CN107459577A

CN107459577A - 表面锚定的fc‑诱饵抗体展示系统

Info

Publication number: CN107459577A
Application number: CN201710518609.1A
Authority: CN
Inventors: D·查; H·H·沙希恩
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2017-12-12
Also published as: CN103534392A; WO2012074948A3; US20140186334A1; US9365846B2; CN110042066A; EP2646606A2; EP2646606B1; WO2012074948A2; EP2646606A4

Abstract

本发明部分提供了同时使用分泌和展示模式的抗体展示系统。与单价抗体片段复合的诱饵可以在宿主细胞表面上表达，其中所述片段可以就抗原结合进行测定，而全抗体同时从宿主细胞中分泌。还提供了使用该系统用于鉴定与目的抗原特异性结合的抗体的方法。还提供了对于制备抗体展示系统有用的多肽、多核苷酸和宿主细胞连同其使用方法。

Description

表面锚定的FC-诱饵抗体展示系统

本申请是申请日为2011年11月29日，申请号为201180066437.X，发明名称为“表面锚定的FC-诱饵抗体展示系统”的发明专利申请的分案申请。本申请要求于2011年12月1日提交的美国临时专利申请号 61/458,771的利益，所述美国临时专利申请整体引入本文作为参考。

技术领域

本发明的领域涉及用于鉴定与抗原特异性结合的抗体的抗体展示系统和使用方法。

背景技术

用于构建和筛选抗体文库的技术是噬菌体展示，由此目的蛋白质作为与噬菌体外壳蛋白质的多肽融合物表达，且随后通过与固定或可溶性生物素化的配体结合进行筛选。

然而，噬菌体展示具有几个缺点。例如，一些真核分泌的蛋白质和细胞表面蛋白质需要翻译后修饰，例如糖基化或广泛二硫键异构化，其在细菌细胞中是无法获得的。

目前的酵母表面抗体展示系统例如冷捕获也具有多个缺点。在冷捕获抗体展示系统中，在低温，来自宿主细胞转运囊泡的抗体释放过程延迟，从而使得分泌的抗体可以在细胞表面上就抗原结合进行测定。冷捕获方法具有低信噪比的缺点，并且对于靶抗原具有特异性的抗体的鉴定很大程度上依赖于抗体的细胞表达水平。

亲和基质系统例如通过生物素将抗体与宿主细胞表面偶联，由此它们可以就抗原结合进行测定。亲和基质系统显示出在抗体克隆之间的交叉污染的高发生率。抗体可以变得从宿主细胞解偶联，并从而丧失它们与编码其免疫球蛋白链的多核苷酸的连接。

全长抗体展示系统通过结合免疫球蛋白结合蛋白例如蛋白A将全长抗体栓系在宿主细胞表面上，所述免疫球蛋白结合蛋白融合至细胞表面锚定蛋白。宿主细胞含有编码抗体免疫球蛋白链的多核苷酸。一般地，抗体的结合在免疫球蛋白结合蛋白在细胞表面上表达后发生。因此这个系统导致抗体与不表达该抗体的宿主细胞的一些错误结合。

发明内容

本发明部分提供了不具有目前可用系统的缺点的抗体展示系统。本发明还允许抗体展示与生产菌株选择的偶联。通过表面展示筛选发现的菌株可以变成生产菌株，同时保存抗体序列和完整性。这种方法使得能够筛选参数例如抗体折叠和表达。

本发明提供了包含下述的抗体展示系统：(a)分离的真核宿主细胞 (例如毕赤酵母属(Pichia)细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))； (b)包含融合至表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如包含CH3、CH2-CH3或VH-CH1多肽)(例如人)的诱饵(例如其中细胞包含编码诱饵的多核苷酸)；(c)编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；和(d)编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸。任选地，抗体展示系统还包含非栓系的全抗体，其包含所述免疫球蛋白轻和重链；和/或与诱饵的Fc部分复合的单价抗体片段。在本发明的一个实施方案中，编码免疫球蛋白轻链可变区的所述一种或多种多核苷酸来自免疫球蛋白轻链可变区的遗传上不同的群体(例如免疫球蛋白文库)；和/或，其中编码免疫球蛋白重链可变区的所述一种或多种多核苷酸来自免疫球蛋白重链可变区的遗传上不同的群体(例如免疫球蛋白文库)。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞包含编码诱饵的多核苷酸，其与可调节的启动子(例如GUT1启动子、 GADPH启动子或PCK1启动子)可操作地结合。

本发明还提供了分离的诱饵多肽，例如包含融合至表面锚定多肽 (例如SED1)或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如其中Fc衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白；例如人，例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)。编码此类多肽的任何分离的多核苷酸；包括多核苷酸的载体和包含多核苷酸和载体的分离的宿主细胞构成本发明的部分。本发明的范围包括分离的宿主细胞(例如真核宿主细胞，例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)，其还包含编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸(例如来自文库)；和/或编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸(例如来自文库)。在本发明的一个实施方案中，本发明的宿主细胞包括位于细胞表面例如细胞膜上的多肽。

本发明包含分离的宿主细胞(例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)，其包含例如通过其为诱饵的部分的细胞表面锚(例如SED1)位于宿主细胞表面上、与Fc/抗原结合片段复合的诱饵多肽；任选地其中所述 Fc/抗原结合片段与抗原结合；任选包含抗体或其抗原结合片段，其包含Fc/抗原结合片段的轻和重链免疫球蛋白；例如，其中宿主细胞包含编码例如诱饵、轻链免疫球蛋白和/或重链免疫球蛋白的一种或多种多核苷酸。

本发明还提供了包含本发明的宿主细胞(参见例如上文)的组合物，所述组合物还包括非栓系的全抗体，其包含所述免疫球蛋白轻和重链；和/或与诱饵的Fc部分复合的抗体的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)。在本发明的一个实施方案中，所述全抗体或Fc/抗原结合片段与抗原复合。

本发明提供了用于测定抗体或其抗原结合片段是否与抗原特异性结合的方法，其包括使抗体展示系统与所述抗原接触；其中所述抗体展示系统包含：(a)分离的真核宿主细胞(例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸(例如来自文库)；和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸(例如来自文库)；和(b)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段(例如SED1)的Fc 免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人，例如包含VH-CH1、CH2-CH3 或CH3多肽)的诱饵；其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)复合；并且测定所述Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)是否与所述抗原特异性结合；其中如果单价抗体片段与所述抗原特异性结合，则所述抗体测定为特异性结合所述抗原。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括分离一种或多种多核苷酸，和任选测定核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括抑制所述诱饵的表达，随后测定所述鉴定的抗体或其抗原结合片段对于所述抗原的亲和力。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括重组表达由该多核苷酸编码的免疫球蛋白链，和任选分离包含所述免疫球蛋白的抗体或其抗原结合片段，和任选产生包含组合所述抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体的药物制剂。

本发明还提供了用于鉴定下述的方法：

(i)与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段；或(ii)编码所述抗体或片段的免疫球蛋白重链的多核苷酸(例如来自文库)和/或编码所述抗体或片段的免疫球蛋白轻链的多核苷酸(例如来自文库)；所述方法包括使抗体展示系统与所述抗原接触，其中所述抗体展示系统包含：(a) 分离的真核宿主细胞(例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸；和

(b)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段(例如SED1)的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人；例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)的诱饵；其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)复合；并且测定所述Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)是否与所述抗原特异性结合；其中如果观察到与所述抗原的所述特异性结合，则鉴定该抗体或片段或多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括分离一种或多种多核苷酸，和任选测定核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括抑制所述诱饵的表达，随后测定所述鉴定的抗体或其抗原结合片段对于所述抗原的亲和力。在本发明的一个实施方案中，该方法还包括重组表达由该多核苷酸编码的免疫球蛋白链，和任选分离包含所述免疫球蛋白的抗体或其抗原结合片段，和任选产生包含组合所述抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体的药物制剂。

本发明还提供了用于制备抗体展示系统的方法，其包含：(a)分离的真核宿主细胞(例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)；(b)包含融合至表面锚定多肽或其功能片段(例如SED1)的人Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人；例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)的诱饵；(c)编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸(例如来自文库)；(d)编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸(例如来自文库)；所述方法包括将编码所述诱饵的多核苷酸，编码免疫球蛋白轻链可变区的所述一种或多种多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链可变区的所述一种或多种多核苷酸引入所述真核宿主细胞内。

本发明还提供了用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；和/或编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸引入包含诱饵的分离的真核宿主细胞(例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)内，所述诱饵包括融合至表面锚定多肽或其功能片段(例如SED1)的人Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人；例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)；和在由此表达编码免疫球蛋白链的多核苷酸且由所述链形成抗体或其抗原结合片段的条件下培养宿主细胞；其中所述诱饵与可调节的启动子(例如GUT1启动子、GADPH启动子或PCK1启动子)可操作地结合，并且当所述免疫球蛋白链表达时，诱饵表达被抑制。

本发明还包含用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许所述抗体或片段的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链表达的条件下在生长培养基中培养分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)；其中所述真核宿主细胞包含：(i)编码所述免疫球蛋白轻链的多核苷酸；和编码所述抗体或片段的所述免疫球蛋白重链的多核苷酸(例如其中所述链由一个共同多核苷酸或两个分开的多核苷酸编码；和/或，其中所述一个或两个所述多核苷酸得自文库或得自单克隆来源)；和(ii)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人，例如包含VH-CH1、CH2-CH3或 CH3多肽)的诱饵；其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段) 复合；并且其中诱饵的表达是任选被抑制的；其中所述抗体或片段任选由所述真核宿主细胞分泌；所述方法任选包括从所述真核宿主细胞和培养基中分离所述抗体或片段。

本发明还提供了用于测定糖(例如O-聚糖和/或N-聚糖，例如本文讨论那些中的任何)对与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段的作用的方法，其包括使抗体展示系统与所述抗原结合；其中所述抗体展示系统包含：

(a)分离的真核控制糖基化的宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸；和(b)包含融合至所述宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的包含所述糖的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人，例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)的诱饵；

其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段复合；其中所述重和/或轻链包含所述糖；

测定所述Fc/抗原结合片段是否与所述抗原特异性结合；测定包含所述糖的抗体或其抗原结合片段对于抗原的结合亲和力；和比较抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力与缺乏所述糖的其他方面等同的抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力；其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺乏该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则该糖测定为增加对于抗原的亲和力，和/或其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺乏该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则该糖测定为降低对于抗原的亲和力。

附图说明

图1.本发明的抗体展示系统及其使用方法。编码抗体的多核苷酸和诱饵在巴斯德毕赤酵母中共表达。编码一条或两条抗体免疫球蛋白链的多核苷酸可以来自文库或可以来自单克隆来源。毕赤酵母属细胞在细胞表面上表达诱饵，此类诱饵中的一些由同样表达的抗体的单价多肽片段(包含一条重和一条轻链)结合。一些表达的抗体逃避诱饵结合，并且因此是可溶的。可以通过FACS分析证实抗体在细胞上的表达，并且还可以测定细胞抗体表达水平的滴度。关闭诱饵表达，或从细胞中逐出(或敲除)编码诱饵的多核苷酸。所得到的细胞仅表达编码抗体重和轻链的多核苷酸且仅产生可溶性全抗体。随后可以证实抗体的细胞表达水平，并且还可以执行抗体亲和力的测定。

