℃下变性1min，在55℃下退火1分钟，和在72℃下延伸1分钟。该序列重复30次，在最后一个循环中在72℃下有6分钟延伸。使用来自Qiagen,Valencia,California的QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳分析重链和轻链编码序列的PCR扩增产物，并且分别为约340个碱基对(bp)长和325bp长。
通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶)分析总RNA或DNA。琼脂糖(0.5g于50ml的Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中,40mM Tris-醋酸盐,1mM EDTA)在微波中加热2分钟以融化和均匀地分散琼脂糖。在室温下冷却溶液，添加溴化乙锭(0.5μg/ml)并倒入该装置。每种样品与6x凝胶装载缓冲液(0.25％溴酚蓝,0.25％二甲苯蓝FF,40％(w/v)蔗糖水溶液)混合。TAE缓冲液用作电泳缓冲液。施加电压(10v/cm)60-90分钟。
根据重链和轻链cDNA的适合的尺寸，在UV照射下从凝胶切出条带，并将切下的凝胶放置在配备有18号针头的1ml注射器中。将凝胶粉碎到1.5ml Eppendorf管中。使用200μL缓冲液饱和的苯酚(pH 7.9±0.2)洗涤每个注射器筒。充分离心混合物并在-70℃下冷冻10分钟。离心混合物5分钟，并且将上面的水相转移到新的管中。使用苯酚/氯仿(1:1)再次萃取水相。离心5分钟后，将上面的水相转移到洁净的管中，并进行氯仿萃取。将醋酸钠(10体积，3M)和2.5体积的冰冷的乙醇添加到上面的水相中以在-20℃下沉淀DNA过夜。
将纯化的重链和轻链cDNA连接到质粒pSTBlue-1载体并转染到NovaBlue感受态细胞(Stratagene)中。包含重链和轻链DNA的菌落通过蓝色和白色菌落选择进行筛选，并通过PCR分析证实。使用标准技术分离重链和轻链DNA并测序。
PCR扩增和单个scFv基因的组装根据Davis等人(1991)Bio/Technology 9:165-169。携带VH和VL基因的质粒pSTBlue-1与单一PCR合成中的所有四种寡核苷酸引物组合。在第一PCR合成后，第一PCR产物的十分之一被移出并添加到仅包含引物a(VH有义引物)和引物d(VL反义引物)的第二PCR反应混合物。第二PCR合成的产物产生单一scFv基因。单一scFv基因连接到质粒pT-Adv(Clontech,Palo Alto,Calif.)。携带scFv基因的pT-Adv用于DNA测序。
由VH、VL和连接肽序列组装完整的功能化的scFv基因以产生具有高度的效率和灵敏度的scFv cDNA。
通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶)分析总RNA或DNA。琼脂糖(0.5g于50ml TAE缓冲液中,40mM Tris-醋酸盐,1mM EDTA)在微波中加热2分钟以融化和均匀地分散琼脂糖。在室温下冷却溶液，添加溴化乙锭(0.5μg/ml)并倒入该装置。每种样品与6x凝胶装载缓冲液(0.25％溴酚蓝,0.25％二甲苯蓝FF,40％(w/v)蔗糖水溶液)混合。TAE缓冲液用作电泳缓冲液。施加电压(10v/cm)60-90分钟。
根据重链和轻链cDNA的适合的尺寸，在UV照射下从凝胶切出条带，并将切下的凝胶放置在配备有18号针头的1ml注射器中。将凝胶粉碎到1.5ml Eppendorf管中。使用200μL缓冲液饱和的苯酚(pH 7.9±0.2)洗涤每个注射器筒。充分离心混合物并在-70℃下冷冻10分钟。离心混合物5分钟，并且将上面的水相转移到新的管中。使用苯酚/氯仿(1:1)再次萃取水相。离心5分钟后，将上面的水相转移到洁净的管中，并进行氯仿萃取。将醋酸钠(10体积，3M)和2.5体积的冰冷的乙醇添加到上面的水相中以在-20℃下沉淀DNA过夜。
将纯化的重链和轻链cDNA连接到质粒pSTBlue-1载体并转染到NovaBlue感受态细胞(Stratagene)中。包含重链和轻链DNA的菌落通过蓝色和白色菌落选择进行筛选，并通过PCR分析证实。使用标准技术分离重链和轻链DNA并测序。
PCR扩增和单个scFv基因的组装根据Davis等人(1991)Bio/Technology 9:165-169。携带VH和VL基因的质粒pSTBlue-1与单一PCR合成中的所有四种寡核苷酸引物组合。在第一PCR合成后，第一PCR产物的十分之一被移出并添加到仅包含引物a(VH有义引物)和引物d(VL反义引物)的第二PCR反应混合物。第二PCR合成的产物产生单一scFv基因。单一scFv基因连接到质粒pT-Adv(Clontech,Palo Alto,Calif.)。携带scFv基因的pT-Adv用于DNA测序。
如下所示，通过PCR由VH、VL和连接肽序列组装完整的功能化的scFv基因，以产生scFv cDNA：
具有Gly.Ser.Cys连接肽[scFv(SC)]的scFv(S)(GST)的DNA和氨基酸序列
连接肽序列
DNA:5‘GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT 3‘SEQ ID NO:4.
氨基酸:GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer SEQ ID NO:5.
scFv(GST)的DNA和氨基酸序列
GST-标签
scFv重链(VH)
连接肽序列
DNA:5‘GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT 3‘SEQ ID NO:4.
