CN107406517A

CN107406517A - 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car)

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Publication number: CN107406517A
Application number: CN201680013844.7A
Authority: CN
Inventors: M.普莱; L.梅卡欧伊; P.阿姆罗利亚; S.高拉希安; A.克雷默; G.程
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: ES2732067T3; CN107406517B; FR25C1040I1; DK3265490T3; EP3265490A1; GB201503742D0; US20200140544A1; PT3265490T; TR201909647T4; US20230220077A1; US20180044417A1; CA2978381A1; WO2016139487A1; US11578126B2; HUE044298T2; US10457730B2; AU2016227498B2; PL3265490T3; JP6574848B2; AU2016227498A1

Abstract

提供了包含CD19结合域的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19结合域包含a)重链可变区(VH)，所述重链可变区具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：CDR1–GYAFSSS(SEQ ID No.1)；CDR2–YPGDED(SEQ ID No.2)CDR3–SLLYGDYLDY(SEQ ID No.3)；和b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有含有以下序列的CDR：CDR1–SASSSVSYMH(SEQ ID No.4)；CDR2–DTSKLAS(SEQ ID No.5)CDR3–QQWNINPLT(SEQ ID No.6)。还提供了包含此类CAR的细胞，和此类细胞在治疗癌症，特别地B细胞恶性肿瘤中的用途。

Description

包含CD19结合域的嵌合抗原受体(CAR)

发明领域

本发明涉及结合B淋巴细胞抗原CD19(分化簇19)的嵌合抗原受体(CAR)。表达此类CAR的T细胞可用于治疗癌性疾病，如B细胞白血病和淋巴瘤。

发明背景

嵌合抗原受体

传统上，抗原特异性T细胞是通过天然对靶抗原特异性的外周血T细胞的选择性扩增产生的。然而，选择和扩增对大多数癌症抗原特异性的大量T细胞是困难且常常是不可能的。使用整合载体的基因治疗为我们提供了这个问题的解决方法：嵌合抗原受体(CAR)的转基因表达允许通过外周血T细胞的混合群体(bulk population)的离体病毒载体转导容易地产生对任何表面抗原特异性的大量T细胞。

这些分子的最常见形式是源自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔物和跨膜域融合到信号传导胞内域(endodomain)的融合物。此类分子响应由scFv对其关联靶物的识别而导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的几种CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前在用于治疗各种癌症的临床试验中。然而，迄今为止，CAR疗法的主要临床探索和潜在应用是B细胞恶性的治疗。

针对CD19的CAR

CD19是一种B细胞抗原，其在B细胞分化中非常早地表达，并且仅在末端B细胞分化为浆细胞时丧失。因此，除了多发性骨髓瘤之外，所有B细胞恶性肿瘤上都表达CD19。它不在其它造血群体或非造血细胞上表达，因此靶向该抗原不应导致对骨髓或非造血器官的毒性。在治疗淋巴样恶性肿瘤时，正常B细胞区室的损失被认为是可接受的毒性，因为虽然有效的CD19 CAR T细胞疗法将导致B细胞不发育(aplasia)，因此可以用合并的免疫球蛋白治疗随后的低丙种球蛋白血(hypogammaglobulinaemia)。

因此，CD19是有吸引力的CAR靶物。到目前为止，CAR领域的主要临床焦点是靶向难治性B细胞癌上的CD19的研究，如表1中汇总。

已经在不同的中心针对CD19测试了CAR的不同设计，如表1中概述：

表1：靶向CD19的CAR经验的汇总

大多数研究测试了基于源自杂交瘤fmc63的scFv的CD19 CAR。最有希望的是治疗急性成淋巴细胞性白血病(ALL,Acute Lymphoblastic Leukaemia)。

针对CD19的CAR的临床经验

CD19指导性CAR疗法在ALL中表现最为有效。Memorial Sloane Kettering(Brentjens,et al.(2013)Leukemia.Sci.Transl.Med.5,177ra38)和宾夕法尼亚大学的团队在2013年春季发表了ALL的第一项研究。最近已经进行了后一研究的更新报告(Maude etal.(2014)N.Engl.J.Med.371,1507–1517)。这里，治疗了25岁龄下的25名患者和超过此年龄的5名患者。90％在一个月时实现了完全响应，并且28例可评估病例的22例实现了MRD阴性状态，并且6个月无事件存活率为67％。研究后15例患者不接受进一步疗法。

Brentjens等人(如上)在成人背景中，用逆转录病毒转导以表达CD19 CAR的自体T细胞治疗5例ALL患者(2例难治性复发性患者、2例MRD阳性疾病患者、和1例MRD阴性患者)，所述CD19 CAR掺入源自SJ25C1杂交瘤的scFv和CD28共刺激域。所有这些都实现了深刻的分子缓解，使这些患者中的4名能够接受异基因(allogeneic)SCT。这排除了响应持续性的评估，但是CAR T细胞仅在输注后在血液或骨髓中可检测3-8周。未移植的患者在90天时复发CD19+疾病。随后，Davila et al.((2014).Sci.Transl.Med.6,224ra25)更新了此分组。16名成年患者中的14名患者在CAR T细胞输注点时具有可检测的疾病，尽管采用挽救化疗和环磷酰胺调理。16例中的14例实现完全缓解，有或没有计数恢复，包括9名在挽救化疗后可检测到残留疾病的形态学证据的患者中的7名。16名患者中的12名实现MRD阴性，并且这允许7名在发表时经历异基因移植。响应在一些患者中可持续，其中8名非移植患者中的4名在长达24个月的随访时持续形态学缓解，尽管该分组的存活曲线尚不稳定。

一项在主要为ALL的儿科和年轻成人患者分组中的最近发表的研究提供了对其结果的第一个意向治疗分析。这可以有助于消除在排除未接受预期剂量的CAR T细胞的患者中固有的偏倚(Lee et al.(2014)Lancet.doi:10.1016/S0140-6736(14)61403-3)。用含有CD28域的第二代CAR治疗21名患者。除2名患者外，所有患者均接受了预期的T细胞剂量，突出显示了将该治疗递送给具有难治性或多复发性ALL的患者的可行性。该研究显示以下功效：67％达到完全缓解，并且60％的ALL患者实现MRD阴性状态。