图2.pGLY9008的质粒图。融合至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SED1的智人(Homo sapiens)Fc由巴斯德毕赤酵母AOX1启动子驱动。

图3(a&b)测量κ轻链浓度的ELISA用于测定由表1中说明的菌株分泌的抗体的浓度。泳道1是系列稀释的ELISA标准；泳道2-3含有通过表1中的菌株产生的材料，不含表面锚定的Fc诱饵(SAFB)；泳道5-10含有相同菌株加上SAFB。Y8316不表达抗体且用作阴性对照。 (c)通过3a中的菌株生成的上清液在蛋白A柱上运行，以捕获分泌的抗体。洗脱的IgGs在非还原SDS-PAGE上运行。

图4(a-c).图显示了证实在多个巴斯德毕赤酵母菌株之间观察到的不同荧光强度的FACS数据。(a)表达抗HER2和抗PCSK9不含Fc-SED1 诱饵的亲本菌株；(b)含和不含诱饵的抗Her2展示细胞；(c)含和不含诱饵的抗PCSK9展示细胞。

图5.展示与抗PCSK9单价抗体片段(H+L)或抗Her2(H+L)单价抗体片段复合的Fc-Sed1p的标记的巴斯德毕赤酵母酵母菌株 YGLY21610和YGLY21614的FACS分析。细胞用山羊抗人Fc Alexa 488、生物素化的PCSK9、和APC 635标记的链霉抗生物素蛋白进行双重标记。将细胞分开分析(分别为左和中图)且以1∶00比混合在一起 (右图)。右图中代表YGLY21610细胞的点是圆圈内的。

图6.表达Fc-SED1诱饵的巴斯德毕赤酵母细胞的FACS分析和； (1)抗PCSK9抗体AX189重和轻链(抗PCSK9；AX189-Fc-Sed1p)；或 (2)来自BP550文库的AX189轻链和重链(BP550-Fc-Sed1p)；或(3)来自 BP551文库的AX189重链和轻链(BP551-Fc-Sed1p)。左图显示与含有文库的未分类菌株有关的数据，并且右图显示与分选一次或两次的包含文库的细胞有关的数据。还显示了与对照AX189表达细胞有关的 FACS数据。

图7.预分选的BP550和BP551文库及其第2轮分选库的PCSK9 和κELISA分析。

图8.Fc-Sed1p展示发现用于在双特异性和其他应用中使用的新型异二聚化Fc片段的用途。在这种方法中，丧失其与自身同二聚化或与野生型Fc异二聚化的能力的Fc突变体可以展示在细胞表面上(A)，并且与H+L突变文库共表达，其中Fab区保持不变，但CH2和/或CH3 结构域是突变的(B)。使用与Fab结合的表面展示，可以使用FACS分离对于抗原结合阳性的细胞(C)。这些细胞将含有对展示的诱饵-Fc恢复二聚化的新型Fc变体。培养上清液可以通过SDS-PAGE进行测定，以确保含有新型Fc的单体分泌H+L(D)。这个练习将导致可以使用相同测定实施后续改造的新型异二聚化Fc对或配偶体的鉴定(E)。

发明详述

本发明提供了用于抗体表面展示的方法和系统，其同时特征在于展示模式和全抗体分泌模式。宿主细胞分泌全抗体且在细胞表面上展示Fc/抗原结合片段。这种方法利用具有细胞表面蛋白质作为“诱饵” 的Fc融合物(例如在N或C末端融合)，所述细胞表面蛋白质共价偶联至细胞表面(例如细胞壁)或嵌入(部分或全部)细胞膜中(例如作为跨膜蛋白质)，且与抗体(例如来自克隆来源的单特异性抗体或来自文库的抗体)共表达。在其中抗体分子通常二聚化以形成全抗体分子的内质网中，表面锚定的Fc融合物“诱饵”与单价抗体片段异二聚化，产生在细胞表面上展示的复合物。在细胞表面上的单价抗体片段可以结合抗原。

本发明的抗体系统可以在任何宿主细胞(例如酵母、哺乳动物细胞、细菌)中采用，其中诱饵可以在宿主细胞表面上表达且Fc/抗原结合片段可以与诱饵结合。

仍出现全抗体的同二聚化，允许全抗体分子分泌到培养物上清液内。分泌的全抗体例如在分离后可以例如用于临床前研究。

需要时，诱饵可以被敲除或突变或其表达可以被关闭，以制备仅产生全抗体的菌株。

分子生物学

依照本发明，在本领域技术内存在可以采用的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中充分说明。参见例如， Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在本文中″Sambrook，等人，1989″)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames &S.J.Higgins编辑(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑 (1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal， A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel，等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons， Inc.(1994)。

文库一般是相关但不同的多核苷酸的集合，所述多核苷酸一般在共同载体主链中。例如，轻链或重链免疫球蛋白文库可以含有在共同载体主链中的多核苷酸，其编码在其核苷酸序列中不同但相关的轻和/ 或重链免疫球蛋白；例如，所述免疫球蛋白例如在本发明的抗体展示系统中在其与其他免疫球蛋白形成复合物的能力中是功能上不同的，且结合特定抗原。

当序列指导RNA聚合酶介导的编码序列转录成RNA、优选mRNA 时，所述RNA随后可以剪接(如果它含有内含子)且翻译成由编码序列编码的蛋白质，编码序列“在细胞中的转录和翻译控制序列控制下”、 “与细胞中的转录和翻译控制序列功能上结合”或“与细胞中的转录和翻译控制序列可操作地结合”。因此，诱饵基因可以与启动子例如可调节的启动子或组成型启动子可操作地结合。

本文讨论的多核苷酸构成本发明的部分。“多核苷酸”、“核酸” 或“核酸分子”包括单链或双链的DNA和RNA。

在本发明的一个实施方案中，例如编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分(例如诱饵)的多核苷酸可以由天然调节(表达控制) 序列侧接，或可以与异源序列结合，所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制基因、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区等。

例如编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分的多核苷酸可以与启动子可操作地结合。在本发明的一个实施方案中，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如直接地或通过其他启动子结合蛋白质或物质)且起始编码序列的转录的DNA 调节区。启动子序列一般在其3′末端以转录起始位点为界，且向上游(5′ 方向)延伸，以包括在任何水平起始转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点(例如通过用核酸酶S1作图方便地定义的)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。启动子可以与其他表达控制序列包括增强子和阻遏序列或与本发明的核酸结合。可以用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号5,385,839和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist，等人，(1981)Nature 290：304-310)、在劳斯肉瘤病毒的 3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto，等人， (1980)Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner，等人， (1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster，等人，(1982)Nature 296：39-42)；原核表达载体例如 β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff，等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75：3727-3731)、或tac启动子(DeBoer，等人，(1983)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 80：21-25)；还参见″Useful proteins from recombinantbacteria″in Scientific American(1980)242：74-94；和来自酵母或其他真菌的启动子元件，例如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”包括媒介物(例如质粒)，通过其可以将DNA或RNA序列引入宿主细胞内，以便转化宿主并且任选促进所引入序列的表达和/或复制。在本发明的一个实施方案中，编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分(例如诱饵)的多核苷酸可以在载体中。

如本文讨论的，可以在本发明的组合物或方法中使用的宿主细胞包括真核生物例如低等和高等真核细胞以及原核生物。高等真核细胞包括哺乳动物、昆虫(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞)、和植物细胞(例如Protalix细胞)。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是低等真核生物例如酵母或丝状真菌细胞，其例如选自任何毕赤酵母属细胞、巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia flnlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、 Pichialindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母 (Pichiasalictaria)、Pichia guercuum、杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母、酵母菌属(Saccharomyces)、多形汉逊酵母(Hansβnula polymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candidaalbicans)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属(Fusari υm)、禾谷镰刀菌(gramineum)、Fusarium venenatum、和粗糙链孢霉(Neuraspora crassa)。高等真核宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞或NSO细胞。原核宿主细胞可以是例如细菌细胞，例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属 (Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属 (Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)和副球菌属(Paracoccus)。大肠杆菌(E.coli)宿主细胞包括DHB4、BL21(其在Lon(Phillips等人(1984)J. Bacteriol.159：283)和OmpT蛋白酶中缺陷)、HB101、BL21 DE3、大肠杆菌AD494、大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)、大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)。其他菌株包括其为甲硫氨酸缺陷的大肠杆菌B834(Leahy等人(1992)Science 258， 987)；其他菌株包括BLR菌株，以及K-12菌株HMS174和NovaBlue，其为改善质粒单体得率且可以帮助稳定含有重复序列的靶质粒的recA 衍生物(这些菌株可以得自Novagen)。还参见美国专利号4,952,496、 5,693,489和5,869,320，以及Davanloo，P.，等人，(1984)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81，2035-2039；Studier，F.W.，等人，(1986)J.Mol.Biol.189： 113-130；Rosenberg，A.H.，等人，(1987)Gene 56：125-135；和Dunn， J.J.，等人，(1988)Gene 68：259。原核细胞也可以例如在培养基中在允许多肽例如免疫球蛋白多肽和/或诱饵的重组表达的条件下进行培养。包含此类基因和蛋白质的此类方法和宿主细胞是本发明的部分。原核宿主细胞也可以用作本发明的抗体展示系统中的宿主细胞，如本文讨论的。

如本文使用的，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换使用且指N联寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺连接附着至多肽的天冬酰胺残基的那种。N联糖蛋白含有与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的占优势糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(Gal N Ac)、N-乙酰葡糖胺(Glc N Ac) 和唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸(NANA))。

N-聚糖具有Man₃Glc N Ac₂(″Man″指甘露糖；″Glc″指葡萄糖；并且 ″NAc″指N-乙酰基；GIcNAc指N-乙酰葡糖胺)的共同戊糖核心。N-聚糖就包含外周糖(例如Glc N Ac、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角) 数目而言不同，所述外周糖附着至Man₃Glc N Ac₂(″Man₃″)核心结构，其也称为“三甘露糖核心”、“戊糖核心”或“少甘露糖核心”。N- 聚糖根据其分支组成成分进行分类(例如高甘露糖、复杂或杂交)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖一般具有附着至1，3甘露糖臂的至少一个Glc N Ac和附着至″三甘露糖″ 核心的1，6甘露糖臂的至少一个Glc N Ac。复杂N-聚糖还可以具有半乳糖(″Gal″)或N-乙酰半乳糖胺(″Gal N Ac″)残基，其任选由唾液酸或衍生物(例如″NANA″或″NeuAc″，其中″Neu″指神经氨酸并且″Ac″指乙酰基)修饰。复杂N-聚糖也可以具有包含“二等分”Glc N Ac和核心岩藻糖(″Fuc″)的链内置换。复杂N-聚糖也可以具有在“三甘露糖核心”上的多个触角，通常被称为“多触角聚糖”。“杂交”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端上的至少一个Glc N Ac和在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的零或多个甘露糖。多个N-聚糖也称为“糖形”。 “PNG酶”或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”指肽N-糖苷酶F(EC3.2.2.18)。