氨基酸:GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer SEQ ID NO:5.
scFv轻链(VL)
具有GST标签的scFv(SC)的DNA序列
具有Gly.Ser.Cys连接肽DNA序列SEQ ID NO:10和氨基酸序列SEQ ID NO:11的scFv(S)(GST)的翻译
翻译的蛋白质序列：
连接肽
蛋白质序列的分析：
氨基酸长度：477
分子量(kD)：53.52
等电点(IP)：5.87
摩尔吸光系数(L/mol/cm)；所有半胱氨酸残基作为二硫键：1.02E+05
摩尔吸光系数(L/mol/cm)；50％的半胱氨酸残基作为二硫键：1.02E+05
摩尔吸光系数(L/mol/cm)；无二硫键：1.01E+05
1.引物设计
具有Gly.Ser.Cys的连接肽
氨基酸序列：GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer SEQ ID NO：5
DNA序列：5’-GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT-3’SEQ IDNO：4
引物设计
1.用于PCR扩增的scFv(S)重链的正向引物
scFv(S)重链N-端(引物15)SEQ ID NO：12
5'GGA TCC CCA GGA ATT CCC GAG GTC AAG CTG CAG GAG TCA GGA3'
EcoRI
2.用于PCR扩增的scFv(S)重链的反向引物
scFv(S)重链C-端加上连接肽1
氨基酸序列:GTTVTVSS SEQ ID NO:13GGGGSCGGGSCGGGS SEQ ID NO:14
用于PCR扩增的scFv(S)重链的反向引物(引物18):
5’ACC GCC ACA CGA TCC ACC GCC GCA GCT ACC ACC CCC GCC TGA GGA GAC GGTGAC CGT GGT CCC 3’SEQ ID NO:17
3.用于scFv(S)轻链PCR扩增的正向引物
连接肽加上scFv(S)轻链N-端SEQ ID NO:18
用于PCR扩增的scFv(S)轻链的正向引物(引物19):
5‘GGT GGT AGC TGC GGC GGT GGA TCG TGT GGC GGT GGC AGT GAA AAT GTG CTCACC CAG TCT CCA3‘SEQ ID NO:21
4.用于PCR扩增的scFv(S)轻链的反向引物(引物17)
有义DNA序列:
5‘GAACGCCAGCACATGGACAGCTGACTCGAGCGGCCGGTG 3’SEQ ID NO:22
反义DNA序列:
5‘CACCGGCCGCTCGAGTCAGCTGTCCATGTGCTGGCGTTC 3’
XhoI SEQ ID NO:23
引物订购自Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)。scFv(SC)的重链(VH)和轻链(VL)的PCR扩增。scFv(SC)的重链和轻链通过聚合酶链反应(PCR)扩增。
PCR的条件为：
PCR循环
通过琼脂糖凝胶电泳(0.9％)分析scFv(SC)的重链和轻链DNA。DNA带被切下、冷冻、解冻和离心。通过PCR延伸重链和轻链DNA扩增scFv(SC)DNA。
PCR的条件为:
通过琼脂糖凝胶电泳(0.9％)分析扩增的scFv(SC)DNA。DNA带被切下，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化并溶于30μl TE缓冲液中。
scFv(SC)与pGEX-4T2[pGEX4T-scFv(SC)]的连接。将scFv(SC)连接到pGEXT-4T2。连接反应如下：
使用EcoRI消化
连接为在15℃下16小时50分钟。连接后，大肠杆菌BL21(DE3)细胞用pGEX4T-scFv(SC)转化并接种在LB/氨苄青霉素板上。细胞在37℃下生长20小时。筛选携带质粒pGEX4T-scFv(SC)的菌落。通过PCR筛选了七个携带质粒pGEX4T-scFv(SC)的菌落。
从菌落1拣选细胞，在100ml的LB/氨苄青霉素培养基中生长，并且使用质粒纯化试剂盒(质粒Midi试剂盒,Qiagen)纯化质粒。scFv(SC)DNA测序由Pudue University进行。测序的DNA通过比对算法(NCBI)分析并且未显示突变。
测序的具有引物15和17的scFv(SC)DNA
＞L_132420_引物15_025.ab1 1464 21 860 ABI
AAAAAACAATGCAAAGTGGTAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACAAGTTATGATATAGACTGGGTGAGGCAGACGCCTGAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGAGGGGAGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGAGTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTATATGGAGCTCACTAGGCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCTAGAGGGGACTACTACAGGCGCTACTTTGACTTGTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGGGTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGCGGTGGCAGTGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAGGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATACGTTACATATATTGGTACCAACAGAAGCCTGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACGTGGCTCCTGGAGTCCCTTTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAACCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGGAGTGGAGTGGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGCGAAAGAAACTGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCTGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCCGGGCCCCGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGAATCGCCTATTTTTATAGGGTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAAACGTCAAGGGGGCACTTTTTCGGGAAATGTGCGCCGAAACCCCTAATTTGTTTTATTTTTCAAAATCCATTTCAATTAAGTTTCCCCCTCATGGAAACAATAACCCCTGGAAAAAAGGCTTTCATTAAATATTGAAAAAAAGGAAAAAAGTTAAAAATTATTTCAAAATTTTCCCTGTGTTCCCCCCTTTATTTTCCCCTTTTTTTTGCGGGCCATTTTTTGCCCTTTTCCCTGGTTTTTTTTGCCCCCCCCCCCCAAAAAAACCCCCCTGGGGTGAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAATGTCTTTAAAAAAAAATTTCCAATTTTTGTGGGGGGGGGGCCCCCCCAAAAGAGTTGGGGGGGTTTTTTAAACCACTTCTCCCAAAACAACATTGGGTGGAGATATTTCTTCTTCACAAAA SEQIDNO：24