CD19 CAR疗法的免疫毒性

细胞因子释放综合征(CRS)涵盖一系列炎症症状，从轻度变化至多器官耗竭伴低血压和呼吸耗竭。在用CD19 CAR T细胞治疗的患者中通常发生一定程度的CRS。在最近分组中治疗的约30％(21/73)患者显示一定程度的CRS(Davilia et al(2014)同上；Lee et al(2014)同上；Kochenderfer(2014)J.Clin.Oncol.Off.J.Am.Soc.Clin.Oncol..doi:10.1200/JCO.2014.56.2025)。在用识别CD19和CD3两者的双特异性重组单链抗体博纳吐单抗(blinatumomab)治疗的患者中也观察到CRS。CRS通常在CAR T细胞输注后5-21天出现。

CRS可以是危及生命的，并且需要在重症监护背景中治疗。CRS与升高的血清细胞因子水平相关。最显著升高的细胞因子是IL-6、IL-10和干扰素γ(IFNγ)。严重CRS的临床表现(发热、肝脾大、凝血病和高铁蛋白血症)类似于例如在T细胞中先天性缺陷患者中发现的巨噬细胞活化综合征(MAS)。这表明涉及共同的免疫病理过程。目前尚不清楚哪种细胞类型(CAR T细胞、频死肿瘤细胞或局部活化的巨噬细胞)负责关键细胞因子，特别是IL-6的产生。然而，MAS中的一种关键的起始因素是释放大量的干扰素-γ(López-Alvarez et al.(2009).Clin.Vaccine Immunol.CVI 16,142–145)。

神经毒性

研究所间的CD19 CAR研究中的许多患者形成了短暂的神经毒性，具有一系列从失语至迟钝、谵妄和癫痫发作的严重程度(Davilia et al(2014)同上)。这似乎限于ALL患者，并且在博纳吐单抗疗法后已经记录了类似的综合征。脑成像似乎是正常的。神经毒性可以反映高水平的穿过血脑屏障的系统性细胞因子。

持续性、复发和T细胞耗竭

持续响应似乎与循环CAR转导的T细胞的较高的峰水平以及B细胞不发育的持续时间相关。除CD19疾病复发患者外，复发通常与循环CAR T细胞的丧失和正常B细胞的恢复相关。

T细胞耗竭是许多慢性感染和癌症中出现的T细胞功能障碍的状态。它由效应细胞功能不良、抑制性受体的持续表达和与功能性效应细胞或记忆T细胞的转录状态不同的转录状态定义。耗竭防止感染和肿瘤的最佳控制。最近，已经出现了耗竭的T细胞的功能和表型谱的更清晰的图片，其中抑制性受体程序性死亡1(PD-1；也称为PDCD1)(活化的T细胞的负调节物)的表达是关键的特征(Dayet al.(2006)Nature 443,350–354)。

CD19 CAR研究中的响应表明，T细胞以高水平持续延长的时段似乎在实现持久的响应中是重要的。减少T细胞耗竭的CD19 CAR可以导致临床响应的改善。

因此，需要与上述缺点不相关的针对CD19的替代CAR。

附图说明

图1：注释和编号的(a)CAT19 VH序列；(b)CAT19 VL

VH和VL的序列使用Chothia编号进行编号。显示了框架和CDR区。也显示插入。

图2：用重组CAT19染色CD19阳性细胞

SupT1细胞通常不表达CD19，但在本研究中工程化改造为如此。将CAT19 VH和VL序列克隆入小鼠IgG2a重链形式和小鼠κ轻链形式中，均在哺乳动物表达质粒中。用重链和轻链两者同时转染293T细胞，并且用蛋白A纯化所得到的抗体。用该重组抗体(或简单的293T上清液)对SupT1细胞和SupT1.CD19细胞进行染色，并进一步用荧光缀合的抗小鼠二抗染色。可以通过流式细胞术检测重组CAT19抗体的结合。

图3：用CAT19 scFv染色CD19阳性细胞

克隆CAT19的VH和VL，使得它们形成scFv，由此通过(SGGGGS)₃接头分开VH和VL。使用VH-VL和VL-VH方向的CAT scFv产生两种scFv。另外，从抗CD19抗体fmc63和4g7产生ScFv，也以任一方向生成。(a)scFv显示形式：这是一种逆转录病毒载体，其中将scFv克隆到具有CD8跨膜域和CD8胞内域的前12个残基的人IgG1 Fc间隔物上。这继而与FMD-2A肽TaV和截短的人CD34框架符合读码框。以这种方式，在细胞的表面上展示scFv，并且可以通过单独检测CD34控制转基因表达。产生SupT1细胞，其表达6种不同的scFv形式之任一种，并且用重组人截短的CD19-小鼠IgG2a Fc融合物和抗-CD34染色这些细胞；(b)用fmc63 VH-VL和VL-VH形式染色；(c)用4g7 VH-VL和VL-VH形式染色；和(d)用CAT19 VH-VL和VL-VH形式染色。令人惊奇的是，CAT19VH-VL scFv良好地结合，而VL-VH scFv给出了显著较少的可检测的结合。

图4：测试的不同代的CAR和初始CAR

(a)包含抗原结合域(其最通常是scFv)、间隔物域、跨膜域和一个或几个信号传导域的典型CAR形式。(b)第一代CAR传送活化信号；其胞内域源自FcGamma受体胞内域或CD3Zeta胞内域；(c)第二代受体传送两个信号：其胞内域包含与CD3-Zeta的胞内域连接的共刺激域。共刺激域通常是CD28的胞内域、OX40的胞内域或41BB的胞内域。(d)第三代受体传送三个信号：其胞内域包含CD28胞内域与41BB胞内域和与CD3-Zeta胞内域，或CD28胞内域与OX40胞质内域和与CD3-Zeta胞内域的融合物。(e)最初测试的基于CAT19的CAR，其包含VH-VL方向的scFv、CD8茎间隔物和包含41BB-Zeta的第二代胞内域(Campana CAR形式)。