在本发明的一个实施方案中，在“真核宿主细胞”中的糖蛋白的 O-糖基化是受控制的。本发明的范围包括其中O-糖基化是受控制的分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法(如本文讨论的)。例如，其中O-聚糖占据和甘露糖链长是减少的。在低等真核宿主细胞例如酵母中，可以通过缺失编码一种或多种蛋白质O-甘露糖基转移酶的基因(Dol-PMan：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMTs)或通过在含有一种或多种 Pmtp抑制剂的培养基中生长宿主来控制O-糖基化。因此，本发明包括例如包含编码PMTs的一种或多种基因的缺失的分离的真核宿主细胞、抗体展示系统及其使用方法(如本文讨论的)，和/或例如，其中宿主细胞可以在包括一种或多种Pmtp抑制剂的培养基中培养。Pmtp抑制剂包括但不限于苄叉噻唑二酮。苄叉噻唑二酮的例子是5-[[3，双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-25苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和 5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代 -2-硫代3-噻唑烷乙酸。

在本发明的一个实施方案中，“真核宿主细胞”包括编码α-1，2 甘露糖苷酶的核酸，其具有指导其用于分泌的信号肽。例如，在本发明的一个实施方案中，将宿主细胞改造为表达具有5.1-8.0、优选5.9- 7.5的最佳pH的外源α-1，2甘露糖苷酶。在本发明的一个实施方案中，将外源酶靶向宿主细胞的内质网或高尔基体，在其中它修改N-聚糖例如Man₈GlcNAc₂，以获得Man_sGlcNAc₂。参见美国专利号7,029,872。

本发明的范围包括此类分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法(如本文讨论的)。

在本发明的一个实施方案中，“真核宿主细胞”是低等真核细胞(例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母)，通过缺失或破坏一个或多个β-甘露糖基转移酶基因(例如BMTl、BMT2、BMT3和BMT4)(参见，美国公开专利申请号2006/0211085)，或使用干扰RNA、反义RNA等取消编码一个或多个β-甘露糖基转移酶的RNAs的翻译，所述低等真核细胞经遗传改造以消除具有α-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白。本发明的范围包括此类分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法(如本文讨论的)。

“真核宿主细胞”还包括低等真核细胞(例如酵母和丝状真菌，例如巴斯德毕赤酵母)，例如通过缺失或破坏一个或两个磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B(参见例如美国专利号7,198,921和7,259,007)，其可以包括缺失或破坏MNN4A基因或使用干扰RNA、反义RNA等取消编码一个或多个磷酸甘露糖基转移酶的RNAs的翻译，所述低等真核细胞经遗传改造为消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白。在本发明的一个实施方案中，“真核宿主细胞”已经遗传修饰为产生具有占优势地选自下述的N-聚糖的糖蛋白：复杂N-聚糖、杂交N-聚糖和高甘露糖 N-聚糖，其中在本发明的一个实施方案中，复杂N-聚糖选自Man₃GlcNAc₂、GlcNAC_(1-4)Man₃GlcNAc₂、 NANA_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂和NANA_(1-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂；在本发明的一个实施方案中，杂交N-聚糖选自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂；并且在本发明的一个实施方案中，高甘露糖N-聚糖选自Man₆GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂、Mang₈1cNAc₂和Man₉GlcNAc₂。本发明的范围包括此类分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法(如本文讨论的)。

如本文使用的，当它涉及在糖蛋白上的特定糖残基例如岩藻糖或半乳糖等的缺乏时，术语“基本上不含”用于指示糖蛋白组合物基本上缺乏含有此类残基的N-聚糖。就纯度而言表达的，基本上不含意指含有此类糖残基的N-聚糖结构的量不超过10％，且优选低于5％、更优选低于1％、最优选低于0.5％，其中百分比是按重量计或按摩尔百分比计。

如本文使用的，当在N-聚糖结构上不存在可检测量的此类糖残基时，糖蛋白组合物“缺乏”特定糖残基例如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选实施方案中，如本文讨论的，糖蛋白组合物通过低等真核生物产生，并且将“缺乏岩藻糖”，因为这些生物的细胞不具有产生岩藻糖化的N-聚糖结构所需的酶。因此，术语“基本上不含岩藻糖”包含术语“缺乏岩藻糖”。然而，即使如上所述组合物曾经含有岩藻糖化的N-聚糖结构，或含有有限但可检测量的岩藻糖化的N-聚糖结构，组合物也可以“基本上不含岩藻糖”。

例如，例如如本文讨论的，在特定情况下，引入、消除或修饰在宿主细胞中表达的免疫球蛋白上的糖残基的宿主细胞在本文中可以被称为“控制糖基化的宿主细胞”。

荧光激活细胞分选(FACS)是专门类型的流式细胞术。它提供了基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，用于将生物细胞的异质混合物分选到两个或更多容器内的方法，一次一个细胞。在细胞分选过程期间，细胞悬液在狭窄、快速流动的液体流中心拖动。流动如此安排，从而使得相对于其直径在细胞间存在分离。振动机制引起细胞流断裂成个别小滴。这样调整该系统，使得存在超过一个细胞/小滴的低概率。正好在流断裂成小滴之前，流动经过荧光测量站，在其中测量每个细胞的目的荧光特征。将充电环正好置于其中流断裂成小滴的点上。基于先前立即荧光强度测量将电荷置于环上，并且当小滴从流中断时，相反电荷在小滴上截留。荷电小滴随后下落经过静电偏转系统，其基于小滴的电荷将它转向到容器内。在一些系统中，将电荷直接应用于流，并且脱落的小滴保留与流相同标志的电荷。在小滴脱落后，流随后回到中性。本发明包含使用例如如本文讨论的本发明的抗体展示系统的方法，其中基于细胞是否由可检测的荧光标记进行标记(例如其中抗原自身或二抗是标记的)，通过FACS分选，从未结合的细胞或无足够水平的结合的细胞中分选出与目的抗原结合(通过Fc/抗原结合片段) 的真核宿主细胞。此类分选的标记的宿主细胞和包含此类分选的标记的宿主细胞的组合物也是本发明的部分。

可调节的启动子是其表达可以被诱导或抑制的启动子。本发明的实施方案包括其中诱饵的表达通过可调节的启动子进行控制的抗体展示系统，以及其如本文讨论的使用方法。与可调节的启动子可操作地结合的编码诱饵的多核苷酸连同包括该多核苷酸的分离的真核宿主细胞一起也构成本发明的部分。在酵母中存在的可调节的启动子的例子包括GUT1启动子、GADPH启动子和PCK1启动子。

在本发明的一个实施方案中，通过使细胞暴露于反义RNA或通过 RNA干扰(例如微小RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA))抑制多核苷酸(例如诱饵)在真核宿主细胞(例如诱饵)中的表达。本发明的实施方案包括使用抗体展示系统(例如如本文讨论的)的方法，其中诱饵的表达通过RNA干扰或反义RNA得到抑制。包含诱饵且还包含抑制诱饵表达的反义或RNA干扰分子的本发明分离的真核宿主细胞(例如如本文讨论的)也是本发明的部分。

抗体

与本发明的用途(例如本发明的抗体展示系统的用途)结合鉴定的抗体或其抗原结合片段可以重新格式化成任何合适的形式。例如，来自使用抗体展示系统分离的全抗体的CDRs可以掺入不同构架(例如人构架)内，以生成包含从本发明的抗体展示系统中分离的CDRs的不同抗体或其抗原结合片段。用于产生嵌合、人源化和人抗体的方法是本领域众所周知的。参见例如，颁给Queen等人的美国专利号5,530,101，颁给Winter等人的美国专利号5,225,539，颁给Boss等人的美国专利号4,816,397。用于重新格式化抗体或其抗原结合片段或用于将CDRs 从一个构架重新定位到另一个的此类方法是本领域常规和众所周知的。例如，抗体或抗原结合片段的CDRs可以用于生成单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、重组抗体、抗独特型抗体、人源化抗体和双特异性抗体；或其抗原结合片段例如纳米抗体(nanobodies)、 Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv片段；dsFv；(dsFv)₂、ds双抗体；dsFv-dsFv’；单链抗体分子例如sc-Fv、sc-Fv二聚体(二价双抗体)；和双特异性双抗体。

全抗体包含亚单位的四聚体。每个四聚体具有两对等同的多肽链，每对具有一条“轻”链(LC)(约25 kDa)和一条“重”链(HC)(约50-70 kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定部分负责效应子功能的恒定结构域。基于轻链中的恒定结构域类型，将轻链(LCs)分类为κ或λ。基于重链中的恒定结构域类型，将重链(HCs)分类为γ、μ、α、δ或 ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、 IgG3或IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD或IgE。

本发明包含用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；和/或编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸引入包含诱饵的分离的宿主细胞 (例如真核宿主细胞，例如毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母)内，所述诱饵包括融合至表面锚定多肽或其功能片段的人Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人；例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3多肽)；和在由此表达编码免疫球蛋白链的多核苷酸且由所述链形成抗体或其抗原结合片段的条件下培养宿主细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述诱饵与可调节的启动子可操作地结合，并且当所述免疫球蛋白链表达时，诱饵表达被抑制。在本发明的一个实施方案中，用反义RNA或通过RNA干扰抑制诱饵表达。

本发明还提供了例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)用于测定抗体或其抗原结合片段的数量的方法。例如，在本发明的一个实施方案中，该方法包括培养包含分离的多肽的真核宿主细胞，所述分离的多肽包含诱饵多肽(融合至表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段(例如人；例如包含VH-CH1、CH2-CH3或CH3 多肽))；其中宿主细胞分泌全抗体或其抗原结合片段(任选地，抗体或片段从宿主细胞和/或培养基中分离)；且通过ELISA测定抗体或其抗原结合片段的数量。在本发明的一个实施方案中，诱饵的表达在定量前被抑制，从而使得宿主细胞仅表达且分泌全抗体。诱饵多核苷酸可以与可调节的启动子可操作地结合，这样抑制所述可调节的启动子，以便抑制诱饵表达。例如，在本发明的一个实施方案中，ELISA包含将抗原包被在固体基质上；使抗体或其抗原结合片段与抗原结合；使可检测标记的二抗与抗体或片段结合；且检测二抗。在本发明的一个实施方案中，二抗用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行标记。在本发明的一个实施方案中，通过使碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP) 与底物结合且测量板的吸光度(例如HRP底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)；HRP底物3，3′-二氨基联苯胺(DAB)；或HRP底物2′-连氮基- 双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；或AP底物对硝基苯基磷酸酯) 来检测标记。

本发明还提供了用于测定抗体或其抗原结合片段(其由本发明的抗体展示系统的真核宿主细胞分泌)对于抗原的亲和力的方法。例如，亲和力可以通过标准亲和ELISA、Biacore分析或竞争测定进行测定。