＞L_132420_引物17_026.ab1 1492 22 854 ABI
GGTGGGTAAATTTAGCAGCAGCAGTTTCTTTCGCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTCCGGATAACCACTCCACTCCTGGCAGTAATAAGTGGCAGCATCCTCAGCCTCCATTCGGTTGATTGTGAGAGAATAAGAGGTCCCAGACCCACTGCCACTGAAGCGAAAAGGGACTCCAGGAGCCACGTTGGATGTGTCATAAATCAGGAGTCTGGGGGAGGATCCAGGCTTCTGTTGGTACCAATATATGTAACGTATACTTGAGCTGGCACTGCAGGTCATGGTGACCCTCTCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGGAGACTGGGTGAGCACATTTTCACTGCCACCGCCACACGATCCACCGCCGCAGCTACCACCCCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCACAAGTCAAAGTAGCGCCTGTAGTAGTCCCCTCTAGCACAGAAATAGACAGCAGAGTCCTCAGATGTCAGCCTAGTGAGCTCCATATAGGCTGTGCTGGAGGACTTGTCTACACTCAGTGTGGCCCTGCCCTTGAACTTCTCATTGTATTCAGTACTCCCCTCTCCAGGAAAAATCCATCCAATCCACTCAAGTCCCTGTTCAGGCGTCTGCCTCACCCAGTCTATATCATAACTTGTGAAGATGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGACAACTTCACTGAAGCCCCAGGCTTTACCACTTCAGTTCCTGACTCCTGCAGCTTGACCTCGGGAATTCCAGAAAGGGCCTGCTTGAACTTCTCCTTTGCTTCTTCCATATCTTTCTCATGGGCGGATCCACGCGGAACCAGATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCCACCACCAAACGTGGCTTGCCAGCCCTGGCAAGGCCATGCTATATACTTGCTGGATTTCAAGTACTTATCAATTTGTGGGAATAGCTTCCTTACGTTTTTTTAAAACAAACTAATTTTGGGAACGCATCCAGGCCCATTTGGTCCATGTATTAAAACACCATCAAAAACCTCCTACAACATGAAATTCCGGAAGGGGTTTACATAATCCCCCATTTTAAATATTGTTTTTATGACATAAAACCAATCTTTCCAAACTTTTTTTCACATTTTCCAGGTAACCTTGGTAAAAAAAAAACCACTTTTGAAAAGTTTTTCAAAATTCTTTTTATTAAAATGCAAATTTTCCCGAAAAAAACCCCTTATTTCTAAAAATTCCCAAAAACCCGCTCCCCTTTCCAAGCCCTTTGAAAAATTTCTTTGCCCCCCCCCTCTTTTTTGGGGAACAAAACCCCCCCCCACAAACTTGGGTTGGGGGTGGTTTTTGTGTCCACGCCCAAATATAAAAAAACAGTATAAATTAAGATGGGGCCCCCACATATAAAAAACTGGGGGGGGTTTTTTTATATAATTTTTTAAAACACAACATCCCCCCCCCCCCCCCACATCCCACACAAAATAAAATATATAATAAAA SEQ ID NO：25
scFv(SC)与测序DNA的比对
scFv(SC)的表达
将携带质粒pGEX4T-scFv(SC)的BL21(DE3)细胞接种在10ml的LB/羧苄青霉素(100μg/ml)中。细胞生长6hr并在6,000rpm(3,700x g)下离心6分钟。丢弃上清液并将团重悬于新鲜的2ml的LB/氨苄青霉素(100μg/ml)中并转移到两个250ml-锥形瓶中的100ml LB/氨苄青霉素培养基中。细胞在37℃下在250rpm下生长3小时。将温度降低至25℃并添加IPTG(0.15mM终浓度)。细胞另外生长15小时，收获并重悬在20ml的20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液中。蛋白质由法式细胞破碎机(3通道，在20,000psi下)提取。通过SDS-PAGE接着丽春红S染色和免疫印迹分析scFv(SC)的表达。
scFv(SC)表达为可溶性蛋白质和不溶性包涵体两者。
scFvSC的1D免疫印迹分析。scFv(SC)对重组ENOX2的反应性通过一维免疫印迹分析。重组ENOX2通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜。使用scFv(SC)孵育硝酸纤维素膜17小时和使用碱性磷酸酶连接的S-蛋白质孵育2小时。检测使用西方蓝(Promega)。scFv(SC)与重组ENOX2反应。为了比较，scFv(S)包括在免疫印迹分析中。
图12显示了混合研究的免疫印迹，以证明具有-CXXC-XX-C连接肽的ScFV(图12A)与常规XXXXXXX连接肽(图12B)相比的功效。在针对两者(以保留S-S键)的非还原条件下，具有功能性半胱氨酸连接肽的ScFV重组抗体当与重组ENOX2孵育时显示降低水平的53kDaScFV(a)和来自下游起始位点的46kDa的截短ScFV(b)，主要是通过全长ScFV和72kDa全长ENOX2之间的以针对约176kDa的组合分子量的一个ENOX2分子加上两个ScFV分子(ENOX2的两个蛋白质二硫键异构酶结合位点中的每个连接一个)的比例的二硫键形成。在图12B中，使用缺乏半胱氨酸的常规连接肽，未观察到在相同反应条件下的交联的迹象。
scFvSC的2D免疫印迹分析。scFv(SC)对重组ENOX2和前列腺癌患者的血清的转录变体的反应性通过二维免疫印迹分析。使用6μg重组体加标的正常血清和来自前列腺癌患者的血清首先通过等电聚焦分离，然后通过SDS-PAGE分离，随后转移到硝酸纤维素膜。使用scFv(SC)孵育硝酸纤维素膜17小时，并使用碱性磷酸酶连接的S-蛋白质孵育2小时。使用西方蓝(Promega)检测。