图5：CAT19 CAR功能与fmc36 CAR的体外比较

用编码Campana形式的CAT19 CAR的慢病毒载体或Campana CAR本身转导来自5个不同供体的原代人T细胞。然后，将这些T细胞用于各种测定法。(a)对SupT1细胞进行铬释放测定法。这些细胞是CD19阴性。CAR T细胞都不响应该细胞系(虚线)。对SupT1.CD9进行铬释放测定法。这两种CAR对该细胞系表现得相等(实现)。接着，使用针对SupT1或SupT1.CD19的NT T细胞、fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞进行脱粒测定法。(b)在CD4+ T细胞上门控的数据，和(c)显示了CD8+ T细胞。使用CAR19 CAR T细胞增加脱粒。(d)使用氚化胸苷酶掺入估算增殖。针对SupT1.CD19测试NT、fmc63 CAR T细胞、CAT19 CAR T细胞。在此实验中，还测试了靶向GD2的无关CAR。使用CAR19 CAR T细胞有增加的增殖的趋势。(e)针对SupT1或SupT1.CD19细胞的激发(challenge)后24小时，从NT T细胞、fmc63 CAR T细胞、CAT19 CART细胞或GD2 CAR T细胞中的干扰素-γ释放。当用CD19+靶物进行激发时，CAT19 CAR T细胞比fmc63 CAR T细胞产生显著更少的IF-G。

图6：CAT19功效的体内模型。

(a)体内模型的实验设置概要。通过尾静脉注射给NSG小鼠注射2.5x10^5个Raji.FLuc细胞。24小时后，通过尾静脉施用4x10^6个NT原代人T细胞或用fmc63 CAR转导的T细胞或用CAT19 CAR转导的T细胞。通过生物发光成像顺序测量肿瘤响应。在第4天取样尾静脉血，用于植入和血清细胞因子。在第11天淘汰动物，并且对组织研究CAR T细胞的持久性和肿瘤负荷。(b)在第10天对不同小鼠分组的生物发光成像。在用NT T细胞处理的小鼠的骨盆、脊柱、肋骨、颅骨和脾脏中观察到广泛的疾病，而在接受CAT19 CAR T细胞或fmc63CART细胞的小鼠中最小的信号是明显的。(c)随时间从不同的小鼠分组取平均的定量生物发光信号。Y轴是对数标尺；在接受NT T细胞的小鼠和接受CAR T细胞的小鼠中的信号积累之间看到明显的差异。在接受fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞的小鼠中没有看到信号积累的差异。(d)在实验结束时来自小鼠的骨髓中的流式细胞术确定的肿瘤负荷。实际上，在接受fmc63或CAT19 CAR T细胞的小鼠的骨髓中未能检测到Raji细胞。

图7：体内持续的CAR T细胞的表征

(a)在上文概述的模型中来自用fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞处理的动物的小鼠脾脏中的CAR T细胞的绝对数目。这显示了相同数目存在于这两者中；(b)用fmc63CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞处理的小鼠骨髓中CAR T细胞的绝对数目。这显示了相同数目的细胞存在于这两者中；(c)用fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞处理的小鼠的脾脏和(d)骨髓中表达PD1的CAR T细胞的绝对数目。在两个区室中较少的CAT19 T细胞为PD1+。

发明概述

本发明人已经开发出具有先前尚未描述的CDR的新型CD19特异性CAR。它与用于UPENN研究中的基于fmc63的CAR具有等同的效力，但是导致降低的毒性和降低的T细胞耗竭。

因此，在第一方面，本发明提供了包含CD19结合域的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19结合域包含a)具有含有以下序列的互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：

CDR1–GYAFSSS(SEQ ID No.1)；

CDR2–YPGDED(SEQ ID No.2)

CDR3–SLLYGDYLDY(SEQ ID No.3)；和

b)具有含有以下序列的CDR的轻链可变区(VL)：

CDR1–SASSSVSYMH(SEQ ID No.4)；

CDR2–DTSKLAS(SEQ ID No.5)

CDR3–QQWNINPLT(SEQ ID No.6)。

CD19结合域可以包含具有如SEQ ID No.7所示的序列的VH域和/或具有如SEQ IDNo.8所示的序列的VL域，或其具有至少95％序列同一性的变体。

CD19结合域可以包含方向VH-VL的scFv。

CD19结合域可以包含如SEQ ID No 9所示的序列或其具有至少95％序列同一性的变体。

CD19结合域可以包含植入到人抗体框架上的权利要求1中限定的6个CDR。

CD19结合域和跨膜域可以是通过间隔物连接的，所述间隔物可以包含下列之一：人IgG1 Fc域；IgG1铰链；或CD8茎。间隔物可以包含CD8茎。

CAR可以包含胞内T细胞信号传导域或与胞内T细胞信号传导域结合。

胞内T细胞信号传导域可以包含下列胞内域的一项或多项：CD28胞内域；41BB胞内域、OX40胞内域和CD3-Zeta胞内域。

特别地，CAR可以包含CD8茎间隔物和胞内T细胞信号传导域，其包含41BB胞内域和CD3-Zeta胞内域。

特别地，CAR可以包含CD8茎间隔物和胞内T细胞信号传导域，其包含OX40胞内域和CD3-Zeta胞内域。

在一个备选的实施方案中，胞内T细胞信号传导域可以包含全部以下胞内域：CD28胞内域；OX40和CD3-Zeta胞内域。

CAR可以包含如SEQ ID No.10至15中任一项所示的序列或其具有至少80％序列同源性但保持i)结合CD19并且ii)诱导T细胞信号传导的能力的变体。与用于UPENN研究的基于fmc63的CAR相比，所述CAR可以具有有利的特性。例如，CAR在由T细胞表达并且用于靶向CD19表达细胞时可以引起比由表达包含CD19结合域的CAR的T细胞引起的更低的由表达CD19的靶细胞的IFNγ释放，所述CD19结合域包含：a)具有含有以下序列的互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：CDR1–GVSLPDY(SEQ ID No.16)；CDR2–WGSET(SEQ ID No.17)；CDR3–HYYYGGSYAMDY(SEQ ID No.18)；和b)具有含有以下序列的CDR的轻链可变区(VL)：CDR1–RASQDISKYLN(SEQ ID No.19)；CDR2–HTSRLHS(SEQ ID No.20)CDR3–QQGNTLPYT(SEQID No.21)。CDR可以是植入到人或人源化框架上的。