抗体展示系统

本发明提供了包含下述的抗体展示系统、组合物或试剂盒：(1)真核宿主细胞和(2)包含在N或C末端(任选通过肽接头例如GGG)融合至表面锚的Fc(例如人Fc，例如包含VH-CH1、CH3或CH2-CH3多肽) 的诱饵，所述诱饵任选与信号序列(例如α交配因子信号序列，例如来自酿酒酵母)连接；所述系统可以例如用于抗体的鉴定中。因此，在本发明的一个实施方案中，该系统中的宿主细胞表达抗体和/或其Fc/抗原结合片段的一条或多条免疫球蛋白链(例如轻和重链，例如其中一条或多条链来自文库来源)。在本发明的一个实施方案中，抗体和/或其Fc/ 抗原结合片段的免疫球蛋白链包含来自诱饵那种的等同或不同CH2-CH3多肽。

抗体的Fc/抗原结合片段(1)与诱饵的Fc部分(例如人Fc，例如包含 VH-CH1、CH3或CH2-CH3多肽)复合，和(2)当与宿主细胞表面上的诱饵复合时，与抗原结合。Fc/抗原结合片段的例子是全抗体的单价片段 (即单价抗体片段)。在本发明的一个实施方案中，诱饵包含CH2-CH3 多肽或其功能片段，其在一个或多个残基上不同于抗体的Fc/抗原结合片段的CH2-CH3。在本发明的此类实施方案中，当诱饵和抗体的Fc/ 抗原结合片段结合时，形成异二聚的Fc结构域。

“单价抗体片段”包含抗体的一半，即包含三个配对的CDRs的与抗体轻链(VL-CL)结合的抗体重链(VH-CH1-CH2-CH3)，例如其中 CH1和CL由二硫桥结合，所述单价抗体片段能够可检测地结合抗原。

“诱饵”包含例如在氨基末端或羧基末端融合至表面锚的Fc结构域(例如人、大鼠、兔、山羊或小鼠Fc，例如重链(例如人、大鼠、兔、山羊或小鼠)的任何部分，例如CH3多肽、VH-CH1多肽或CH2-CH3 多肽)，所述诱饵具有致使诱饵能够在本发明的抗体展示系统中起作用的本文描述的功能性质(例如如下文阐述的)。在本发明的一个实施方案中，Fc结构域可以这样突变，以便改善其在本发明的抗体展示系统中起作用的能力，例如可以加入或移动半胱氨酸或其他残基，当与人IgG Fc或Fc/抗原结合片段复合时，允许更广泛的二硫桥形成。适合于在诱饵中使用的Fc包含Fc(即，包含CH1和/或CH2和/或CH3结构域)或其功能片段(例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变体)，当融合至表面锚定蛋白质时，所述Fc或其功能片段能够例如与真核宿主细胞表面上的人IgG Fc或Fc/抗原结合片段二聚化。在本发明的一个实施方案中，术语“Fc”指包含CH2和CH3结构域的抗体的“片段结晶的” C末端区。在本发明的一个实施方案中，在诱饵Fc和Fc/抗原结合片段之间的二聚化在按路线运送至细胞表面之前在细胞内发生，其中Fc 和Fc/抗原结合片段一旦在细胞表面上就保持结合。一般而言，在不存在Fc/抗原结合片段的情况下，诱饵同二聚化；从而包含两个表面锚和两个Fc结构域。在本发明的一个实施方案中，与诱饵共表达的全抗体包含能够彼此二聚化的轻和重链，以形成单价抗体片段，所述单价抗体片段与诱饵的Fc二聚化。

抗原可以是任何免疫原性分子或物质，例如多肽(例如寡肽)、细胞膜、细胞提取物或全细胞。多肽抗原包括例如下述多肽：趋化因子、细胞因子(例如炎性细胞因子或趋化因子)、受体、PCSK9、粒细胞-CSF；凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C；可溶性IgE受体α链；尿激酶；胰凝乳蛋白酶和尿素胰蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；胰岛素样生长因子1受体、血管表皮生长因子、表皮生长因子；生长激素释放因子；GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质)、膜联蛋白V融合蛋白；IL-23p19、IL-23p40、IL-23R、IL12R-β1、TNFα(肿瘤坏死因子α)、TGFβ(肿瘤坏死因子β)、IL-10、IL-17、TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)、血管抑素；血管内皮生长因子-2；髓样前体细胞抑制因子-1；骨保护素(OPG)、RANK(核因子κB受体活化因子)或 RANKL(核因子κB受体活化因子配体)；在本发明的一个实施方案中，其中任何可以是人的。

“表面锚”是当与Fc或其功能片段融合时，被表达且定位至细胞表面的任何多肽，其中Fc/抗原结合片段可以与Fc或其功能片段复合。细胞表面锚的例子是蛋白质，例如但不限于SED-1、α-凝集素、Cwp1、 Cwp2、GasI、Yap3、FIoIp1 Crh2、Pirl、Pir4、Tip1、Wpi、Hpwpl、Als3 和Rbt5；例如，酿酒酵母CWP1、CWP2、SED1或GAS1；巴斯德毕赤酵母SP1或GAS1；或多形汉逊酵母TIP1。在本发明的一个实施方案中，表面锚是任何糖基磷脂酰肌醇锚定(GPI)蛋白质。表面锚的功能片段包含表面锚全多肽的片段，当融合至Fc或其功能片段时，所述片段能够形成功能诱饵；例如其中当在真核宿主细胞中作为Fc融合物表达时，所述片段位于细胞表面上，其中Fc能够与Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)形成复合物。

如本文讨论的，用于在本发明的抗体展示系统中使用的合适真核宿主细胞是毕赤酵母属细胞，例如巴斯德毕赤酵母。

本发明的范围包含在细胞表面上包含诱饵(即例如在氨基末端或羧基末端融合至表面锚或其功能片段的人Fc结构域或其功能片段)的分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，其中例如通过在诱饵Fc和单价抗体片段的重链之间(例如在诱饵中的CH2-CH3多肽和Fc/抗原结合片段之间)结合，该诱饵与Fc/抗原结合片段二聚化。本发明还包括这样的组合物，其包括包含诱饵的真核宿主细胞和例如在液体培养基中分泌的抗体或其抗原结合片段和/或其Fc/抗原结合片段。

本发明提供了例如用于鉴定下述的方法：(i)与目的抗原特异性结合的抗体或其Fc/抗原结合片段，和/或(ii)编码所述抗体或片段的免疫球蛋白重链的多核苷酸和/或编码所述抗体或片段的免疫球蛋白轻链的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该方法包括：

(a)在分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)中共表达诱饵(例如包括包含与细胞表面锚例如SED1连接的CH3、VH-CH1或CH2-CH3 多肽的多肽)和一条或多条重和轻免疫球蛋白链(例如其中此类链中的一条或多条由来自文库来源的多核苷酸编码)，从而使得在诱饵的Fc 部分(例如包含VH-CH1、CH3或CH2-CH3多肽)和包含免疫球蛋白链的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)之间的复合物形成并且位于细胞表面上；例如，其中宿主细胞用编码诱饵和免疫球蛋白链的一种或多种多核苷酸转化；

(b)鉴定表达与抗体的Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)二聚化的诱饵的真核宿主细胞，其对于抗原具有可检测的亲和力(例如可接受的亲和力)(例如与抗原可检测的结合)；例如其中诱饵以及轻和重链免疫球蛋白由真核宿主细胞中的多核苷酸编码；

在本发明的一个实施方案中，分析包含等同于与诱饵复合的那些 (例如由宿主细胞表达的免疫球蛋白)的轻和重链免疫球蛋白可变结构域的非栓系的、分泌的全抗体，以测定它们是否具有可检测的亲和力。

在本发明的一个实施方案中，全抗体从宿主细胞分泌到培养基内。在本发明的一个实施方案中，全抗体从宿主细胞中分离。

在本发明的一个实施方案中，在步骤(b)后，抑制宿主细胞中诱饵的表达，但不抑制全抗体的表达。在本发明的这个实施方案中，宿主细胞仅表达全抗体但不表达以任何显著数量的多肽。在本发明的一个实施方案中，一旦诱饵的表达被抑制，就分析由宿主细胞产生的全抗体，以测定它是否具有可检测的亲和力(例如可接受的亲和力)；和

(c)如果观察到Fc/抗原结合片段的可检测结合，例如其中编码轻和 /或重链免疫球蛋白的一种或多种多核苷酸任选从宿主细胞中分离，则鉴定所述抗体或抗原结合片段或多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，测定多核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，宿主细胞群体表达共同诱饵和共同免疫球蛋白重链以及例如来自文库来源的多种不同轻链免疫球蛋白，其中可以鉴定形成Fc/抗原结合片段的个别轻链免疫球蛋白和与诱饵栓系且显示出抗原结合的全抗体。类似地，在本发明的一个实施方案中，宿主细胞群体表达共同诱饵和共同免疫球蛋白轻链以及例如来自文库来源的多种不同重链免疫球蛋白，其中可以鉴定形成Fc/抗原结合片段的个别重链免疫球蛋白和与诱饵栓系且显示出抗原结合的全抗体。

在本发明的一个实施方案中，具有编码重和轻链免疫球蛋白的多核苷酸的宿主细胞还可以用于在培养中表达分泌的非栓系的抗体(例如全抗体)或其抗原结合片段。例如，在本发明的这个实施方案中，诱饵的表达是任选被抑制的，从而使得不发生以显著数量的诱饵表达。宿主细胞随后在培养基中在由此分泌的、非栓系的抗体(例如全抗体)或其抗原结合片段由宿主细胞表达且分泌的条件下进行培养。非栓系的抗体或其抗原结合片段可以任选从宿主细胞和培养基中分离。在本发明的一个实施方案中，将免疫球蛋白链转移至分开的宿主细胞(例如缺乏抗体展示系统组分)用于重组表达。

本发明提供了例如用于鉴定下述的方法：(i)与目的抗原特异性结合的抗体或其Fc/抗原结合片段，所述目的抗原包含在一个或多个残基上不同于诱饵的第一个CH2-CH3的第二个CH2-CH3，或(ii)编码所述抗体或片段的免疫球蛋白重链的多核苷酸和/或编码所述抗体或片段的免疫球蛋白轻链的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该方法包括：

(a)在分离的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)中共表达包含第一个CH2-CH3多肽的诱饵；连同包含所述第二个CH2-CH3多肽的重免疫球蛋白链(例如其中所述重免疫球蛋白链来自文库来源)和轻免疫球蛋白链(例如VL-CL)一起，从而使得在诱饵的第一个CH2-CH3多肽和Fc/抗原结合片段的第二个CH2-CH3多肽之间的复合物结合并且位于细胞表面上；例如，其中宿主细胞用编码诱饵和免疫球蛋白链的一种或多种多核苷酸转化；

(b)鉴定表达与Fc/抗原结合片段二聚化的诱饵的真核宿主细胞，其对于抗原具有可检测的亲和力(例如可接受的亲和力)；例如其中诱饵以及轻和重链免疫球蛋白由真核宿主细胞中的多核苷酸编码；和任选地，