方法5-浓缩的抗体溶液的物理稳定性的提高
本发明的一个重要的实施方案是提高浓缩的溶液的物理稳定性，同时保持化学稳定性和生物效力。本发明提供了scFv抗体，其与SEQ ID NO:11至少99％相同，并且具有7xl0-7M的ENOX2蛋白质kDa和至少95％的纯度。
然而，确定scFv的功效的一个重要因素是其聚集倾向。在-70℃或4℃下仅储存十天后，纯化的scFv与重组ENOX2蛋白质的结合降低超过90％。在大量研究后，功效的损失仅追溯到蛋白质聚集。在免疫杂交期间，聚集的抗体不特异性与ENOX2蛋白质结合。由光散射测量测定的功能化的scFv抗体的聚集通过储存在50％甘油中和储存在-70℃下实现，其为整个方案中必需的成分以实现期望的灵敏度和特异性水平。在没有甘油的情况下储存时，活性快速丧失。
表4.ENOX2转录变体和参考蛋白质的检测，比较了在50％甘油存在或不存在的情况下储存的功能化的scFv重组抗体。
在50％甘油的存在下储存时(右)，所有三种参考蛋白质比不存在甘油(左)约强两倍。转录变体(斑点)当储存在50％甘油中(右)比其不存在时(左)更清晰。
图13是由光散射(Agilent 7080粒径分光光度计)测定的基于尺寸(nm)的抗体的颗粒分布随浓度(％)的变化，主要显示了当在-70℃下在50％甘油中储存时，非聚集抗体的主要贡献。
这三个要素——在抗体结合期间添加NADH、修饰scFv连接肽以模拟ENOX2蛋白质二硫键-巯基互换功能基序和使用50％甘油防止scFv聚集组合提供前所未有的ONCOblot测试的灵敏度，以允许在临床症状之前超过10年检测癌症。
方法6-在NADH存在下的灵敏度的测定和功能化的抗体的检测限。
确认的假阳性和确认的假阴性的发生率较低，各低于1％(D.J.Morre和D.S.Gilmartin.2015ONCOblot Reports 1(1):1-2)。对于几种癌症，两种或多种ENOX2转录变体必须存在于起源癌症测试的ONCOblot组织中以允许起源的组织的正确确定。这些包括膀胱、结肠直肠、胃、间皮瘤、卵巢、肾细胞和子宫癌。如果缺乏一种或多种ENOX2转录变体或在检测限以下，癌症的起源的组织可能被错误确定。在目前的方案下分析的最近的ONCOblot中，错误确定率为2.8％。因此，具有临床诊断的癌症的测试的总体准确度为至少95％。
当通过二维(2-D)凝胶电泳分离蛋白质并通过免疫印迹检测时，可视化的蛋白质呈现小球形或椭圆形免疫反应性区域，称为“斑点”。由ENOX2蛋白质产生的斑点的平均直径与存在的ENOX2蛋白质的量成比例。为了测定通过ONCOblot的ENOX2检测限，生成斑点直径的标准曲线。为此，人类ENOX2的功能46kDa形式首先在大肠杆菌中产生并纯化到接近均质。不同量的该重组ENOX2蛋白质随后通过ONCOblot分析。产生的斑点直径的对数针对分析的ENOX2蛋白质的量的对数绘图(图11)，并且在这些值中发现强的线性相关(r2＝0.95)。由ONCOblot分析的ENOX2蛋白质的检测的实际下限为约0.25mm的斑点，其与图11相比与120飞摩尔(1.2X 1011个分子)的ENOX2/分析的检测相关。该值大致等于100飞摩尔的ENOX2/分析的下限。
图11示出了斑点直径和装载在2-D凝胶上的ENOX2蛋白质的量之间的双对数关系。通过免疫印迹分析了不同量的重组ENOX2。然后将检测的ENOX2斑点的直径的对数绘制为装载的ENOX2的量对数的函数。
图12显示了混合实验的免疫印迹，以证实与常规的XXXXXXX连接肽(图12B)相比，具有-CXXC-XX-C连接肽(图12A)的ScFV的功效。在针对两者(以保留S-S键)的非还原条件下，具有功能性半胱氨酸连接肽的ScFV重组抗体当与重组ENOX2孵育时显示降低水平的53kDa ScFV(a)和来自下游起始位点的46kDa的截短ScFV(b)，主要是通过全长ScFV和72kDa全长ENOX2之间的以针对约176kDa的组合分子量的一个ENOX2分子加上两个ScFV分子(ENOX2的两个蛋白质二硫键异构酶结合位点中的每个连接一个)的比例的二硫键形成。在图12B中，使用缺乏半胱氨酸的常规连接肽，未观察到在相同反应条件下的交联的迹象。
图13是由光散射(Agilent 7080粒径分光光度计)测定的基于尺寸(nm)的抗体的颗粒分布随浓度(％)的变化，主要显示了当在-70℃下在50％甘油中储存时，非聚集抗体的主要贡献。
通过ONCOblot检测25名0期和I期癌症患者的血清内的ENOX2蛋白质(Morre,D.J和Taggart,D.J.2015.ONCOblot Reports 1(4):1-2)。通过与图11的标准曲线相比，这些血清样品内的ENOX2的平均浓度为约990飞摩尔(6X1011个分子)每150μL分析。按照定义，0期和I期癌症的直径通常小于20mm(Cancer Facts and Figures.2014.Amer Can Soc 2-3)。然而，由于0期或I期癌症的平均尺寸更可能是直径为5至10mm，ENOX2的检测下限将预测为由0.8mm至1.6mm直径的肿瘤(平均1.2mm)产生。之前版本的ONCOblot测试(Hostetler等人，2009.Clinical Proteomics 5:46-51)和具有NADH和功能化的scFv抗体的当前版本的测试之间的重组ENOX2的检测下限提供在图14中。使用NADH和功能化的scFv抗体，方案中的重组ENOX2的检测下限为约5μg。对于使用NADH和修饰的连接肽的功能化的测试，检测限约低10倍(右侧曲线)。
如果肿瘤细胞作为球体被处理，则实体瘤中的细胞数可以使用方程1计算，其中V肿瘤是肿瘤的体积，V细胞是癌细胞的平均体积，D是肿瘤直径，并且d是癌细胞的平均直径，该平均直径估计为10um，则1.2mm直径的癌症计算出包含约两百万个细胞。
方法7-使用NADH和修饰的连接肽的功能化测试能在临床症状前多早检测癌症。
本文总结的证据已经确定在本结构中的测试能力是在临床症状之前10至20年检测癌症，与提供的升高10倍的灵敏度一致。
为了估计其能够在临床症状之前多久通过测试的当前功能化版本检测癌症存在，设计研究以通过与NCI Seer癌症统计数据综述(Howlander,N.等人SEER CancerStatistics Review,1875-2912,National Cancer Institute,Bethesda,MD)比较确定当前测试结果与诊断患有癌症的整体风险相关的密切程度，比较了由等数量的男性和女性参与者组成的六个年龄组。将实际的诊断与随年龄增加被诊断患有癌症的预测风险的Seer癌症统计数据综述预测的那些比较。
通过当前的具有NADH和功能化的连接肽的2-D凝胶-免疫印迹测试，分析共300名没有癌症临床迹象的健康志愿者的癌症存在，六个年龄组中每个有25名男性和25名女性。通过静脉穿刺收集血清并使用IRB批准的方案和知情同意书分析。总结在表5中的结果显示了相对高的早期癌症检测的发生率，其中正常的健康群体与在临床症状之前10到20年的癌症检测一致(还参见图5)。
表5.由当前的具有NADH和功能化的连接肽的2-D凝胶免疫印迹测试检测的在健康男性和女性志愿者的正常人群中早期癌症的发生率。
包括实体癌和血细胞癌两者。