在第二个方面，本发明提供了核酸序列，其编码根据本发明的第一方面的CAR。

在第三个方面，提供了载体，其包含根据本发明的第二个方面的核酸序列。

在第三个方面，提供了细胞，其包含根据本发明的第一个方面的CAR。

细胞可以是细胞溶解免疫细胞，诸如T细胞或天然杀伤(NK)细胞。

在第四个方面，提供了细胞组合物，其包含多个根据本发明的第三个方面的细胞。

在第五个方面，提供了用于制备根据第三个方面的细胞的方法，其包括用根据第三个方面的载体转导或转染细胞的步骤。

在第六个方面，提供了用于制备根据第四个方面的细胞组合物的方法，其包括用根据第三个方面的载体离体转导或转染来自受试者的细胞样品的步骤。

例如，细胞样品可以是血液样品或其衍生物，如外周血单核细胞(PBMC)样品。

在第七个方面，提供了药物组合物，其包含根据本发明的第一个方面的细胞，或根据本发明的第四个方面的细胞组合物，以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

在第八个方面，提供了用于治疗癌症的方法，其包括对受试者施用根据本发明的第一个方面的细胞、根据本发明的第四个方面的细胞组合物或根据本发明的第七个方面的药物组合物的步骤。

方法可以包括用根据本发明的第三个方面的载体离体转导或转染来自受试者的细胞，然后将经转染的细胞或一些经转染的细胞施用回所述受试者的步骤。

还提供了根据本发明的第七个方面的药物组合物，其用于治疗癌症。

还提供了根据本发明的第三个方面的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

例如，癌症可以是B细胞恶性肿瘤。

发明详述

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合抗原受体(CAR)，也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是将任意特异性植入免疫效应细胞上的工程化受体。在经典的CAR中，将单克隆抗体的特异性植入T细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将CAR编码核酸转移到T细胞。这样，可以产生大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。该方法的I期临床研究显示功效。

CAR的靶抗原结合域通常通过间隔物和跨膜域融合到胞内域。胞内域可以包含胞内T细胞信号传导域或与胞内T细胞信号传导域结合。当CAR结合靶抗原时，这导致将活化信号传送到上面有其表达的T细胞。

本发明的CAR包含基于小鼠抗CD19单克隆抗体的CD19结合域。

本发明的CAR包含CD19结合域，其包含：

a)重链可变区(VH)，其具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：

CDR1–GYAFSSS(SEQ ID No.1)；

CDR2–YPGDED(SEQ ID No.2)

CDR3–SLLYGDYLDY(SEQ ID No.3)；和

b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有含有以下序列的CDR：

CDR1–SASSSVSYMH(SEQ ID No.4)；

CDR2–DTSKLAS(SEQ ID No.5)

CDR3–QQWNINPLT(SEQ ID No.6)。

可以有可能将一个或多个突变(取代、添加或缺失)引入每个CDR中，而不负面影响CD19结合活性。每个CDR可以例如具有一个、两个或三个氨基酸突变。

CDR可以为单链可变片段(scFv)的形式，其是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经由10至约25个氨基酸的短接头肽连接的融合蛋白。scFv可以是方向VH-VL，即VH位于CAR分子的氨基末端，并且VL域与间隔物，继而与跨膜域和胞内域连接。

CDR可以植入到人抗体或scFv的框架上。例如，本发明的CAR可以包含由以下序列之一组成或包含以下序列之一的CD19结合域

本发明的CAR可以包含以下VH序列：

SEQ ID No.7–来自鼠单克隆抗体的VH序列

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本发明的CAR可以包含以下VL序列：

SEQ ID No 8–来自鼠单克隆抗体的VL序列

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本发明的CAR可以包含以下scFv序列：

SEQ ID No 9–来自鼠单克隆抗体的VH-VL scFv序列

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CAR可以由以下序列之一组成或包含以下序列之一：

SEQ ID No.10–使用“Campana”构造的CAT19C AR(参见实施例)

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SEQ ID No.11–具有OX40-Zeta胞内域的CAT19 CAR

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SEQ ID No.12–具有CD28-Zeta胞内域的CAT19 CAR

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SEQ ID No.13–第三代CD19 CAR

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SEQ ID No.14–具有IgG1铰链间隔物的CD19 CAR

MGTSLLCWMALCLLGADHADAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.15–具有人IgG1的铰链-CH2-CH3的CD19 CAR，其中FcR结合位点突变

MGTSLLCWMALCLLGADHADAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

本发明的CAR可以包含如SEQ ID No.7,8,9,10,11,12,13,14或15所示的序列的变体，其具有至少80,85,90,95,98或99％序列同一性，条件是变体序列保留结合CD19的能力(当与互补的VL或VH域(若合适的话)一起时)。

可以通过诸如BLAST(其可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得)的程序容易地确定两个多肽序列之间的百分比同一性。

跨膜域

本发明的CAR还可以包含跨膜的跨膜域。它可以包含疏水性α螺旋。跨膜域可以源自CD28，其具有良好的受体稳定性。

跨膜域可以包含如SEQ ID No.22所示的序列。

SEQ ID No.22

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

胞内T细胞信号传导域(胞内域)

胞内域是CAR的信号传送部分。在抗原识别后，受体簇和信号传送给细胞。最常用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的组分。这在抗原结合后将活化信号传送给T细胞。CD3-zeta不能提供完全有能力的活化信号，并且可以需要额外的共刺激信号传导。例如，来自CD28或OX40或41BB的胞内域可以与CD3-Zeta一起使用以传送增殖/存活信号，或者所有三者可以一起使用。

早期的CAR设计具有从FcεR1或CD3ζ的γ链的胞内部分衍生的胞内域。因此，这些第一代受体传送免疫信号1，其足以触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖和存活。为了克服这个限制，构建了复合胞内域。T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3ζ的细胞内部分的融合产生第二代受体，其可以在抗原识别之后同时传送活化和共刺激信号。最常用的共刺激域是CD28的共刺激域。这提供了最有力的共刺激信号，即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还描述了一些受体，其包括传送存活信号的TNF受体家族胞内域，如OX40和41BB。最后，描述了甚至更有力的第三代CAR，其具有能够传送活化、增殖和存活信号的胞内域。图4中总结了CAR及其不同代。