本发明的抗体展示系统可以用于评估给定糖基化模式对抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力的作用。一般而言，包含改变的糖基化模式的Fc/抗原结合片段的能力可以就与抗原的结合进行评估，这之后可以评估全抗体或其抗原结合片段的亲和力。例如通过使用当链表达时修饰糖基化模式的例如如本文讨论的宿主细胞和/或通过例如如本文讨论的在由此修饰糖基化模式的条件下培养宿主，可以修饰在抗体展示系统中表达的免疫球蛋白链上的糖基化模式。例如，在本发明的一个实施方案中，该方法包括使抗体展示系统与所述抗原接触；其中所述抗体展示系统包含：(a)分离的真核控制糖基化的宿主细胞，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸；和(b)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的包含Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段的诱饵；其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的 Fc/抗原结合片段复合；其中所述重或轻链包含所述糖；测定所述Fc/ 抗原结合片段是否与所述抗原特异性结合；测定包含所述糖的抗体或其抗原结合片段对于抗原的结合亲和力；和比较抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺乏所述糖的其他方面等同的抗体或其抗原结合片段的亲和力；其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺乏该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则该糖测定为增加对于抗原的亲和力，和/或其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺乏该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则该糖测定为降低对于抗原的亲和力。例如，缺乏糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力可以以类似方式在本发明的抗体展示系统或亲和力中进行测定，或它可以通过由已知方法例如ELISA、biacore测定或竞争测定测量亲和力直接进行测定。

诱饵表达可以通过几个可接受的方法中的任何得到抑制。例如，编码诱饵(例如表面锚和/或Fc)的多核苷酸可以通过可调节的启动子进行表达，所述可调节的启动子的表达可以在宿主细胞中得到抑制。在本发明的一个实施方案中，诱饵表达通过RNA干扰、反义RNA、来自宿主细胞的编码诱饵(例如表面锚和/或Fc)的多核苷酸的突变或去除或多核苷酸的遗传突变得到抑制，从而使得宿主细胞不表达功能诱饵。

“可接受的亲和力”指抗体或抗原结合片段对于抗原的亲和力，其为至少10^-3M或更大亲和力(更低数目)，例如10^-3M、10^-4M、10^-5M、 10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M。

在本发明的一个实施方案中，编码抗体或Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)重和轻链的多核苷酸在一个或多个多核苷酸文库中，所述多核苷酸编码轻和/或重链免疫球蛋白(例如一个文库编码轻链和一个文库编码重链)。在这个实施方案中，当观察到宿主细胞表面上的表面锚定的Fc/抗原结合片段与目的抗原结合时，特定目的免疫球蛋白链区别于文库中的其他链。

在本发明的一个实施方案中，在抗体展示系统中表达的重或轻链免疫球蛋白来自文库来源，并且其他免疫球蛋白链是已知的(即来自克隆来源的单链)。在本发明的这个实施方案中，如本文讨论的，抗体展示系统可以用于鉴定新文库链，当与已知链偶联时，所述新文库链形成期望抗体或其抗原结合片段。可替代地，抗体展示系统可以用于分析包含两条已知免疫球蛋白链的抗体或其抗原结合片段的表达和结合特征。

在本发明的一个实施方案中，通过使细胞与荧光标记的抗原(例如生物素标记)一起温育，且通过荧光激活细胞分选(FACS)分选/选择特异性结合抗原的细胞，可以检测表达与抗原结合的通过锚例如SED1与细胞栓系的Fc/抗原结合片段的细胞。

在本发明的一个实施方案中，使用荧光激活细胞分选(FACS)鉴定且分选表达与Fc/抗原结合片段二聚化的诱饵的真核宿主细胞。例如，在本发明的一个实施方案中，用荧光抗原或同样与抗原结合的荧光二抗标记表达与细胞表面上的Fc/抗原结合片段二聚化的诱饵的细胞。荧光标记在FACS分选过程中被检测且用作用于分选的信号。标记的细胞指示表达诱饵/Fc/抗原结合片段/抗原复合物的细胞表面的存在，且收集在一个器皿中，而不表达信号的细胞收集在分开器皿中。相应地，本发明包括包含下述步骤的方法用于测定来自文库的抗体或其抗原结合片段是否与抗原特异性结合：

(1)将下述转化到包含编码诱饵的多核苷酸的真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)内：

(i)一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码轻和重链免疫球蛋白的多核苷酸；

(ii)一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码轻链免疫球蛋白和单一克隆重链免疫球蛋白的多核苷酸；或

(iii)一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码重链免疫球蛋白和单一克隆轻链免疫球蛋白的多核苷酸；

其中所述链能够形成抗体或其抗原结合片段；

(2)在液体培养基中生长转化的细胞；

(3)允许诱饵在细胞表面上表达；

(4)用荧光标记的抗原或与荧光标记的二抗结合的抗原标记细胞；

(5)使用FACS分选且分离荧光标记的细胞一轮；

(6)再生长标记的、分选的细胞；

(7)允许诱饵在细胞中表达；

(8)用荧光标记的抗原或与荧光标记的二抗结合的抗原标记细胞；

(9)使用FACS分选且分离荧光标记的细胞第二轮；

(10)在固体培养基上再生长标记的、分选的细胞，从而使得个别细胞克隆生长成不连续的细胞菌落；

(11)鉴定对于抗原具有亲和力的菌落；

(12)在液体培养基中生长来自鉴定菌落的细胞，且分离含有包含免疫球蛋白轻和重链的非栓系全抗体或其抗原结合片段的上清液；其中，诱饵的表达任选被抑制；

(13)测定来自上清液的非栓系的抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力，且鉴定具有可接受的亲和力(例如通过Biacore分析)的克隆；

(14)测定编码重和轻链免疫球蛋白的鉴定克隆中的多核苷酸的核苷酸序列。

本发明的范围还包括用于鉴定编码抗体的重链和轻链免疫球蛋白的多核苷酸或用于鉴定显示出高稳定性的抗体的方法。此类方法包括下述步骤：

(a)在真核宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)中共表达诱饵和编码重和轻链的多核苷酸，同时对包含所述链的抗体实施变性剂；

在本发明的一个实施方案中，变性剂以本领域普通技术人员从业者将预期至少部分变性抗体且因此抑制其与抗原结合的能力的浓度或量或量级(例如在足够高的温度)存在。例如，可能的变性剂包括尿素(例如2、3、4、5或6 M或更多)、去污剂例如triton X-100(例如1％或更多)、二硫苏糖醇(DTT)(例如250 mM或500 mM或更多)、盐酸胍、光 (例如紫外线或可见光)、极端pH(例如1、2、3、14、13或12)或高于约4℃的温度例如37℃(例如42℃、48℃或50℃)或其任何组合(例如500 mM DTT/6 M尿素)。

(b)鉴定表达与Fc/抗原结合片段(例如单价抗体片段)二聚化的诱饵的真核宿主细胞，所述片段对于抗原具有可检测的亲和力(例如可接受的亲和力)；

在本发明的一个实施方案中，还分析包含等同于与诱饵复合的那些的轻和重链可变区的全抗体，以测定它们是否具有可检测的亲和力。

在本发明的一个实施方案中，全抗体从宿主细胞中分泌。在本发明的一个实施方案中，全抗体从宿主细胞中分离。

在本发明的一个实施方案中，抑制宿主细胞中诱饵的表达，但不抑制全抗体的表达。在本发明的这个实施方案中，宿主细胞仅表达全抗体但不表达以任何显著数量的诱饵。在本发明的一个实施方案中，一旦诱饵的表达被抑制，就分析由宿主细胞产生的全抗体，以测定它是否具有可检测的亲和力(例如可接受的亲和力)。

和

(c)从细胞中鉴定所述抗体或编码重和轻链的多核苷酸，其中一种或多种多核苷酸任选从宿主细胞中分离；其中在变性剂的存在下显示出对于抗原的亲和力的抗体测定为显示出高稳定性。在本发明的一个实施方案中，测定多核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，用于在诱饵中使用的人Fc免疫球蛋白结构域包含下述氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO：1)。

在本发明的一个实施方案中，SED1包含下述氨基酸序列：

VDQFSNSTSASSTDVTSSSSISTSSGSVTITSSEAPESDNGTSTAAPTETSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTALPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTGLPTNGTTSAFPPTTSLPPSNTTTTPPYNPSTDYTTDYTVVTEYTTYCPEPTTFTTNGKTYTVTEPTTLT1TDCPCTIEKPTTTSTTEYTVVTEYTTYCPEPTTFTTNGKTYTVTEPTTLTITDCPCTIEKSEAPESSVPVTESKGTTTKETGVTTKQTTANPSLTVSTVVPVSSSASSHSVVINSNGANVVVPGALGLAGVAMLFL

(SEQ ID NO：2)。

在本发明的一个实施方案中，融合至SED1多肽的人Fc免疫球蛋白与信号序列例如α交配因子信号序列(例如 MRFPSIFTAVLFAASSALA(SEQ ID NO：3))连接。

在本发明的一个实施方案中，包含融合至SED1多肽的人Fc免疫球蛋白结构域的诱饵包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO：4)。Fc免疫球蛋白结构域是有下划线的且连接的以粗体字体。SED1多肽在接头后，并且α交配因子信号肽在Fc前。

具体实施方式

本发明预期例示本发明而不是限制本发明。下文公开的方法和组合物(例如多肽、多核苷酸、质粒、酵母细胞)属于本发明的范围。

实施例1：抗体展示系统的构建和用途

抗体展示诱饵的构建

如下构建表达盒。编码将蛋白质锚定在酵母细胞壁上的细胞表面锚定蛋白质的N末端的多核苷酸与编码人IgG1 Fc区的核酸序列连接，所述细胞表面锚定蛋白质固有地含有附着的糖基磷脂酰肌醇锚定(GPI) 翻译后修饰。我们使用的特异性细胞表面锚定蛋白质是酿酒酵母Sed1 蛋白质，其已通过筛选一组质膜蛋白质的细胞壁进行鉴定，所述组已使用GPI蛋白质预测软件(在国际公开号WO09/111183中描述)进行鉴定。