阳性测试的总发生率在21至29岁年龄组为10％，并且在50至79岁稳定在约22％。40至49岁的男性中的阳性ONCOblot的显著升高是由于在该群体内不成比例的数量的早期前列腺指征，其中许多将根本不会发展成明显疾病。另外，对于所有年龄组，观察到的癌症的发生率与国家癌症研究所Seer癌症统计数据综述针对10至20年所预测的(表6)密切匹配，而不与之前的由缺乏本发明的NADH/功能化的连接肽修饰版本的2-D凝胶免疫印迹方案提供的7到10年的估算值匹配，与测试的灵敏度比原始测试的灵敏度升高2至3倍一致。
表6.来自国家癌症研究所Seer癌症统计数据综述的不同的年龄组被诊断患有癌症的风险(Howlander,N.等人SEER癌症统计数据综述,1875-2912,National CancerInstitute,Bethesda,MD)。
研究显示如本发明所述的2-D凝胶免疫印迹测试具有比任何之前报导的测试更早地检测癌症的潜力。当然，不是所有早期检测的癌症将预期发展成临床上诊断的疾病，但是，基于提供的比较，约50％将具有发展成临床上诊断的疾病的高的可能性。至少对于前列腺癌，对在40至49岁男性年龄组中的PSA值低至0.5ng/ml的受试者记录了阳性ONCOblot结果，作为功能化的ONCOblot测试指示的异常高的癌症发生率的一个解释。
可以设想，在本说明书中讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
将理解的是，本文描述的具体实施方案以说明的方式显示，而不作为对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体程序的许多等价方式。这样的等价方式将被视为在本发明的范围内并由权利要求书涵盖。
说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明涉及的领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请被引入本文作为参考，其程度如同具体地和单独地表明将各出版物和专利申请引入本文作为参考。
单词“一个(a)”或“一个(an)”当与权利要求中的术语“包括(comprising)”联合使用时，可以指“一个”，但其还符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义。术语“或”在权利要求中的使用是用来指“和/或”，除非明确指出仅指代供选择的方案或供选择的方案是互相排斥的，但本公开支持仅指代供选择的方案和“和/或”。贯穿本申请，术语“约”用于表示数值包括装置的误差、用于测定该数值的方法的固有变化，或研究受试者之间存在的变化。
如本说明书和权利要求中所使用的，单词“包括(comprising)”(和包括的任何形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)，“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”，“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“包含(containing)”(和包含的任何形式，如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包括性的或开放式的，不排除另外的未列举的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包括(comprising)”可以被“基本上由……组成”或“由……组成”替代。如本文所使用，短语“基本上由……组成”需要规定的整数或步骤，以及不实质上影响要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文所使用，术语“由……组成”仅用来表示列举的整数的存在(例如，元件、特征、性质、方法/工艺步骤或限度)或整数组(例如，特征(或多个特征)、元件(或多个元件)、性质(或多个性质)、特性(或多个特性)、方法/工艺步骤或限度(或多个限度))。
如本文使用的术语“或其组合”是指所有在术语之前的所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中当顺序是重要的时，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或条款的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解通常对任意组合中的项目或条款的数量没有限制，除非上下文另有说明。
如本文所使用，例如但不限于“约”、“基本上”或“基本上地”是指当如此修饰时理解为并不一定是绝对或完善的，而是将被视为与本领域技术人员的那些足够接近以保证指定该条件存在的条件。描述可以变化的程度将取决于变化程度，该变化可以实施并且由于仍然具有未改变的特征的特征和能力而使本领域普通技术人员仍能识别改变的特征。通常，但限于之前的讨论，由近似的单词如“约”修饰的本文的数值可以从规定的值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％.
根据本发明，本文公开的和要求保护的所有组合物和/或方法可以在无需过度实验的情况下进行和执行。虽然根据优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，变化可以适用于本文所述的组合物和/或方法以及适用于步骤或方法的步骤的顺序。对本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和修改被视为如所附权利要求限定的在本发明的精神、范围和构思内。
Claims (14)
1.一种用于检测受试者中的癌症的良性到恶性转化的组合产品，优选为试剂盒，包括：
用于在电泳蛋白质分离之前收集来自受试者的样品的装置；
用于激活电泳分离的ENOX2转录变体的ENOX2电子供体；和
用于检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在的泛-ENOX2可检测的结合试剂，其中样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在表示癌症的恶性转化，由此当与等价的未激活的ENOX2转录变体比较时，获得一种或多种激活的ENOX2转录变体的检测灵敏度的10至100倍的升高；
优选地，所述样品为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或体液。
2.权利要求1所述的组合产品，其中激活ENOX2转录变体所需的ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，和用于在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的装置，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内。
3.权利要求1或2所述的组合产品，还包括：
用于进行二维(2D)电泳蛋白质分离的装置和用于杂交到膜或纸上的装置；
用于在临床症状前至少一年检测癌症的装置和/或用于确定人类癌症起源的组织的装置；
用于确定一种或多种未知原发灶的癌症(CUP)的起源的组织的装置；
用于筛选以下至少一种的装置：在具有家族癌症史、环境暴露的人群中或在一般人群中的早期癌症。