本发明的CAR的胞内域可以包括CD3-Zeta胞内域、41BB胞内域、OX40胞内域或CD28胞内域中的一个或多个的组合。

本发明的CAR的胞内T细胞信号传导域(胞内域)可以包含如SEQ ID No.23,24,25,26,27,28,29或30所示的序列，或其具有至少80％序列同一性的变体。

SEQ ID No.23(CD3zeta胞内域)

RSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.24(41BB胞内域)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID No.25(OX40胞内域)

RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

SEQ ID No.26(CD28胞内域)

KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY

此类胞内域的组合的实例包括41BB-Z、OX40-Z、CD28-Z和CD28-OX40-Zeta。

SEQ ID No.27(41BB-Z胞内域融合物)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.28(OX40-Z胞内域融合物)

RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.29(CD28Z胞内域融合物)

KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.30(CD28OXZ)

KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

变体序列可以与SEQ ID No.22,23,24,25,26,27,28,29或30具有至少80％,85％,90％,95％,98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供了有效的跨膜域/胞内T细胞信号传导域。

信号肽

本发明的CAR可以包含信号肽，使得当CAR在诸如T细胞的细胞内表达时，将新生蛋白质引导到内质网并且随后到表达其的细胞表面。

信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以以氨基酸的短正电荷区段开始，这有助于在移位期间强制多肽的适当拓扑学。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特异性蛋白酶消化。

信号肽可以在分子的氨基末端。

本发明的CAR可以具有以下通式：

信号肽-CD19结合域-间隔物域-跨膜域/胞内T细胞信号传导域。

信号肽可以包含SEQ ID No.31或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、取代或添加)的变体，条件是信号肽仍然发挥功能以引起CAR的细胞表面表达。

SEQ ID No.31:METDTLLLWVLLLWVPGSTG

SEQ ID No.31的信号肽是紧凑且高效的。预期在末端甘氨酸后给出约95％的切割，产生通过信号肽酶的有效除去。

间隔物

本发明的CAR可以包含间隔物序列以连接CD19结合域与跨膜域并且在空间上分开CD19结合域与胞内域。柔性间隔物允许CD19结合域在不同方向上取向以实现CD19结合。

间隔物序列可以例如包含IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎、或其组合。或者，间隔物可以包含具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎类似的长度和/或域间隔性质的备选序列。

可以改变人IgG1间隔物以除去Fc结合基序。

下文给出了这些间隔物的氨基酸序列的实例：

SEQ ID No.32(人IgG1的铰链-CH2CH3)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID No.33(人CD8茎)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID No.34(人IgG1铰链)：

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID No.35(IgG1铰链-Fc)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

SEQ ID No.36(IgG1铰链–Fc，其修饰为除去Fc受体识别基序)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVA*GPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

经修饰的残基是加下划线的；*表示缺失。

干扰素释放和CAT T细胞耗竭

本发明人已经发现，基于CAT19 scFv的CD19 CAR具有可导致较低毒性和较好功效的性质。

鉴于CD19 CAR疗法的主要经验是基于fmc63 scFv的CAR，并且最久、最大且可能最重大的临床数据集是基于fmc63的Campana CAR，本发明人采用该Campana CAR作为“金标准”。因此，在fmc63-Campana CAR和类似CAR但具有CAT19 scFv而非fmc63之间进行了比较。令人惊奇的是，本发明人发现虽然CAT19 CAR T细胞实现杀死表达CD19的靶细胞，而且响应于表达CD19的靶物而增殖，但是干扰素gamma释放较少。此外，攻击性B细胞淋巴瘤的小动物模型在基于fmc63的和基于CAT19的CAR之间显示相同的功效和相等的植入，但令人惊讶的是，比fmc63 CAR T细胞更少的CAT19 CAR T细胞被耗竭。

在涉及使CAR T细胞与靶细胞接触的比较测定法中，本发明的CAR可以导致低25,50,70或90％的IFNγ释放。

本发明的CAR可以导致比fmc63 CAR T细胞更小比例的CAR T细胞被耗竭。可以使用本领域已知的方法来评估T细胞耗竭，如PD-1表达的分析。在涉及使CAR T细胞与靶细胞接触的比较测定法中，本发明的CAR可以导致比fmc63 CAR T细胞少20,30,40,50,60或70％的CAR T细胞表达PD-1。

核酸序列

本发明的第二方面涉及编码本发明第一方面的CAR的核酸序列。

核酸序列可以编码具有SEQ ID No.10-15中任一项所示的氨基酸序列的CAR。

载体

本发明还提供了包含本发明的核酸序列的载体。可以使用此类载体将核酸序列导入宿主细胞中，使得其表达并产生根据本发明第一方面的分子。

载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。

载体可以能够转染或转导细胞，如T细胞。

细胞

本发明还提供了包含根据本发明的核酸的细胞。本发明提供在细胞表面表达根据本发明的第一方面的CAR的细胞。

细胞可以是细胞溶解免疫细胞，如T细胞或天然杀伤(NK)细胞。

可以通过用CAR编码核酸转导或转染细胞来制备能够表达根据本发明的CAR的细胞。

本发明的CAR表达细胞可以离体产生。细胞可以来自细胞样品，如来自患者或供体的外周血单核细胞(PBMC)样品。在用CAR编码核酸转导之前，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理，可以活化和/或扩增细胞。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，其含有本发明的一种CAR表达细胞或多种细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选地一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如为适合用于静脉输注的形式。

治疗方法

本发明的CAR表达细胞可以能够杀死癌细胞，如B细胞淋巴瘤细胞。CAR表达细胞，如T细胞或NK细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的设置中产生，或自不相关供体的外周血(第三方)产生。或者，CAR表达细胞可以源自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞离体分化成诸如T细胞的细胞。在这些情况中，通过多种手段之一，包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染导入编码CAR的DNA或RNA产生CAR细胞。

表达本发明CAR分子的T细胞或NK细胞可用于治疗癌性疾病，特别是与CD19表达相关的癌性疾病。

治疗疾病的方法涉及本发明的细胞或细胞群体的治疗用途。在这方面，可以向具有现有疾病或状况的受试者施用细胞以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病进展。本发明的方法可以引起或促进细胞介导的对表达CD19的细胞，如B细胞的杀伤。