为了制备含有诱饵盒的质粒，使用含有在编码IgG Fc N末端的序列上游融合的酿酒酵母α交配因子信号序列的核酸序列的EcoRI正向 PCR引物，和编码以编码GGGG接头的序列终止的IgG1 Fc的C末端的SalI反向引物，合成人IgG1 Fc片段的密码子最佳化的序列。包含抗Her2基因序列的质粒用作PCR模板用于扩增EcoRI-α-交配因子信号序列-Fc-GGGG-SalI片段。使用EcoRI和SalI核酸内切酶消化PCR 产物和pGLY3033(在国际公开号WO09/111183中描述)。将编码Fc的 EcoRI-SalI片段在框中与EcoRI-SalI pGLY3033主链连接，以生成质粒 pGLY9008(图2)。这个质粒致使能够递送在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子序列的控制下的Fc-SED1盒。如同亲本质粒，它含有充当基因组中的整合基因座的巴斯德毕赤酵母URA6基因序列和亚砷酸盐抗性基因，以允许在含有亚砷酸钠的培养基上选择。

pGLY3033质粒序列包含核苷酸序列：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGGAATTCacgatggtcgcttggtggtctttgtttctgtacggtcttcaggtcgctgcacctgctttggctACTTCCAGATTGGAGGGATTGCAATCCGAAAACCACAGATTGAGAATGAAGATCACTGAGTTGGACAAGGACTTGGAGGAAGTTACTATGCAGTTGCAGGATGTTGGTCGTTGTGAGCAGAAGTTGATCTCCGAAGAGGATTTGGTCGACCAATTCTCTAACTCTACTTCCGCTTCCTCTACTGACGTTACTTCCTCCTCCTCTATTTCTACTTCCTCCGGTTCCGTTACTATTACTTCCTCTGAGGCTCCAGAATCTGACAACGGTACTTCTACTGCTGCTCCAACTGAAACTTCTACTGAGGCTCCTACTACTGCTATTCCAACTAACGGAACTTCCACAGAGGCTCCAACAACAGCTATCCCTACAAACGGTACATCCACTGAAGCTCCTACTGACACTACTACAGAAGCTCCAACTACTGCTTTGCCTACTAATGGTACATCAACAGAGGCTCCTACAGATACAACAACTGAAGCTCCAACAACTGGATTGCCAACAAACGGTACTACTTCTGCTTTCCCACCAACTACTTCCTTGCCACCATCCAACACTACTACTACTCCACCATACAACCCATCCACTGACTACACTACTGACTACACAGTTGTTACTGAGTACACTACTTACTGTCCAGAGCCAACTACTTTCACAACAAACGGAAAGACTTACACTGTTACTGAGCCTACTACTTTGACTATCACTGACTGTCCATGTACTATCGAGAAGCCAACTACTACTTCCACTACAGAGTATACTGTTGTTACAGAATACACAACATATTGTCCTGAGCCAACAACATTCACTACTAATGGAAAAACATACACAGTTACAGAACCAACTACATTGACAATTACAGATTGTCCTTGTACAATTGAGAAGTCCGAGGCTCCTGAATCTTCTGTTCCAGTTACTGAATCCAAGGGTACTACTACTAAAGAAACTGGTGTTACTACTAAGCAGACTACTGCTAACCCATCCTTGACTGTTTCCACTGTTGTTCCAGTTTCTTCCTCTGCTTCTTCCCACTCCGTTGTTATCAACTCCAACGGTGCTAACGTTGTTGTTCCTGGTGCTTTGGGATTGGCTGGTGTTGCTATGTTGTTCTTGTAATAGGGCCGGCCATTTAAATACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGATCCGCGGCCGCTTACGCGCCGTTCTTCGCTTGGTCTTGTATCTCCTTACACTGTATCTTCCCATTTGCGTTTAGGTGGTTATCAAAAACTAAAAGGAAAAATTTCAGATGTTTATCTCTAAGGTTTTTTCTTTTTACAGTATAACACGTGATGCGTCACGTGGTACTAGATTACGTAAGTTATTTTGGTCCGGTGGGTAAGTGGGTAAGAATAGAAAGCATGAAGGTTTACAAAAACGCAGTCACGAATTATTGCTACTTCGAGCTTGGAACCACCCCAAAGATTATATTGTACTGATGCACTACCTTCTCGATTTTGCTCCTCCAAGAACCTACGAAAAACATTTCTTGAGCCTTTTCAACCTAGACTACACATCAAGTTATTTAAGGTATGTTCCGTTAACATGTAAGAAAAGGAGAGGATAGATCGTTTATGGGGTACGTCGCCTGATTCAAGCGTGACCATTCGAAGAATAGGCCTTCGAAAGCTGAATAAAGCAAATGTCAGTTGCGATTGGTATGCTGACAAATTAGCATAAAAAGCAATAGACTTTCTAACCACCTGTTTTTTTCCTTTTACTTTATTTATATTTTGCCACCGTACTAACAAGTTCAGACAAATTAATTAACACCATGTCAGAAGATCAAAAAAGTGAAAATTCCGTACCTTCTAAGGTTAATATGGTGAATCGCACCGATATACTGACTACGATCAAGTCATTGTCATGGCTTGACTTGATGTTGCCATTTACTATAATTCTCTCCATAATCATTGCAGTAATAATTTCTGTCTATGTGCCTTCTTCCCGTCACACTTTTGACGCTGAAGGTCATCCCAATCTAATGGGAGTGTCCATTCCTTTGACTGTTGGTATGATTGTAATGATGATTCCCCCGATCTGCAAAGTTTCCTGGGAGTCTATTCACAAGTACTTCTACAGGAGCTATATAAGGAAGCAACTAGCCCTCTCGTTATTTTTGAATTGGGTCATCGGTCCTTTGTTGATGACAGCATTGGCGTGGATGGCGCTATTCGATTATAAGGAATACCGTCAAGGCATTATTATGATCGGAGTAGCTAGATGCATTGCCATGGTGCTAATTTGGAATCAGATTGCTGGAGGAGACAATGATCTCTGCGTCGTGCTTGTTATTACAAACTCGCTTTTACAGATGGTATTATATGCACCATTGCAGATATTTTACTGTTATGTTATTTCTCATGACCACCTGAATACTTCAAATAGGGTATTATTCGAAGAGGTTGCAAAGTCTGTCGGAGTTTTTCTCGGCATACCACTGGGAATTGGCATTATCATACGTTTGGGAAGTCTTACCATAGCTGGTAAAAGTAATTATGAAAAATACATTTTGAGATTTATTTCTCCATGGGCAATGATCGGATTTCATTACACTTTATTTGTTATTTTTATTAGTAGAGGTTATCAATTTATCCACGAAATTGGTTCTGCAATATTGTGCTTTGTCCCATTGGTGCTTTACTTCTTTATTGCATGGTTTTTGACCTTCGCATTAATGAGGTACTTATCAATATCTAGGAGTGATACACAAAGAGAATGTAGCTGTGACCAAGAACTACTTTTAAAGAGGGTCTGGGGAAGAAAGTCTTGTGAAGCTAGCTTTTCTATTACGATGACGCAATGTTTCACTATGGCTTCAAATAATTTTGAACTATCCCTGGCAATTGCTATTTCCTTATATGGTAACAATAGCAAGCAAGCAATAGCTGCAACATTTGGGCCGTTGCTAGAAGTTCCAATTTTATTGATTTTGGCAATAGTCGCGAGAATCCTTAAACCATATTATATATGGAACAATAGAAATTAATTAACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGCGGCCTAAGGCGCGCCAGGCCATAATGGCCCAAATGCAAGAGGACATTAGAAATGTGTTTGGTAAGAACATGAAGCCGGAGGCATACAAACGATTCACAGATTTGAAGGAGGAAAACAAACTGCATCCACCGGAAGTGCCAGCAGCCGTGTATGCCAACCTTGCTCTCAAAGGCATTCCTACGGATCTGAGTGGGAAATATCTGAGATTCACAGACCCACTATTGGAACAGTACCAAACCTAGTTTGGCCGATCCATGATTATGTAATGCATATAGTTTTTGTCGATGCTCACCCGTTTCGAGTCTGTCTCGTATCGTCTTACGTATAAGTTCAAGCATGTTTACCAGGTCTGTTAGAAACTCCTTTGTGAGGGCAGGACCTATTCGTCTCGGTCCCGTTGTTTCTAAGAGACTGTACAGCCAAGCGCAGAATGGTGGCATTAACCATAAGAGGATTCTGATCGGACTTGGTCTATTGGCTATTGGAACCACCCTTTACGGGACAACCAACCCTACCAAGACTCCTATTGCATTTGTGGAACCAGCCACGGAAAGAGCGTTTAAGGACGGAGACGTCTCTGTGATTTTTGTTCTCGGAGGTCCAGGAGCTGGAAAAGGTACCCAATGTGCCAAACTAGTGAGTAATTACGGATTTGTTCACCTGTCAGCTGGAGACTTGTTACGTGCAGAACAGAAGAGGGAGGGGTCTAAGTATGGAGAGATGATTTCCCAGTATATCAGAGATGGACTGATAGTACCTCAAGAGGTCACCATTGCGCTCTTGGAGCAGGCCATGAAGGAAAACTTCGAGAAAGGGAAGACACGGTTCTTGATTGATGGATTCCCTCGTAAGATGGACCAGGCCAAAACTTTTGAGGAAAAAGTCGCAAAGTCCAAGGTGACACTTTTCTTTGATTGTCCCGAATCAGTGCTCCTTGAGAGATTACTTAAAAGAGGACAGACAAGCGGAAGAGAGGATGATAATGCGGAGAGTATCAAAAAAAGATTCAAAACATTCGTGGAAACTTCGATGCCTGTGGTGGACTATTTCGGGAAGCAAGGACGCGTTTTGAAGGTATCTTGTGACCACCCTGTGGATCAAGTGTATTCACAGGTTGTGTCGGTGCTAAAAGAGAAGGGGATCTTTGCCGATAACGAGACGGAGAATAAATAAACATTGTAATAAGATTTAGACTGTGAATGTTCTATGTAATATTTTTCGAGATACTGTATCTATCTGGTGTACCGTATCACTCTGGACTTGCAAACTCATTGATTACTTGTGCAATGGGCAAGAAGGATAGCTCTAGAAAGAAGAAGAAAAAGGAGCCGCCTGAAGAGCTGGATCTTTCCGAGGTTGTTCCAACTTTTGGTTATGAGGAATTTCATGTTGAGCAAGAGGAGAATCCGGTCGATCAAGACGAACTTGACGGCCATAATGGCCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