用于基于表1中描述的ENOX2转录变体的存在确定一种或多种激活的ENOX2转录变体的起源的组织的装置；
用于解析在53和/或79至85kDa下的蛋白质作为总蛋白质装载对照的装置；
用于基于一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在区分远处转移和多原发性癌症的装置；
用于检测0期和1期癌症的装置和用于确定癌症的起源的组织的装置；和/或
用于监测癌症的再现的装置，其中两百万个或更少的癌细胞基于一种或多种激活的ENOX2转录变体的再现是可检测的。
4.权利要求1至3任一项所述的组合产品，其中：
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11；
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:1的scFv，其中SEQ ID NO:11的scFv的稳定性、结合效率和有效期通过在防止聚集的50％的甘油中储存来改善；和/或
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括抗-ENOX2 scFv融合蛋白，所述抗-ENOX2 scFv融合蛋白：在4℃至40℃下是非聚集的；包括包含间隔为CXXXXC或CXXXXXC的两个半胱氨酸(C)的氨基酸残基的小侧链(Gly/Ser)；和能够与ENOX2的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序形成链间二硫键。
5.权利要求1至4任一项所述的组合产品，其中用于浓缩血液、血清或血浆样品的装置进一步定义为使用结合和浓缩一种或多种ENOX2转录变体的镍-琼脂糖底物浓缩一种或多种ENOX2转录变体的装置。
6.权利要求1至5任一项所述的组合产品，其中：
预测的癌症的假阳性和确认的假阴性的发生率小于1％；
用于检测癌症的灵敏度大于97％；和/或
其中检测的癌症的起源的组织选自以下至少一种：膀胱、血细胞、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤和骨髓瘤、乳腺、宫颈、结肠直肠、食道、胃、肝细胞、肺、非小细胞、黑素瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、肾细胞(肾)、肉瘤、鳞状细胞、睾丸生殖细胞、甲状腺滤泡、甲状腺乳头状癌或子宫。
7.一种在免疫印迹上定量ENOX2转录变体的校正产品，优选为试剂盒，包括：
用于使来自受试者浓缩的样品的样品经受电泳蛋白质分离的装置；
用于将电泳分离的蛋白质免疫杂交到蛋白质俘获膜或纸上的蛋白质俘获膜或纸；
用于激活蛋白质俘获膜或纸上的一种或多种ENOX2转录变体的还原的ENOX2底物；和
用于检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在的泛-ENOX2可检测的结合试剂，其中样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在表明癌症的恶性转化，其中当与未激活的ENOX2比较时，获得ENOX2的检测灵敏度10至100倍的升高，其中当与已知量的一种或多种ENOX2转录变体比较时，基于蛋白质俘获膜或纸上的ENOX2转录变体的斑点直径和强度校正一种或多种激活的ENOX2转录变体的量；
优选地，所述样品为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或体液。
8.权利要求7所述的产品，其中：
将所述斑点直径与重组ENOX2的标准曲线比较；
所述斑点直径和ENOX2的质量的对数线性相关；和/或
通过斑点直径和ENOX2活性的组合实现定量；和/或
通过以下实现所述定量：切掉ENOX2抗体反应性斑点，并使用洗脱和形成银纳米颗粒的与四氧化银的反应对ENOX2的量进行定量，以及通过与不含ENOX2的相应斑点比较，使用紫外-可见分光光度计或光散射分光光度计通过光散射定量纳米颗粒；
优选地，在大于7％的背景以上的斑点百分比证实斑点中的ENOX2转录变体的存在；
更优选地，所述产品还包括用于在临床症状之前至少一年检测人类癌症的斑点中的起源的组织的装置和用于在临床症状之前至少一年确定人类癌症的斑点中的起源的组织的装置。
9.一种确定受试者中的癌症的起源的组织的组合产品，优选为试剂盒，包括：
用于使来自受试者的样品中的蛋白质经受二维(2D)分子量和等电点电泳蛋白质分离的装置；
用于将蛋白质转移到蛋白质俘获膜或纸的蛋白质俘获膜或纸；
用于激活电泳分离的ENOX2转录变体的蛋白质俘获膜或纸上的ENOX2电子供体；
用于检测激活的ENOX2转录变体的装置；和
用于基于来自表1的样品中的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在确定癌症的起源的组织的装置，其中当与未激活的ENOX2转录变体相比时，一种或多种ENOX2转录变体的原位激活使检测灵敏度提高10至100倍；
优选地，所述样品为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或体液。
10.权利要求9所述的组合产品，其中激活ENOX2转录变体所需的所述ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，和用于在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的装置，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内。
11.权利要求9或10所述的组合产品，还包括：
用于进行二维(2D)电泳蛋白质分离的装置和用于杂交到膜或纸上的装置，其中所述ENOX2电子供体选自还原型吡啶核苷酸、NADH、NAD(P)H或作为ENOX2电子供体的合成性底物中的至少一种，和用于在2D印迹上检测一种或多种激活的ENOX2转录变体的装置，其中NADH或NAD(P)H的终浓度在10μM至50μM的范围内；
用于在临床症状前至少一年检测癌症的装置和/或用于确定人类癌症起源的组织的装置。
12.权利要求9至11任一项所述的组合产品，其中：
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11；
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括SEQ ID NO:11的scFv，其中SEQ ID NO:1的scFv的稳定性、结合效率和有效期通过在防止聚集的50％的甘油中储存来改善；和/或
所述泛-ENOX2可检测的结合试剂包括抗-ENOX2scFv融合蛋白，所述抗-ENOX2scFv融合蛋白：
在4℃至40℃下是非聚集的；
包括包含间隔为CXXXXC或CXXXXXC的两个半胱氨酸(C)的氨基酸残基的小侧链(Gly/Ser)；和
能够与ENOX2的蛋白质二硫键-巯基互换功能基序形成链间二硫键。
13.权利要求9至12中任一项所述的组合产品，其中用于浓缩血液、血清或血浆样品的装置进一步定义为使用结合和浓缩一种或多种ENOX2转录变体的镍-琼脂糖底物浓缩一种或多种ENOX2转录变体的装置。