现在将通过实施例进一步描述本发明，所述实施例旨在用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：克隆VH和VL并证明CD19结合

从小鼠抗CD19单克隆抗体克隆VH和VL，并且与人κ恒定区和人IgG1恒定区以符合读码框的方式融合。将这些嵌合重链和轻链克隆到表达载体中并用于转染293T细胞。随后产生的抗体用于染色SupT1细胞(CD19阴性的T细胞系)，以及已被工程化改造为CD19阳性的SupT1细胞。该染色显示CD19的特异性结合(图2)。

实施例2：证明VH/VL可以形成结合CD19的scFv

然后，研究克隆的VH和VL是否可以以scFv形式结合CD19。将VH和VL作为scFv以两个方向克隆：VH-VL和VL-VH，其中两个可变区由包含(SGGGG)4的接头分开。将这些scFv克隆到与截短的CD34共表达的非信号传导CAR中，如图3a中所示。简言之，这包括信号肽、scFv、人IgG1的铰链-CH2-CH3、CD8跨膜域、CD8胞内域的前12个残基、FMD-2A肽TeV、截短的人CD34。为了进行比较，来自fmc63的scFv和来自另一抗CD19杂交瘤4g7的scFv在VH-VL和VL-VH方向两者中以相同的形式克隆。

这样，可以研究几个参数：(1)通过使用与鼠Fc融合的重组关联靶抗原，靶抗原与CAR的结合，不受由信号传导引起的受体内化(internalization)的阻碍；(2)可以使用多克隆抗Fc测定受体的稳定性；(3)可以通过CD34的共染色来控制盒的表达水平。

将这些构建体转导入SupT1细胞。产生重组CD19-小鼠IgG2aFc融合物。用与不同荧光团缀合的抗体对SupT1细胞染色小鼠-Fc、人Fc和抗CD34，并且通过流式细胞术询问稳定性/结合。

下文详述了所使用的不同scFv的序列：

>scFv_fmc63_VH-VL(SEQ ID No.37)

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKA

>scFv_fmc63_VL-VH(SEQ ID No.38)

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

>scFv_4g7_VH-VL(SEQ ID No.39)

EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKR

>scFv_4g7_VL-VH(SEQ ID No.40)

DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKRSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSS

>scFv_CAT_VH-VL(SEQ ID No.9)

>scFv_CAT_VL-VH(SEQ ID No.41)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSS

在图3中汇总了使用的构建体和染色结果。令人惊讶的是，具有VH-VL方向的scFv的CAT CAR结合CD19，而具有VL-VH方向的scFv的CAT19 CAR给出最小的CD19结合。这与在HL和LH两种方向都结合CD19的fmc63 CAR和4g7 CAR形成对比。HL CAT CAR的结合和稳定性表现得与fmc63的结合和稳定性相等。

实施例3：CAT19 CAR功能与fmc36 CAR的体外比较

将HL方向的CAT scFv克隆到由Campana设计的CAR支架(Imai et al(2004)Leuk.Off.J.Leuk.Soc,Am.Leuk,Res.Fund.UK 18:676-684)中。有效地将fmc63 scFv替换为CAT scFv，并与初始的基于fmc63的CAR进行比较。该CAR包括信号肽、scFv、CD8茎间隔物和跨膜和41BB和Zeta胞内域。下文给出了CAT CAR和fmc63 CAR的氨基酸序列：

>CAT19_CAR(SEQ ID No.10)

>Fmc63_CAR，如由Imai et al(2004)同上描述(SEQ ID No.42)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

用编码Campana形式的CAT19 CAR或fmc63 Campana CAR本身的慢病毒载体转导来自5个不同供体的原代人T细胞。然后，将这些T细胞用于各种测定法。对SupT1细胞进行铬释放测定法。这些细胞是CD19阴性。两种CAR T细胞都不响应这种细胞系，证明了CAR19 CAR对CD19阴性细胞没有非特异性杀伤活性[图5(a)]。(b)还对工程化改造为表达CD19的SupT1细胞进行铬释放测定法。这两种CAR在该测定法中以高水平杀伤对该细胞系表现得相等[图5(b)]。接下来，通过在与靶细胞共培养后染色效应细胞表面上的CD107进行脱粒测定法。这里，使用NT T细胞、fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞作为效应细胞，并且使用SupT1或SupT1.CD19细胞作为靶物。通过流式细胞术检测表面CD107，所述流式细胞术允许差异测量CD4+和CD8+细胞的脱粒。[分别为图5(c)和(d)]。与fmc63 CAR T细胞相比，脱粒在CAT19CAR T细胞的情况下是增加的。使用氚标记的胸苷酸盐(thymidilate)掺入估算增殖。在这里，将NT、fmc63 CAR T细胞、CAT19 CAR T细胞与工程化改造为表达CD19的SupT1细胞共培养。胸苷掺入。在本实验中，还测试了无关的靶向GD2的CAR。使用CAR19 CAR T细胞有增加的增殖的趋势[图4(e)]。接下来，通过ELISA测量针对SupT1或SupT1.CD19细胞激发后24小时从NT T细胞、fmc63 CAR T细胞、CAT19 CAR T细胞或GD2 CAR T细胞的干扰素-γ释放。当用CD19+靶物激发时，CAT19 CAR T细胞产生比fmc63 CAR T细胞显著更少的干扰素-γ。