(SEQ ID NO：5)。

pGLY9008质粒序列包含核苷酸序列：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGGAATTCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGACAAGACACATACTTGTCCACCATGTCCAGCTCCAGAATTGTTGGGTGGTCCATCCGTTTTCTTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACTTTGATGATCTCCAGAACTCCAGAGGTTACATGTGTTGTTGTTGACGTTTCTCACGAGGACCCAGAGGTTAAGTTCAACTGGTACGTTGACGGTGTTGAAGTTCACAACGCTAAGACTAAGCCAAGAGAAGAGCAGTACAACTCCACTTACAGAGTTGTTTCCGTTTTGACTGTTTTGCACCAGGACTGGTTGAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAGGTTTCCAACAAGGCTTTGCCAGCTCCAATCGAAAAGACTATCTCCAAGGCTAAGGGTCAACCAAGAGAGCCACAGGTTTACACTTTGCCACCATCCAGAGAAGAGATGACTAAGAACCAGGTTTCCTTGACTTGTTTGGTTAAAGGATTCTACCCATCCGACATTGCTGTTGAGTGGGAATCTAACGGTCAACCAGAGAACAACTACAAGACTACTCCACCAGTTTTGGATTCTGATGGTTCCTTCTTCTTGTACTCCAAGTTGACTGTTGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGTAACGTTTTCTCCTGTTCCGTTATGCATGAGGCTTTGCACAACCACTACACTCAAAAGTCCTTGTCTTTGTCCCCTGGTGGTGGTGGTGTCGACCAATTCTCTAACTCTACTTCCGCTTCCTCTACTGACGTTACTTCCTCCTCCTCTATTTCTACTTCCTCCGGTTCCGTTACTATTACTTCCTCTGAGGCTCCAGAATCTGACAACGGTACTTCTACTGCTGCTCCAACTGAAACTTCTACTGAGGCTCCTACTACTGCTATTCCAACTAACGGAACTTCCACAGAGGCTCCAACAACAGCTATCCCTACAAACGGTACATCCACTGAAGCTCCTACTGACACTACTACAGAAGCTCCAACTACTGCTTTGCCTACTAATGGTACATCAACAGAGGCTCCTACAGATACAACAACTGAAGCTCCAACAACTGGATTGCCAACAAACGGTACTACTTCTGCTTTCCCACCAACTACTTCCTTGCCACCATCCAACACTACTACTACTCCACCATACAACCCATCCACTGACTACACTACTGACTACACAGTTGTTACTGAGTACACTACTTACTGTCCAGAGCCAACTACTTTCACAACAAACGGAAAGACTTACACTGTTACTGAGCCTACTACTTTGACTATCACTGACTGTCCATGTACTATCGAGAAGCCAACTACTACTTCCACTACAGAGTATACTGTTGTTACAGAATACACAACATATTGTCCTGAGCCAACAACATTCACTACTAATGGAAAAACATACACAGTTACAGAACCAACTACATTGACAATTACAGATTGTCCTTGTACAATTGAGAAGTCCGAGGCTCCTGAATCTTCTGTTCCAGTTACTGAATCCAAGGGTACTACTACTAAAGAAACTGGTGTTACTACTAAGCAGACTACTGCTAACCCATCCTTGACTGTTTCCACTGTTGTTCCAGTTTCTTCCTCTGCTTCTTCCCACTCCGTTGTTATCAACTCCAACGGTGCTAACGTTGTTGTTCCTGGTGCTTTGGGATTGGCTGGTGTTGCTATGTTGTTCTTGTAATAGGGCCGGCCATTTAAATACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGATCCGCGGCCGCTTACGCGCCGTTCTTCGCTTGGTCTTGTATCTCCTTACACTGTATCTTCCCATTTGCGTTTAGGTGGTTATCAAAAACTAAAAGGAAAAATTTCAGATGTTTATCTCTAAGGTTTTTTCTTTTTACAGTATAACACGTGATGCGTCACGTGGTACTAGATTACGTAAGTTATTTTGGTCCGGTGGGTAAGTGGGTAAGAATAGAAAGCATGAAGGTTTACAAAAACGCAGTCACGAATTATTGCTACTTCGAGCTTGGAACCACCCCAAAGATTATATTGTACTGATGCACTACCTTCTCGATTTTGCTCCTCCAAGAACCTACGAAAAACATTTCTTGAGCCTTTTCAACCTAGACTACACATCAAGTTATTTAAGGTATGTTCCGTTAACATGTAAGAAAAGGAGAGGATAGATCGTTTATGGGGTACGTCGCCTGATTCAAGCGTGACCATTCGAAGAATAGGCCTTCGAAAGCTGAATAAAGCAAATGTCAGTTGCGATTGGTATGCTGACAAATTAGCATAAAAAGCAATAGACTTTCTAACCACCTGTTTTTTTCCTTTTACTTTATTTATATTTTGCCACCGTACTAACAAGTTCAGACAAATTAATTAACACCATGTCAGAAGATCAAAAAAGTGAAAATTCCGTACCTTCTAAGGTTAATATGGTGAATCGCACCGATATACTGACTACGATCAAGTCATTGTCATGGCTTGACTTGATGTTGCCATTTACTATAATTCTCTCCATAATCATTGCAGTAATAATTTCTGTCTATGTGCCTTCTTCCCGTCACACTTTTGACGCTGAAGGTCATCCCAATCTAATGGGAGTGTCCATTCCTTTGACTGTTGGTATGATTGTAATGATGATTCCCCCGATCTGCAAAGTTTCCTGGGAGTCTATTCACAAGTACTTCTACAGGAGCTATATAAGGAAGCAACTAGCCCTCTCGTTATTTTTGAATTGGGTCATCGGTCCTTTGTTGATGACAGCATTGGCGTGGATGGCGCTATTCGATTATAAGGAATACCGTCAAGGCATTATTATGATCGGAGTAGCTAGATGCATTGCCATGGTGCTAATTTGGAATCAGATTGCTGGAGGAGACAATGATCTCTGCGTCGTGCTTGTTATTACAAACTCGCTTTTACAGATGGTATTATATGCACCATTGCAGATATTTTACTGTTATGTTATTTCTCATGACCACCTGAATACTTCAAATAGGGTATTATTCGAAGAGGTTGCAAAGTCTGTCGGAGTTTTTCTCGGCATACCACTGGGAATTGGCATTATCATACGTTTGGGAAGTCTTACCATAGCTGGTAAAAGTAATTATGAAAAATACATTTTGAGATTTATTTCTCCATGGGCAATGATCGGATTTCATTACACTTTATTTGTTATTTTTATTAGTAGAGGTTATCAATTTATCCACGAAATTGGTTCTGCAATATTGTGCTTTGTCCCATTGGTGCTTTACTTCTTTATTGCATGGTTTTTGACCTTCGCATTAATGAGGTACTTATCAATATCTAGGAGTGATACACAAAGAGAATGTAGCTGTGACCAAGAACTACTTTTAAAGAGGGTCTGGGGAAGAAAGTCTTGTGAAGCTAGCTTTTCTATTACGATGACGCAATGTTTCACTATGGCTTCAAATAATTTTGAACTATCCCTGGCAATTGCTATTTCCTTATATGGTAACAATAGCAAGCAAGCAATAGCTGCAACATTTGGGCCGTTGCTAGAAGTTCCAATTTTATTGATTTTGGCAATAGTCGCGAGAATCCTTAAACCATATTATATATGGAACAATAGAAATTAATTAACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGCGGCCTAAGGCGCGCCAGGCCATAATGGCCCAAATGCAAGAGGACATTAGAAATGTGTTTGGTAAGAACATGAAGCCGGAGGCATACAAACGATTCACAGATTTGAAGGAGGAAAACAAACTGCATCCACCGGAAGTGCCAGCAGCCGTGTATGCCAACCTTGCTCTCAAAGGCATTCCTACGGATCTGAGTGGGAAATATCTGAGATTCACAGACCCACTATTGGAACAGTACCAAACCTAGTTTGGCCGATCCATGATTATGTAATGCATATAGTTTTTGTCGATGCTCACCCGTTTCGAGTCTGTCTCGTATCGTCTTACGTATAAGTTCAAGCATGTTTACCAGGTCTGTTAGAAACTCCTTTGTGAGGGCAGGACCTATTCGTCTCGGTCCCGTTGTTTCTAAGAGACTGTACAGCCAAGCGCAGAATGGTGGCATTAACCATAAGAGGATTCTGATCGGACTTGGTCTATTGGCTATTGGAACCACCCTTTACGGGACAACCAACCCTACCAAGACTCCTATTGCATTTGTGGAACCAGCCACGGAAAGAGCGTTTAAGGACGGAGACGTCTCTGTGATTTTTGTTCTCGGAGGTCCAGGAGCTGGAAAAGGTACCCAATGTGCCAAACTAGTGAGTAATTACGGATTTGTTCACCTGTCAGCTGGAGACTTGTTACGTGCAGAACAGAAGAGGGAGGGGTCTAAGTATGGAGAGATGATTTCCCAGTATATCAGAGATGGACTGATAGTACCTCAAGAGGTCACCATTGCGCTCTTGGAGCAGGCCATGAAGGAAAACTTCGAGAAAGGGAAGACACGGTTCTTGATTGATGGATTCCCTCGTAAGATGGACCAGGCCAAAACTTTTGAGGAAAAAGTCGCAAAGTCCAAGGTGACACTTTTCTTTGATTGTCCCGAATCAGTGCTCCTTGAGAGATTACTTAAAAGAGGACAGACAAGCGGAAGAGAGGATGATAATGCGGAGAGTATCAAAAAAAGATTCAAAACATTCGTGGAAACTTCGATGCCTGTGGTGGACTATTTCGGGAAGCAAGGACGCGTTTTGAAGGTATCTTGTGACCACCCTGTGGATCAAGTGTATTCACAGGTTGTGTCGGTGCTAAAAGAGAAGGGGATCTTTGCCGATAACGAGACGGAGAATAAATAAACATTGTAATAAGATTTAGACTGTGAATGTTCTATGTAATATTTTTCGAGATACTGTATCTATCTGGTGTACCGTATCACTCTGGACTTGCAAACTCATTGATTACTTGTGCAATGGGCAAGAAGGATAGCTCTAGAAAGAAGAAGAAAAAGGAGCCGCCTGAAGAGCTGGATCTTTCCGAGGTTGTTCCAACTTTTGGTTATGAGGAATTTCATGTTGAGCAAGAGGAGAATCCGGTCGATCAAGACGAACTTGACGGCCATAATGGCCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGT C

(SEQ ID NO：6)。

为了测试这个构型用于在酵母细胞壁上展示单价抗体片段(包含人 IgGs)(1个重链免疫球蛋白和1个轻链免疫球蛋白(H+L))的能力，将 pGLY9008引入GFI 5.0菌株内，所述GFI 5.0菌株先前已选择作为人抗Her2或抗PCSK9 IgGs的表达宿主。包括空菌株作为对照(表1)。

表1.酵母菌株

菌株	mAb
		YGLY8316	空
YGLY18483	抗PCSK9(AX189)
		YGLY18281	抗PCSK9(AX132)
YGLY14755	抗PCSK9(1DG)
		YGLY13979	抗Her2
YGLY14836	抗Her2

*这些巴斯德毕赤酵母菌株构成本发明的部分。

表1中糖改造的巴斯德毕赤酵母单克隆抗体生产菌株在50 mL BMGY培养基中生长，直至在600 nm处的培养物光密度是2时。将细胞用1 M山梨糖醇洗涤三次，并且重悬浮于1 mL 1 M山梨糖醇中。将约1-2微克SpeI线性化的pGLY9008与这些感受态细胞混合。使用对于核酸电穿孔到巴斯德毕赤酵母内特异性的制造商程序，用BioRad电穿孔仪执行转化。将1 mL回收培养基加入细胞中，所述细胞随后在具有50μg/mL亚砷酸盐的酵母-大豆胨-右旋糖(YSD)培养基上铺平板。

Fc-单价抗体片段(H+L)展示酵母的生长和诱导。使用在96深孔板中的600μLBMGY或在250 mL摇瓶中的50 mL BMGY接种表达人 IgGs和Fc-SED1诱饵表达盒的糖改造的酵母两天。通过离心收集细胞且弃去上清液。根据国际申请公开号WO2007/061631中所述的方法，通过在具有PMTi抑制剂的300μL或25 mL BMMY中温育过夜诱导细胞。根据制造商的方案和蛋白A捕获SDS-PAGE分析，在诱导后，使用κELISA就抗体表达测定培养上清液。图3a和b中的数据分别描述这两个测定的结果。如图3中概述的，发现含有Fc-Sed1蛋白质诱饵的培养上清液含有相似水平的分泌的全抗体分子(2个重链免疫球蛋白和2个轻链免疫球蛋白((H2+L2))，与其亲本菌株(不含Fc-Sed1p)相比较。这指示Fc-Sed1p诱饵的存在不干扰酵母分泌全IgG抗体(H2+L2) 的能力。

为了测定使用这种方法的表面展示抗体的效率，将细胞用检测人抗体分子的轻链的APC 635标记的小鼠抗人κ进行标记，并且通过流式细胞术进行处理。简言之，在生长至在600 nm处的光密度2后，将每种培养物通过离心形成团块且在100μL PBS中洗涤。细胞在室温 (RT)在含有荧光标记(APC635)的小鼠抗人κ轻链的100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育30分钟，并且在100μL PBS中洗涤。在流式细胞仪中分析前，一百微升PBS用于重悬浮团块。