14.一种印迹，其包括来自受试者的浓缩的样品的一种或多种电泳分离的蛋白质，其中将所述印迹暴露于泛-ENOX2检测试剂和激活印迹上的ENOX2转录变体的ENOX2的还原底物，其中针对来自表1的一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在分析所述印迹，其中一种或多种激活的ENOX2转录变体的存在用于在临床症状前至少一年检测和确定人类癌症的起源的组织，当与未激活的ENOX2转录变体相比时，一种或多种ENOX2转录变体的原位激活使检测灵敏度提高10至100倍。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15/169,205 | 2016-05-31 | ||
| US15/169,205 US9612243B1 (en) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | Methods and compositions for targeted two-dimensional western blot analysis for early cancer detection and cancer diagnosis up to ten years in advance of clinical symptoms of malignant disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107525935A true CN107525935A (zh) | 2017-12-29 |
| CN107525935B CN107525935B (zh) | 2021-04-02 |
Family
ID=56550725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610595973.3A Expired - Fee Related CN107525935B (zh) | 2016-05-31 | 2016-07-26 | 用于在恶性疾病的临床症状之前高达十年的早期癌症检测和癌症诊断的靶向二维免疫印迹分析的方法和组合物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9612243B1 (zh) |
| EP (1) | EP3252473A1 (zh) |
| JP (1) | JP6442440B2 (zh) |
| CN (1) | CN107525935B (zh) |
| HK (1) | HK1247990A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013052926A2 (en) | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Mor-Nutech, Inc. | Methods and compositions for single chain variable region enox2 antibodies for cancer detection and diagnosis |
| WO2017192879A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Mor-Nuco Enterprises, Inc. | Methods and compositions for identification and quantitation of enox2 transcript variants as indications of cancer presence in blood serum and other body fluids based on gold or silver nanoparticle formation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013052926A2 (en) * | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Mor-Nutech, Inc. | Methods and compositions for single chain variable region enox2 antibodies for cancer detection and diagnosis |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001032673A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Purdue Research Foundation | Sequences encoding human neoplastic marker |
| US7053188B2 (en) | 2002-02-22 | 2006-05-30 | Purdue Research Foundation | Monoclonal antibodies specific for neoplasia-specific NADH:disulfide reductase |
| US20030207340A1 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-06 | Morre D. James | Sequences encoding human neoplastic marker |
| JP2008111824A (ja) | 2006-09-01 | 2008-05-15 | Nox Technologies Inc | 腫瘍特異的ｔＮＯＸアイソフォーム及び方法 |
| JP2011516046A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-05-26 | トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ | 肺障害の検出のための多元的方法 |
| WO2011060305A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Nox Technologies, Inc. | Potato skin compositions that lower cytosolic nadh level to mimic calorie restriction |
| US20120034626A1 (en) * | 2010-03-03 | 2012-02-09 | Morre D James | Neoplasia-Specific Autoantibodies and Methods |
-
2016
- 2016-05-31 US US15/169,205 patent/US9612243B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2016-06-16 JP JP2016119555A patent/JP6442440B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2016-07-20 EP EP16180364.8A patent/EP3252473A1/en not_active Withdrawn