实施例4：CAT19 CAR疗法的体内功效的证明。

该体内模型的实验装置的概述呈现于图6(a)中。简言之，NSG(NOD scid gamma,NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)小鼠是充分免疫受损的，使得它们允许人细胞系和原代人T细胞的植入。Raji细胞是从伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)衍生的B细胞系。这些细胞易于在NSG小鼠的骨髓内移植，导致攻击性白血病样综合征。将Raji细胞工程化以表达萤火虫萤光素酶，以允许使用生物发光成像(BLI)的非侵入性跟踪。通过尾静脉注射给小鼠注射2.5x10^5个Raji.FLuc细胞。24小时后，通过尾静脉施用4x10^6个NT原代人T细胞或用fmc63 CAR转导的T细胞或用CAT19 CAR转导的T细胞。通过BLI顺序测量肿瘤响应。在第4天采集尾静脉血，用于植入和血清细胞因子。在第11天淘汰动物，并且对组织研究CAR T细胞的持久性和肿瘤负荷。图6(b)中显示了第10天不同小鼠分组的BLI成像。在用NT T细胞处理的小鼠的骨盆、脊柱、肋骨、颅骨和脾脏中看到广泛的疾病，而接收CAT19 CAR T细胞或fmc63 CAR T细胞的小鼠中的最小信号是明显的。在图6(c)中以对数标度显示随时间从不同小鼠分组取平均的定量生物发光信号。在接受NT T细胞的小鼠和接受CAR T细胞的小鼠中的信号积累之间看到明显的差异。在接受fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞的小鼠中没有看到信号积累的差异。最后，处死后，进行每只小鼠的骨髓的流式细胞术分析以直接确定肿瘤负荷。Raji细胞易于与小鼠造血细胞和过继转移的T细胞区分开，因为它们表达人B细胞标志物。在接受fmc63或CAT19 CAR T细胞的小鼠的骨髓中可以检测到最小的Raji细胞。

实施例5：体内持续CAR T细胞的表征

从上述动物模型，本发明人试图确定是否在这些NSG小鼠的骨髓和脾内植入了两种类型的CAR T细胞。用计数珠对骨髓和脾脏的流式细胞术分析允许测定CAR T细胞的绝对数。图7(a)和(b)中显示了该数据。来自用fmc63 CAR T细胞或CAT19 CAR T细胞处理的动物的小鼠脾脏中的CAR T细胞的绝对数目是相似的。接下来，本发明人进行确定是否这些不同组织中耗竭的T细胞数目存在任何差异。通过在上述样品中共染色PD1表达，可以确定耗竭的T细胞的数目。图7(c)和(d)中显示了该数据。令人惊讶的是，用CAT19 CAR比fmc63 CAR在两个组织区室中存在更少的耗竭的T细胞。

上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对分子生物学、CAR技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的描述模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> UCL商务股份有限公司

<120> 嵌合抗原受体

<130> P105665PCT

<150> GB 1503742.7

<151> 2015-03-05

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区(VH)互补决定区(CDR) CDR1

<400> 1

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR, CDR2

<400> 2

Tyr Pro Gly Asp Glu Asp

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR, CDR3

<400> 3

Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区(VL) CDR, CDR1

<400> 4

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR, CDR2

<400> 5

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR, CDR3

<400> 6

Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自鼠单克隆抗体的VH序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自鼠单克隆抗体的VL序列

<400> 8

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自鼠单克隆抗体的VH-VL scFv序列

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile

195 200 205

Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

225 230 235 240

Arg

<210> 10

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用"Campana"构造的CAT19嵌合抗原受体(CAR)

<400> 10

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

325 330 335

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

340 345 350

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

370 375 380

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 11

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有OX40-Zeta胞内域的CAT19 CAR

<400> 11

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg

325 330 335

Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser

340 345 350

Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu

355 360 365

Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

370 375 380

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

385 390 395 400

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

405 410 415

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

420 425 430

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

465 470 475 480

Pro Pro Arg

<210> 12

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有CD28-Zeta胞内域的CAT19 CAR

<400> 12

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser

325 330 335

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

340 345 350

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

355 360 365

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 13

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三代CD19 CAR

<400> 13

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

325 330 335

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

340 345 350

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

355 360 365

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu

370 375 380

Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro

385 390 395 400

Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg

405 410 415

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

420 425 430

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

435 440 445

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

450 455 460

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

465 470 475 480

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

485 490 495

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

500 505 510

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520 525

<210> 14

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有IgG1铰链间隔物的CD19 CAR

<400> 14

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp

260 265 270

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val

275 280 285

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

290 295 300

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

305 310 315 320

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

325 330 335

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

340 345 350

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

355 360 365

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

370 375 380

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

385 390 395 400

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

405 410 415

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

420 425 430

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

435 440 445

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

450 455 460

Arg

465

<210> 15

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有人IgG1的铰链CH2-CH3的CD19 CAR, FcR结合位点突变出来

<400> 15

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp

260 265 270

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

275 280 285

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala

290 295 300

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

305 310 315 320

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

325 330 335

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

340 345 350

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

355 360 365

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

370 375 380

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

405 410 415

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

420 425 430

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

435 440 445

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

450 455 460

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

465 470 475 480

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

485 490 495

Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR, CDR1

<400> 16

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR, CDR2

<400> 17

Trp Gly Ser Glu Thr

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR, CDR3

<400> 18

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR, CDR1

<400> 19

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR, CDR2

<400> 20

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR, CDR3

<400> 21

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 跨膜域

<400> 22

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 23

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 zeta胞内域

<400> 23

Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

1 5 10 15

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

20 25 30

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

35 40 45

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

50 55 60

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

65 70 75 80

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

100 105 110

Pro Arg

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB胞内域

<400> 24

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 25

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40胞内域

<400> 25

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Lys Ile

35

<210> 26

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28胞内域

<400> 26

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

1 5 10 15

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

20 25 30

Asp Phe Ala Ala Tyr

35

<210> 27

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB-Z胞内域融合物

<400> 27

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

35 40 45

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

50 55 60

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

65 70 75 80

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

85 90 95

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

100 105 110

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

115 120 125

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

130 135 140

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 28

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-Z胞内域融合物

<400> 28

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

35 40 45

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

50 55 60

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

65 70 75 80

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

85 90 95

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

100 105 110

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

115 120 125

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

130 135 140

Ala Leu Pro Pro Arg

145

<210> 29

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28Z胞内域融合物

<400> 29

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

1 5 10 15

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

20 25 30

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

35 40 45

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

50 55 60

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

65 70 75 80

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

85 90 95

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

100 105 110

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

115 120 125

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

130 135 140

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 30

<211> 187

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28OXZ

<400> 30

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

1 5 10 15

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

20 25 30

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala

35 40 45

His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu

50 55 60

Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser

65 70 75 80

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

85 90 95

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

100 105 110

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

115 120 125

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

130 135 140

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

145 150 155 160

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

165 170 175

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

180 185

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 31

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 32

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔物(人IgG1的铰链-CH2CH3)

<400> 32

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp

225 230

<210> 33

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔物(人CD8茎)

<400> 33

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔物(人IgG1铰链)

<400> 34

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Pro Lys

20

<210> 35

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔物(IgG1铰链-Fc)

<400> 35

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys

225 230 235

<210> 36

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔物(IgG1铰链 - Fc，修饰为除去Fc受体识别基序)

<400> 36

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys

225 230 235

<210> 37

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链可变片段(scFv), scFv_fmc63_VH-VL

<400> 37

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

165 170 175

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Thr Lys Ala

<210> 38

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv, scFv_fmc63_VL-VH

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Lys Ala Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu

115 120 125

Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val

130 135 140

Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp

145 150 155 160

Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp

165 170 175

Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser

195 200 205

Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr

210 215 220

Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 39

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv, scFv_4g7_VH-VL

<400> 39

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala

130 135 140

Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp

165 170 175

Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met

180 185 190

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

210 215 220

Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly

225 230 235 240

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

245

<210> 40

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv, scFv_4g7_VL-VH

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys

180 185 190

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 41

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv, scFv_CAT_VL-VH

<400> 41

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

115 120 125

Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser

130 135 140

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val

145 150 155 160

Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro

165 170 175

Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr

180 185 190

Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser

195 200 205

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu

210 215 220

Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 42

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fmc63_CAR

<400> 42

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

100 105 110

Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Lys

115 120 125

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

165 170 175

Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

195 200 205

Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys

210 215 220

Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala

225 230 235 240

Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro Thr

260 265 270

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

275 280 285

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

305 310 315 320

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

325 330 335

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

340 345 350

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

355 360 365

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

370 375 380

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

385 390 395 400

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

405 410 415

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

420 425 430

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

435 440 445

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

450 455 460

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

465 470 475 480

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 43

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 43

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

Claims

1.包含CD19结合域的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19结合域包含：

a)重链可变区(VH)，其具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：

CDR1–GYAFSSS(SEQ ID No.1)；

CDR2–YPGDED(SEQ ID No.2)

CDR3–SLLYGDYLDY(SEQ ID No.3)；和

b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有含有以下序列的CDR：

CDR1–SASSSVSYMH(SEQ ID No.4)；

CDR2–DTSKLAS(SEQ ID No.5)

CDR3–QQWNINPLT(SEQ ID No.6)。

2.根据权利要求1的CAR，其中所述CD19结合域包含具有如SEQ ID No.7所示的序列的VH域和/或具有如SEQ ID No.8所示的序列的VL域，或其具有至少95％序列同一性的变体。

3.根据权利要求1的CAR，其中所述CD19结合域包含方向为VH-VL的scFv。

4.根据权利要求3的CAR，其中所述CD19结合域包含如SEQ ID No 9所示的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。

5.根据权利要求1的CAR，其中所述CD19结合域包含植入到人抗体框架上的权利要求1中限定的6个CDR。

6.根据前述权利要求中任一项的CAR，其中所述CD19结合域和跨膜域是通过间隔物连接的。

7.根据权利要求6的CAR，其中所述间隔物包含下列之一：人IgG1Fc域；IgG1铰链；或CD8茎。

8.根据权利要求7的CAR，其中所述间隔物包含IgG1铰链或CD8茎。

9.根据前述权利要求中任一项的CAR，其还包含胞内T细胞信号传导域。

10.根据权利要求9的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导域包含下列胞内域的一项或多项：CD28胞内域；41BB胞内域、OX40胞内域和CD3-Zeta胞内域。

11.根据权利要求10的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导域包含41BB胞内域和CD3-Zeta胞内域。

12.根据权利要求10的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导域包含OX40胞内域和CD3-Zeta胞内域。

13.根据权利要求10的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导域包含所有以下胞内域：CD28胞内域；OX40和CD3-Zeta胞内域。

14.根据前述权利要求中任一项的CAR，其包含如SEQ ID No.10至15中任一项所示的序列或其具有至少80％序列同源性但保持i)结合CD19和ii)诱导T细胞信号传导的能力的变体。

15.根据前述权利要求中任一项的CAR，其在由T细胞表达并且用于靶向表达CD19的细胞时，引起比由表达包含以下的CD19结合域的CAR的T细胞引起的更低的由表达CD19的靶细胞的IFNγ释放，所述CD19结合域包含：

a)重链可变区(VH)，其具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：

CDR1–GVSLPDY(SEQ ID No.16)；

CDR2–WGSET(SEQ ID No.17)；

CDR3–HYYYGGSYAMDY(SEQ ID No.18)；和

b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有含有以下序列的CDR：

CDR1–RASQDISKYLN(SEQ ID No.19)；

CDR2–HTSRLHS(SEQ ID No.20)

CDR3–QQGNTLPYT(SEQ ID No.21)。

16.根据前述权利要求中任一项的CAR，其中所述CDR是植入到人或人源化框架上的。

17.核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的CAR。

18.载体，其包含根据权利要求17的核酸序列。

19.细胞，其包含根据权利要求1至16中任一项的CAR。

20.根据权利要求19的细胞，其是T细胞或天然杀伤(NK)细胞。

21.细胞组合物，其包含多个根据权利要求19或20的细胞。

22.用于制备根据权利要求19或20的细胞的方法，其包括用根据权利要求18的载体转导或转染细胞的步骤。

23.用于制备根据权利要求21的细胞组合物的方法，其包括用根据权利要求18的载体离体转导或转染来自受试者的细胞样品的步骤。

24.药物组合物，其包含根据权利要求19或20的细胞，或根据权利要求21的细胞组合物，以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

25.用于治疗癌症的方法，其包括对受试者施用根据权利要求19或20的细胞、根据权利要求21的细胞组合物或根据权利要求24的药物组合物的步骤。

26.根据权利要求25的方法，其包括用根据权利要求18的载体离体转导或转染来自受试者的细胞，然后将经转染的细胞施用回所述受试者的步骤。

27.根据权利要求25或26的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。

28.根据权利要求24的药物组合物，其用于治疗癌症。

29.根据权利要求20或21的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。