使用共表达Fc-Sed1p诱饵和抗Her2、或Fc-Sed1p诱饵和抗PCSK9 的细胞进行流式细胞术分析。制备其中仅表达Fc-Sed1p诱饵的空菌株或表达不含Fc-Sed1p的全长抗体(H2+L2)的菌株的对照。发现共表达抗 Her2或抗PCSK9与Fc-Sed1p诱饵的菌株展示显著水平的抗κ结合，而缺乏Fc-Sed1p诱饵的菌株显示本底信号水平。在图4a-c中，比较来自这些实验的荧光强度。图显示在抗Her2展示细胞和抗PCSK9展示细胞与不含有Fc-Sed1p诱饵的亲本菌株之间的这些不同荧光强度。值得一提的是抗Her2展示细胞显示比抗PCSK9展示细胞更高的荧光强度。这些结果与关于这两种抗体的表达水平已知的那种一致。

为了确定这种方法用于分离抗体混合物的效用，如下执行展示 Fc-Sed1p抗PCSK9单价抗体片段(H+L)(菌株YGLY21610)和Fc-Sed1p 抗Her2(H+L)(菌株YGLY21614)的细胞混合物的荧光激活细胞分选 (FACS)。将展示抗PCSK9(H+L)的细胞和展示抗Her2(H+L)的细胞以下述比混合在一起：1∶0；0∶1；和1∶100。细胞用山羊抗人Fc Alexa 488 和100 nM生物素化的PCSK9和APC 635标记的链霉抗生物素蛋白进行双重标记。图5显示Fc-Sed1p/抗PCSK9(H+L)能够结合生物素化的 PCSK9，而Fc-Sed1p/抗Her2(H+L)则不能。两种菌株均与抗人FcAlexa 488抗体反应。当来自两个培养物的细胞以Fc-Sed1p抗PCSK9展示细胞(圆圈内的)与Fc-Sed1p抗Her2展示细胞的1∶100比混合时，两个分开的细胞群体是可见的。这个混合物中的PCSK9结合剂数目与1∶100 比一致，从而使得进一步支持这种方法在筛选具有所需抗原结合的抗体中的坚固性。

上述实验证实Fc-Sed1p抗体展示系统可以用于展示IgG单价抗体片段(H+L)，其保留其相应全抗体分子(H2+L2)二聚体的特异性抗原结合。下一个目标是使用这种方法分离且富集可以与任何目的抗原结合的新型抗体分子。为此，我们利用两个新近构建的文库。文库一通过改变抗PCSK9抗体AX189的重链序列同时维持(marinating)原始轻链序列进行构建。这个文库具有约2500个独特序列的多样性，并且将被称为″BP550″。第二个文库通过维持原始AX189重链序列且改变轻链序列生成。这个文库含有约4000个独特序列，并且将被称为″BP551″。

BP550和BP551如先前描述的转化到菌株YGLY21605(携带表达 Fc-Sed1p的pGLY9008的空5.0菌株)内，并且在含有300微克/毫升博莱霉素(zeocin)的YSD上铺平板。对于每次转化获得大约50,000个菌落，从而提供文库中所有可能序列的丰富统计覆盖。从固体培养基刮取转化两个文库获得的菌落，并且分开接种到含有50 mL YSG液体培养基与300μ/mL博莱霉素的250 mL摇瓶中。通过将1 mL每种培养物再接种到新鲜选择性液体培养基(YSG+博莱霉素)内，将培养物传代 3次。允许第三次传代在YSG培养基中生长至饱和，并且根据国际专利公开号WO2007/061631中所述的方法，在具有PMTi抑制剂(PMTi4：L000001772；以1微克/ml的浓度)的25 mL BMMY中诱导过夜。包括菌株YGLY21610(Fc-Sed1p抗PCSK9(AX189))和YGLY21614(Fc-Sed1p 抗Her2)分别作为阳性和阴性对照。

在24小时诱导后，四个培养物各自生长至在600 nm处的光密度2。将团块通过离心收集且用100μL 1X PBS洗涤，随后在含有抗κAlexa 488和100nM生物素-PCSK9的100μLPBS中标记。混合物在室温温育30分钟，随后用100μL PBS溶液洗涤。细胞在室温与APC 635标记的链霉抗生物素蛋白一起在100μL PBS中温育10分钟，且在 PBS中洗涤2X且提交用于FACS。

使用由YGLY21610和YGLY21614作为边界生成的流式细胞仪点图来门控潜在结合剂，在FACS分选器中分选来自两个文库群体BP550 和BP551的100,000个细胞的克隆，并且收集在5 mL YSG培养基中。通过在室温振荡5天允许回收培养物。分选第1轮库在50 mLYSG液体培养基中再接种，并且重复相同过程以诱导且标记培养物。对第1 轮库进行另一轮分选(第2轮)，并且如上收集细胞且诱导。为了获得单一菌落，在固体培养基上铺平板两个两轮分选群体(BP550和BP551) 的1000个细胞，并且通过κELISA和PCSK9亲和ELISA分选，以分别测定蛋白质滴度和对于PCSK9的结合亲和力。另外，执行酵母菌落 PCR扩增反应，以扩增第2轮克隆的重链和轻链基因，其提交用于DNA 序列分析。

如图6中所示，使用生物素化的PCSK9抗原的两轮分选导致特异性PCSK9结合剂的显著富集。PCSK9 ELISA比较对于BP550和BP551 预分选的文库与第2轮分选的库(图7)。来自两个文库的第2轮分选的库含有超过预分选的群体的高百分比的结合剂。DNA测序证实对于新抗PCSK9结合序列的富集。

本发明在范围中并不受本文描述的具体实施方案限制。事实上，本发明的范围包括本文具体阐述的实施方案和本文未具体阐述的其他实施方案；本文具体阐述的实施方案不一定预期是详尽的。除了本文描述那些外的本发明的多个修饰根据前述说明书对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修饰预期属于权利要求的范围。

本申请自始至终引用专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，其公开内容为了所有目的整体引入本文作为参考。

Claims

1.一种用于测定抗体或其抗原结合片段是否与抗原特异性结合的方法，其包括使抗体展示系统与所述抗原接触；其中所述抗体展示系统包含：

(a)分离的真核宿主细胞，其包含编码融合至轻链恒定结构域的所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链可变区的多核苷酸；编码包含融合至表面锚定多肽的重Fc免疫球蛋白结构域的诱饵的多核苷酸；和编码融合至Fc的所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白重链可变区的多核苷酸；其中在表达每种所述多核苷酸编码的多肽的条件下培养所述宿主细胞；

(b)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段的诱饵；和

(c)与宿主细胞表面上的所述诱饵的Fc部分复合的，包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段；

并且测定所述Fc/抗原结合片段是否与所述抗原特异性结合；

其中所述编码诱饵的多核苷酸与可调节的启动子可操作地结合，所述可调节的启动子可被抑制以抑制诱饵表达；

其中如果与宿主细胞表面上的所述诱饵的Fc部分复合的，包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段与所述抗原特异性结合，则所述抗体或抗原结合片段被测定为特异性结合所述抗原。

2.一种用于鉴定下述的方法：

(i)与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段；或

(ii)编码所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白重链的多核苷酸和/或编码所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链的多核苷酸；

其包括使抗体展示系统与所述抗原接触，其中所述抗体展示系统包含：

(c)与宿主细胞表面上的诱饵的Fc部分复合的，包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段；

并且测定所述Fc/抗原结合片段是否与所述抗原特异性结合；

其中如果观察到与宿主细胞表面上的所述诱饵的Fc部分复合的，包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段与所述抗原的特异性结合，则鉴定所述抗体或抗原结合片段或多核苷酸。

3.权利要求2的方法，其还包括分离所鉴定的多核苷酸。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其还包括抑制所述诱饵的表达，随后测定所述鉴定的抗体或其抗原结合片段对于所述抗原的亲和力。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其还包括重组表达由所述多核苷酸编码的免疫球蛋白链，和任选分离包含所述免疫球蛋白的抗体或其抗原结合片段，和任选产生包含组合所述抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体的药物制剂。

6.一种用于制备包含下述的抗体展示系统的方法：

(a)分离的真核宿主细胞；

(b)包含融合至表面锚定多肽的人Fc免疫球蛋白结构域的诱饵；

(c)编码融合至轻链恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；

(d)编码融合至Fc的免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸；

所述方法包括将编码所述诱饵的多核苷酸，编码免疫球蛋白轻链的所述一种或多种多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链的所述一种或多种多核苷酸引入所述真核宿主细胞内；

其中所述编码诱饵的多核苷酸与可调节的启动子可操作地结合，所述可调节的启动子可被抑制以抑制诱饵表达。

7.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码融合至轻链恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；和编码融合至Fc的免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸引入包含诱饵的分离的真核宿主细胞内，所述诱饵包括融合至表面锚定多肽或其功能片段的人Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段；和在由此表达编码免疫球蛋白链的多核苷酸且由所述链形成抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞；其中所述诱饵与可调节的启动子可操作地结合，并且当所述免疫球蛋白链表达时，诱饵表达被抑制。

8.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链表达的条件下在生长培养基中培养分离的真核宿主细胞；其中所述真核宿主细胞包含：

(i)编码融合至轻链恒定结构域的所述免疫球蛋白轻链的可变区的多核苷酸；和编码融合至Fc的所述抗体或抗原结合片段的所述免疫球蛋白重链的可变区的多核苷酸；和

(ii)包含融合至所述真核宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段的诱饵；

其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段复合；并且其中所述编码诱饵的多核苷酸与可调节的启动子可操作地结合，所述可调节的启动子可被抑制以任选地抑制诱饵的表达；其中所述抗体或抗原结合片段任选由所述真核宿主细胞分泌；所述方法任选包括从所述真核宿主细胞和培养基中分离所述抗体或抗原结合片段。

9.一种用于测定糖对与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段的作用的方法，其包括使抗体展示系统与所述抗原接触；其中所述抗体展示系统包含：

(a)分离的真核控制糖基化的宿主细胞，其包含编码融合至轻链恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变区的多核苷酸；和编码融合至Fc的免疫球蛋白重链可变区的多核苷酸；和

(b)包含融合至所述宿主细胞表面上的表面锚定多肽或其功能片段的Fc免疫球蛋白结构域或其功能片段的诱饵；

其中编码所述诱饵的多核苷酸与可调节的启动子可操作地结合，所述可调节的启动子可被抑制以抑制诱饵表达；

其中所述诱饵的Fc与宿主细胞表面上包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的Fc/抗原结合片段复合；其中所述重或轻链包含所述糖；

测定所述Fc/抗原结合片段是否与所述抗原特异性结合；

测定包含所述糖的抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力；和

比较所述抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺乏所述糖的其他方面等同的抗体或其抗原结合片段的亲和力；

其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺乏所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则所述糖测定为增加对于抗原的亲和力，和/或其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺乏所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则所述糖测定为降低对于抗原的亲和力。