- 2016-07-26 CN CN201610595973.3A patent/CN107525935B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-02-16 US US15/434,982 patent/US9804165B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-06-06 HK HK18107398.3A patent/HK1247990A1/zh unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013052926A2 (en) * | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Mor-Nutech, Inc. | Methods and compositions for single chain variable region enox2 antibodies for cancer detection and diagnosis |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| D. JMAES MORRE ET AL: "ENOX2-based early detection (ONCOblot) of asbestos-induced malignant mesothelioma 4–10 years in advance of clinical symptoms", 《CLINICAL PROTEOMICS》 * |
| JAMES TODD HOOPES ET AL: "Staining Electrophoretic Gels for Laccase and Peroxidase", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| JOACHIM SOCK ET AL: "Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Membrane-Immobilized Auxiliary Enzymes", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9804165B1 (en) | 2017-10-31 |
| JP2017215305A (ja) | 2017-12-07 |
| EP3252473A1 (en) | 2017-12-06 |
| CN107525935B (zh) | 2021-04-02 |
| HK1247990A1 (zh) | 2018-10-05 |
| US9612243B1 (en) | 2017-04-04 |
| JP6442440B2 (ja) | 2018-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4295826B2 (ja) | 前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体 | |
| CN112851818B (zh) | 针对d-二聚体的结合蛋白及其应用和检测d-二聚体的方法 | |
| US20210018504A1 (en) | Shon as a prognostic biomarker for cancer and as a predictor of response to endocrine therapy | |
| US10712345B2 (en) | Methods and compositions for single chain variable region ENOX2 antibodies for cancer detection and diagnosis | |
| He et al. | Cytosolic thymidine kinase is a specific histopathologic tumour marker for breast carcinomas. | |
| WO2006055880A2 (en) | Diagnostic pkm2 methods and compositions | |
| CN107525935A (zh) | 用于在恶性疾病的临床症状之前高达十年的早期癌症检测和癌症诊断的靶向二维免疫印迹分析的方法和组合物 | |
| CN114478759A (zh) | 抗人血红蛋白的抗体及其应用和诊断试剂盒 | |
| CN112920272A (zh) | 抗cTnI的蛋白和检测cTnI的方法 | |
| CN113004411B (zh) | 可特异性结合ckmb的结合蛋白、其应用以及检测ckmb的方法 | |
| CN112940130B (zh) | 能够特异性结合mpo的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测mpo的方法 | |
| CN112898429B (zh) | 针对cyfra21-1的结合蛋白、其应用、肿瘤诊断试剂和试剂盒 | |
| CN112898430A (zh) | Ca242的结合蛋白及其应用、检测方法和试剂盒 | |
| JPH08500731A (ja) | 診断法 | |
| CN112979813B (zh) | 一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN113508141B (zh) | 抗体及其功能片段 | |
| JP2008111824A (ja) | 腫瘍特異的ｔＮＯＸアイソフォーム及び方法 | |
| JP6793514B2 (ja) | 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤 | |
| CN113929778A (zh) | 抗肌红蛋白的抗体以及试剂盒 | |
| CN112898423A (zh) | 用于检测cyfra21-1的结合蛋白以及cyfra21-1的检测方法 | |
| CN112979816B (zh) | 针对ckmb的结合蛋白及其应用 | |
| US7160697B2 (en) | Use of novel cytokine receptors as biomarkers and therapeutic targets in human cancer | |
| EP1621637A1 (en) | ppGalNac-T6 mRNA or peptide as a new marker for the detection of cancer cells | |
| WO2003020115A2 (en) | Methods and compositions for the detection of cancer | |
| CN112979799A (zh) | 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210402 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |